專利名稱：采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中伏馬毒素b1含量的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及對食品和糧食作物中的 伏馬毒素B1含量的檢測，尤其是一種采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢 測食品中伏馬毒素B1含量的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
伏馬毒素(Fumonisins， FBs)是1988年由南非科學(xué)家Gelderblom 等首次從F. verticilliodes (異名串珠鐮孢F. mo"z/z/w附e Sheldon) MRC 826培養(yǎng)物中分離到的一組結(jié)構(gòu)類似物，也稱伏馬菌素、腐馬 素等。該毒素主要由串珠鐮孢及多育鐮孢(F. ; ra/z/erafww M加m^/"附a)產(chǎn)生，是以污染玉米為主的水溶性次級代謝產(chǎn)物。1989 年Laurent等從伏馬毒素中分離出兩種結(jié)構(gòu)相似的有毒物質(zhì)，分別被 命名為伏馬毒素B,(FB,)和伏馬毒素B2 (FB2)。到目前為止，己發(fā)現(xiàn) 有FB,、 FB2、 FB3、 FB4、 FA,、 FA2、 FC,、 FC2、 FC3、 FC4 、 FQ和 FP,等多種衍生物；其中，以FB,的毒性最強，污染水平最高。伏馬毒素與瘋牛病病毒、二惡英、大腸桿菌0-157和氯丙醇五種 污染物被認(rèn)為是當(dāng)今世界危及人類食品安全的五大毒素。國際上認(rèn)為 伏馬毒素是一種具有重大衛(wèi)生學(xué)意義的真菌毒素，已形成繼黃曲霉毒 素之后的又一個研究熱點。世界衛(wèi)生組織也將伏馬毒素作為近幾年需 要優(yōu)先進行研究的幾種真菌毒素之一。許多證據(jù)表明，伏馬毒素能引 起動物各種疾病，可嚴(yán)重威脅人類和動物的健康及食品安全，也被認(rèn) 為與人類食管癌的高發(fā)有關(guān)。1993年，國際癌癥研究院(The International Agency for Research on Cancer)將伏馬毒素定為2B組致 癌物質(zhì)(可能是人類致癌物)。國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)于1993對伏馬毒素的毒性進行了評 價，JECFA(FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會)于2001年第56 次會議確定伏馬毒素的急、慢性無作用劑量值為20mg/kg七w，并將 伏馬毒素B,、 B2、 B3 (單一或混合)的PMTDI (暫定每日耐受攝入 量)定為2pg/kg。由于資料不足，CCFAC (食品添加劑與污染物法 典委員)尚未規(guī)定伏馬毒素的最高限量，我國目前也沒有制定關(guān)于糧食與飼料中伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。2001年美國食品與藥物管理局 (FDA)發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素最高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2mg/kg;另外， FDA的畜牧醫(yī)學(xué)中心(CVM)也同時發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的最 高限量指導(dǎo)性公告，規(guī)定其限量范圍為5-100mg/kg;瑞士公共健康部 (Swiss Federal Office of Public Health)對伏馬毒素在玉米中的限量也 作了規(guī)定，為每克干的玉米中含有的FB,和FB2總量小于lmg;而法 國公共衛(wèi)生委員會(French Council of Public Hygiene)則推薦谷物中 的最大限量為3mg/kg。目前伏馬毒素B1的測定方法有多種，如薄層層析法(TLC)、 氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC/MS)、毛細管電泳法(CE)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)和酶 聯(lián)免疫測定法(ELISA)等方法。其中，國內(nèi)外研究與應(yīng)用較多的是 HPLC法，這是國際分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)的指定分析方法，在 伏馬毒素的檢測中最為常用。但是這種方法前處理過程繁瑣，操作復(fù) 雜，在實驗時需要對伏馬毒素進行柱前衍生化處理，而且通常需要專 業(yè)人員進行操作，儀器設(shè)備昂貴，檢測過程耗時且費用較高，不適于 大量樣品的現(xiàn)場快速檢測；酵聯(lián)免疫測定法ELISA由于其特異性強， 靈敏度高，準(zhǔn)確性好，操作簡便，適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點越來 越受到人們的青睞。雖然很多科研機構(gòu)和大專院校的科研人員對伏馬 毒素B1酶聯(lián)免疫分析檢測方法進行了研究，但是檢測的靈敏度和試 劑盒的穩(wěn)定性方面離實際應(yīng)用還有一定的距離。酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的基本原理是將酶與抗原或抗體用交聯(lián)劑結(jié)合起來，此種 酶標(biāo)記抗原或抗體與待測樣品中相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異反應(yīng)，并牢 固結(jié)合；在加入相應(yīng)的酶的底物時，底物被酶催化生成呈色物，可根 據(jù)該呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技術(shù)是建立 在抗原抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有檢測 靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確性好等特點。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一個可定量檢測 食品中及糧食作物中的伏馬毒素B1含量的試劑盒及其檢測方法，該 試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價廉、靈敏度高，該檢測方法檢測的靈 敏度可達yg/kg級。本發(fā)明解決其技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的 一種采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中伏馬毒素B,含量的 試劑盒，包括試劑和96孔酶標(biāo)板，該試劑盒的制備包括以下步驟(1) 制備伏馬毒素B,-KLH抗原；(2) 制備多克隆伏馬毒素B,抗體；(3) 制備酶標(biāo)抗原；(4) 制備包被板；(5) 配制試劑。其中，制備伏馬毒素B,-KLH抗原的方法是(1) 將大分子蛋白匙孔血蘭蛋白KLH用戊二醛溶液溶解，3 5°C連 續(xù)攪拌15 18h,在緩沖液PBS中透析45 50h以除去過多的戊二醛；(2) 將伏馬毒素B,溶于甲醇中，逐滴加入到已活化的大分子蛋白 KLH中，室溫攪拌反應(yīng)1 2 h，然后放于3-5。C連續(xù)攪拌15~20h過 夜，形成混合液；(3) 向混合液中加入硼氫化鈉，連續(xù)攪拌3~5 h以封閉未反應(yīng)的醛 基，形成反應(yīng)液；(4) 將反應(yīng)液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析68~73 h;(5) 精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積并測定濃度，加入疊氮鈉后 4"C保存。而且，所述的戊二醛溶液為50%的戊二醛溶于0.01 mol/L緩沖液 PBS中，其pH二7.4。而且，所述的制備多克隆伏馬毒素B1抗體的方法是(1) 伏馬毒素免疫原lmg溶于NaCl中，與弗氏完全佐劑乳化，制 得油包水抗原乳化劑；(2) 利用新西蘭大白兔作為免疫動物進行皮下多點注射，進行初次 免疫，在初次免疫14天后進行加強免疫，免疫原劑量為0.5mg，用 弗氏不完全佐劑進行乳化，以后每隔三十天左右加強免疫一次，共免 疫6次左右，每次免疫10天后對動物試采血進行血清效價測定和親 和力測定；(3) 末次免疫后采用頸動脈采血法對動物采全血，經(jīng)離心處理后收 集全部血清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加 0.1%W/V的疊氮鈉后于3 5'C儲存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于所述的制備酶標(biāo)抗原的方法是(1) 將辣根過氧化酶HRP加入1 mol/L高碘酸鈉溶液并于室溫活 化15 25min，然后對1 mM醋酸鈉緩沖液透析過夜，形成活化的辣 根過氧化酶HRP;(2) 向活化后的HRP中加入伏馬毒素B,，室溫攪拌反應(yīng)1 3 h后， 向反應(yīng)液中加入O.l mL的l mol/L硼氫化鈉溶液終止反應(yīng)，該反應(yīng) 過程在3~5 。C下進行0.5~1.5h;(3) 將所有反應(yīng)液放入透析袋中對0.01 mol/L的緩沖液PBS透析 70~73 h。而且，所述的制備包被板的方法是用pH9.6的Na2C03~~NaHC03的緩沖液將伏馬毒素B,抗體稀釋 為lHg/100nL作為包被液，微孔板每孔各加入100pL，室溫放置過夜 或者36 38'C恒溫溫育2 3h，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干 液封閉0.5 1.5小時，洗滌液洗漆四次后，凍干，3 5"C保存。而且，所述的試劑盒體內(nèi)的試劑構(gòu)成及其制備方法為-(1) 緩沖液PBS:其構(gòu)成包括Na2HPCV12H20、 NaH2P(V2 H20及 NaCl，加雙蒸水稀釋，在使用時l: 5倍稀釋；(2) 伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液以伏馬毒素B,純品配制的母液中稀釋得 到，母液所用溶劑為色譜純甲醇，稀釋液為5%甲醇磷酸鹽緩沖液， 共六瓶，濃度分別為10pg/L，3.33ng/L， 1.11pg/L，0.37ng/L，0.123^ig/L， 0.041|Xg/L;(3) 凍干液Tris溶于lOOmL雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.4，加入 蔗糖、乳糖、牛血清蛋白和抗壞血酸；(4) 底物A:其構(gòu)成為無水醋酸鈉、P"糊精及過氧化氫脲，加雙 蒸水稀釋后，調(diào)pH至5.0左右，3 5i:保存；(5) 底物B: 50mg溶于二甲基亞砜5mL;(6) 洗滌液含0.05XTween20的PBS水溶液；(7) 基質(zhì)隱蔽劑0.5%魚皮膠PBS溶液；(8) 酶標(biāo)抗原。而且，取包被有伏馬毒素B1抗體的微孔包被板，加入伏馬毒素 B,標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各微孔中，再加入酶標(biāo)抗原(即伏馬毒素 B1-HRP)，震蕩反應(yīng)0.5 1.5h，洗滌液洗滌，提前混合底物A和底物 B作為底物液并加入到微孔中，反應(yīng)0.4~0.6h后每孔加入1.25mol/L硫酸中止反應(yīng)，測定吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的伏馬毒素 B,含量。而且，所述的伏馬毒素B,樣品的處理方法為取各種谷物樣品各8 12g，分別向各種加標(biāo)樣品中加入30 50mL萃取液，于混合振 蕩器上200-300 rpm振蕩萃取10 20 min，靜置10~20 min后，取部 分上清用基質(zhì)掩蔽劑稀釋后即可。


圖1為本發(fā)明伏馬毒素B,-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；具體實施方式
下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案不限制本發(fā) 明；本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的方案可以對其進行改進和變化， 這些改進和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由 權(quán)利要求來限定。一、制備試劑盒1. 伏馬毒素B,-KLH抗原的制備稱取10mg大分子蛋白匙孔血蘭蛋白(KLH)(以下簡稱KLH)， 用10mL0.2%戊二醛(50%戊二醛溶于0.01 mol/LPBS (緩沖液，以 下簡稱PBS)中，pH7.4)溶解，4'C連續(xù)攪拌16 h，在0.01 mol/LPBS (pH 7.4)中透析48 h除去過多的戊二醛。取lmg FB,溶于0.4 mL 甲醇中，逐滴加入到已活化的KLH中，室溫攪拌反應(yīng)2h，然后放于 4。C連續(xù)攪拌過夜(16h)，最后向混合液中加入12mg硼氫化鈉，連 續(xù)攪拌4h以封閉未反應(yīng)的醛基。最后將反應(yīng)液裝入透析袋，在PBS 中透析72h，然后精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積并測定濃度，加 入疊氮鈉后4-C保存。該伏馬毒素B,是一種小分子半抗原，分子量為721，只有反應(yīng)原 性而無免疫原性，需要與載體蛋白偶聯(lián)后才能使動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 伏馬毒素Bl第2位碳原子上的氨基是偶聯(lián)的最佳部位，因此可以用 戊二醛法將伏馬毒素Bl分子中的氨基和大分子蛋白KLH相結(jié)合， 以合成的伏馬毒素B1-KLH作為免疫原進行動物免疫。2. 多克隆伏馬毒素Bl抗體的制備免疫動物選擇日本大耳白兔3只，月齡3個月，體重1.5公斤左 右，分別編號為l號、2號和3號。免疫采取皮下和肌肉注射法共同 進行。免疫程序初次免疫為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐劑乳化的免疫原，劑量為lmg (溶于1 mL0.9。/。的NaCl和1 mL的弗 氏完全佐劑)。加強免疫初次免疫后第14天進行加強免疫，劑量為 0.5 mg (溶于1 mL 0.9%的NaCl及1 mL的弗氏不完全佐劑)。以后每隔30天加強免疫一次，共免疫6次。從第2次加強免疫開始，每 次免疫IO天后對動物試采血進行血清效價測定和親和力測定。末次 免疫后采用頸動脈采血法對動物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血 清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加0.1% (W/V)的疊氮鈉后于4t:儲存?zhèn)溆谩?. 醸標(biāo)抗原的制備準(zhǔn)確稱取2.0 mg HRP，加入1 mol/L高碘酸鈉溶液于室溫活化 20 min，然后對1 mM醋酸鈉緩沖液(pH 4.4)透析過夜。向活化后的 HRP中加入1.0mL伏馬毒素B,(lmg伏馬毒素B,溶于lmLpH9.5 的碳酸鹽緩沖液中)，室溫攪拌反應(yīng)2h后，向反應(yīng)液中加入O.lmLl mol/L的硼氫化鈉溶液終止反應(yīng)，該過程在4 。C下進行1 h。最后將 所有反應(yīng)液放入透析袋中對0.01 mol/L的PBS透析72 h。4. 包被板的制備伏馬毒素B,抗體包被于微孔板中，用pH9.6 Na2C03~~NaHC03 的緩沖液將伏馬毒素B1抗體稀釋為lpg/100^iL作為包被液，96孔(或 48孑L)微孔板每孔各加入100nL，室溫放置過夜或者37X:恒溫溫育 2-3小時，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入20(HiL凍干液封閉1小 時，洗滌液洗滌四次后，凍干，4"C保存。5. 試劑的配制緩沖液(PBS): Na2HP0412H20: 68.8g， NaH2P042 H20: 8.97g， NaCl: 45g加雙蒸水至lL，使用時1: 5倍稀釋；凍干液0.121gTris溶于100mL雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.4，加 入lg蔗糖、lg乳糖、2g牛血清蛋白和0.8g抗壞血酸。底物A:無水醋酸鈉8.2g ， p—糊精2.5g，過氧化氫脲429 mg加雙蒸水至1000mL，調(diào)pH至5.0， 4t:保存；底物B: 50mg溶于二甲基亞砜(DMSO) 5 mL;洗滌液含0.05%Tween20的PBS水溶液；終止液1.25mol/L硫酸；伏馬毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)液，以伏馬毒素Bl純品配制的母液中稀釋得 到，母液所用溶劑為色譜純甲醇，稀釋液為5%甲醇磷酸鹽緩沖液， 共六瓶，濃度分別為10ng/L，3.33^ig/L,l.ll嗎/L，0.37^ig/L,0.123^ig/L， 0.041pg/Lo基質(zhì)隱蔽劑0.5M魚皮膠PBS溶液試劑盒提供的試劑-1x96孔板，(8條xl2孔，可以進行拆分)包被有伏馬毒素Bl 抗體；6x伏馬毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)液，1.0mL/瓶，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為10pg/L， 3.33ng/L， 1.11pg/L， 0.37ng/L， 0.123pg/L， 0.041嗎/L; lx伏馬毒素Bl-HRP，用時PBS1: IOOO稀釋； lx底物A， 15mL; lx底物B, lmL;lx洗滌液，30mL，用時以蒸餾水l: 5稀釋； lx緩沖液，30mL; lx終止液，5mL; 1X基質(zhì)隱蔽劑，10mL。 測定之前注意事項(1) 使用之前將所有試劑恢復(fù)室溫(15-3(TC);(2) 使用之后立即將所有試劑放回4°C;(3) 如果樣品量大建議使用多通道移液器。二、 檢測谷物樣品(以玉米為例)玉米經(jīng)粉碎機分別充分粉粹成粉末狀，于干燥箱中50 。C烘干， -20°<:儲存?zhèn)溆谩７謩e取玉米樣品各10g，加入40 mL萃取液(75% 甲醇/水，V : V)，于混合振蕩器上250 rpm振蕩萃取15 min，靜置 10-20 min后，取部分上清用基質(zhì)掩蔽劑15倍稀釋后用于ELISA測 定。加標(biāo)試驗中，分別向樣品其中添加不同濃度的FB,，將加標(biāo)樣品 充分混勻，室溫靜置過夜。其余處理過程同上。三、 檢測方法取包被有伏馬毒素B,抗體的凍干板條，加酶標(biāo)抗原和標(biāo)樣(或 樣品提取液)每孔先加入IOO 伏馬毒素B,標(biāo)樣溶液或樣品提取 液，然后加入100ML酶標(biāo)抗原溶液，以不加FB,標(biāo)樣的孔為對照孑L。 室溫反應(yīng)lh，然后用PBST洗液洗板3次；在每孔中加入150^iL底 物液，室溫下反應(yīng)30min;每孔加入50nL終止液，終止反應(yīng)；在雙 波長方式(450-650 nm)下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。在對玉米樣品的檢 測中，分別在25(Hig/kg和50(Hig/kg水平進行加回收試驗，其回收率 為103%和86%。本發(fā)明的工作原理是采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測伏馬毒素Bl，其測定的基礎(chǔ)是酶標(biāo)記免疫反應(yīng)，微孔板包被伏馬毒素Bl抗體，加入伏馬毒素Bl 標(biāo)準(zhǔn)或樣品，再加入伏馬毒素B1和辣根過氧化物酶(HRP)連接物， 游離的伏馬毒素Bl和伏馬毒素Bl—HRP連接物共同競爭伏馬毒素 Bl抗體，沒有連接的伏馬毒素Bl被洗滌除去，加入反應(yīng)底物，在 HRP酶催化下反應(yīng)體系顯色，加入中止液后用酶標(biāo)儀測定其吸光度， 吸光度值與樣品中的伏馬毒素B1濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1) 即可以確定被測樣品中的伏馬毒素B1的含量。本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫分析檢測技術(shù)來檢測伏馬毒素Bl，可 實現(xiàn)對食品中及糧食作物中的伏馬毒素B1的定量檢測的目的；并且 本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價廉、靈敏度高；其檢測方法特異性 強，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，其靈敏度可以達到lig/kg級。
權(quán)利要求
1. 一種采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中伏馬毒素B1含量的試劑盒，包括試劑和96孔酶標(biāo)板，其特征在于該試劑盒的制備包括以下步驟(1)制備伏馬毒素B1-KLH抗原；(2)制備多克隆伏馬毒素B1抗體；(3)制備酶標(biāo)抗原；(4)制備包被板；(5)配制試劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于制備伏馬毒素B,-KLH抗原的方法是(1) 將大分子蛋白匙孔血蘭蛋白KLH用戊二醛溶液溶解，3 5'C連 續(xù)攪拌15 18h，在緩沖液PBS中透析45 50h以除去過多的戊二醛;(2) 將伏馬毒素B廣溶于甲醇中，逐滴加入到己活化的大分子蛋白 KLH中，室溫攪拌反應(yīng)1~2 h，然后放于3 5。C連續(xù)攪拌15~20h過 夜，形成混合液；(3) 向混合液中加入硼氫化鈉，連續(xù)攪拌3~5 h以封閉未反應(yīng)的醛 基，形成反應(yīng)液；(4) 將反應(yīng)液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析68 73 h;(5) 精確量取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積并測定濃度，加入疊氮鈉后 4'C保存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于所述的戊二醛溶液為50% 的戊二醛溶于0.01 mol/L緩沖液PBS中，其pH =7.4。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于所述的制備多克隆伏馬毒素 Bl抗體的方法是(1) 伏馬毒素免疫原lmg溶于NaCl中，與弗氏完全佐劑乳化，制 得油包水抗原乳化劑；(2) 利用新西蘭大白兔作為免疫動物進行皮下多點注射，進行初次 免疫，在初次免疫14天后進行加強免疫，免疫原劑量為0.5mg，用 弗氏不完全佐劑進行乳化，以后每隔三十天左右加強免疫一次，共免 疫6次左右，每次免疫10天后對動物試采血進行血清效價測定和親和力測定；(3)末次免疫后采用頸動脈采血法對動物采全血，經(jīng)離心處理后收 集全部血清，采取免疫親合層析法進行抗體純化，所得抗體添加 0.1%W/V的疊氮鈉后于3-5'C儲存?zhèn)溆谩?br> 5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于所述的制備酶標(biāo)抗原的方法 是(1) 將辣根過氧化酶HRP加入1 mol/L高碘酸鈉溶液并于室溫活 化15 25min，然后對1 mM醋酸鈉緩沖液透析過夜，形成活化的辣 根過氧化酶HRP;(2) 向活化后的HRP中加入伏馬毒素BP室溫攪拌反應(yīng)1 3 h后， 向反應(yīng)液中加入O.l mL的l mol/L硼氫化鈉溶液終止反應(yīng)，該反應(yīng) 過程在3 5 。C下進行0.5~1.5h;(3) 將所有反應(yīng)液放入透析袋中對0.01 mol/L的緩沖液PBS透析 70~73 h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于:所述的制備包被板的方法是:用pH9.6的Na2C03—NaHC03的緩沖液將伏馬毒素B,抗體稀釋 為lpg/100nL作為包被液，微孔板每孔各加入100kiL，室溫放置過夜 或者36 38'C恒溫溫育2 3h，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍千 液封閉0.5 1.5小時，洗滌液洗滌四次后，凍干，3 5T:保存。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中 伏馬毒素B,含量的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒體內(nèi)的試劑構(gòu) 成及其制備方法為(1) 緩沖液PBS:其構(gòu)成包括Na2HP(V12H20、 NaH2P04'2 H20及NaCl，加雙蒸水稀釋，在使用時l: 5倍稀釋；(2) 伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液以伏馬毒素B,純品配制的母液中稀釋得 到，母液所用溶劑為色譜純甲醇，稀釋液為5%甲醇磷酸鹽緩沖液， 共六瓶，濃度分別為1(Hig/L， 3.33ng/L， 1.1 lng/L， 0.37pg/L， 0.123pg/L， 0麓ng/L;(3) 凍干液Tris溶于100mL雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.4，加入 蔗糖、乳糖、牛血清蛋白和抗壞血酸；(4) 底物A:其構(gòu)成為無水醋酸鈉、卩一糊精及過氧化氫脲，加雙 蒸水稀釋后，調(diào)pH至5.0左右，3 5'C保存；(5) 底物B: 50mg溶于二甲基亞砜5mL;(6) 洗滌液含0.05%Tween20的PBS水溶液；(7) 基質(zhì)隱蔽劑0.5。/。魚皮膠PBS溶液；(8) 酶標(biāo)抗原。
8. —種如權(quán)利要求1所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品 中伏馬毒素B,含量的試劑盒的檢測方法，其特征在于取包被有伏馬 毒素Bl抗體的微孔包被板，加入伏馬毒素B,標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到 各微孔中，再加入酶標(biāo)抗原(即伏馬毒素B1-HRP)，震蕩反應(yīng) 0.5~1.5h，洗滌液洗滌，提前混合底物A和底物B作為底物液并加入 到微孔中，反應(yīng)0.4 0.6h后每孔加入L25mol/L硫酸中止反應(yīng)，測定 吸光度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的伏馬毒素B,含量。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品 中伏馬毒素Bi含量的試劑盒的檢測方法，其特征在于所述的伏馬毒 素B,樣品的處理方法為取各種谷物樣品各8 12 g，分別向各種加 標(biāo)樣品中加入30 50mL萃取液，于混合振蕩器上200-300 rpm振蕩 萃取10 20min，靜置10 20min后，取部分上清用基質(zhì)掩蔽劑稀釋 后即可。
全文摘要
本發(fā)明屬涉及一種采用酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)定量檢測食品中伏馬毒素B1含量的試劑盒及其檢測方法，其試劑盒包括制備伏馬毒素B₁-KLH抗原；制備多克隆伏馬毒素B₁抗體；制備酶標(biāo)抗原；制備包被板；配制試劑。本發(fā)明主要采用酶聯(lián)免疫分析檢測技術(shù)來檢測伏馬毒素B1，可實現(xiàn)對食品中及糧食作物中的伏馬毒素B1定量檢測的目的；并且本試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價廉、靈敏度高；其檢測方法特異性強，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，其靈敏度可以達到μg/kg級。
文檔編號G01N33/543GK101231291SQ200710056559
公開日2008年7月30日 申請日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月25日
發(fā)明者燕 張, 英 權(quán), 碩 王, 王向紅, 鄭文杰 申請人:天津科技大學(xué)