專利名稱：巨細胞病毒特異性細胞免疫應(yīng)答體外檢測模型的制作方法
巨細胞病毒特異性細胞免疫應(yīng)答體外檢測模型技術(shù)領(lǐng)域 該發(fā)明涉及一種能在體外檢測巨細胞病毒(CMV)特異性細胞免疫 應(yīng)答的模型，該模型不僅可以方便地在體外檢測患者的巨細胞病毒特異性細胞 免疫應(yīng)答，而且可以篩選新型藥物。
背景技術(shù)：
近年來，科學(xué)家們紛紛致力于開發(fā)新的抗CMV藥物，以期抑制病 毒引起的免疫病理損傷。新藥療效的檢測，首先需要建立一 CMV特異性免疫應(yīng) 答體外檢測模型，但目前國內(nèi)外就此尚未見相關(guān)報道。將經(jīng)典的CMV實驗室株 感染人成纖維母細胞為抗原遞呈細胞，流式細胞儀檢測細胞因子及HLA分子表 達的方法，分析該病毒株感染的細胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，研究發(fā)現(xiàn)感染細胞 表面MHC I類分子表達明顯降低，未能檢測到病毒特異性的細胞免疫應(yīng)答，因此 并不適宜作為檢測模型。發(fā)明內(nèi)容為排除MHC I類分子表達降低而對抗原遞呈的影響，本發(fā)明建立一 種以CMV突變株感染人成纖維母細胞為抗原遞呈細胞，刺激淋巴細胞，釆用流 式細胞儀檢測細胞內(nèi)IFN- Y表達的方法，建立一在體外檢測CMV特異性細胞免 疫應(yīng)答的模型；該突變體基因組缺失了一段抑制主要組織相容性復(fù)合體I類分 子表達的基因序列USll、 US12，不影響MHC I類分子的表達，故不影響細胞對 病毒特異性抗原的遞呈。
具體實施例方式-.CMV感染人,錐母細胞剌激外周血淋巴細胞將人成纖維母細胞接種于 24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入2mlDMEM培養(yǎng)基，細胞長成單層，鋪滿全孔， 按照l: l的比例(數(shù)量比)，加入CMV突變株病毒液，37。C感染l小時，棄 掉游離的病毒液，加入2ml DMEM細胞培養(yǎng)基，在37。C 、 5% C02的孵箱中孵育48小時，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，之后加入2乂106外周血淋巴細 胞，孵育2小時后，加入10 ng/ml高爾基體抑制劑Brefeldin A，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。二 細胞內(nèi)細胞因子標記法檢測IFN-y:培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，PBS洗滌 一次，將細胞重懸于含0. 02% EDTA的PBS溶液中，37°C孵育15分鐘，離心， PBS洗滌一次，將細胞重懸于紅細胞裂解液中室溫避光孵育10分鐘，洗滌、 重懸細胞；加入破膜劑室溫避光反應(yīng)20分鐘，PBS洗滌一次，加入鼠抗人 CD8-APC、 CD3-PerCP和IFN- y -FITC抗體4。C避光標記30分鐘，PBS洗滌一 次后，重懸細胞，在流式細胞儀上進行檢測，分析受到CMV感染細胞的刺激 時，淋巴細胞產(chǎn)生IFN- y作為CMV特異性免疫應(yīng)答的指標。本發(fā)明的有益效果是，能在體外檢測患者的巨細胞病毒特異性的細胞免疫應(yīng)答；若在該體系中加入待檢的新藥，即可檢測其對細胞免疫應(yīng)答的影響，從而篩選新藥。
權(quán)利要求
1. 一種巨細胞病毒特異性細胞免疫應(yīng)答體外檢測模型，由三部分組成重組巨細胞病毒感染人成纖維母細胞，刺激淋巴細胞，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)細胞因子，其特征在于重組巨細胞病毒突變體缺失了一段抑制主要組織相容性復(fù)合體I類分子表達的基因序列US11、US12，將該重組病毒以1∶1(數(shù)量比)感染人成纖維母細胞48小時，加入淋巴細胞共同孵育6小時，然后流式細胞儀檢測細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ的表達，作為病毒特異性細胞免疫應(yīng)答的指標。
全文摘要
抗巨細胞病毒新藥療效的檢測，需要建立一巨細胞病毒特異性免疫應(yīng)答的體外檢測模型，但目前國內(nèi)外就此尚未見相關(guān)報道。以傳統(tǒng)的巨細胞病毒實驗室株感染細胞建立的模型，因病毒抑制主要組織相容性復(fù)合體I類分子的表達，影響抗原遞呈，而不能檢測到病毒特異性免疫應(yīng)答。本發(fā)明采用巨細胞病毒突變株感染人成纖維母細胞為抗原遞呈細胞，刺激淋巴細胞，流式細胞儀檢測細胞因子γ-干擾素的表達作為指標，建立一巨細胞病毒特異性細胞免疫應(yīng)答的體外檢測模型。在此模型中加入待檢藥物，即可以檢測該藥對病毒特異性細胞免疫應(yīng)答的影響。
文檔編號G01N33/569GK101246166SQ200710063900
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日
發(fā)明者斌 孫, 武志明, 王延軍 申請人:王延軍;孫 斌;武志明