專利名稱：：檢測Dkk-1的時間分辨熒光免疫分析方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種分泌型蛋白dickkopfl(Dkk-l)的免疫檢測方法，特別涉及一種檢測Dkk-l的時間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)及相應的試劑盒。
背景技術：
：Wnt信號途徑是對控制胚胎發(fā)育有重要作用的、進化上保守的信號轉導途徑，其不恰當?shù)募せ顓⑴c了人類多種腫瘤的發(fā)生。最近的一些研究報道了參與這一信號途徑的細胞內分子P-catenin、APC和AXIN的基因突變使細胞內P-catenin磷酸化水平降低和相應的泛素化降解削弱，致使穩(wěn)定的P-catenin入核與TCF/LEF結合調控相關基因的表達，因而導致wnt信號途徑的異常激活。分泌型蛋白dickkopfl(Dkk-l)在非洲爪蟾早期發(fā)育中發(fā)揮重要調控作用，抑制wnt誘導的軸的復制而參與頭的形成。Dkk-l人類的同源物也作為一種抑制信號對Wnt信號途徑起調控作用。目前的研究認為Dkk-l與低密度月旨蛋白受體相關蛋白5/6(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5/6，LRP5/6)結合，在膜蛋白Kremen參與下引起LRP5/6的內吞而抑制wnt信號。最近有研究通過cDNA微陣列芯片技術比較肝細胞癌組織及鄰近正常肝組織的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)Dkk-l基因在肝細胞癌中高表達，該基因編碼一個35kDa的分泌性蛋白^Dkk-l蛋白，以前對于該基因功能研究主要集中在胚胎期神經的發(fā)育。隨后我們分別采用RT-PCR、Northernblot、熒光定量PCR、Westernblot等技術均證實Dkk-l在人類多種腫瘤細胞系中有不同程度高表達。在今年3月出版的CancerResearch雜志上，日本學者TakumiYamabuki等報道了Dkk-l在肺癌和食道癌中的診斷作用，Dkk-l在非小細胞性肺癌的陽性率達70%,在小細胞性肺癌中的陽性率為69.4%，在食道癌中為63%，僅有4.8%的假陽性率。血清Dkk-l蛋白檢測，各室驗均運用ELISA原理自己建立檢測方法，無商業(yè)化的試劑盒可用。ELISA方法存在穩(wěn)定性差，批間差異大，靈敏度低的缺點，難以滿足Dkk-l檢測。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種靈敏度、特異度及穩(wěn)定性較佳，且適于產業(yè)化的檢測Dkk-l的時間分辨熒光免疫分析方法(TRFIA)及其試劑為提高Dkk-l檢測方法的靈敏度、特異度和/或穩(wěn)定性，且能產業(yè)化利用，本發(fā)明人在現(xiàn)有諸多免疫方法中進行篩選，驚奇地發(fā)現(xiàn)TRFIA在靈敏度、特異度和穩(wěn)定性方面均具有良好的效果。TRFIA是上世紀八十年代初發(fā)展起來的新的免疫測定技術。其原理是利用具有雙功能基團結構的螯和劑，其一端和鑭系元素，如銪(Eu)、鋱(Te)、釤(Sm)、鏑(Dy)等結合，另一端和抗體分子上的自由氨基聯(lián)接，制成鑭系元素標記抗體，它與待測樣品中的抗原結合成免疫復合物。理想情況下，測定復合物中鑭系元素，如Ei^+的熒光強度就能確定樣品中抗原的量，但實際上這種復合物的熒光強度相當弱，只有再加入一種增強液(Enhancementsolution),使鑭系元素從復合物中解離下來，并與增強液中所含的P-萘甲酰三氟丙酮(P-NTA)重新形成微膠囊，在紫外等光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，增強效果上百萬倍。用全自動TRFIA檢測儀測定其熒光強度，即可確定樣品中抗體的量，因此本發(fā)明采用TRFIA檢測Dkk-l可提高臨床檢驗結果的速度，又可大幅度降低人為誤差，適于產業(yè)化檢測?？梢?，本發(fā)明可以通過下列技術方案解決上述問題。一種檢測Dkk-l的時間分辨熒光免疫分析方法，其可以包括下列步驟①固相抗體制備將抗Dkk-l單克隆抗體用緩沖液稀釋至110mg/L作為包被液，包被反應板，并用封閉液封閉；②銪離子標記抗體制備選用抗Dkk-l多克隆抗體進行El^+標記，抗Dkk-l多克隆抗體與Eu,示記物Eu3+-DTTA的重量比為l:0.20.5;③測定方法測定的基礎是基于雙抗體夾心的免疫反應，包括在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔依次加入Dkk-l標準品或待測樣品，加入反應緩沖液室溫振蕩反應，洗滌液洗滌后加入用反應緩沖液以體積比為1:100稀釋的步驟②制得的標記抗體100-200ul;室溫振蕩反應后用洗滌液洗滌，最后加入增強液進行熒光檢測。其中，步驟①中所述的緩沖液優(yōu)選50mmol/L、pH9.6的Na2COrNaHC03緩沖液，包被過程包括在96或48孔微孔板中加入100|al包被液，4t:放置過夜，棄去包被液，用洗滌液沖洗4次，加200ial含0.2w/v。/。明膠和2w/vM蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4"C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干。如不立即使用，可將其密封后置-20。C冷凍保存。根據(jù)本發(fā)明，步驟②銪離子標記方法可參照E^+標記試劑盒說明書。其中抗Dkk-l多克隆抗體與Eu"示記物Eu3+-DTTA的重量比本發(fā)明優(yōu)選1:0.20.5，這樣可獲得標記率在7-8的最住標記效果(抗體/￡113+-011八，摩爾比)。標記率太高，影響被標記抗體的免疫活性；標記率太低，信號強度不夠，降低檢測靈敏度。較佳地，步驟③中所述的反應緩沖液為含有8mmol/LNaCl、0.1w/v。/。明膠、0.2w/v°/。IgG、50)utmol/L二乙烯三胺五乙酸、O.lml/LTween-80和0.1w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。而步驟(D中所述的洗滌液優(yōu)選含有14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，所述的Dkk-l標準品濃度分別為Ong/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。根據(jù)本發(fā)明，所述的Dkk-l待測樣品通常是體液，如血清以及心包積液、胸腔積液、腹腔積液、尿液等。本發(fā)明檢測方法的基礎是雙抗體夾心的免疫反應同現(xiàn)有其它標記免疫反應相似，銪標記抗體、Dkk-l抗原和反應板上的固化抗體經過振蕩反應形成夾心復合物，反應后經洗滌去除游離的未與固化抗體反應的Dkk-l、銪標記的Dkk-l抗體和/或Dkk-l與銪標記抗體形成的復合物。加增強液振蕩反應后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀器測定其熒光強度。熒光強度與樣品中的Dkk-l濃度成正比，對照標準曲線即可確定樣品中抗原的量。本發(fā)明要解決的另一技術問題是提供一種相應于上述TRFIA檢測Dkk-l的試劑盒。該檢測Dkk-l的TRFIA試劑盒包括包被抗Dkk-l單克隆抗體的固相抗體微孔板、反應緩沖液、洗滌液、Eu"標記的抗Dkk-l多克隆抗體、增強液和Dkk-l標準品。其中，所述的包被抗Dkk-l單克隆抗體的固相抗體微孔板如上述步驟①。而所述的反應緩沖液、洗滌液也同上述。所述的增強液可選用現(xiàn)已知的E^+增強液含有15iLmiol/LP-萘甲酰三氟丙酮、50pmol/L三正辛基氧化膦和lml/L曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。本發(fā)明檢測Dkk-l具有較高的靈敏度、特異度及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗結果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結果的可靠性。通過對人體體液中Dkk-l含量的檢測，可作為臨床腫瘤診斷的輔助指標。圖1為本發(fā)明Dkk-l-TRFIA標準曲線及精密度圖。具體實施方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。其中，下列實施例中的抗Dkk-l單克隆抗體(CatalogNumber:MAB1096)，多克隆抗體(CatalogNumber:AF1096)和重組人Dkk-l蛋白標準品(CatalogNumber:1096-DK)購自Biodesign公司；96、48孔微孔板為labsystem公司產品；Eu"標記盒PerkerElmer公司產品，SephadexG-50為Amersham產品；其他試劑均為國產分析純；全自動TRFIA檢測儀(AutoDELFIA1235)為Wallac產品。試劑的配制1)標準品配制系列標準品為凍干品，共6瓶，用前用lml蒸餾水溶解成0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml,100ng/ml，500ng/ml。2)反應緩沖液8mmol/LNaCl、0.1w/v。/。明膠、0.2w/v%IgG、50|amol/L二乙烯三胺五乙酸、O.lml/LTween-80和0.1w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液；3)洗滌液14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80禾Q0.2w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液；4)增強液l升pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液，含15^imoip-萘甲酰三氟丙酮，50(imol三正辛基氧化膦和lml曲拉通X-100。實施例1試劑盒每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下1)1X96或48孔板(8或4條X12孔，可以拆分為單孔)包被有抗Dkk-l單克隆抗體的微孔反應板；2)6XDkk-l標準品，凍干品，用前用lml蒸餾水溶解，濃度分別為0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。3)lX銪標記抗Dkk-l多克隆抗體凍干品，用時用0.5ml蒸餾水溶解。4)1X增強液，15ml。5)1X洗滌液，30ml，用時以蒸餾水1:25稀釋。6)1X反應緩沖液，30ml。其中Dkk-l標準品制備取市購重組人Dkk-l抗原用含0.2%BSA、0.1%NaN3，50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl緩沖液配制成Ong/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml系列標準品共6瓶，制成凍干粉，使用前加1ml蒸餾水溶解。微孔反應板制備用50mmol/LpH9.6Na2C03-NaHC03的緩沖液將抗Dkk-l單克隆抗體稀釋至5^ig/mL作為包被液，96或48孔微孔板各加入lOOjxl，4。C放置過夜，棄去包被液，沖洗四次，加200)^1含0.2%明膠和2%蔗糖的50mmol/LpH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4"C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20'C冷凍保存。Eu"標記抗Dkk-l抗體制備參照Ei^+標記試劑盒說明書操作。具體為取lmg抗Dkk-l多克隆抗體溶于0.25mol/LNaHC03液200pl中，加入0.3mg￡113+^2-0>異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混勻，4'C反應24小時。反應液用SephadexG-50柱Qx20cm)層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量，稀釋分裝備用。同時用PerkinElmer公司Eu1示準液測定合并峰的Eu3+濃度。所得的標記率(Eu3+mol/IgGmol)是7.34，蛋白回收率為82%。具體檢測步驟如下取包被有抗Dkk-l單克隆抗體的微孔反應板，加50ial不同濃度的Dkk-l標準品至各自的微孔中，每個標準品必須使用新的吸頭，加100pl反應緩沖液，室溫振蕩反應1小時。用洗滌液洗滌4次后再加200W以反應緩沖液作稀釋劑，1:100稀釋的銪標記的抗Dkk-l抗體，25-37'C振蕩反應1小時，用洗漆液洗滌6次，加增強液200|^1振蕩5分鐘后測量熒光強度，從標準曲線計算樣品中的Dkk-l含量。l.Dkk-lTRFIA標準曲線以濃度值的對數(shù)為橫坐標，熒光計數(shù)值的對數(shù)為左縱坐標，右縱坐標為CV。/。值，可見標準曲線線性好(r-0.997)，各濃度值的變異系數(shù)小于均6%。見圖1。2.靈敏度和線性范圍以零參考標準品當作樣品測量20次，計算其熒光均值及標準差。以該點熒光測定平均值加2倍標準差所得的熒光值代入標準曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經測定本試驗靈敏度為0.03ng/ml。將標準品抗原稀釋成不同濃度進行測定，測得標準曲線線性范圍為0.035000ng/ml。3.方法的特異性將Dkk-4，Kremen-2，Kremen-l和LRP-6/FcChimera當作樣品稀釋至一定濃度當作樣品用本方法進行測定，結果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4.精密度采用本方法對三個濃度值的標本進行測定，各設10個復孔。本方法的批內變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%(見表2)，符合試劑盒規(guī)定要求。表2精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>5.準確度(回收試驗)按常規(guī)方法對本法進行回收試驗。見表3。表3回收試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>6.倍比稀釋試驗把高含量的Dkk-l血清樣品經l:232稀釋后用本方法測定結果見表4。表4倍比稀釋試驗稀釋倍數(shù)樣本1樣本2樣本3理論值實測值理論值實測值理論值實測值無/12.76/86.66/777.556.385.4543.3345.08388.78401.85x43.194.5721.6725.56194.39159.33x81.6052.0910.836.7597.19120.99x160.800.495.429.0748.6041.21x320.400.262.711.9824.3021.9經相關回歸分析計算各組的斜率，截距，r值。樣本1分別0.9038,0.3375和0.9334;樣本2分別為1.054，-0.0017和d0.9833;樣本3分別為1.0155,-3.935和0.9892。綜上可見，用時間分辨熒光免疫分析技術建立的Dkk-l檢測方法具有高度的特異性，檢測靈敏度達0.03ng/mL，試劑盒穩(wěn)定性好，批內批間差異均小于6%，整體性能優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA方法。應用實施例1臨床應用試劑盒同實施例l。實驗分組-直結腸癌62例，取自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院普外科手術確診病人。抽取患者的靜脈血2ml置試管內待測。正常對照組101例，為近期來上述醫(yī)院體檢的健康體檢者，經檢測各項目指標均正常。抽取靜脈血2ml置試管內待測。具體檢測步驟取包被有抗Dkk-l單克隆抗體的微孔反應板，加50^1Dkk-l標準品或血清樣品至各自的微孔中，每個標準品和樣品必須使用新的吸頭，加100|lU反應緩沖液，室溫振蕩反應1小時。用洗滌液洗滌4次后再加200|il以反應緩沖液作稀釋劑，1:100稀釋的銪標記的抗Dkk-l抗體，25-37'C振蕩反應1小時，用洗滌液洗滌6次，加增強液20(^1振蕩5分鐘后測量熒光強度，從標準曲線計算樣品中的Dkk-l含量。結果示健康體檢人員為U.5ng/ml士6.9ng/ml，直結腸癌患者為35.3ng/ml±12.1ng/ml，經t檢驗分析，pO.OOl。以20ng/ml為臨界值，陽性率為31%。權利要求1、一種檢測Dkk-1的時間分辨熒光免疫分析方法，其包括下列步驟①固相抗體制備將抗Dkk-1單克隆抗體用緩沖液稀釋至1～10mg/L作為包被液，包被反應板，并用封閉液封閉。②銪離子標記抗體制備選用抗Dkk-1多克隆抗體進行Eu3+標記，抗Dkk-1多克隆抗體與Eu3+標記物Eu3+-DTTA的重量比為1∶0.2～0.5。③測定方法在步驟①制得的具有固相抗體的反應板上，每孔依次加入Dkk-1標準品或待測樣品，加入反應緩沖液室溫振蕩反應，洗滌液洗滌后加入用反應緩沖液以體積比為1∶100稀釋的步驟②制得的標記抗體100-200ul；室溫振蕩反應后用洗滌液洗滌，最后加入增強液進行熒光檢測。2、如權利要求1所述的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于步驟①中所述的緩沖液為50mmol/L、pH9.6的Na2COrNaHC03緩沖液，96或48孔微孔板加入10(^1包被液，4。C放置過夜，棄去包被液，用洗滌液沖洗4次，加200|iil含0.2w/v。/。明膠和2w/v。/。蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4'C放置過夜，棄去封閉液，真空抽干。3、如權利要求1所述的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于步驟③中所述的反應緩沖液為含有8mmol/LNaCl、0.1w/v。/。明膠、0.2w/v%IgG、50|amol/L二乙烯三胺五乙酸、O.lml/LTween-80和0.1w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。4、如權利要求1所述的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于步驟③中所述的洗滌液為含有14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。5、如權利要求1~4任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的Dkk-l標準品濃度分別為Ong/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml。6、一種檢測Dkk-l的時間分辨熒光免疫分析的試劑盒，其包括包被有抗Dkk-l單克隆抗體的固相抗體微孔板、反應緩沖液、洗滌液、El^+標記的抗Dkk-l多克隆抗體、增強液和Dkk-l標準品。7、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的包被抗Dkk-l單克隆抗體的固相抗體微孔板可以通過下列方法制得用50mmol/LpH9.6Na2COrNaHC03的緩沖液將抗Dkk-l單克隆抗體稀釋至110mg/L作為包被液，96或48孔微孔板加入100pl包被液，4"C放置過夜，棄去包被液，用洗滌液沖洗4次，加200^1含0.2w/v。/。明膠和2w/v。/。蔗糖的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液封閉，4"放置過夜，棄去封閉液，真空抽干。8、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的反應緩沖液為含有8mmol/LNaCl、0.1w/v。/。明膠、0.2w/v%IgG、50|amol/L二乙烯三胺五乙酸、O.lml/LTween-80和0.1w/v%NaN3的50mmoI/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。9、如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2w/v%NaN3的50mmol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液。10、如權利要求6~10任一項所述的試劑盒，其特征在于所述的增強液為含有15lumol/L(3-萘甲酰三氟丙酮、50|iimol/L三正辛基氧化膦和lml/L曲拉通X-100的pH3.2的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測Dkk-1的時間分辨熒光免疫分析方法及其試劑盒。該方法包括下列步驟①固相抗體制備；②銪離子標記抗體制備；③測定方法基于雙抗體夾心的免疫反應。本發(fā)明檢測Dkk-1具有較高的靈敏度、特異度及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動化，可提高臨床檢驗結果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結果的可靠性。文檔編號G01N33/68GK101398433SQ200710046368公開日2009年4月1日申請日期2007年9月25日優(yōu)先權日2007年9月25日發(fā)明者盛世樂,謝秀蘭,鋼黃申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院