專利名稱：檢測痕量辣根過氧化物酶的分光光度法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測痕量辣根過氧化物酶的方法，特別是一種用陽離子表面活 性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的方法。
背景技術：
辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,簡稱HRP)是一種非常重要的過 氧化物酶，在分析化學、環(huán)境科學、臨床化學、有機合成等領域均有重要的應 用。測定游離HRP和各種HRP標記中HRP的含量可以間接地測定體液和其他 組織液中抗體或抗原的量，對于免疫學及組織化學的研究以及臨床疾病的診斷 具有十分重要的意義。
基于HRP催化H202氧化無色的苯胺類、苯酚類衍生物，生成具有顏色、 熒光或電化學活性的醌式或偶氮類二聚或多聚產物，可用分光光度法、熒光法 或電化學方法檢測HPR活性和H202 ，并廣泛用于酶聯(lián)免疫和酶分析。
現(xiàn)有的測定HRP活性的方法主要有分光光度法，熒光光度法、化學發(fā)光法， 以及酶聯(lián)免疫吸附分析法、酶聯(lián)熒光免疫分析法、電化學酶聯(lián)免疫分析法等。 其中伏安酶聯(lián)免疫分析法靈敏度較高，但操作比較繁瑣。上述方法主要存在兩 個缺點第一，所用底物多為苯胺類、苯酚類衍生物，穩(wěn)定性較差，見光或空 氣極易被氧化，更為不足的是苯胺類底物具有致癌作用，使它的應用受到限制。 第二， HRP是一種對氫供體底物(如酚、胺、抗壞血酸等)缺乏特異性氧化的 酶，可以催化氧化多種底物，因而底物類似物對測定也有干擾。因此，研究HRP 的新底物和新方法具有重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術的不足而提供一種用陽離子表面活性劑締 合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的方法。
本發(fā)明目的采用如下技術方案來實現(xiàn)
本發(fā)明研究了陽離子表面活性劑溴代十四烷基吡啶(TPB) -HRP-KI-H202 體系的光度法特征及其分析應用。在酸性條件下，HRP可以催化11202與過量的 r反應生成I3、 13—與陽離子表面活性劑TPB等形成締合物微粒(TPB-I3) n，該
締合物微粒存在吸收效應，HRP濃度在一定范圍內與TPB體系304nm處的吸光 度呈線性關系。據此建立一種靈敏度高、選擇性好、簡便快速測定痕量HRP的 光度法。
本發(fā)明采用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化 物酶。具體檢測方法包括如下步驟
1. 在5.0mL的具塞試管中，依次加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI和HRP;
2. 在步驟l的具塞試管中再加入11202，搖勻；
3. 將步驟2的試管置于溫水浴中，再加入TPB，搖勻，用蒸餾水定容至2.5mL
4. 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上掃 描得到體系的吸收光譜，以不加HRP測得的吸收強度為空白；
5. 將上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計測定304nm 處的吸光度，繪制標準工作曲線，根據標準曲線Aabs=0.0801c+0.1252， R2=0.9981，即可求得辣根過氧化物酶在0.4 3.2ng/mL范圍內的濃度。
步驟1所述的具塞試管中，依次加入的HAc-NaAc緩沖溶液，其pH值為 4.6 5.2，體積0.2 0.5mL，加入的KI濃度為4X l(T3 mol/L 6X 10-3 mol/L， 加入的HRP濃度為0.1 pg/ mL，體積為10 80|iL;
步驟2所述的加入的壓02濃度為1.0X 10-5 3.0X l(T5 mol/L;
步驟3所述的水浴溫度為20 30°C ，水浴反應時間為25 50min ,TPB濃度 為2.0X 10國5 6.0X l(T5mol/L;
步驟5所述的測定波長為304nm。
本發(fā)明的原理是在偏酸性的HAc-NaAc緩沖溶液中，當有11202存在時， HRP可催化H202產生'OH， 'OH可氧化過量的r生成l2，過量的1—與12可結合 形成V，而TPB可與V結合形成(l3——TPB)n締合微粒。用NaNo-ZS90納米粒 度與Zeta電位分析儀對此微粒進行分析表明，該微粒的平均粒徑在700 800nm 范圍內。因該微粒有較大的粒徑可產生吸收效應，而該粒子大小與HRP的濃度 有關，據此，可以建立間接測定HRP活力的新方法。其主要反應如下
<formula>formula see original document page 4</formula>i2 + r -I3— (3)
nTPB十 nl3- - (I3-—TPB)n (4)
本發(fā)明的優(yōu)點是
1: KI作為HRP的氫供體底物，該試劑無毒易得；
2: HRP催化氫受體底物H202具有特異性，本方法利用HRP催化壓02氧 化KI的反應，測定HRP活性，方法具有選擇性好，靈敏度高(達pg/mL)的特 占.
3:設備簡單，僅需一臺紫外可見分光光度計和恒溫水浴槽； 4:操作簡便，試劑成本低廉。


圖1為本發(fā)明實施例KI-HRP-H202-TPB體系的紫外可見吸收光譜圖，其中 a: pH4.6- 4.80X 10-3 mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H202- 4.00X1(T5 mol/L TPB; b: pH4.6- 4.80X 10-3 mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H202- 4.00 X l(T5 mol/L TPB- 0.40ng/ mL HRP; c: pH4.6- 4.80 X l(T3 mol/L KI-1.51 X 10-5 mol/L H202- 4.00 X 10-5 mol/L TPB- 2.40 ng/ mL HRP; d: pH4.6- 4.80X l(T3mol/L KI-1.51 X l(T5 mol/L H2Or 4.00 X 10-5 mol/L TPB- 3.20 ng/ mL HRP。
具體實施例方式
下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步描述
采用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的 方法包括以下步驟
1. 在5.0 mL的具塞試管中，依次加入pH為4.6的HAc-NaAc緩沖溶液 0.2mL， 4.80X l(T3 mol/L的KI， 0.1 jug/ mL 10 80pL的HRP;
2. 在步驟1的溶液中加入1.51 Xl(T5 mol/LH202，搖勻；
3. 在25。C水浴30min后，再加入4.0X l(T5 mol/L TPB，搖勻，用蒸餾水定 容至2.5mL;
4. 將上述所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上掃描得 到體系的吸收光譜，以不加HRP測得的吸光強度為空白，在304nm處，根據標 準曲線Aabs=0.0801c+0.1252, R2=0.9981，即可求得辣根過氧化物酶在0.4-3.2 ng/
mL范圍內的濃度。
圖中KI-HRP-H202-TPB體系的紫外光譜圖表明(TPS-I3) n締合微?？僧a 生吸收效應，最大吸收波長在304nm處，選擇在304nm處進行測量，隨著HRP 濃度的增加，該締合微粒的吸收強度增大。
雖然以上通過實例對本發(fā)明實施方式進行了描述，但本領域的技術人員應 該知道，上述僅為舉例，可以對實施方式做出多種變更和修改，本發(fā)明的范圍 僅由所附權利要求書限制。
權利要求
1.檢測痕量辣根過氧化物酶的方法，其特征是采用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征是檢測方法包括如下步驟(1) 在具塞試管中，分別加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI和HRP;(2) 在步驟l的具塞試管中再加入H202，搖勻；(3) 將步驟2的試管置于溫水浴反應，再加入TPB，搖勻，用蒸餾水定容；(4) 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上 掃描得到體系的吸收光譜，以不加HRP測得的吸光強度為空白；(5) 將上述所得溶液適量倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上 測定304mn的吸光度，根據所得實驗結果繪制標準工作曲線，根據該曲線， Aabs=0.0801c+0.1252， R2=0.9981 ，即可求得辣根過氧化物酶在0.4 3.2 ng/ mL范 圍內的濃度。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征是步驟l所述的具塞試管為5.0mL， 加入的HAc-NaAc緩沖溶液，pH值為4.6 5.2，體積0.2~0.5mL，加入的KI濃 度為4 X l(T3 mol/L ~6 X l(T3 mol/L，加入的HRP濃度為0.1 pg/ mL，體積為10 80pL。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征是步驟2所述的加入的H202濃度為1.0X10-5 3.0X10-5mol/L。
5. 如權利要求2所述的方法，其特征是步驟3所述的水浴溫度為20 30 。C，水浴反應時間為25 50min， TPB濃度為2.0X 10-5 6.0X 10-5mol/L，用蒸 餾水定容至2.5ml。
6. 如權利要求2所述的方法，其特征是步驟5所述的測定波長為304nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用陽離子表面活性劑締合物微粒分光光度法檢測痕量辣根過氧化物酶的方法，它是在具塞試管中，依次加入HAc-NaAc緩沖溶液、KI、HRP和H₂O₂，搖勻后，置于溫水浴中反應，再加入TPB搖勻，定容，將所得溶液倒入石英比色皿中，置于紫外可見分光光度計上測定308nm處吸光度，根據標準曲線求得辣根過氧化物酶的濃度。該方法的優(yōu)點在于KI作為HRP的氫供體底物，無毒易得；HRP催化氫受體底物H₂O₂具有特異性，本方法利用HRP催化H₂O₂氧化KI的反應測定HRP活性，方法靈敏度高，選擇性好；設備簡單，僅需紫外可見分光光度計和恒溫水浴槽；操作簡便，試劑成本低廉。
文檔編號G01N21/25GK101201316SQ20071004997
公開日2008年6月18日 申請日期2007年9月4日 優(yōu)先權日2007年9月4日
發(fā)明者蔣治良, 紀 馬 申請人:廣西師范大學