專利名稱：：一種快速測定青霉素?；该富畹姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶活的檢測方法。
背景技術(shù)：
：為了解決病菌對(duì)青霉素等抗生素抗藥性的提高，人們發(fā)明了人工半合成青霉素等人工抗生素。自從青霉素?；阜ㄋ庵迫?-APA和7-ADCA取代傳統(tǒng)的化學(xué)裂解工藝以來，青霉素酰化酶法成為了目前半合成-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中如頭孢霉素和羥氨芐青霉素的主要生產(chǎn)方法，青霉素?；敢矎拇说巧狭酥匾墓I(yè)舞臺(tái)。至今國內(nèi)工廠在裂解生產(chǎn)中使用的固定化青霉素?；高€有一半是進(jìn)口商品，所以國內(nèi)研究生產(chǎn)提供青霉素酰化酶是十分重要的。目前世界上用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化青霉素G?；钢饕獊碜源竽c桿菌和巨大芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)。對(duì)它的酶活測定的方法也在不斷地摸索改進(jìn)中。下面就介紹一下一般青霉素?；傅臏y定方法。最初，人們以原料青霉素作為底物，酶解得到產(chǎn)物脫苯乙酰生成6-氨基青霉垸酸(6-APA)，測定單位時(shí)間單位體積6-APA的生成量來得到酶活。為了檢測到6-APA，人們發(fā)展了不同的方法如PDAB法等。但馬上都發(fā)現(xiàn)了底物青霉素對(duì)各種檢測產(chǎn)物6-APA的方法都有不可忽略的干擾，測量前必須抽提掉青霉素。這樣這種酶活測定的方法不僅步驟繁瑣，而且靈敏度很低。90年代，有人發(fā)展了熒光檢測法，用熒光胺結(jié)合6-APA。此方法可以極大地降低底物青霉素干擾，并同時(shí)因?yàn)橛脽晒鈾z測使靈敏度提高104倍?？墒嵌嚯念愇镔|(zhì)和熒光胺結(jié)合影響嚴(yán)重，需調(diào)節(jié)PH至4才能消除影響。這樣使酶活測定環(huán)境大大改變，令它的準(zhǔn)確性和可靠性降低。事實(shí)上在青霉素法使用不久后人們便找到了一種替代青霉素的底物6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)，產(chǎn)物為6-硝基-3-氨基苯甲酸。這種方法不僅解決的底物干擾的問題，而且產(chǎn)物本身是可檢測的淡黃色物質(zhì)，可在波長405nm下用分光光度計(jì)檢測濃度。如此，簡化了測量步驟，并使靈敏度較PDAB法上升了三個(gè)數(shù)量級(jí)以上(約5000倍)。這種方法就是至今仍為主要運(yùn)用的NIPAB法。NIPAB底物較昂貴，并且它的酶活反應(yīng)不是以青霉素本身為底物，所以很多研究特別是生產(chǎn)上考慮到節(jié)約成本等仍使用青霉素法。要申請(qǐng)的本專利就是基于NIPAB的發(fā)展。以下是傳統(tǒng)的NIPAB法，步驟較繁瑣發(fā)酵液離心去上清保留沉淀，沉淀細(xì)胞用磷酸緩沖液重懸后采用超聲波、高壓或凍融等細(xì)胞破碎法破碎細(xì)胞，離心取上清。取上述上清液20u1加入980u150mmol/LpH7.5的磷酸緩沖液中，37。C保溫。再加入lml已在37。C下預(yù)熱的0.9mg/mlNIPAB溶液，精確反應(yīng)4min，加入ltrtl乙醇終止反應(yīng)。取上述已終止的反應(yīng)液在分光光度計(jì)波長405mn下檢測吸光值。酶活力定義在上述反應(yīng)條件下，1min水解1ymol的NIPAB所需青霉素?；笧?個(gè)酶活力單位U。酶的菌體比活力定義為每升每ODe。。菌體所具有的酶活力單位。酶活力計(jì)算公式106XA405XV0酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(1)其中t:反應(yīng)時(shí)間(min)p:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率V:反映體系總體積(ml)樣品光密度讀數(shù)于空白樣品光密度讀數(shù)差VI:酶液體積(ml)比色皿厚度默認(rèn)為1,單位為cm上述方法步驟繁瑣，給操作帶來極大不便。通常實(shí)驗(yàn)室中為了快速測定少量樣品會(huì)不破細(xì)胞直接測酶活，但試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明無論有毒性的三氯乙酸還是乙醇都難以徹底終止反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的就是為微生物發(fā)酵生產(chǎn)的青霉素?；柑峁┖啽憧旖莸拿富顪y定方法。本發(fā)明針對(duì)原來的NIPAB方法步驟繁瑣的問題，從即可簡化步驟，又不影響檢測效果的角度出發(fā)，提供了一種新的快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步驟-a)取青霉素?；富蚬こ叹l(fā)酵液用pH7.4—7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋10-50倍；h)用pH7.4—7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液配制NIPAB溶液；c)取步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液先后加入酶標(biāo)板，控制反應(yīng)體系中NIPAB的量為過量；d)在37°C，用酶標(biāo)儀振動(dòng)混勻下，在405nm處動(dòng)態(tài)曲線方式連續(xù)檢測吸光度4一5分鐘，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)獲得動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線；e)動(dòng)態(tài)曲線減去空白板與空白樣后線性回歸得斜率k與截距b。f)計(jì)算酶活酶活力(U/L)=_，其中酶活力單位為U/L。pXV,其中p:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率V。反映體系總體積，單位為mlV1:酶液體積，單位為ml上述酶活力計(jì)算公式由酶活力基本計(jì)算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)變換而來，其中，A4。5/t就是單位時(shí)間內(nèi)吸光值的變化，即酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)處理得到的k。上述步驟a中，取青霉素?；富蚬こ叹l(fā)酵液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋時(shí)，高密度罐發(fā)酵一般稀釋50倍，搖瓶發(fā)酵按生長密度一般為10-50倍；優(yōu)選的，上述步驟a和b中所述緩沖液為pH7.5的磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的，上述步驟d用酶標(biāo)儀連續(xù)檢測中，相鄰兩次檢測的時(shí)間間隔為0.5分鐘。上述步驟c中需控制反應(yīng)體系中NIPAB的量為過量的原因是酶量一定時(shí)，酶反應(yīng)隨著底物濃度不斷增加到一定程度將表現(xiàn)為0級(jí)反應(yīng)，即酶反應(yīng)速率不再受底物濃度的影響。因此在底物遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的情況下，酶反應(yīng)速率對(duì)酶濃度呈線性關(guān)系。一般而言，以反應(yīng)液的總體積為基礎(chǔ)計(jì)，當(dāng)發(fā)酵酶液被稀釋約50倍時(shí)，NIPAB的濃度在0.65mg/inl以上即可保證達(dá)到整個(gè)反應(yīng)過程中為過量，0.9mg/ml大約為室溫下去離子水作溶劑的飽和濃度。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容并結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員可以靈活地控制酶液的稀釋倍數(shù)、NIPAB溶液的濃度以及兩者混合的比例，從而達(dá)到確保NIPAB過量的目的。當(dāng)然，為了方便控制，可如優(yōu)選的實(shí)施例那樣，步驟b中，配制NIPAB溶液的濃度為0.9mg/ml;步驟c中，將步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液以等體積的量先后加入酶標(biāo)板。此外，本發(fā)明還進(jìn)行了溫度對(duì)酶活檢測數(shù)值影響的研究，給出了室溫檢測時(shí)的校正系數(shù)，以使檢測更為方便。其中，當(dāng)上述步驟d為在室溫下，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測時(shí)，步驟f計(jì)算酶活酶活的公式就調(diào)整為106XkXV0X1.2酶活力二pXVj其中酶活力單位為U/Lp:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率V。反映體系總體積，單位為mlVl:酶液體積，單位為ml。由于本發(fā)明最大的特點(diǎn)在于不終止酶反應(yīng)，而是測定一個(gè)動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線，因此命名為動(dòng)態(tài)法測青霉素?；该富睢１景l(fā)明從即簡化操作步驟又保證準(zhǔn)確性的角度出發(fā)來考慮新的青霉素?；该富顧z測方法，具體思路及原理如下省去最為繁瑣的破碎細(xì)胞步驟，這是因?yàn)镹IPAB可以出入酶所在的周質(zhì)空間，細(xì)胞不破碎也不會(huì)影響NIPAB與酶的反應(yīng)。特別對(duì)于不久前出現(xiàn)的直接固定化周質(zhì)空間中含有青霉素酰化酶的細(xì)胞來生產(chǎn)半合成抗生素的技術(shù)來說，有重要的意義。此外，由于在實(shí)際檢測過程中樣品往往需要冰箱保存，凍融對(duì)細(xì)胞破損嚴(yán)重，簡單的離心提取對(duì)測得的酶活損失影響很大，因此也考慮省去了離心等不必要的操作步驟。本發(fā)明中，動(dòng)態(tài)法是解決簡化步驟后保證(甚至提高)測量準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。采用動(dòng)態(tài)法來測定酶活是由于經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，如不破碎細(xì)胞而仍采用終止法，由于乙醇對(duì)進(jìn)出細(xì)胞終止反應(yīng)的效果很不理想，特別是在高密度大規(guī)模培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液，4min精確計(jì)時(shí)的反應(yīng)時(shí)間就根本無法保證。并且試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分、細(xì)胞組織碎片等對(duì)吸光度數(shù)值影響極大，終點(diǎn)法下任何樣品液預(yù)處理步驟的省略都將對(duì)酶活值得測量帶來不可忽率的偏差。而采用"動(dòng)態(tài)法"后，就可以省略終點(diǎn)法中大部分不必要的純化預(yù)處理過程，不僅使雜質(zhì)影響消失，還提高了酶活測量值的可靠性。采用動(dòng)態(tài)法測酶活省略了樣品處理過程，對(duì)測量過程卻更復(fù)雜了。而酶標(biāo)儀的功能對(duì)解決青霉素酰化酶活測量上遇到的問題十分適合。因此本發(fā)明中進(jìn)一步采用動(dòng)態(tài)法結(jié)合酶標(biāo)儀從而實(shí)現(xiàn)了簡化檢測步驟，提高檢測準(zhǔn)確度的目的。研究發(fā)現(xiàn)，使用酶標(biāo)儀試驗(yàn)在原本終點(diǎn)法的4一5分鐘內(nèi)，酶活曲線線性關(guān)系良好，可用線性回歸計(jì)算得曲線斜率值，從而計(jì)算獲得酶活。改進(jìn)后方案比傳統(tǒng)的NIPAB法更適用于高密度發(fā)酵生產(chǎn)的使用酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)曲線法測青霉素?；该富钕卤頌楸景l(fā)明與以往檢測青霉素?；该富罘椒ǖ目偨Y(jié)和比較:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>總體來說，本發(fā)明的方法步驟簡單，準(zhǔn)確度高，節(jié)約成本，且適合檢測高密度發(fā)酵生產(chǎn)的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推廣價(jià)值。圖h實(shí)施例2的動(dòng)態(tài)曲線圖圖2:實(shí)施例6動(dòng)態(tài)法測溫度對(duì)酶活的影響圖圖3:實(shí)施例6終點(diǎn)法測溫度對(duì)酶活的影響圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例l標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和斜率p值的確定。NIPAB法在波長405nm下檢測的是它的酶解產(chǎn)物緒BA(5-氨基_6-硝基苯甲酸)的吸光值，因此先繪制標(biāo)樣ANBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以ANBA的濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)，A.,05為縱坐標(biāo)的曲線，為線性，可得出它的斜率P。實(shí)驗(yàn)步驟-a)取ANBA標(biāo)準(zhǔn)品用50mmol/LPH7.5磷酸鉀鹽緩沖液分別稀釋到10mmol/L、20mmol/L、40,1/L、50,1/L、60,1/L和80腦1/L。b)以上每種濃度分別置適量于一試管中，共有1——6號(hào)試管空白管為0號(hào)，為50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液。c)上述0——6號(hào)管置于37。C恒溫。然后用721分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀在405nm波長下檢測吸光值，記錄。d)以ANBA濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作圖，并線性回歸求得相關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得P值為8976。實(shí)施例2構(gòu)建大腸桿菌青霉素酰化酶基因工程菌DH5a/pKKFPGA(構(gòu)建方法由《糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；冈诖竽c桿菌中組成型表達(dá)及分離純化》，《生物工程學(xué)報(bào)》20巻第5期，736~740公開)，其宿主菌是DH5a(supE44，△lacU169(*80lacZ△M15)，hsdR17，recAl，endAl'gyrA96，thi-1,reAl)。質(zhì)粒pKKCAII，Pkk235衍生質(zhì)粒，不含laciq等位基因，表達(dá)為組成型。采用不同條件高密度培養(yǎng)上述大腸桿菌青霉素?；富蚬こ叹M(jìn)行對(duì)照。重組大腸桿菌霉素酰化酶基因工程菌的發(fā)酵周期為48h，發(fā)酵溫度28'C，500ml搖瓶發(fā)酵220rpm。不同條件分別為發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0.5mMCu"、含有0.5m顧i+以及不含有這兩種離子的三種條件。分別用不破碎細(xì)胞并不離心操作下的終態(tài)酶活測量方法和用酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)曲線測量法測酶活比較。(注數(shù)據(jù)值只用注意縱向比較，即不同方法間的差異，u即為U/L)1.不破碎細(xì)胞并不離心操作下的終態(tài)酶活測量方法測酶活試驗(yàn)步驟a)取不同條件下青霉素?；赴l(fā)酵液9個(gè)樣品，編號(hào)為1一9號(hào)；b)1—9號(hào)樣品分別用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液稀釋50倍；c)取上述步驟獲得的9個(gè)混合液各lml以及作空白管的pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液lml分別置于10個(gè)10ml試管中放在37。C水浴鍋中恒溫；d)把足量(15m1-20ml)用50腿ol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液配制好的0.9mg/mlNIPAB溶液同樣置于37t水浴鍋中預(yù)熱；e)準(zhǔn)備好后開始計(jì)時(shí)，快速依次在1—9號(hào)試管以及空白管里各加入lml步驟d)處理的NIPAB溶液；f)精確計(jì)時(shí)到4分鐘時(shí)，快速依次在1—9號(hào)試管及空白管里各加入lml90X(質(zhì)量百分比)乙醇來終止反應(yīng)；g)終止后立刻用721分光光度計(jì)在405nm下依次測得1—9號(hào)及空白管的吸光值，樣品管減去空白管值即為公式(1)中所需A405，計(jì)算得酶活。得到最終酶活數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)曲線測量法測酶活實(shí)驗(yàn)設(shè)備ThermoLabsystems公司的MultiskanMK3型酶標(biāo)儀實(shí)驗(yàn)步驟-a)按使用說明對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，設(shè)置孵育時(shí)間為1分鐘，孵育溫度37'C。孵育后設(shè)為振蕩步驟，采用動(dòng)態(tài)檢測，檢測時(shí)間間隔設(shè)為0.5分鐘，連續(xù)檢測4分鐘；b)取1—9號(hào)發(fā)酵液用50rmnol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液稀釋50倍；c)取步驟a獲得的混合液與作空白管的pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液各lOOu1預(yù)熱至37。C后依次加入96孔酶標(biāo)板；d)在加樣的IO個(gè)孔內(nèi)快速加入已經(jīng)在37t:預(yù)熱的用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液配制的0.9mg/mlNIPAB各100y1;e)后把96孔板放入儀器，開始反應(yīng)并自動(dòng)測量，結(jié)束后獲得以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)的動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線；f)動(dòng)態(tài)曲線減去空白板掃描值后線性回歸得斜率k與截距b，用公式(1)計(jì)算得酶活值。表1是酶標(biāo)儀測得原始數(shù)據(jù)表,動(dòng)態(tài)曲線參見圖1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖1以"1組"為例，線性回歸得到公式顯示于上方。表2是用公式(1)計(jì)算最終得到的酶活數(shù)據(jù)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.不破碎細(xì)胞并不離心操作下的終態(tài)酶活測量方法和用酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)曲線測量法測酶活比較動(dòng)態(tài)法總酶活總低于不破碎細(xì)胞并不離心操作下的終點(diǎn)法，這主要由于終點(diǎn)法中，乙醇在規(guī)定4min內(nèi)無法徹底終止反應(yīng)以及非酶反應(yīng)對(duì)吸光度的影響造成。截距酶活定義為反應(yīng)時(shí)間為O時(shí)的酶活值，不隨時(shí)間變化而變化。之所以在反應(yīng)時(shí)間為0時(shí)也會(huì)出現(xiàn)酶活是由于非酶反應(yīng)因素影響吸光值，從而在代入用吸光值推算酶活的公式后會(huì)獲得對(duì)應(yīng)的酶活值。從實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，樣品不做預(yù)處理特別是酶活低時(shí)非酶反應(yīng)因素對(duì)產(chǎn)物所在波長的吸光值影響巨大，他們不隨時(shí)間變化而變化。本方法中，截距酶活的存在并不會(huì)影響酶活值的準(zhǔn)確性。實(shí)施例3利用動(dòng)態(tài)法測青霉素酰化酶酶活來研究測量中對(duì)吸光值產(chǎn)生影響的因素首先對(duì)所有會(huì)對(duì)吸光值產(chǎn)生影響的因素對(duì)應(yīng)的酶活值進(jìn)行設(shè)定可溶性培養(yǎng)基中胞外的酶其為某種機(jī)制少量分泌到胞外的酶，還有細(xì)胞凍融等原因破碎，到培養(yǎng)基中的酶，其酶活設(shè)為ul;可溶性培養(yǎng)基其酶活設(shè)為ua。去上清物質(zhì)胞內(nèi)酶其酶活設(shè)為U2;菌體及不可溶培養(yǎng)基其酶活設(shè)為ub。按上述描述，在動(dòng)態(tài)法測量中，酶活u的數(shù)值為ul+u2，截距酶活的數(shù)值為ua+ub同實(shí)施例2中的樣品1—9號(hào)，各取10ml，離心機(jī)3000rpml0分鐘后去除上清液，小心洗滌后用pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液重懸，如是三次。再用實(shí)施例2中動(dòng)態(tài)法的操作步驟用酶標(biāo)儀進(jìn)行測量，結(jié)果如表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上表中胞內(nèi)酶活即u2，去上清截距酶活即為ub。這樣結(jié)合表2，計(jì)算可得:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述試驗(yàn)結(jié)果表明，酶大部分在周至空間中，會(huì)有一些由于凍融破壁等原因到胞外。菌體等不溶物質(zhì)對(duì)波長405nm淺黃色的吸光值影響最大，培養(yǎng)基等的影響也很大，它們?cè)诘兔富顣r(shí)(如搖瓶短時(shí)培養(yǎng)及組成型培養(yǎng)等情況)比酶反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)吸光的貢獻(xiàn)更大。實(shí)施例4不離心去除雜質(zhì)及不破碎細(xì)胞的簡略終點(diǎn)法中乙醇終止效果的研究以下實(shí)驗(yàn)是對(duì)于不離心去除雜質(zhì)及不破碎細(xì)胞的簡略終點(diǎn)法中乙醇終止效果的研究。同一個(gè)樣品在不同乙醇濃度的終止下終止效果隨時(shí)間的變化。實(shí)驗(yàn)步驟基本同實(shí)例2，變化處與結(jié)果于表5列出表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果顯示不同濃度的乙醇的終止效果有差別，且隨時(shí)間波動(dòng)較明顯。開始時(shí)由于不能終止反應(yīng)酶活上升，終止時(shí)間過長后由于溫度等環(huán)境因素顯著變化以及產(chǎn)物分解等原因酶活有所下降?？梢钥闯鲆掖冀K止效果不良會(huì)帶來顯著誤差，且大批量樣品測量時(shí)手動(dòng)終止反應(yīng)將很難精確控制時(shí)間。但比較實(shí)例3可以發(fā)現(xiàn)乙醇終止效果不良相對(duì)于雜質(zhì)影響程度要小許多，因此傳統(tǒng)終態(tài)法在離心去除雜質(zhì)的少量樣品測量中可以將誤差降到很低。實(shí)施例5傳統(tǒng)方法與新動(dòng)態(tài)法的比較本實(shí)例為傳統(tǒng)方法與新動(dòng)態(tài)法的比較，結(jié)果顯示新法在省略大部分繁瑣的樣品處理過程后仍保持著很高的精確度，完全克服了雜質(zhì)干擾。某一批培養(yǎng)的發(fā)酵液樣品分別采用如下傳統(tǒng)和動(dòng)態(tài)法兩種不同的處理、測量方法進(jìn)行測量。傳統(tǒng)法中的破碎細(xì)胞本實(shí)例中使用兩種方法凍融法結(jié)合溶菌酶處理，超聲波破碎。傳統(tǒng)法步驟a)取發(fā)酵液10ml離心6000rpm15min，去上清保留沉淀；b)沉淀細(xì)胞用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液重懸后采用超聲波、凍融等細(xì)胞破碎法破碎細(xì)胞，離心6000rpm15min取上清；c)取上述上清液20u1加入980y150mmol/LpH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液中，37°C保溫。再加入lml已在37。C下預(yù)熱的0.9mg/mlNIPAB溶液，精確反應(yīng)4min，加入lml乙醇終止反應(yīng)；d)空白管用lml50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液代替稀釋的發(fā)酵液，其他操作相同；e)取上述已終止的反應(yīng)液在分光光度計(jì)波長405nm下檢測吸光值。按上述步驟得到超聲波與凍融法破碎細(xì)胞處理的樣品的吸光值分別為0.024、0.030，按公式計(jì)算的酶活為100u和125u。動(dòng)態(tài)法步驟同實(shí)例2。此外，把前述傳統(tǒng)法樣品處理方法處理的樣品也使用酶標(biāo)儀動(dòng)態(tài)測量計(jì)算，結(jié)果一并列出，如下表。酶標(biāo)儀所得動(dòng)態(tài)曲線數(shù)據(jù)處理同實(shí)例2。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>不同于傳統(tǒng)方法，本實(shí)例把破碎后離心操作所得的上清與沉淀組分都測定了酶活，同列于上表。此表顯示的酶活與前傳統(tǒng)法現(xiàn)實(shí)的酶活吻合:傳統(tǒng)法略低于動(dòng)態(tài)法，可能緣于處理過程中的產(chǎn)物損失；破碎可能不夠徹底，離心沉淀中仍有少量酶活；超聲波破碎酶活稍低，可能是因?yàn)樘囟ǖ牟僮鲹p失產(chǎn)物如超聲波產(chǎn)生的高溫；截距酶活顯著，特別是不溶物沉淀，與前述實(shí)例中的情況相符。本實(shí)例驗(yàn)證了新動(dòng)態(tài)法與傳統(tǒng)方法的測量結(jié)果相符，是可靠的。實(shí)施例6溫度對(duì)酶活檢測方法的影響試驗(yàn)由于溫控、振動(dòng)設(shè)備等不是酶標(biāo)儀的必需配件，屬于附件，所以很多酶標(biāo)儀并不具有溫控等裝置。其中溫控對(duì)酶反應(yīng)測酶活非常重要的，酶反應(yīng)速率受溫度顯著影響?？紤]到這個(gè)，用酶標(biāo)儀在不同的溫度下測酶活探究規(guī)律。將青霉素?；富蚬こ叹?同實(shí)施例2)發(fā)酵培養(yǎng)。5L罐發(fā)酵，裝液量1L，接種量10%。通氣量0.5VVM，培養(yǎng)溫度28。C，溶氧保持在30%以上。發(fā)酵周期為72h，此為48h取樣。取三個(gè)平行樣編號(hào)為a、b、c，分別在21。C、27°C、32°C、37°C、42。C和47。C下測酶活，步驟通實(shí)施例2中的動(dòng)態(tài)法的試驗(yàn)步驟。所得數(shù)據(jù)以溫度rc)為橫坐標(biāo)、酶活(U/L)為總坐標(biāo)作圖，如圖2可以看出指數(shù)型曲線在37'C前接近線性，變化幅度較小，從室溫到37'C增長小于并接近20%的酶活值。后又用某一批發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液樣品，用終點(diǎn)法使用恒溫水浴鍋控溫，分別在17°C、22°C、27°C、32°C、37°C、42°C、47'C和52"C下721分光光度計(jì)測酶活。所得數(shù)據(jù)用公式(1)算得酶活，同樣以溫度(°C)為橫坐標(biāo)、酶活(U/L)為總坐標(biāo)作圖，得圖3。溫度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響研究用終態(tài)一點(diǎn)法和動(dòng)態(tài)法的得到的結(jié)論是相符的，酶的最適溫度在45。C左右。而在37。C前保持著近似線性關(guān)系，從室溫到37^酶活上升20%。據(jù)此獲得室溫檢測的酶活與37'C下測得酶活的校正系數(shù)酶活(37'C)=1.2x室溫酶活。參考上述實(shí)驗(yàn)，對(duì)于沒有溫控裝置的酶標(biāo)儀，在實(shí)驗(yàn)室于室溫下測得的酶活值可以乘上1.2這個(gè)校正系數(shù)，對(duì)于室溫以外的溫度也可以乘上相應(yīng)的系數(shù)以減小誤差。對(duì)于15'C及以下的低溫和37°C以上高溫校正系數(shù)不適用乘以校正系數(shù)的方法。權(quán)利要求1.一種快速測定青霉素?；该富畹姆椒?，包括下列步驟a)取青霉素?；富蚬こ叹l(fā)酵液用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)；b)用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液配制NIPAB溶液；c)取步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液先后加入酶標(biāo)板，控制反應(yīng)體系中NIPAB的量為過量；d)在37℃，用酶標(biāo)儀振動(dòng)混勻下，在405nm處動(dòng)態(tài)曲線方式連續(xù)檢測吸光度4-5分鐘，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)獲得動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線；e)動(dòng)態(tài)曲線減去空白板與空白樣后線性回歸得斜率k與截距b；f)計(jì)算酶活其中酶活力單位為U/Lp標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率V0反映體系總體積，單位為mlV1酶液體積，單位為ml。2.如權(quán)利要求1所述快速測定青霉素?；该富畹姆椒?，其特征在于，步驟a和b中所述緩沖液為pH7.5的磷酸鹽緩沖液。3.如權(quán)利要求l所述快速測定青霉素?；该富畹姆椒?，其特征在于，步驟b中所述NIPAB溶液的濃度為0.9mg/ml，步驟c中所述步驟a獲得的混合液與步驟b獲得的溶液以等體積的量先后加入酶標(biāo)板。4.如權(quán)利要求1所述快速測定青霉素?；该富畹姆椒ǎ涮卣髟谟?，所述步驟d為在室溫下，用酶標(biāo)儀振動(dòng)混勻下，在405nm處動(dòng)態(tài)曲線方式連續(xù)檢測吸光度4一5分鐘，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)獲得動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線；所述步驟f中，計(jì)算酶活的公式為106XkXV0X1.2酶活力=。<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>5.如權(quán)利要求1或2或3所述快速測定青霉素?；该富畹姆椒ǎ涮卣髟谟?，步驟d中，用酶標(biāo)儀動(dòng)力學(xué)檢測時(shí)，相鄰兩次檢測的時(shí)間間隔為0.5分鐘。全文摘要本發(fā)明涉及酶活的檢測方法，公開了一種快速測定青霉素?；该富畹姆椒?，在不破碎細(xì)胞的情況下使用酶標(biāo)儀采用動(dòng)態(tài)法檢測酶活，獲得動(dòng)態(tài)反應(yīng)曲線，用動(dòng)態(tài)曲線線性回歸后獲得的斜率及截距計(jì)算酶活。此外，還對(duì)溫度對(duì)酶活測定的影響作了簡單研究，并設(shè)置了修正系數(shù)方便于室溫的快速測定。本發(fā)明的方法步驟簡單，準(zhǔn)確度高，節(jié)約成本，且適合檢測高密度發(fā)酵生產(chǎn)的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推廣價(jià)值。文檔編號(hào)G01N33/543GK101201356SQ20071004811公開日2008年6月18日申請(qǐng)日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日發(fā)明者炬儲(chǔ),莊英萍,張嗣良,施曉疌,王永紅,袁中一申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)