專利名稱：人、大鼠、小鼠hsp70雙抗夾心法檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)產(chǎn)品，具體地說涉及一種雙抗夾心法快速檢測HSP70蛋白的檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：
熱休克蛋白家族(HSPs)是一類高度保守的蛋白，HSP70是熱休克蛋白家族中的重要成員，其分為誘導型的組成型的。當機體受到外界環(huán)境中多種不良因素刺激時，誘導型的HSP70蛋白表達升高。HSP70蛋白對細胞損傷的修復、存活和維持正常的細胞功能是必需的。在環(huán)境刺激、病原菌感染、疾病引起細胞應(yīng)激損傷中發(fā)揮分子伴侶作用，阻止蛋白聚集，促進損傷蛋白的重新折疊。在大多數(shù)的哺乳動物，只有在應(yīng)激條件下HSP70表達，而且顯著的細胞和機體應(yīng)激后才能檢測到，但是在人和靈長類，誘導型的HSP70有一個基準值，在一些特殊條件下如過熱、化學有毒物質(zhì)暴露、缺氧、缺血、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、細菌和病毒引起的感染，動脈粥樣硬化等心血管疾病中，生物體的HSP70表達顯著升高；在正常老化過程，精子發(fā)生，月經(jīng)，運動練習等正常生理過程中，生物體的HSP70表達也顯著升高，提示其在這些過程中可能發(fā)揮重要作用。一般認為誘導型的HSP70是細胞內(nèi)的蛋白，但是研究發(fā)現(xiàn)在正常人的外周循環(huán)和一些疾病狀態(tài)下能夠檢測到可溶性的HSP70和HSP70抗體，細胞內(nèi)的HSP70能夠釋放到細胞外，細胞外的HSP70成為科學研究的熱點。近來的研究主要是探討HSP70作為細胞保護治療藥物，作為內(nèi)環(huán)境失衡和細胞應(yīng)激的敏感生物預(yù)警指標?，F(xiàn)在檢測HSP70的方法主要有免疫組化法、Western Bloting、Elisa方法。各種方法互相印證，同時又存在檢測靈敏度、專業(yè)性、設(shè)備設(shè)施條件及成本的影響。目前，以血清學反應(yīng)原理為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附吸附測定(Elisa)是被廣泛接受和推廣的方法。
1969年，Avrameas將酶聯(lián)抗體應(yīng)用于學清學技術(shù)，1971年Engvall和Perlmann將該方法進一步完善發(fā)展了ELISA方法。1974年Voller等將ELISA技術(shù)應(yīng)用于人和動物的抗體檢測。之后，此方法進一步發(fā)展，廣泛應(yīng)用于人和動物的體液蛋白檢測。與其他檢測方法相比，ELISA檢測方法具有成本低、檢測設(shè)施設(shè)備簡單、快速高效的特點，并在不斷改進當中，已經(jīng)有直接ELISA、間接ELISA、單抗體ELISA，微波ELISA、雙抗體夾心ELISA方法。目前市售的檢測HSP70試劑盒主要是雙抗夾心法檢測，主要是美國的Stressgen公司的HSP70檢測試劑盒，其基本上壟斷了HSP70檢測試劑盒的市場；目前Stressgen公司市售的檢測HSP70的試劑盒一個檢測盒中的96孔板的價格約10000元人民幣約測定樣品50個，每個樣品檢測費用約200元人民幣。我國這方面的銷售公司大部分是代理或者進口分裝的，也有偶有自行研制的報道，但是其檢測靈敏度低，檢測范圍窄，遠沒有達到生產(chǎn)檢測的程度。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測靈敏度高、準確性強、高效的人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下 一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的固化HSP70單克隆抗體的酶標板和設(shè)在盒體內(nèi)的物質(zhì)，盒體內(nèi)的物質(zhì)包括HIS-HSP70蛋白標準品、生物素標記的HSP70多克隆抗體、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、辣根酶標記親和素、辣根酶標記親和素稀釋液、底物顯色液A液、底物顯示液B液和終止液； 所述HIS-HSP70蛋白標準品是用下述方法制成 先設(shè)計上游引物5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’，下游引物5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’，PCR擴增，雙酶切連入PET-32a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導表達，純化，SDS膠鑒定純度，透析后冷凍干燥，即制成HIS-HSP70蛋白標準品，分裝，-70℃凍存； 所述生物素標記的HSP70多克隆抗體是用下述方法制成 (1)制備HSP70多克隆抗體選用健康雌性家兔為免疫動物，用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作為免疫抗原，4℃保存；進行免疫注射程序，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml；一個月后，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml；再一個月后，用0.5ml免疫抗原耳靜脈注射；再7-10天后，頸動脈全采血，分離血清，加入質(zhì)量百分濃度為0.8-1.2％的硫柳汞水溶液，-70℃下保存，得HSP70多克隆抗體血清；采用硫酸銨沉淀法純化HSP70多克隆抗體血清； (2)對HSP70多克隆抗體進行生物素標記 1)制備生物素N-羥基丁二酰亞胺酯取生物素1g混懸于10-18ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.4-0.8gN-羥基丁二酰亞胺和0.6-1.0g二環(huán)己基碳二亞胺，置于密閉容器內(nèi)，室溫下磁力攪拌作用8-12小時，過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸干，加8-12mL乙醚洗滌，繼加160-220ml異丙醇使其重結(jié)晶，獲得白色粉末狀晶體，-30℃分裝凍存； 2)生物素與HSP70多克隆抗體藕聯(lián) ①取所述生物素N-羥基丁二酰亞胺酯粉末，以二甲亞砜制備成1-2mg/ml溶液，備用； ②將純化的HSP70多克隆抗體以0.1mol/L pH9.0的NaHCO3配成2-4mg/ml溶液； ③將步驟①與步驟②制備的溶液按體積比為1∶4-8混合，20-30℃攪拌3.5-5.5h； ④4℃條件下使上述混合液體以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析8-12小時，加等體積甘油，-20℃分裝存放； 所述固化HSP70單克隆抗體的酶標板是用下述方法制成 用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作為免疫抗原，選用18-20g的Balb/c雌鼠作為免疫動物，并取其脾細胞與SP2/0細胞融合，ELISA篩選、亞類鑒定、腹水制備，純化單克隆抗體，將純化的單克隆抗體包被酶標板，4℃保存。
所述樣品稀釋液的組成為每100ml含有NaCl 0.5g，KCl 0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO4 0.181g，余量為水。
所述洗滌緩沖液的組成為每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO41.81g，吐溫-20 20ul，余量為水。
所述抗體稀釋液的組成為每5ml含有小牛血清500ul，質(zhì)量百分濃度為1％硫柳汞水溶液100ul，100mM的鐵氰化鉀50ul，吐溫-20 2.5ul，10mg/ml的慶大霉素25ul，余量為pH7.4的0.01M的PBS。
所述辣根酶標記親和素稀釋液的組成為每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO4 0.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量為水。
所述底物顯色液A液的組成為每20ml含有醋酸鈉0.544g，檸檬酸0.064g，體積百分濃度為30％的H2O2 12ul，余量為水。
所述底物顯色液B液的組成為每20ml含有EDTA-Na 0.008g，檸檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基聯(lián)苯胺0.008g，余量為水，避光保存。
所述終止液的組成為每20ml含有濃H2SO4 1.15ml，余量為水。
本發(fā)明的優(yōu)點是檢測靈敏度高，準確性強、成本低，可以同時檢測人、大鼠、小鼠細胞裂解液、組織提取液、血漿和血清中的HSP70蛋白。
隨著研究的深入，HSP70可能會作為疾病的預(yù)警分子標記物和疾病預(yù)防的藥物靶標，本試劑盒將會更多的應(yīng)用于臨床檢測，試劑盒將有更大的應(yīng)用前景。



圖1生物素標記的多克隆抗體制備流程； 圖2包被單克隆抗體的酶標板制備流程； 圖3標準品陽性對照HSP70蛋白純化圖； 圖4HSP70檢測試劑盒檢測靈敏度和檢測范圍曲線。

具體實施例方式 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1 一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的固化HSP70單克隆抗體的酶標板和設(shè)在盒體內(nèi)的物質(zhì)，盒體內(nèi)的物質(zhì)包括HIS-HSP70蛋白標準品、生物素標記的HSP70多克隆抗體、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、辣根酶標記親和素、辣根酶標記親和素稀釋液、底物顯色液A液、底物顯示液B液和終止液。
實施例2 HIS-HSP70蛋白標準品是用下述方法制成 1.)先設(shè)計PCR擴增引物 上游5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’ 下游5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’ PCR擴增，擴增條件是 95℃4min；95℃30s 56℃ 60s 72℃60s(30cycle)；72℃10min 經(jīng)EcoR I和HinDIII雙酶切后連入質(zhì)粒PET-32a 2.)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 37℃振搖，OD值0.5時加入IPTG 1.0ul/ml，誘導4h，超聲破碎，離心收集上清。
3.)將收集的上清液按法瑪西亞公司的HISTrap純化試劑盒操作說明進行純化。經(jīng)過摸索最佳的純化條件為1ml純化柱，柱平衡液平衡6ml——上樣(1ml上清液，流速0.5ml/ml)——柱洗滌液洗滌8ml——20mmol/L咪磋洗脫液洗脫8ml——300mmol/L咪磋洗脫液洗脫——收集2-4ml洗脫液。
4.)將收集到的洗脫液取100ul SDS膠鑒定純度，其余裝入透析袋中，PBS液中透析過夜，其間換液三次。
5.)將透析袋中的液體分裝入冷凍干燥管中，每管中總蛋白量為1mg，冷凍干燥成粉末狀，放入-70℃?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明所述的重組HSP70蛋白純度及含量檢測分別采用SDS膠鑒定和考馬斯亮藍染色法。具體方法為 1.SDS膠鑒定重組HSP70蛋白純度 將純化時300mmol/L咪磋洗脫液取80ul，加5×上樣緩沖液20，100℃變性5min，10000g離心，取上清10ul上樣，10％SDS膠，80v，10min，180v，45min；考染脫色，膠圖分析。結(jié)果重組HSP70蛋白純度≥95％，如圖3所示，箭頭所示HSP70蛋白。
圖3為標準品陽性對照HSP70蛋白純化圖，其中泳道1為正常菌，2為誘導菌，3-7為分部純化的HSP70，箭頭所示HSP70蛋白。
2.蛋白濃度測定采用的考馬斯亮藍染色法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
試劑盒中HIS-HSP70蛋白標準品是陽性對照，分裝成100ug/管，-20℃保存，使用時可用1ml PBS或蒸餾水溶解、稀釋即可使用。
實施例3 生物素標記標的HSP70蛋白多克隆抗體是用下述方法制成 (1)制備HSP70蛋白多克隆抗體 選用2kg以上的健康雌性家兔作為免疫動物，用2mg/ml的實施例2制備的HIS-HSP70蛋白為免疫抗原，-4℃保存；然后進行免疫注射程序，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml； 一個月后，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml； 一個月后，用0.5ml免疫抗原耳靜脈注射； 7-10天后，頸動脈全采血，分離血清，加入質(zhì)量百分濃度為1％硫柳汞水溶液(也可以選用0.8％或1.2％的硫柳汞水溶液，成為新的實施例)，-70℃保存，獲得HSP70多克隆抗體血清35ml； 對所采集的HSP70多克隆抗體血清進行純化采用的是硫酸銨沉淀法，具體的方法為 1.)取血清10ml，置磁力攪拌器上攪拌，室溫下加入30ml醋酸鈉(60mmol/L，pH4.0)，用0.1mmol/LNaOH調(diào)pH值至4.5(也可以是4.2或4.8)； 2.)緩慢滴加辛酸至終濃度100ul/ml，繼續(xù)攪拌30min； 3.)10000g離心30min，棄沉淀，濾紙過濾，加入1/10體積的10×PBS，調(diào)pH值到7.4； 4.)緩慢加入預(yù)冷的飽和硫酸銨至45％飽和度，混勻后4℃過夜； 5.)3000g離心30min，用0.01mol/L PBS(pH7.4)重懸，并用透析袋透析； 6.)抗體定量如前述考馬斯亮藍定量方法，獲得的抗體濃度為26mg/ml，-70℃保存， 對所采集的HSP70多克隆抗體進行檢測分析，將HSP70多克隆抗體純液倍比稀釋為1∶10 1∶20 1∶40......1∶256000以間接ELISA法測定抗體效價。結(jié)果純化后的多克隆抗體的效價為1∶128000，獲得純化的多克隆抗體5ml； (2)對純化后的HSP70多克隆抗體進行生物素標記 1.)生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS)的制備 取生物素1g混懸于12ml(也可以選用10ml或8ml)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，加人0.6g(也可以選用0.4g或0.8g)N-羥基丁二酰亞胺和0.8g(也可以選用0.6g或1.0g)二環(huán)己基碳二亞胺，置于密閉容器內(nèi)，室溫下磁力攪拌作用10小時，(也可以選用8小時或12小時)，過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸干，加10ml(也可以選用8ml或12ml)乙醚洗滌，繼加200ml(也可以選用160ml或220ml)異丙醇使其重結(jié)晶，獲得白色粉末狀晶體。-30℃分裝凍存； 2.)生物素與抗體藕聯(lián) (1)取BNHS粉末，以二甲亞砜(DMSO)制備成1mg/ml(也可以選用2mg/ml)溶液，備用； (2)將純化的HSP70多克隆抗體以0.1mol/L pH9.0的NaHCO3配成2mg/ml(也可以選用3mg/ml、4mg/ml)溶液； (3)將步驟(1)與步驟(2)制備的溶液按體積比為1∶8(也可以選用1∶4或1∶6)混合，室溫攪拌4h(也可以選有20℃攪拌5.5h或30℃攪拌3.5h)； (4)4℃條件下使上述混合液體以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析過夜，加等體積甘油，-20℃分裝存放。
將標記生物素的HSP70多克隆抗體稀釋成1mg/ml，備用。將純化的HSP70蛋白稀釋成1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml，0.0001mg/ml，0.00001mg/ml，0.000001mg/ml，以間接ELISA方法測定生物素標記的HSP70多克隆抗體靈敏度。結(jié)果經(jīng)過純化、生物素標記后，得到抗體3ml，最低檢出度(檢測靈敏度)達到0.01-0.001ng。
在組裝本發(fā)明的試劑盒時，將生物素標記的HSP70多克隆抗體溶液加0.1％疊氮鈉，無菌分裝后，密封、冷貯(-70℃)、備用。在使用時可保存在4℃，不宜反復動融，有效期1年。每個試劑盒50ul，使用時用PBS或蒸餾水1∶2000稀釋。
實施例4 固化HSP70單克隆抗體的酶標板的制備 用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作為免疫抗原，選用18-20g的Balb/c雌鼠作為免疫動物，并取其脾細胞與SP2/0細胞融合，ELISA篩選、然后對單克隆抗體亞類鑒定，腹水制備，純化單克隆抗體，對所得的單克隆抗體進行分析，篩選出一個可以識別人、大鼠、小鼠天然HSP70蛋白的廣譜單克隆抗體細胞株，間接ELISA測定抗體效價為1∶20000。
對所得的單克隆抗體進行酶標板抗體包被，具體步驟為 (1)取篩選到并純化的單克隆抗體濃縮液，用包被緩沖液稀釋成1mg/ml，4℃保存，備用。
(2)將上述液體包被酶標板，每孔加液體100ul，4℃過夜。
(3)洗板三次，拍干；每孔加150ul 10％胎牛血清封閉液，4℃封閉過夜。
(4)洗板三次，拍干，4℃存放，備用。
對所得到的包被有單克隆抗體的酶標板進行分析，將純化的HSP70蛋白稀釋成1mg/ml，0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml，0.0001mg/ml，0.00001mg/ml，0.000001mg/ml，以間接ELISA方法測定酶標板的靈敏度。結(jié)果經(jīng)過抗體純化、包被后，得到酶標板，最低檢出度(檢測靈敏度)達到0.1-0.01ng。
在組裝本發(fā)明所述的試劑盒時，酶標板一塊(96孔，包被HSP70單克隆抗體)，4℃保存，不宜反復凍融，有效期一年。
實施例5 試劑盒中其他主要材料和藥品，4℃保存。
(1)樣品稀釋液每100ml含有NaCl 0.5g，KCl 0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO40.181g，余量為水； (2)洗滌緩沖液每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO4 1.81g，吐溫-20 20ul，余量為水； (3)抗體稀釋液每5ml含有小牛血清500ul，質(zhì)量百分比為的1％硫柳汞100ul，100mM的鐵氰化鉀50ul，吐溫-20 2.5ul，10mg/ml的慶大霉素25ul，余量為pH7.4的0.01M的PBS； (4)辣根酶標記親和素為HRP-avidin，分裝，4℃保存，備用。每個試劑盒，5ul， 使用時用PBS或蒸餾水按1∶1000-2000稀釋，可由Sigma購買。
(5)辣根酶標記親和素稀釋液每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO40.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量為水； (6)底物顯色液A液每20ml含有醋酸鈉0.544g，檸檬酸0.064g，體積百分濃度為30％的H2O2 12ul，余量為水； (7)底物顯色液B液每20ml含有EDTA-Na 0.008g，檸檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基聯(lián)苯胺0.008g，余量為水，避光保存； (8)終止液每20ml含有H2SO4 1.15ml，余量為水， 本發(fā)明試劑盒可以根據(jù)檢測單位的實際需要，每個試劑盒組裝成可以檢測大樣本的抗體及藥品試劑量。
本發(fā)明的人、大鼠、小鼠HSP70檢測試劑盒是在現(xiàn)有的ELISA方法上，采用雙抗夾心法檢測HSP70，并且能夠同時檢測人、大鼠、小鼠的HSP70，檢測的靈敏度高，檢測靈敏度可達到195pg/ml，檢測范圍是390pg～50000pg/ml，比StressGen公司的檢測試劑盒要高5-10倍，試劑成本便宜，易于實現(xiàn)批量化生產(chǎn)，每個樣品的檢測費用約為40元人民幣左右，遠遠低于國外的同類產(chǎn)品，對于研究HSP70的功能作用有很大幫助。
實施例6 本發(fā)明進行HSP70雙抗夾心法檢測，具體方法如下 1.將標準品陽性對照用1ml樣品稀釋液稀釋成10ug/ml，進一步稀釋成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加樣分別設(shè)空白孔、5個標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，37℃，120分鐘。
2.棄去液體，拍干，不用洗滌。
3.每孔加多克隆抗體溶液(生物素標記)100ul，37℃，60分鐘。洗滌緩沖液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物顯色液AB各90ul，37℃避光顯色30分鐘。
依序每孔加終止溶液90ul，終止反應(yīng)。用酶標儀在450nm波長讀數(shù)(OD值)。
實施例7 本實施例的目的確定本試劑盒檢測的檢測范圍和靈敏度。
材料本檢測試劑盒。
方法取陽性對照標準品與PBS配成1ug/ml，倍比稀釋成10個管，按實施例6中的方法進行，雙復孔測定。
結(jié)果如圖4所示，本試劑盒檢測HSP70的靈敏度195pg/ml，檢測范圍是390pg～50000pg/ml 實施例8 本實施例的目的確定陰陽性判別、準確性比較。
每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4，測量時先用此孔調(diào)OD值至零；待測樣品OD值與陰性對照OD值之比大于等于2.1時，待測樣品為陽性，否則為陰性。為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法手工洗板方法吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。自動洗板如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標軸上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
實施例9 本實施例的目的在于測定HSP70 EIISA檢測試劑盒的穩(wěn)定性，通過試劑盒內(nèi)部和組間的變異度判定，確定試劑盒的穩(wěn)定性，具體方法如下 1.HSP70 ELISA試劑盒內(nèi)部變異系數(shù)確定方法三個已知濃度樣品(5ng，12ng，25ng)在一塊HSP70免疫反應(yīng)板上各單獨測定20次。變異系數(shù)計算方法 CV＝批內(nèi)標準差S/平均值×100％ 結(jié)果變異系數(shù)的值CV＝8.2％＜10％。
2.HSP70 ELISA試劑盒反應(yīng)之間變異系數(shù)確定方法三個已知濃度的樣品由四個研究人員單獨各測定20次。試劑盒反應(yīng)之間的變異系數(shù)CV＝批間標準差S/批間平均值×100％CV＝7.6％＜10％。
結(jié)果通過兩組的CV值，本試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。
實施例10 本實施例目的是確定本試劑盒檢測HSP70種屬特異性。
本實施例所述的HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標板(單克隆抗體包被)和盒體內(nèi)的物質(zhì)，盒體內(nèi)的物質(zhì)包括HIS-HSP70蛋白標準品、生物素標記的HSP70多克隆抗體、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、辣根酶標記親和素、辣根酶標記親和素稀釋液、底物顯色液A液、底物顯示液B液和終止液，所述的多克隆抗體和單克隆抗體分別由2mg/ml重組HSP70作為免疫抗原，免疫兔子和小鼠制備而成。
實施例11 本試劑盒中的單克隆抗體制備過程中，我們篩選出了一株廣譜的單克隆抗體細胞株，間接ELISA法確定其可以識別人、大鼠、小鼠天然的HSP70蛋白，我們進一步研究本試劑盒特異性檢測人、大鼠、小鼠HSP70蛋白。具體方法為 材料HSP70 EIISA試劑盒；人血清(1∶10)，血漿(1∶10)，細胞提取液(原液)，組織提取液(原液) 方法 1.將標準品陽性對照用1ml樣品稀釋液稀釋成10ug/ml，進一步稀釋成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加樣分別設(shè)空白孔、5個標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，37℃，120分鐘。
2.棄去液體，拍干，不用洗滌。
3.每孔加多克隆抗體溶液(生物素標記)100ul，37℃，60分鐘。洗滌緩沖液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物顯色液AB各90ul，37℃避光顯色30分鐘。
依序每孔加終止溶液90ul，終止反應(yīng)。用酶標儀在450nm波長讀數(shù)(OD值)。儀器酶標儀、洗板機等 結(jié)果 本試劑盒可以檢測人不同體液中天然HSP70蛋白。
實施例12 方法同實施例11中的方法，不同的是材料是大鼠的血清(1∶10)，血漿(1∶10)，細胞提取液(原液)，組織提取液(原液) 儀器酶標儀、洗板機等 結(jié)果 本試劑盒可以檢測大鼠不同體液中天然HSP70蛋白。
實施例13 方法同實施例11中的方法，不同的是材料是小鼠的血清(1∶10)，血漿(1∶10)，細胞提取液(原液)，組織提取液(原液) 儀器酶標儀、洗板機等 結(jié)果 本試劑盒可以檢測小鼠不同體液中天然HSP70蛋白。
本ELISA試劑盒能夠特異性的檢測重組；其他的種屬包括猴子、倉鼠、豬、牛、羊和狗的Hsp70沒有進行檢測。
實施例14 HSP70 ELISA試劑盒檢測操作說明書 熱休克蛋白70(HSP70)ELISA 試劑盒使用說明書 本試劑盒僅供研究使用 應(yīng)用 雙抗夾心ELISA法定量測定人、大鼠、小鼠細胞裂解液、組織提取液、血漿和血清中HSP70含量。
實驗原理 本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中HSP70水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入HSP70抗原、生物素化的抗大鼠HSP70抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP70呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(0D值)，計算樣品濃度。
試劑盒組成 1.酶標板一塊(96孔)(包被單克隆抗體)。
2.標準品(凍干品，陽性對照)1瓶，臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為10000000pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成50000pg/mL，25000pg/mL，12500pg/mL，6250pg/mL，3125pg/mL，1562.5pg/mL，781.25pg/mL，390pg/mL，195pg/mL，樣品稀釋液直接作為標準濃度0pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
3.生物素標記多克隆抗體1×50ul/管。
4.抗體稀釋液5ml/瓶。
5.樣品稀釋液100ml/瓶。
6.酶標親和素1×0.5ml/管。
7.酶標親和素稀釋液1×5ml/瓶。
8.洗滌緩沖液1×100ml/瓶。
9.顯色液A1×20ml/瓶。
10.顯色液B1×20ml/瓶。
11.終止液1×20ml/瓶。
標本的采集及保存 1.血清標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
2.血漿可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?70℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
3.組織提取液取新鮮組織或者液氮凍存組織加入提取液勻漿，離心1000g 10min提取蛋白，立即測定，或?qū)吮痉庞?70℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
4.細胞提取液1×PBS洗三次，加細胞裂解液刮取，4℃離心10000g 10min。取上清進行測定(適當增加細胞的濃度)。
注標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。檢測樣品視具體情況進行適當?shù)南♂尰蛘咴黾訚舛葴y定。取上清時勿將沉淀吸入，影響檢測結(jié)果。
操作步驟 1.將標準品陽性對照用1ml樣品稀釋液稀釋成10ug/ml，進一步稀釋成50 12.5 3.1250.78 0.195ng/ml。
2.加樣分別設(shè)空白孔、5個標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，37℃，120分鐘。
2.棄去液體，拍干，不用洗滌。
3.每孔加多克隆抗體溶液(生物素標記)100ul，37℃，60分鐘。洗滌緩沖液洗板3次，350ul/每孔/次，拍干。
4.每孔加HRP-avidin 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，拍干。
5.依序每孔加底物顯色液AB各90ul，37℃避光顯色30分鐘。
依序每孔加終止溶液90ul，終止反應(yīng)。用酶標儀在450nm波長讀數(shù)(OD值)。
注 1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法 手工洗板方法吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠HSP70，亦可檢測人、小鼠天然HSP70，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算 以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標(普通坐標)，在坐標軸上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項 1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2.一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。
4.如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6.底物請避光保存。
檢測范圍 390pg-50000pg/ml 說明 1.試劑盒保存-20℃(較長時間不用時)；2-8℃(頻繁使用時)。
2.有效期6個月 3.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
權(quán)利要求
1.一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的固化HSP70單克隆抗體的酶標板和設(shè)在盒體內(nèi)的物質(zhì)，盒體內(nèi)的物質(zhì)包括HIS-HSP70蛋白標準品、生物素標記的HSP70多克隆抗體、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、辣根酶標記親和素、辣根酶標記親和素稀釋液、底物顯色液A液、底物顯示液B液和終止液；
所述HIS-HSP70蛋白標準品是用下述方法制成
先設(shè)計上游引物5‘CGGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG 3’，下游引物5‘CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT 3’，PCR擴增，雙酶切連入PET-32a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導表達，純化，SDS膠鑒定純度，透析后冷凍干燥，即制成HIS-HSP70蛋白標準品，分裝，-70℃凍存；
所述生物素標記的HSP70多克隆抗體是用下述方法制成
(1)制備HSP70多克隆抗體選用健康雌性家兔為免疫動物，用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作為免疫抗原，4℃保存；進行免疫注射程序，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml；一個月后，將0.5ml免疫抗原加0.5ml弗氏完全佐劑，充分混合，在兔子背部皮下多點注射，每點0.2ml，下肢腹股溝0.2ml；再一個月后，用0.5ml免疫抗原耳靜脈注射；再7-10天后，頸動脈全采血，分離血清，加入質(zhì)量百分濃度為0.8-1.2％的硫柳汞水溶液，-70℃下保存，得HSP70多克隆抗體血清；采用硫酸銨沉淀法純化HSP70多克隆抗體血清；
(2)對HSP70多克隆抗體進行生物素標記
1)制備生物素N-羥基丁二酰亞胺酯取生物素1g混懸于10-18ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.4-0.8gN-羥基丁二酰亞胺和0.6-1.0g二環(huán)己基碳二亞胺，置于密閉容器內(nèi)，室溫下磁力攪拌作用8-12小時，過濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸干，加8-12mL乙醚洗滌，繼加160-220ml異丙醇使其重結(jié)晶，獲得白色粉末狀晶體，-30℃分裝凍存；
2)生物素與HSP70多克隆抗體藕聯(lián)
①取所述生物素N-羥基丁二酰亞胺酯粉末，以二甲亞砜制備成1-2mg/ml溶液，備用；
②將純化的HSP70多克隆抗體以0.1mol/L pH9.00的NaHCO3配成2-4mg/ml溶液；
③將步驟①與步驟②制備的溶液按體積比為1∶4-8混合，20-30℃攪拌3.5-5.5h；
④4℃條件下使上述混合液體以0.05mol/L，pH7.2 PBS透析8-12小時，加等體積甘油，-20℃分裝存放；
所述固化HSP70單克隆抗體的酶標板是用下述方法制成
用2mg/ml的所述HIS-HSP70蛋白作為免疫抗原，選用18-20g的Balb/c雌鼠作為免疫動物，并取其脾細胞與SP2/0細胞融合，ELISA篩選、亞類鑒定、腹水制備，純化單克隆抗體，將純化的單克隆抗體包被酶標板，4℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述樣品稀釋液的組成為每100ml含有NaCl0.5g，KCl0.0125g，KH2PO4 0.0125g，Na2HPO4 0.181g，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述洗滌緩沖液的組成為每100ml含有NaCl 5g，KCl 0.125g，KH2PO4 0.125g，Na2HPO41.81g，吐溫-20 20ul，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述抗體稀釋液的組成為每5ml含有小牛血清500ul，質(zhì)量百分濃度為1％硫柳汞水溶液100ul，100mM的鐵氰化鉀50ul，吐溫-20 2.5ul，10mg/ml的慶大霉素25ul，余量為pH7.4的0.01M的PBS。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述辣根酶標記親和素稀釋液的組成為每5ml含有NaCl 0.025g，KCl 0.00125g，KH2PO4 0.00125g，Na2HPO4 0.009g，余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述底物顯色液A液的組成為每20ml含有醋酸鈉0.544g，檸檬酸0.064g，體積百分濃度為30％的H2O2 12ul，余量為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述底物顯色液B液的組成為每20ml含有EDTA-Na 0.008g，檸檬酸0.038g，丙三醇2ml，四甲基聯(lián)苯胺0.008g，余量為水，避光保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，其特征是所述終止液的組成為每20ml含有濃H2SO4 1.15ml，余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人、大鼠、小鼠HSP70雙抗夾心法檢測試劑盒，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的固化HSP70單克隆抗體的酶標板和設(shè)在盒體內(nèi)的物質(zhì)，盒體內(nèi)的物質(zhì)包括HIS-HSP70蛋白標準品、生物素標記的HSP70多克隆抗體、樣品稀釋液、洗滌緩沖液、抗體稀釋液、辣根酶標記親和素、辣根酶標記親和素稀釋液、底物顯色液A液、底物顯示液B液和終止液；本發(fā)明的優(yōu)點是檢測靈敏度高，準確性強、成本低，可以同時檢測人、大鼠、小鼠細胞裂解液、組織提取液、血漿和血清中的HSP70蛋白。
文檔編號G01N33/543GK101105498SQ20071005862
公開日2008年1月16日 申請日期2007年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者錢令嘉, 雪 冷, 銳 戰(zhàn) 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所