專利名稱：測定通過抑制整聯(lián)蛋白表達(dá)所介導(dǎo)的血管生成抑制劑的作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定影響整聯(lián)蛋白表達(dá)的藥物，優(yōu)選血管生成抑制劑的作用的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是表現(xiàn)出高死亡率的疾病，用抗癌劑進(jìn)行治療的目的一般是改善患者的QOL和延長生存時(shí)間。然而，難以在短時(shí)間內(nèi)確定藥物延長生命的效果，因此使用腫瘤減小速度和血液腫瘤抗原水平作為替代標(biāo)志物以用作療效指標(biāo)。
此外，因?yàn)樵诳拱﹦┑呐R床研究中使用確定藥拘作用的生命延長時(shí)期也需要長期研究，可在較短時(shí)間內(nèi)評(píng)價(jià)的腫瘤減小速度已用作替代標(biāo)志物。然而，已有人指出，腫瘤減小速度不是必然起著生命延長指標(biāo)的作用。因此，除了腫瘤減小速度以外，人們已嘗試著使用疾病進(jìn)展的時(shí)間、患病的存活時(shí)間、生物標(biāo)志物等來作為替代標(biāo)志拘。然而，這些方法仍然沒有建立起來。
人們認(rèn)為，如果表明通過施用藥物引起的并且與存活時(shí)間延長密切相關(guān)的變化的生物標(biāo)志物可用作替代標(biāo)志物，則就易于在臨床研究中確定出適當(dāng)?shù)闹委煼椒?，并且?biāo)志拘可在治療期間用作藥物療效的指標(biāo)。
下面是已經(jīng)報(bào)道過的替代標(biāo)志物。
Panorex是涉及糖蛋白EpCAM的抗體，其首先是作為結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)的，之后經(jīng)鑒定是粘著分子。其與存活率的關(guān)系是作為保留在骨鏈中的微癌細(xì)胞消除的替代標(biāo)志物測定的(Stephan B.等人，Cllnical Cancer Research，1999，5，3999-4004)，并且平行進(jìn)行了大規(guī)模的III期臨床試驗(yàn)。
前列腺特異性抗原已經(jīng)在前列腺癌的激素治療中用作替代標(biāo)志物以確定最佳劑量(Denis L.，&Mahler C.Urology，1996，47(1ASuppl.)，26-32)。
至于血管生成抑制劑作為替代標(biāo)志物的應(yīng)用，已經(jīng)在BMS275291(一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)的I期臨床試驗(yàn)中測定了在傷口愈合中(在皮膚上切一個(gè)口之后)使用血管生成作為指標(biāo)的方法。此外，對(duì)于另一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，已經(jīng)報(bào)道了在腫瘤位點(diǎn)使用酶活性作為標(biāo)志物的方法(Clin。Cancer Res.，2000，6(8)，3290-6)。
另外，預(yù)計(jì)血管生成抑制劑是除癌癥之外的疾病的有效治療劑，這些疾病例如動(dòng)脈硬化、糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早熟性視網(wǎng)膜病、老年黃斑變性、新血管形成性青光眼、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、血管瘤、血管纖維瘤等。如果發(fā)現(xiàn)了血管生成的替代標(biāo)志物，就能夠通過使用其作為這些疾病中的指標(biāo)來確定適當(dāng)?shù)乃幬飫┝?、藥物效果和給藥時(shí)間。
整聯(lián)蛋白是在細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞粘著分子，并且由α-鏈和β-鏈構(gòu)成。整聯(lián)蛋白參與細(xì)胞外基質(zhì)膜蛋白與細(xì)胞之間的粘著以及細(xì)胞之間的粘著。當(dāng)細(xì)胞粘著分子與整聯(lián)蛋白結(jié)合時(shí)，細(xì)胞中的信號(hào)系統(tǒng)就開始運(yùn)轉(zhuǎn)。結(jié)果不僅發(fā)生了細(xì)胞粘著，還發(fā)生了細(xì)胞延伸、細(xì)胞生長、細(xì)胞程序死亡、分化、細(xì)胞支架定向、細(xì)胞遷移、組織形成、癌侵襲和轉(zhuǎn)移、傷口愈合、血液凝集等。
在這些整聯(lián)蛋白當(dāng)中，已知整聯(lián)蛋白α2β1作用于膠原、層粘連蛋白等粘著分于，并在血管生成期間參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的管形成(George E等人，Exp.Cell.Res.，1996，224，39-51)。此外，據(jù)報(bào)道，涉及整聯(lián)蛋白α1和整聯(lián)蛋白α2的抗體在體內(nèi)抑制VEGF引起的血管生成(Donald R.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1997，94，13612-13617)。
整聯(lián)蛋白αvβ3特異性地存在于處于血管生成狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞中，并且據(jù)報(bào)道，在使用小雞胚胎絨毛尿囊的血管生成模型中，整聯(lián)蛋白αvβ3中和抗體(LM609)抑制由成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)引起的血管生成(Brook，P.C.等人，Science，1994，264，569-571)。此外，據(jù)報(bào)道，整聯(lián)蛋白αvβ3參與由FGF-2和腫瘤壞死因子-α引起的血管生成，整聯(lián)蛋白αvβ5參與由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-α引起的血管生成(Friedlander，M.等人，Science，1995，270，1500-1502)?？拐?lián)蛋白αvβ3抗體和整聯(lián)蛋白αvβ3抑制劑目前正處于臨床試驗(yàn)階段。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是提供用于影響整聯(lián)蛋白，優(yōu)選整聯(lián)蛋白α2的表達(dá)，并抑制血管生成的藥物的替代標(biāo)志物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)于通過抑制整聯(lián)蛋白α2表達(dá)來抑制血管生成的通式(II)化合物(在下文中稱為“化合物A”)所代表的藥物，在其降低整聯(lián)蛋白α2表達(dá)、減弱血管生成以及由此抑制癌細(xì)胞生長的狀態(tài)下，周圍血液中血小板表面上的整聯(lián)蛋白α2表達(dá)也被降低了。
他們還發(fā)現(xiàn)，位于周圍血液中的血小板表面上的整聯(lián)蛋白α2可用作血管生成抑制的替代標(biāo)志物，并由此完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供下列內(nèi)容。
1.測試藥物對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的方法，包括如下步驟測定施用藥物的患者血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量確定藥物對(duì)除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的步驟。
2.依據(jù)1的方法，其中所述整聯(lián)蛋白是整聯(lián)蛋白α2。
3.依據(jù)1的方法，其中所述整聯(lián)蛋白表達(dá)量是通過免疫化學(xué)方法測定的。
4.依據(jù)3的方法，其中所述免疫化學(xué)方法是FACS法。
5.用于定量測定整聯(lián)蛋白的在如3所定義的方法中使用的試劑。
6.依據(jù)1的方法，其中所述整聯(lián)蛋白表達(dá)量是通過測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的量來測定的。
7.依據(jù)6的方法，其中mRNA的量是通過定量PCR測定的。
8.用于定量測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的在如6所定義的方法中使用的試劑。
9.依據(jù)2的方法，其中所述藥物是通式(I)所代表的磺酰胺化合拘或其可藥用鹽或水合物
其中B代表C6-C10芳環(huán)或6-10元雜芳環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代和部分飽和的；K代表單鍵、-CH＝CH-或-(CR4bR5b)mb，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分別代表氫原子或C1-C4烷基，且mb是整數(shù)1或2；R1代表氫原子或C1-C6烷基；Z代表單鍵或-CO-NH-；且R代表C6-C10芳環(huán)或6-10元雜芳環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代和部分飽和的。
10.依據(jù)9的方法，其中R代表吲哚、喹啉或異喹啉。
11.依據(jù)2的方法，其中所述藥拘是通式(Ia)所代表的磺酰胺化合物或其可藥用鹽或水合物 其中Aa代表可以被取代的單環(huán)或二環(huán)芳環(huán)；Ba代表6元不飽和烴環(huán)或含有一個(gè)氮原子作為雜原子的不飽和6元雜環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代的；Ca代表可以被取代的含有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的5元雜環(huán)；R1a代表氫原子或C1-C6烷基；Wa代表單鍵或-CH＝CH-；Ya代表碳或氮原子；Za代表-N(R2a)-，其中R2a代表氫原子或低級(jí)烷基，或氮原子。
12.依據(jù)11的方法，其中Wa代表單鍵。
13.依據(jù)11的方法，其中Wa代表單鍵，Za代表-NH-，且Ya代表碳原子。
14.依據(jù)11-13任一項(xiàng)的方法，其中Ba代表可以被取代的苯或吡啶。
15.依據(jù)11-14任一項(xiàng)的方法，其中Ca代表可以被取代的吡咯。
16.依據(jù)11的方法，其中Aa代表可以被取代的苯或吡啶，Ba代表可以被取代的苯，Ca代表可以被取代的吡咯，Wa代表單鍵，且Za代表-NH-。
17.依據(jù)2的方法，其中所述藥物是通式(Ib)所代表的含有磺酰胺的雜環(huán)化合物或其可藥用鹽或水合物 其中Ab代表氫原子；鹵素原子；羥基；可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)kbNR2bR3b，其中R2b和R3b可相同或不同，并分別代表氫原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且kb是0或1；可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基；或可具有選自下面提及的組A的取代基的苯基或苯氧基；Bb代表可具有選自下面提及的組A的取代基的芳基或單環(huán)雜芳基，或 其中Qb代表可具有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的芳環(huán)，Mb代表與Qb共享一個(gè)雙鍵的C5-C12不飽和單環(huán)或多元環(huán)，所述環(huán)可具有1-4個(gè)選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，Qb和Mb可共享一個(gè)氮原子，且Qb和Mb可具有選自下面提及的組A的取代基；Kb代表單鍵或-(CR4bR5b)ab，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分別代表氫原子或C1-C4烷基，且mb是整數(shù)1或2；Tb、Wb、Xb和Yb可相同或不同，并分別代表＝C(Db)-，其中Db代表氫原子、鹵素原子、羥基、可被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基、氰基、-(CO)nbNR6bR7b，其中R6b和R7b可相同或不同，并分別代表氫原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且nb是0或1，或可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基；或氮原于；Ub和Vb可相同或不同，并分別代表＝C(Db)-，其中Db如上所定義，氮原子、-CH2-、氧原子或-CO-；Zb代表單鍵或-CO-NH-；R1b代表氫原子或C1-C4烷基；代表單鍵或雙鍵；組A；鹵素原子；羥基；可被鹵素原于取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-R8bR9bN(NH)pb-，其中R8b和R9b可相同或不同，并分別代表氫原子或可被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且pb是0或1，R8b和R9b可以與它們所鍵合的氮原子一起形成5或6元環(huán)，所述環(huán)還可以進(jìn)一步含有氮原子、氧原子或硫原子，并且可以被取代；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺?；豢杀蝗〈腃1-C8?；?C1-C4烷基)-S(O)2b-(C1-C4亞烷基)，其中2b是整數(shù)0、1或2；可被取代的C1-C4烷基或苯基磺?；被?(CO)qbNR10bR11b，其中R110b和R111b可相同或不同，并分別代表氫原子或可被鹵素原子取代的C1-C4烷基或可被C1-C4烷基取代的氨基，且qb是0或1；或可被取代的芳基或雜芳基。
18.依據(jù)17的方法，其中Ub和Vb分別代表＝C(Db)-，其中Db如上所定義，或氮原子。
19.依據(jù)17或18的方法，其中Zb代表單鍵。
20.依據(jù)17-19任一項(xiàng)的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb當(dāng)中至少有一個(gè)代表氮原子。
21.依據(jù)17-20任一項(xiàng)的方法，其中Ab代表鹵素原子；可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)rbNR12bR13b，其中R12b和R13b可相同或不同，并分別代表氬原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且rb是0或1；或可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基。
22.依據(jù)17-21任一項(xiàng)的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb當(dāng)中僅有一個(gè)代表氨原子。
23.依據(jù)17-22任一項(xiàng)的方法，其中Tb、Wb和Yb當(dāng)中僅有一個(gè)代表氮原子。


圖1表示的是化合拘A對(duì)整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的影響。
圖2表示的是抗整聯(lián)蛋白α2抗體對(duì)管形成的影響。
圖3表示的是化合物A對(duì)管形成的影響。
圖4表示的是化合拘A對(duì)腫瘤體積增加的抑制作用。
圖5表示的是化合物A對(duì)血小板中整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的影響。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明方法是測試藥拘對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的方法，包括如下步驟測定施用藥物的患者血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量確定藥物對(duì)除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的步驟。
整聯(lián)蛋白優(yōu)選是整聯(lián)蛋白α2。整聯(lián)蛋白α2是在細(xì)胞表面上表達(dá)的粘著分子的整聯(lián)蛋白家族中的一個(gè)成員。人整聯(lián)蛋白α2的序列以登記號(hào)NM_002203登記在GenBank中。
上文提及的化合拘A降低整聯(lián)蛋白α2表達(dá)，特別是表現(xiàn)出血管生成抑制作用和抗腫瘤生長作用。因此，化合物A所代表的藥物的作用可通過測定血小板上整聯(lián)蛋白α2的表達(dá)量來以較高的靈敏度測定。
給患者施用藥拘的劑量和方法沒有特別限制，可使用適于該藥物的劑量和方法。本發(fā)明方法優(yōu)選用于測定通過系統(tǒng)給藥例如口服給藥施用的藥物的影響。
對(duì)于除血小板以外的細(xì)胞沒有特別限制，但優(yōu)選其中可發(fā)生血管生成的組織的細(xì)胞。例如，可提及的是腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞。此外，它們可優(yōu)選為其中信號(hào)例如關(guān)于細(xì)胞生長、細(xì)胞程序死亡和分化的信號(hào)是經(jīng)由整聯(lián)蛋白α2傳遞的成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，例如黑素瘤細(xì)胞。另外，因?yàn)橐呀?jīng)在單核細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞中證實(shí)了整聯(lián)蛋白α2表達(dá)，所以還可以提及這些細(xì)胞。本發(fā)明方法還可用于評(píng)價(jià)這些細(xì)胞的功能。
用于測定血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的方法沒有特定限制。整聯(lián)蛋白表達(dá)量可通過免疫化學(xué)方法等測定，或者可測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的量。
基于免疫化學(xué)方法的測定整聯(lián)蛋白表達(dá)量的方法的實(shí)例包括FACS方法。FACS方法是通過使用熒光激活的細(xì)胞分類劑測定用熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行免?；瘜W(xué)染色的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度等的方法。
測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的量的方法的實(shí)例包括定量PCR。
下面將以下列順序詳細(xì)解釋測定表達(dá)量的步驟的實(shí)施方案1.分離血小板，2.定量測定血小板表面上的整聯(lián)蛋白的量，和3.定量測定血小板中的整聯(lián)蛋白mRNA的量。
1.分離血小板血小板可通過離心、凝膠過濾、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)來分離。
1)離心向血液中加入10％體積的3.8％檸檬酸鈉水溶液，并將該混合物以100×g于室溫離心10分鐘。將上層液用作富含血小板的血漿，并以1500×g離心10分鐘。從沉淀中獲得血小板。
2)流式細(xì)胞術(shù)將用PBS等稀釋的血液在流式細(xì)胞計(jì)中流動(dòng)，并暴露于激光束或類似光束。根據(jù)同時(shí)產(chǎn)生的前散射光和側(cè)散射光的強(qiáng)度，可從其它血細(xì)胞中分離出血小板。
2.定量測定在血小板表面上的整聯(lián)蛋白的量在血小板表面上的整聯(lián)蛋白的量可通過免疫化學(xué)方法，例如免疫組織學(xué)染色、ELISA、Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)等來定量測定。在ELISA中，例如，通過涉及血小板表面抗原的抗體將血小板結(jié)合在固相上，然后固定在固相上，并洗滌。然后讓標(biāo)記的抗整聯(lián)蛋白抗體與其反應(yīng)，并且可由結(jié)合的標(biāo)記拘的量定量測定在血小板表面上的整聯(lián)蛋白。在Western印跡中，例如，將分離的血小板溶解在含有SDS的緩沖液中，然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡。印跡在膜上的整聯(lián)蛋白可通過使用標(biāo)記的抗整聯(lián)蛋白抗體來定量測定。在這種情況下，如果同時(shí)通過使用涉及血小板表面抗原的抗體來定量測定血小板的量，則還可以定量測定每個(gè)血小板上的整聯(lián)蛋白的量。
在流式細(xì)胞術(shù)中，例如，將金血稀釋，并與標(biāo)記的抗整聯(lián)蛋白抗體結(jié)合。根據(jù)前散射光和側(cè)散射光可分離出血小板級(jí)份，并且可通過測定血小板上的熒光強(qiáng)度來定量測定血小板上整聯(lián)蛋白的量。下文中將具體解釋流式細(xì)胞術(shù)，但是本發(fā)明的范圍并不受該解釋的限制。通過使用流式細(xì)胞術(shù)，可通過使用未分離血小板的全血來定量測定整聯(lián)蛋白的量。
將4μl血液用396μl含有0.0038％檸檬酸鈉水溶液的PBS稀釋。將用FITC標(biāo)記的涉及整聯(lián)蛋白的抗體，優(yōu)選涉及整聯(lián)蛋白α2的抗體，例如對(duì)于小鼠，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠CD49b抗體(BD Pharmingen，Cat.No.BD-558757)，或?qū)τ谌?，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗人CD49b抗體(BDPharmingen，Cat.No.BD-555498)，用含有0.1％BSA至適當(dāng)濃度的PBS稀釋。將10μl抗體加到90μl稀釋的血液中。讓該混合物在室溫反應(yīng)60分鐘，并通過濾器(FALCON，Cat.No.2235).向該殘余物中加入900μl PBS，并根據(jù)通過使用流式細(xì)胞計(jì)(BectonDickinson，F(xiàn)ACS Calibur)測定的前散射光和側(cè)散射光的強(qiáng)度分離血小板級(jí)份。通過測定血小板上的熒光強(qiáng)度未定量測定血小板上的整聯(lián)蛋白，優(yōu)選整聯(lián)蛋白α2。
3.定量測定血小板中整聯(lián)蛋白mRNA的量1)提取RNA通過胍硫氰酸鹽方法、苯酚方法等可提取RNA。將分離的血小板溶解在1ml ISOGEN中，并在室溫放置5分鐘。向該混合物中加入0.2ml氯仿，將該混合物攪拌，然后放置2分鐘。將該反應(yīng)混合物在4℃以13000rpm離心15分鐘(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)，并將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)管中。加入0.5ml異丙醇，將該混合拘在室溫放置5分鐘。將該混合物在4℃以13000rpm離心10分鐘(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)，并棄去上清液。向該沉淀中加入1ml 70％乙醇水溶液，并將該混合物在4℃以15000rpm離心15分鐘(MX-150，TOMY，Rotor TMA-11)。棄去上清液，將沉淀溶解在不含RNase的水中。
2)定量測定RNA可通過Northern印跡分析、斑點(diǎn)印跡分析、RNase保護(hù)分析、競爭性RT-PCR、競爭性RT-PCR、定量PCR等技術(shù)定量測定RNA。定量PCR是優(yōu)選的。下面解釋定量PCR技術(shù)，但是本發(fā)明的范圍不受該解釋的限制。如下所述通過使用TapMan Probe和ABI Prism7700 SequenceDetection System(Perkin-Blmer Applied Biosystems)進(jìn)行定量PCR。
用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR兩個(gè)步驟進(jìn)行操作。如下所述進(jìn)行第一個(gè)步驟-反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)向所獲得的RNA中加入dNTP、低聚d(T)16引物、RNase抑制劑和Multiscribe Reverse Transcriptase(Perkin-ElmerApplied Biosystems)，將該混合物在25℃保持10分鐘，然后將該混合物在48℃加熱30分鐘。將該混合物在95℃加熱5分鐘以終止該反應(yīng)。
將所獲得的cDNA用于第二個(gè)步驟的PCR中。在例如包含下列組分的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR2.5ng cDNA、1×TaqMan PCR緩沖液、3mMMgCl2、分別是200μM的dATP、dCTP和dGTP、400μM dUTP、200nM引物對(duì)、0.01U/μl AmpErase UNG和0.025U/μl AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin-Blmer Applled Biosystems)。對(duì)于反應(yīng)條件，反應(yīng)在50℃進(jìn)行2分鐘，在95℃進(jìn)行10分鐘，然后是由在95℃進(jìn)行20秒的反應(yīng)、在55℃進(jìn)行20秒的反應(yīng)和在72℃進(jìn)行30秒的反應(yīng)組成的循環(huán)，該循環(huán)重復(fù)40次。通過使用Primer Expression(Perkin-ElmerApplied Biosystems)來設(shè)計(jì)引物和探針。為了比較兩種或更多種樣品，在根據(jù)持家基因的mRNA水平進(jìn)行校正后來使用定量測定的值，其中所述持家基因在每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄量，優(yōu)選GAPDH的mRNA水平方面表現(xiàn)出小的差異。
藥物對(duì)于除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響是根據(jù)通過測定如上所述的表達(dá)量的步驟所測定的表達(dá)量來確定的。該確定可根據(jù)血小板中的整聯(lián)蛋白表達(dá)量與除血小板以外的細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白表達(dá)量的關(guān)系來確定。也就是說，如果血小板中的表達(dá)量下降，則可以確定出藥拘的影響是降低除血小板以外的細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白表達(dá)。反之，當(dāng)血小板中的表達(dá)量增加時(shí)，則可以確定出藥拘的影響是增加除血小板以外的細(xì)胞中的整聯(lián)蛋白表達(dá)。
此外，本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法中的定量測定試劑。
第一個(gè)實(shí)施方案的定量測定試劑是在用于測試藥物對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的方法中使用的試劑，其中所述方法包括如下步驟通過免疫化學(xué)方法測定施用藥拘的患者血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量確定藥物對(duì)除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的步驟。
該實(shí)施方案的定量測定試劑的組分可類似于用于整聯(lián)蛋白的免疫化學(xué)定量測定的試劑。根據(jù)基于免疫化學(xué)方法的測定方法，該實(shí)施方案的定量測定試劑可通過選自常用于制備定量測定試劑的那些技術(shù)的技術(shù)來制得。通常包括抗整聯(lián)蛋白抗體?？拐?lián)蛋白抗體可用熒光拘質(zhì)標(biāo)記。
當(dāng)定量測定試劑是由兩種或更多種組分構(gòu)成的時(shí)，其可以作為試劑盒提供。此外，定量測定試劑可以作為還含有可用于定量測定試劑的載體的組合物來提供。例如，試劑盒可以包括熒光標(biāo)記的涉及整聯(lián)蛋白α2的單克隆抗體或涉及整聯(lián)蛋白α2的單克隆抗體與熒光標(biāo)記的抗小鼠Ig抗體、稀釋劑和固定溶液。
第二個(gè)實(shí)施方案的定量測定試劑是在用于測試藥拘對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的方法中使用的試劑，其中所述方法包括如下步驟通過測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的量來測定施用藥拘的患者血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量確定藥拘對(duì)除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的步驟。
該實(shí)施方案的定量測定試劑的組分可類似于用于定量測定編碼整聯(lián)蛋白的mRNA的試劑。根據(jù)mRNA定量測定方法，該實(shí)施方案的定量測定試劑可通過選自常用于制備定量測定試劑的那些技術(shù)的技術(shù)來制得。該方法的實(shí)例包括基于PCR的方法、雜交等。該試劑通常包括可用作引物或探針的與編碼整聯(lián)蛋白的mRNA互補(bǔ)的核酸。引物和探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)編碼已知整聯(lián)蛋白的核苷酸序列容易地設(shè)計(jì)。
當(dāng)定量測定試劑是由兩種或更多種組分構(gòu)成的時(shí)，其可以作為試劑盒提供。此外，定量測定試劑可以作為還含有可用于定量測定試劑的載體的組合物來提供。例如，試劑盒可以包括PCR引物，優(yōu)選用于定量PCR的標(biāo)記的引物、對(duì)照引物和對(duì)照DNA。
藥物優(yōu)選是通式(I)、(Ia)或(Ib)所代表的磺酰胺化合物或其可藥用鹽或它們的水合物。
在通式(I)中，由B和R代表的可以是被取代和部分飽和的C6-C10芳環(huán)或6-10元雜芳環(huán)是指具有6-10個(gè)碳原子的芳族烴基或含有至少一個(gè)氮原子、氧原子和硫作為雜原子的6-10元芳族雜環(huán)，每一所述基團(tuán)可具有一個(gè)或多個(gè)取代基，并且可以是部分飽和的。其具體實(shí)例包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、萘、喹啉、異喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、異吲哚、吲嗪、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑、4，5，6，7-四氫吲哚、1，2，3，4-四氫異喹啉、2，3-二氫苯并呋喃、二氫化茚、四氫萘酮、二氫吲哚、異二氫吲哚、色滿、四氫萘等。上述芳環(huán)可具有1-3個(gè)取代基。當(dāng)存在兩個(gè)或更多個(gè)取代基時(shí)，它們可相同或不同。取代基的實(shí)例包括可被低級(jí)烷基或低級(jí)環(huán)烷基取代的氨基；低級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基；羥基；硝基；巰基；氰基；低級(jí)烷硫基；鹵索；式-aa-ba-代表的基團(tuán)，其中aa代表單鍵、-(CH2)ka-、-O-(CH2)ka-、-S-(CH2)ka-或-N(R3a)-(CH2)ka-，其中ka是1-5的整數(shù)，R3a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ba代表-CH2-da，其中da代表可被低級(jí)烷基取代的氨基、鹵素原子、羥基、低級(jí)烷硫基、氰基或低級(jí)烷氧基；式-aa-ea-fa代表的基團(tuán)，其中aa如上所定義，ea代表-S(O)-或-S(O)2-，且fa代表可被低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基取代的氨基、低級(jí)烷基、三氟甲基、-(CH2)ma-ba或-N(R4a)-(CH2)ma-ba，其中ba如上所定義，R4a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ma是1-5的整數(shù)；式-aa-ga-ha代表的基團(tuán)，其中aa如上所定義，ga代表-C(O)-或-C(S)-，且ha代表可被低級(jí)烷基取代的氨基、羥基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、-(CH2)na-ba或-N(R5a)-(CH2)na-ba，其中ba如上所定義，R5a代表氫原子或低級(jí)烷基，且na是1-5的整數(shù)；式-aa-N(R6a)-ga-ia代表的基團(tuán)，其中aa和ga如上所定義，R6a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ia代表氫原子、低級(jí)烷氧基或fa(fa如上所定義)；式-aa-N(R7a)-ea-fa代表的基團(tuán)，其中aa、ea和fa如上所定義，且R7a代表氫原子或低級(jí)烷基；式-(CH2)pa-ja-(CH2)qa-ba代表的基團(tuán)，其中ja代表氧原子或硫原子，ba如上所定義，且pa和qa可相同或不同，并分別代表1-5的整數(shù)；式-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara代表可被低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素原子取代的苯基或雜芳基，且ua是0或1-5的整數(shù)；式-CONH-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara和ua如上所定義；式-SO2-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara和ua如上所定義；等等。
在通式(I)代表的化合物中，R優(yōu)選代表吲哚、喹啉或異喹啉。
在上述通式(Ia)中，Aa所代表的“可被取代的單環(huán)或二環(huán)芳環(huán)”是芳族烴環(huán)或含有至少一個(gè)氮原子、氧原子和硫原子的芳族雜環(huán)，每一所述環(huán)可在環(huán)上具有1-3個(gè)取代基。包含在Aa中的芳環(huán)的典型實(shí)例包括吡咯、吡唑、咪唑、噻吩、呋喃、噻唑、唑、苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、萘、喹啉、異喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、異吲哚、吲嗪、吲唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并唑、苯并咪唑、苯并吡唑、苯并噻唑等。上述芳環(huán)可具有1-3個(gè)取代基。當(dāng)存在兩個(gè)或更多個(gè)取代基時(shí)，它們可相同或不同。取代基的實(shí)例包括可被低級(jí)烷基或低級(jí)環(huán)烷基取代的氨基；低級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基；羥基；硝基；巰基；氰基；低級(jí)烷硫基；鹵素；式-aa-ba-代表的基團(tuán)，其中aa代表單鍵、-(CH2)ka-、-O-(CH2)ka-、-S-(CH2)ka-或-N(R3a)-(CH2)ka-，其中ka是1-5的整數(shù)，R3a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ba代表-CH2-da，其中da代表可被低級(jí)烷基取代的氨基、鹵素、羥基、低級(jí)烷硫基、氰基或低級(jí)烷氧基；式-aa-ea-fa代表的基團(tuán)，其中aa如上所定義，ea代表-S(O)-或-S(O)2-，且fa代表可被低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基取代的氨基、低級(jí)烷基、三氟甲基、-(CH2)ma-ba或-N(R4a)-(CH2)．a(chǎn)-ba，其中ba如上所定義，R4a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ma是1-5的整數(shù)；式-aa-ga-ha代表的基團(tuán)，其中aa如上所定義，ga代表-C(O)-或-C(S)-，且ha代表可被低級(jí)烷基取代的氨基、羥基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、-(CH2)na-ba或-N(R5a)-(CH2)na-ba，其中ba如上所定義，R5a代表氫原子或低級(jí)烷基，且na是1-5的整數(shù)；式-aa-N(R6a)-ga-ia代表的基團(tuán)，其中aa和ga如上所定義，R6a代表氫原子或低級(jí)烷基，且ia代表氫原子、低級(jí)烷氧基或fa(fa如上所定義)；式-aa-N(R7a)-ea-fa代表的基團(tuán)，其中aa、ea和fa如上所定義，且R7a代表氫原子或低級(jí)烷基；式-(CH2)pa-ja-(CH2)qa-ba代表的基團(tuán)，其中ja代表氧原子或硫原子，ba如上所定義，且pa和qa可相同或不同，并分別代表1-5的整數(shù)；式-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara代表可被低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或鹵素原子取代的苯基或雜芳基，且ua是0或1-5的整數(shù)；式-CONH-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara和ua如上所定義；式-SO2-(CH2)ua-Ara代表的基團(tuán)，其中Ara和ua如上所定義；等等。
在上述取代基的實(shí)例中，當(dāng)取代基是被兩個(gè)烷基取代的氨基時(shí)，這些烷基可鍵合以形成5或6元環(huán)。此外，當(dāng)Aa是具有羥基或巰基的含氮雜環(huán)時(shí)，這些基團(tuán)通過共振可以以氧代或硫代基團(tuán)的形式存在。
Ba代表的“可以被取代的6元不飽和烴環(huán)或含有一個(gè)氮原子作為雜原子的不飽和6元雜環(huán)”是可以部分氫化，并且可以在環(huán)上具有一個(gè)或兩個(gè)取代基的苯或吡啶。當(dāng)存在兩個(gè)取代基時(shí)，它們可相同或不同。
Ca代表的“可以被取代的含有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的5元雜環(huán)”是可以部分氫化，并且可以在環(huán)上具有一個(gè)或兩個(gè)取代基的吡咯、吡唑或咪唑。當(dāng)存在兩個(gè)取代基時(shí)，它們可相同或不同。
Ba和Ca可具有的取代基的實(shí)例包括例如鹵素；氰基；低級(jí)烷基；低級(jí)烷氧基；羥基；氧代基；式-C(O)-ra代表的基同，其中ra代表氫原子、可被低級(jí)烷基取代的氧基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基或羥基；可被低級(jí)烷基取代的氨基；三氟甲基等。
在上述通式(Ia)中，R1a和R2a以及Aa、Ba和Ca可具有的取代基的定義中的低級(jí)烷基是指具有1-6個(gè)碳原于的直鏈或支鏈烷基。其實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基(戊基)、異戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，2-二甲基丙基、正己基、異己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基等。在這些基團(tuán)當(dāng)中，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基和異丁基是優(yōu)選的，甲基、乙基、正丙基和異丙基是最優(yōu)選的。
在Aa可具有的取代基的定義中的低級(jí)環(huán)烷基是具有3-8個(gè)碳原子的環(huán)烷基，其實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等。
在Aa、Ba和Ca可具有的取代基的定義中的低級(jí)烷氧基是指衍生自上述低級(jí)烷基的低級(jí)烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基和叔丁氧基。在這些基團(tuán)當(dāng)中，甲氧基和乙氧基是最優(yōu)選的。低級(jí)烷硫基是指衍生自上述低級(jí)烷基的低級(jí)烷硫基。鹵素原子的實(shí)例包括氟原子、氯原子、溴原子等。
在這些化合拘當(dāng)中，特別優(yōu)選的化合拘包括1)N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺2)N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-6-氯-3-吡啶磺酰胺3)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-4-氨磺酰基苯磺酰胺4)N-(5-溴-3-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺5)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺6)N-(4-溴-1 H-吲哚-7-基)-4-氰基苯磺酰胺7)N-(4-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺8)N-(3-溴-4-氯-1H-吲哚-7-基)-6-氨基-3-吡啶磺酰胺9)N-(3-溴-5-甲基-1H-吲哚-7-基)-5-氰基-2-噻吩磺酰胺1 0)N-(4-溴-3-氯-1H-吲哚-7-基)-2-氨基-5-嘧啶磺酰胺11)N-(3-氯-1H-吲哚-7-基)-4-氨磺?；交酋０返取?br> 通式(Ia)代表的磺酰胺衍生拘可以與酸或堿形成鹽。本發(fā)明還包括通式(Ia)代表的化合物的鹽。與酸形成的鹽的實(shí)例包括與無機(jī)酸形成的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽和硫酸鹽，以及與有機(jī)酸例如乙酸、乳酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸、苯甲酸、甲磺酸、對(duì)甲苯磺酸形成的鹽，與堿形成的鹽的實(shí)例包括無機(jī)鹽例如鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽，以及與有機(jī)堿例如三乙胺、精氨酸和賴氨酸形成的鹽。
在本發(fā)明中，Qb代表的“可具有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的芳環(huán)”是指芳烴或含有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的6元芳族雜環(huán)。包含在Qb中的芳環(huán)的實(shí)例包括苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪等。此外，M代表的“可具有1-4個(gè)選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子的C5-C12不飽和單環(huán)或多環(huán)”是與Qb共享一個(gè)雙鍵的不飽和單環(huán)或多環(huán)。其實(shí)例包括芳烴例如苯和萘，不飽和烴例如環(huán)戊烯、環(huán)己烯、環(huán)庚烯、環(huán)辛烯、環(huán)戊二烯、環(huán)庚二烯和環(huán)辛二烯，和不飽和雜環(huán)例如四氫吡啶、吡咯、呋喃、噻吩、唑、異唑、噻唑、異噻唑、吡唑、咪唑、三唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、三嗪、吲哚、異吲哚、喹啉、異喹啉、吲唑烷、萘啶、苯并呋喃、苯并吡喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并唑、苯并噻唑、吡咯并吡啶、吡啶并嘧啶和咪唑并吡啶。此外，表達(dá)語“Qb和Mb可共享一個(gè)氮原子”是指氮原子包含在兩個(gè)環(huán)的稠合點(diǎn)上。以該方式形成的環(huán)的實(shí)例包括吲唑烷、咪唑并[1，2-a]吡啶、咪唑并[1，5-a]吡啶、吡唑并[1，5-a]嘧啶等。
在本發(fā)明中，R1b、R4b和R5b中的C1-C4烷基或Ab、Db、R1b、R2b、R3b、R6b、R7b、R8b、R9b、R10b、R11b、R12b、R13b、R14b、R15b、G1B、G2b和組A中可被鹵素原子取代的C1-C4烷基中的C1-C4烷基是指具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。表達(dá)語“可被鹵素原子取代”是指這些烷基可被選自氟原子、氯原子、溴原子和碘原子的鹵素原子取代。實(shí)例包括一氟甲基、一氯甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-或2-一氟乙基、1-或2-一氯乙基、1-或2-一溴乙基、1，2-二氟乙基、1，2-二氯乙基、1，1，2，2，2-五氟乙基、3，3，3-三氟丙基等。在這些基團(tuán)當(dāng)中，一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-或2-一氟乙基、1，2-二氟乙基、1，1，2，2，2-五氟乙基等是優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，Ab、Db和組A中可被鹵素原子取代的C1-C4烷氧基中的C1-C4烷氧基是指具有1-4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，其實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。表達(dá)語“可被鹵素原子取代”是指烷氧基可被選自氟原于、氯原子、溴原子和碘原于的鹵素原于取代。實(shí)例包括-氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-或2-一氟乙氧基、1-或2-一氯乙氧基、1-或2-一溴乙氧基、1，2-二氟乙氧基、1，1，2，2，2-五氟乙氧基、3，3，3-三氟丙氧基等。在這些基團(tuán)當(dāng)中，一氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、1-或2-一氟乙氧基、1，2-二氟乙氧基、1，1，2，2，2-五氟乙氧基等是優(yōu)選的。
在本發(fā)明中，存在于Ab和Db中的C2-C4鏈烯基或炔基是指具有2-4個(gè)碳原子的鏈烯基或炔基。其實(shí)例包括乙烯基、烯丙基、2-或3-丁烯基、1，3-丁二烯基、乙炔基、2-丙炔基、2-甲基乙炔基、2-或3-丁炔基等。
在本發(fā)明中，存在于Bb和組A中的芳基是指芳烴。其實(shí)例包括苯基、萘基等。此外，雜芳基是含有一個(gè)或多個(gè)氨原子、氧原子和硫原子的單環(huán)或多環(huán)。其實(shí)例包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、呋喃基、噻吩基、唑基、異唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、吲哚基、吲嗪基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、酞嗪基等。
在本發(fā)明中，在R8b和R9b的定義中的表達(dá)語“R8b和R9b可以與它們所鍵合的氮原子一起形成5或6元環(huán)，并且所述環(huán)還可以含有氮原子、氧原子或硫原子”是表示，R8b和R9b可以與它們所鍵合的氮原子一起形成吡咯烷基、哌啶基、嗎啉代、硫代嗎啉代、哌嗪基等。
在本發(fā)明中，在組A中，在可被一-或二(C1-C4烷基)取代的氨基磺?；?、(C1-C4烷基)-S(O)2b-(C1-C4亞烷基)、C1-C4烷基或可被取代的苯基磺?；被约翱杀籆1-C4烷基取代的C1-C4烷基中的烷基是指如上所定義的烷基。亞烷基的實(shí)例包括亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、甲基亞甲基、1-或2-甲基亞乙基、1-、2-或3-甲基亞丙基、二甲基亞甲基等。
此外，C1-C8烷?；侵讣柞；?、乙酰基、丙?；?、丁?；?、異丁酰基、戊酰基、苯甲酰基等。
在本發(fā)明中，存在于Jb中的“可具有保護(hù)基的氨基”中的保護(hù)基沒有特別限制，只要所述保護(hù)基是已知用作常規(guī)有機(jī)合成中的氨基保護(hù)基即可。其實(shí)例包括芐氧基羰基、叔丁氧基羰基、甲?；?、乙酰基、氯乙酰基、2，2，2-三氯乙基、亞芐基、二苯甲基、三苯甲基等。此外，可具有保護(hù)基的數(shù)基中的保護(hù)基和R16b中的數(shù)基的保護(hù)基沒有特別限制，只要所述保護(hù)基是已知用作常規(guī)有機(jī)合成中的羧基保護(hù)基即可。其實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基、甲氧基甲基、2，2，2-三氯乙基、新戊酰氧基甲基、芐基等。
在本發(fā)明中，關(guān)于表達(dá)語“可被取代”或“可具有取代基”的取代基的實(shí)例包括鹵素原子；可被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；羥基；羥基(C1-C4烷基)；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基；C2-C4鏈烯基或炔基；氰基；C1-C8?；?；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基；羧基；(C1-C4烷氧基)羰基；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基甲?；?。
通式(Ib)代表的含有磺酰胺的雜環(huán)化合物可以與酸或堿形成鹽。本發(fā)明還包括通式(Ia)代表的化合物的鹽。與酸形成的鹽的實(shí)例包括與無機(jī)酸形成的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽和硫酸鹽，以及與有機(jī)酸例如乙酸、乳酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、檸檬酸、苯甲酸、甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸形成的鹽。另外，與堿形成的鹽的實(shí)例包括無機(jī)鹽例如鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽，以及與有機(jī)堿例如三乙胺、精氨酸和賴氨酸形成的鹽。
如果存在的話，這些化合物的水合物以及光學(xué)異構(gòu)體都包括在化合物的范圍內(nèi)。此外，還包括在體內(nèi)通過代謝例如氧化、還原、水解和結(jié)合而由這些化合物形成的，并表現(xiàn)出血管生成抑制作用的化合物。另外，本發(fā)明還包括在體內(nèi)經(jīng)過代謝例如氧化、還原和水解而生成本發(fā)明化合物的化合物。
用于本發(fā)明的化合物可通過多種不同方法制得。例如，某些方法具體公開在日本專利特開平7-165708和8-231505中。
實(shí)施例用下列實(shí)施例來更具體地解釋本發(fā)明。然而，本發(fā)明的范圍并不限于下列實(shí)施例。
化合物A對(duì)整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的影響從人臍帶中分離出人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并在EGM培養(yǎng)基(2％FCS，不含氫化可的松，Clonetics)中培養(yǎng)。將細(xì)胞在I-型膠原包被的燒瓶(Sumilon)中傳代培養(yǎng)，并使用第4代-第6代傳代培養(yǎng)物。抗人整聯(lián)蛋白α2抗體(A2-IIE10)購自Upstate BiotechnologyInc。抗人CD31抗體(JC/70A)和FITC標(biāo)記的鬼子抗小鼠免疫球蛋白的F(ab′)2片段購自Dako。
將細(xì)胞接種在25-cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并在CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。3小時(shí)后，用含有化合物A(5、50、500ng/ml)的相同培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞，將2×105個(gè)細(xì)胞漂浮在100μlPBS(0.1％BSA，0.05％NaN3)中。加入1μg初級(jí)抗體，將該細(xì)胞在4℃培養(yǎng)30分鐘，用PBS洗滌，然后與FITC標(biāo)記的次級(jí)抗體培養(yǎng)30分鐘。用PBS洗滌該細(xì)胞，然后用CellFix(Becton Dickinson)固定。使用FACS Calibur(Becton Dickinson)測定每份樣本的2×104個(gè)細(xì)胞的熒光值。通過使用不含初級(jí)抗體的對(duì)照樣本的熒光值校正每份樣本的熒光值來獲得細(xì)胞表面分子的表達(dá)量(依據(jù)下列公式)。
RMFI(相對(duì)平均熒光強(qiáng)度)＝樣本MFI(平均熒光強(qiáng)度)/背景MFI如圖1所示，化合物A(50、500ng/ml)降低了HUVEC上的整聯(lián)蛋白α2的表達(dá)量。
抗整聯(lián)蛋白α2抗體與化合物A對(duì)管形成的影響將I型膠原凝膠置于24孔平板的每個(gè)孔中并凝膠化，將懸浮在含有10ng/ml EGF(GIBCO BRL)和20ng/ml bFGF(GIBCO BRL)或20ng/ml VEGF(Wako Pure Chemical Industries)的不含血清的培養(yǎng)基(Human Bndothelial-SFM Basal Growth Medium，GIBCO BRL)中的HUVEC以1-1.2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)過夜，并覆蓋上用于膠凝的I型膠原凝膠。然后加入含有藥物(抗整聯(lián)蛋白α2抗體或化合物A)的上述不含血清的培養(yǎng)基(含有EGF和bFGF或VEGF)，并將該細(xì)胞在37℃再培養(yǎng)4天。對(duì)于抗整聯(lián)蛋白α2抗體的作用，使用96孔平板來進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。
培養(yǎng)后，用MTT給細(xì)胞著色，在顯微鏡下拍攝由HUVEC形成的管。通過掃描儀將照片電子化，通過使用圖像分析軟件Mac SCOPE 2.56(MITANI)測定管的長度來定量測定由HUVEC形成的管。
如圖2所示，表明抗整聯(lián)蛋白α2抗體抑制了由bFGF誘導(dǎo)的HUVEC的管形成，這意味著整聯(lián)蛋白α2參與由bFGF誘導(dǎo)的管形成。此外，如圖3所示，化合物A抑制由bFGF或VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的管形成。同時(shí)考慮參考實(shí)施例2的結(jié)果，可以認(rèn)為化合物A通過抑制整聯(lián)蛋白α2表達(dá)來抑制管形成。
化合拘A的腫瘤體積增加抑制作用與血小板整聯(lián)蛋白α2表達(dá)抑制作用的關(guān)系將100μl KP-1(人胰腺癌細(xì)胞株)在PBS中的懸浮液(5×107個(gè)細(xì)胞/ml)移植到小鼠(SLC KSN，雌性，Lot.No.085605376)的皮下組織內(nèi)。從移植后一周開始，每天口服施用2次0.5％甲基纖維素水溶液(載體)或者100或200mg/kg化合物A(懸浮在0.5％甲基纖維素中)。每天測定體重和腫瘤體積。每天用乙醚將小鼠麻醉，用毛細(xì)管從眼底采集血液。將4μl血液用396μl含有0.0038％檸檬酸鈉水溶液的PBS稀釋。用含有0.1％BSA的PBS將FITC標(biāo)記的抗小鼠CD49b抗體(Pharmingen，Cat.No.09794D，Lot.No.M006073)稀釋30倍。將10μl抗體加到90μl稀釋的血液中。讓該混合物在室溫反應(yīng)60分鐘，并流經(jīng)濾器(FALCON，Cat.No.2235)。向殘余物中加入900μl PBS，使用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，F(xiàn)ACSCalibur)基于前散射光和側(cè)散射光分離出血小板級(jí)份，并測定血小板上的熒光強(qiáng)度。
如圖4所示，化合物A在100mg/kg和200mg/kg的劑量抑制了KP-1腫瘤體積增加。同時(shí)考慮到參考實(shí)施例1和2的結(jié)果，可以認(rèn)為化合物A通過抑制整聯(lián)蛋白α2表達(dá)抑制了管形成，并且抑制由腫瘤誘導(dǎo)的血管生成，導(dǎo)致腫瘤體積的增加被抑制。
如圖5所示，化合物A降低了同時(shí)測定的血小板中的整聯(lián)蛋白α2的表達(dá)量。在現(xiàn)察到腫瘤體積增加被抑制的100mg/kg和200mg/kg的劑量現(xiàn)察到了血小板中整聯(lián)蛋白α2表達(dá)量的下降。因此，這證實(shí)了血小板中的整聯(lián)蛋白α2表達(dá)量可用作化合物A的腫瘤體積增加抑制作用的替代標(biāo)志物。
工業(yè)實(shí)用性依據(jù)本發(fā)明，通過使用血小板中的整聯(lián)蛋白表達(dá)量作為替代標(biāo)志物，能夠監(jiān)測通過抑制整聯(lián)蛋白表達(dá)來表現(xiàn)出其藥拘效力的藥拘例如血管生成抑制劑的效力。因?yàn)檠“逡子谧鳛闃颖臼占?，所以高效監(jiān)測變得可能。
權(quán)利要求
1.抗整聯(lián)蛋白α2抗體在制備用于確定藥物對(duì)整聯(lián)蛋白α2表達(dá)影響的方法中的試劑的應(yīng)用，其中所述方法包括如下步驟通過免疫化學(xué)方法測定由施用藥物的患者收集得到的血小板中整聯(lián)蛋白α2表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量的下降確定藥物對(duì)除血小板以外的整聯(lián)蛋白α2表達(dá)細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的影響的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述整聯(lián)蛋白α2表達(dá)細(xì)胞是選自內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫化學(xué)方法是流式細(xì)胞術(shù)法。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物是通式(I)所代表的磺酰胺化合物或其可藥用鹽或水合物 其中B代表C6-C10芳環(huán)或6-10元雜芳環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代和部分飽和的；K代表單鍵、-CH＝CH-或-(CR4bR5b)mb-，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分別代表氫原子或C1-C4烷基，且mb是整數(shù)1或2；R1代表氫原子或C1-C6烷基；Z代表單鍵或-CO-NH-；且R代表C6-C10芳環(huán)或6-10元雜芳環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代和部分飽和的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中R代表吲哚、喹啉或異喹啉。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物是通式(Ia)所代表的磺酰胺化合物或其可藥用鹽或水合物 Aa代表可以被取代的單環(huán)或二環(huán)芳環(huán)；Ba代表6元不飽和烴環(huán)或含有一個(gè)氮原子作為雜原子的不飽和6元雜環(huán)，每一所述環(huán)可以是被取代的；Ca代表可以被取代的含有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的5元雜環(huán)；R1a代表氫原子或C1-C6烷基；Wa代表單鍵或-CH＝CH-；Ya代表碳或氮原子；Za代表-N(R2a)-，其中R2a代表氫原子或碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷基，或氮原子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中Wa代表單鍵。
8.權(quán)利要求6的方法，其中Wa代表單鍵，Za代表-NH-，且Ya代表碳原子。
9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，其中Ba代表可以被取代的苯或吡啶。
10.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的方法，其中Ca代表可以被取代的吡咯。
11.權(quán)利要求6的方法，其中Aa代表可以被取代的苯或吡啶，Ba代表可以被取代的苯，Ca代表可以被取代的吡咯，Wa代表單鍵，且Za代表-NH-。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述藥物是通式(Ib)所代表的含有磺酰胺的雜環(huán)化合物或其可藥用鹽或水合物 其中Ab代表氫原子；鹵素原子；羥基；可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)kbNR2bR3b，其中R2b和R3b可相同或不同，并分別代表氫原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且kb是0或1；可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基；或可具有選自下面提及的組A的取代基的苯基或苯氧基；Bb代表可具有選自下面提及的組A的取代基的芳基或單環(huán)雜芳基，或 其中Qb代表可具有一個(gè)或兩個(gè)氮原子的芳環(huán)，Mb代表與Qb共享一個(gè)雙鍵的C5-C12不飽和單環(huán)或多環(huán)，所述環(huán)可具有1-4個(gè)選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，Qb和Mb可共事一個(gè)氮原子，且Qb和Mb可具有選自下面提及的組A的取代基；Kb代表單鍵或-(CR4bR5b)mb-，其中R4b和R5b可以相同或不同，并且分別代表氫原予或C1-C4烷基，且mb是整數(shù)1或2；Tb、Wb、Xb和Yb可相同或不同，并分別代表＝C(Db)-，其中Db代表氫原子、鹵素原子、羥基、可被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基、氰基、-(CO)nbNR6bR7b，其中R6b和R7b可相同或不同，并分別代表氫原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且nb是0或1，或可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基；或氮原子；Ub和Vb可相同或不同，并分別代表＝C(Db)-，其中Db如上所定義，氮原子、-CH2-、氧原子或-CO-；Zb代表單鍵或-CO-NH-；R1b代表氫原子或C1-C4烷基； 代表單鍵或雙鍵；組A鹵素原子；羥基；可被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-R8bR9bN(NH)pb-，其中R8b和R9b可相同或不同，并分別代表氫原子或可被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且pb是0或1，R8b和R9b可以與它們所鍵合的氮原子一起形成5或6元環(huán)，所述環(huán)還可以進(jìn)一步含有氮原子、氧原子或硫原子，并且可以被取代；可被一-或二-(C1-C4烷基)取代的氨基磺酰基；可被取代的C1-C8?；?；(C1-C4烷基)-S(O)8b-(C1-C4亞烷基)，其中sb是整數(shù)0、1或2；可被取代的C1-C4烷基或苯基磺?；被?；-(CO)qbNR10bR11b，其中R10b和R11b可相同或不同，并分別代表氫原子或可被鹵素原于取代的C1-C4烷基或可被C1-C4烷基取代的氨基，且qb是0或1；或可被取代的芳基或雜芳基．
13.權(quán)利要求12的方法，其中Ub和Vb分別代表＝C(Db)-，其中Db如上所定義，或氮原子。
14.權(quán)利要求12的方法，其中Zb代表單鍵。
15.權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb當(dāng)中至少一個(gè)代表氮原子。
16.權(quán)利要求12的方法，其中Ab代表鹵素原子；可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基或烷氧基；氰基；-(CO)rbNR12bR13b，其中R12b和R13b可相同或不同，并分別代表氫原子或可以被鹵素原子取代的C1-C4烷基，且rb是0或1；或可以被取代的C2-C4鏈烯基或炔基。
17.權(quán)利要求15的方法，其中Tb、Ub、Vb、Wb、Xb和Yb當(dāng)中僅有一個(gè)代表氮原子。
18.權(quán)利要求17的方法，其中Tb、Wb和Yb當(dāng)中僅有一個(gè)代表氮原子。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述除血小板以外的整聯(lián)蛋白α2表達(dá)細(xì)胞是其中可發(fā)生血管生成的組織的細(xì)胞，并且對(duì)整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的抑制是以血管生成抑制作用的形式確定的。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述除血小板以外的整聯(lián)蛋白α2表達(dá)細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，并且對(duì)整聯(lián)蛋白α2表達(dá)的抑制是以腫瘤生長抑制作用的形式確定的。
21.如權(quán)利要求4的方法，其中所述的藥物是N-(3-氰基-4-甲基-1H-吲哚-7-基)-3-氰基苯磺酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽，或其水合物。
全文摘要
測試藥物對(duì)整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的方法，包括如下步驟測定施用藥物的患者血小板中整聯(lián)蛋白表達(dá)量的步驟，和根據(jù)所測定的表達(dá)量確定藥物對(duì)除血小板以外的細(xì)胞中整聯(lián)蛋白表達(dá)的影響的步驟。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101025419SQ20071008781
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2002年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者小野尚人, 仙波太郎, 畑直子, 船橋泰博, 若林利明 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司