專利名稱：用動態(tài)散斑照明實現(xiàn)準共焦熒光顯微的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種利用動態(tài)散斑照明近似實現(xiàn)共焦熒光顯微(也就是準共焦熒光顯微)的新 方法和新裝置。該方法能夠以非侵入的方式，獲取生物組織樣品的高時間和空間分辨三維層 析顯微圖像信息，裝置結(jié)構(gòu)簡單、性價比高、后期數(shù)據(jù)處理方便、易于操作和推廣，有巨大 的應(yīng)用前景和市場，對于臨床疾病診斷和生命科學(xué)研究等都具有非常重要的意義。
技術(shù)背景在生命科學(xué)研究和臨床診斷領(lǐng)域，激光掃描共焦顯微[l]已經(jīng)成為一種能夠有效獲得生物 組織樣品高空間分辨三維層析圖像信息的顯微技術(shù)。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微技術(shù)相比，激光掃描 共焦顯微具有深層分辨能力和三維層析能力，并且能夠有效降低樣品的散射光對所獲得圖像 對比度的影響，改善了圖像分辨率和成像質(zhì)量[2]。傳統(tǒng)的激光掃描共焦顯微鏡一般采用復(fù)雜 的掃描成像方式來獲得整個樣品的圖像，因此圖像的獲取時間長，同時導(dǎo)致系統(tǒng)復(fù)雜，不便 于操作；另外，這種系統(tǒng)的價格昂貴，只有為數(shù)不多的一些科研單位和醫(yī)院有條件裝備。為 了克服傳統(tǒng)激光掃描共焦顯微鏡的缺點，早期的解決方法是采用隨機掃描的方式來提高圖像 信息的獲取時間[3]。但是，在共焦顯微鏡中所采用的共焦針孔在有效避免信號串擾和消除背 景影響的同時也大大降低了有效信號的功率。為此，提出了很多新穎的光學(xué)顯微成像方法， 例如，結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)[4]。這種顯微成像技術(shù)具有與傳統(tǒng)共焦顯微成像技術(shù)相近的 層析成像能力，但是不適用于對具有一定厚度的樣品成像。近年來，出現(xiàn)了一種使用散斑照 明的準共焦顯微成像技術(shù)[5]，這種顯微成像技術(shù)使用隨機變化的散斑圖案照明樣品，記錄一 系列寬場熒光圖像和相應(yīng)的散斑照明圖案，通過對所獲得的散斑熒光圖像的統(tǒng)計積分來獲得 樣品的寬場熒光顯微圖像。隨著對"散斑現(xiàn)象"的深入研究，以"散斑攝影術(shù)"和"散斑干涉計量 術(shù)"為基礎(chǔ)的散斑計量學(xué)逐步發(fā)展成為的一門嶄新的、具有廣闊應(yīng)用前景的學(xué)科[6-8]。目前， 使用散斑效應(yīng)對樣品進行寬場照明以獲得待測生物樣品的三維層析圖像已成為一種引起廣泛 關(guān)注的非掃描式三維熒光顯微成像技術(shù)。當使用激光光束投射到一光學(xué)粗糙表面(即表面平均起伏大于光波波長量級)上時，即 呈現(xiàn)出利用普通光照明見不到的斑點狀圖樣，其中的每一個斑點稱為散斑(Speckle),整個 圖樣稱為散斑圖案(Speckle Pattern) [9]，這種散斑現(xiàn)象是使用高相干光時所固有的。散斑的 物理成因可以簡單地說明如下當激光照射到物體表面，其上的每一個物點(面元)都可視 為子波源，產(chǎn)生散射光。由于激光具有高相干性的特點，物體表面的每一個物點散射的光將 和其他物點所產(chǎn)生的散射光發(fā)生干涉。又因為物體表面各個面元是隨機分布的(這種隨機性 由表面粗糙度引起)，則由它們散射的各個子波的振幅和相位都不相同，而且也是隨機分布的。 所以由各面元散射的子波相干疊加的結(jié)果，形成的反射光場具有隨機的空間光強分布。當把 探測器或眼睛置于光場中時，將記錄或觀察到一種雜亂無章的干涉圖樣，呈現(xiàn)顆粒狀結(jié)構(gòu)， 此即"散斑"。根據(jù)觀察方式的不同，散斑可以分為"自由空間散斑"和"像面散斑"兩種類型。[IO]當激光 照明漫射體(反射或透射體)時，在其附近的自由空間產(chǎn)生的散斑稱為"自由空間散斑"(或 菲涅耳型散斑、"客觀"散斑)。觀察屏上任一點的光場，來自于整個漫射表面上所有散射點源產(chǎn)生的子波的疊加。散斑的平均尺寸與產(chǎn)生散斑的輻射面對觀察點的張角a有關(guān)。距離漫射 體為z處的散斑的橫向平均尺寸為
<formula>formula see original document page 4</formula>
式中，X是光的波長，L為漫射體上照明光束的孔徑的線寬度。散斑的縱向平均尺寸為
<formula>formula see original document page 4</formula>當a愈小時，散斑的尺寸愈大。應(yīng)當強調(diào)散斑的平均尺寸與漫射體本身的顆粒度無關(guān)。 但散斑的細微空間分布卻和漫射體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。照射尺寸相同但結(jié)構(gòu)不同的兩個漫射體，在 相同距離處產(chǎn)生的散斑雖然平均尺寸相同，但分布卻完全不同。
漫射體受激光照射，經(jīng)透鏡成像，在像面上產(chǎn)生的散斑稱為"像面散斑"(或夫瑯未費型 散斑、"主觀"散斑)。每一個物點在像面上產(chǎn)生一個衍射斑(相干脈沖響應(yīng))，所有衍射斑相 干疊加得到物體的像。當透鏡孔徑D足夠大，脈沖響應(yīng)比較窄時，對像面上任一點光場能產(chǎn) 生貢獻的，只是物面上以幾何物點為中心的一個小區(qū)域?？梢哉f，像面散斑尺寸與漫射體被 照明的面積無關(guān)，而僅與透鏡孔徑對觀察點的張角I3有關(guān)，散斑的平均橫向尺寸為
D ) ， (3)
式中，di為像距。這個尺寸和愛里衍射圖樣的中央亮斑是同一數(shù)量級的。 使用散斑照明樣品產(chǎn)生層析成像的原理卩l(xiāng)]如圖1所示，圖中實線表示探測點擴散函數(shù)
(PSFdet)。散斑照明產(chǎn)生的散粒狀熒光在焦平面內(nèi)有較高的對比度，而在焦平面外的其他地
方相對模糊。因此，在散斑圖案的隨機移動時，在焦點內(nèi)的光強度變化大(依賴于是否散斑
微粒與PSFdet相互重疊)，離焦的光強度變化小。因而，在一系列圖像中提取變化的處理算法
優(yōu)先顯示產(chǎn)生自焦平面內(nèi)的熒光信號，從而在樣品上實現(xiàn)光學(xué)層析。 散斑照明熒光顯微的成像原理
利用散斑照明圖像獲得層析圖像的計算方法可由下面的公式表示[12]<formula>formula see original document page 4</formula>(4 )
式中I,m對應(yīng)的是散斑照明產(chǎn)生的熒光圖像，S對應(yīng)的是相應(yīng)的散斑照明圖像作為參考 圖像，Ip是經(jīng)計算機處理后所得到的樣品層析圖像。
成像的層析特性能夠通過計算樣品上同一平面的離焦合成強度Iint(U)與焦點內(nèi)的強度 Iint(0)的比值R得到[13]
n,n,(氛(O)， (5)
其中，光學(xué)單位定義為"-2"^^2/々，Az表示離焦距離，N表示數(shù)值孔徑，、表示照明 光波長。
在散斑照明準共焦熒光顯微系統(tǒng)的圖像接收面上所探測到的信號強度可以由下式表示式中，A(》，—》表示樣品上的散斑強度，C(A一z)表示樣品中熒光標記的濃度，探測和照明的點擴展函數(shù)PSFs (分別表示為PSFdet和PSFm)。利用Gaussian-Lorentzian近似定義探測 和照明的點擴展函數(shù)PSFs:<formula>formula see original document page 5</formula>其中，《=lArA2。定義^4 = ;^。2/2，并且自相關(guān)函數(shù)可以由下式表示<formula>formula see original document page 5</formula>最終，像面上每一個象素的均方根(rms)可以表示為<formula>formula see original document page 5</formula>實際上，均方根圖像必須由有限個(比如N個)強度In的原始圖像來獲得，每一個圖像 對應(yīng)于動態(tài)變化的散斑圖案。與傳統(tǒng)的共焦顯微成像技術(shù)相比較，動態(tài)散斑照明準共焦熒光顯微主要具有如下的優(yōu)點1) 可獲得厚組織樣品的高分辨率深層層析圖像；2) 與傳統(tǒng)共焦顯微鏡相比，具有較好的軸向和橫向空間分辨率；3) 具有高的圖像對比度和放大倍率；4) 在樣品上不易發(fā)生光致漂白，對樣品的光致?lián)p傷小；5) 容易和現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡結(jié)合，不需要復(fù)雜的掃描裝置和共焦光闌，系統(tǒng)整體穩(wěn)定 可靠，結(jié)構(gòu)簡單；6) 系統(tǒng)自動化程度高，整體成本低，性價比高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出并實現(xiàn)了一種將動態(tài)散斑照明與傳統(tǒng)熒光顯微鏡有機地結(jié)合，實現(xiàn)快速獲取 生物組織樣品的高空間分辨三維層析圖像的新方法和裝置，避免了傳統(tǒng)激光掃描共聚焦顯微 技術(shù)中存在的系統(tǒng)復(fù)雜、不便于操作和維護等問題。本發(fā)明的原理和裝置如圖2所示，系統(tǒng)由氬離子激光器201、玻璃基底散射體202、步進 電機203、擴束整形及中繼光學(xué)裝置透鏡204和205、雙色分光鏡206、熒光顯微物鏡207、 濾光片209、鏡頭210和CCD相機211等組成，實驗樣品是208。本發(fā)明使用波長為488nrn的氬離子激光器作為激發(fā)光源，平均輸出功率為20mW。本發(fā)明采用具有一定顆粒度的玻璃基底散射體202，激光器201輸出的光通過散射體202 時形成散斑圖案。本發(fā)明通過計算機控制的步進電機203帶動玻璃基底散射體202旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生動態(tài)變化的 散斑圖案，并通過擴束、整形中繼光學(xué)系統(tǒng)204和205后耦合進普通的熒光顯微鏡。本發(fā)明對耦合進熒光顯微鏡的散斑圖案，經(jīng)過雙色鏡206后用熒光顯微物鏡207聚焦在待測樣品208上，形成動態(tài)變化的散斑光場激發(fā)樣品。
本發(fā)明通過特殊設(shè)計的光路及耦合系統(tǒng)、高靈敏度圖像增強及探測系統(tǒng)實現(xiàn)對微弱信號 的高靈敏度探測。
本發(fā)明通過圖像采集系統(tǒng)可以實時監(jiān)測和記錄樣品的熒光信號，快速獲得高空間和時間 分辨的熒光強度數(shù)據(jù)信息，通過計算機存儲、處理，最終得到待測樣品的三維高空間分辨層 析熒光顯微圖像。


圖l、用散斑照明實現(xiàn)準共焦熒光顯微層析成像的原理圖 圖2、用動態(tài)散斑照明實現(xiàn)準共焦熒光顯微的裝置示意圖
具體實施例方式
本發(fā)明的具體實施方式
如圖2所示。采用波長為488nm的氬離子激光器201作為光源， 平均輸出功率為20mW。 201所發(fā)出的激光，經(jīng)過一塊具有特定顆粒度的玻璃基底散射體202 后，產(chǎn)生散斑圖案。202裝在一臺步進電機上203上，并利用計算機控制203步進旋轉(zhuǎn)大約 0.5度，產(chǎn)生動態(tài)的散斑圖案。所產(chǎn)生的散斑照明激發(fā)光束通過光束擴束整形、中繼光學(xué)系統(tǒng) 耦合204和205后，被耦合到一臺傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡，激發(fā)光經(jīng)過雙色分光鏡206后， 被反射進顯微物鏡207，并聚焦到樣品208上，形成動態(tài)的散斑照明。樣品所發(fā)出的熒光信 號通過雙色鏡206后，經(jīng)濾光片209濾出激發(fā)光后，經(jīng)過光學(xué)鏡頭210被CCD相機211接收。
用計算機控制步進電機的旋轉(zhuǎn)，在樣品上產(chǎn)生不同的散斑照明圖案，用CCD相機記錄一 系列圖像。經(jīng)計算機處理后，最終可獲得樣品聚焦層的高空間分辨圖像。根據(jù)實驗樣品及實 驗?zāi)康牡牟煌梢圆捎貌煌臄?shù)據(jù)處理方法，獲得樣品的三維高空間分辨層析圖像。
參考文獻 T. Wilson, C丄Sheppard， 1984， Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy, Academic Press, New York. M.G. Somekh， C.W. See, J. Goh， Optics Communications, 2000, 2, pp75. M. Petran, M. Hadravsky, M.D. Egger， R. Galambos, J. Opt. Soc. Am., 1968, 58, 661. D. Karadaglic, R. Juskaitis, T. ^Vilson， Scanning, 2002, 24， pp310. J.G. Walker, Optics Communications, 2001,189, pp221. K厄爾夫，散斑計量學(xué)，賀鐸民，賀民霞譯，1989，機械工業(yè)出版社. J. R. Dainty (Ed.). Laser Speckle and Related Phenomena, 1975, Springer陽Verlag. M. Francon. Laser Speckle and Application in Optics, 1979, Academic Press, New York.王仕墦等，2003，信息光學(xué)理論與應(yīng)用，北京郵電大學(xué)出版社.呂乃光編，1987，傅立葉光學(xué)，機械工業(yè)出版社. Cathie Ventalon and Jerome Mertz， Optics Letters, 2005, December, Vol. 30, No. 24. [12]Shi-hong Jiang, John G. Walker, Optics Communications, 2004， 238, ppl. T. Wilson, Confocal Microscopy, 1990, Academic Press, San Diego， CA.
權(quán)利要求
1.一種利用激光散斑圖案照明樣品，在無需掃描的情況下，實現(xiàn)準共焦熒光顯微的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所用激光器是氬離子激光器，輸出波長488nm，輸出功率 20mW。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，所用的氬離子激光器可以是連續(xù)輸出，也可以是脈沖 輸出；激光器的輸出波長可以是458nm， 476nm， 488nm和514nm;激光的輸出功率可以 是從5mW到IOW。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所用激光器可以是二極管激光器，輸出波長在350nm到 1000nm，輸出功率從lmw到20W。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3和4所述的方法，所用激光器可以是其它的固體、氣體和化學(xué)激 光器，輸出波長可調(diào)諧，連續(xù)或脈沖輸出，激光器輸出激光的波長范圍從350nm到 IOOO跳
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用的散射體具有一定的顆粒度、散射角和透過. 率參數(shù)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的方法，采用步進電機控制散射體的旋轉(zhuǎn)角度，產(chǎn)生動態(tài)變化 的散斑圖案。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1和7所述的方法，可采用一維、二維或三維控制臺帶動散射體，產(chǎn)生動 態(tài)的散斑照明圖案。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的方法，采用光學(xué)系統(tǒng)將帶有散斑圖案的光束進行擴束、整形 后耦合進入熒光顯微鏡，被雙色鏡反射到物鏡，聚焦到樣品上產(chǎn)生動態(tài)的散斑照明圖案。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1和9所述的方法，應(yīng)根據(jù)激發(fā)光源的波長以及研究樣品的不同，在熒光 顯微鏡中選用不同的雙色分束鏡。
11.根據(jù)權(quán)利要求9和10所述的方法，樣品所發(fā)出的熒光用顯微鏡物鏡收集后，通過雙色鏡 并經(jīng)過濾光片后被CCD相機接收。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1和11所述的方法，CCD相機前的濾光片應(yīng)該能夠阻擋激發(fā)光，對樣品所 發(fā)出的熒光具有高的透過率。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l、 9、 10、 ll所述的方法，所用的熒光顯微鏡既可以是整個系統(tǒng)的一個整 體設(shè)計部分，也可以是對單獨的熒光顯微鏡的光路改造；熒光顯微鏡可以是正置的，也 可以是倒置的。
14. 根據(jù)權(quán)利要求l、 11和12所述的方法，接收熒光圖像的CCD相機即可以是制冷的、也 可以是常溫工作的。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l、 11、 12和14所述的方法，接收熒光圖像的相機還可以是CMOS相機和 其它各種攝像機。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l、 11、 12、 14和15所述的方法，所用的相機可以是帶有增強器。
17. 根據(jù)權(quán)利要求l、 6、 7、 8、 9和11所述的方法，利用計算機或其它的機械的或光電的手 段，改變在樣品上的散斑圖案，并依次記錄一系列樣品的熒光圖像。
18. 根據(jù)權(quán)利要求〗7所述的方法，采用均方根或方差法等數(shù)據(jù)處理方法，從所獲得的一系列 熒光圖像中，提取出樣品上激發(fā)光聚焦面的層析圖像。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，可通過橫向或縱向移動樣品，以獲取樣品不同位置或不同 深度的層析圖像，實現(xiàn)無需進行激發(fā)光掃描的高空間分辨三維層析成像。
全文摘要
本發(fā)明是一種將動態(tài)散斑照明與傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡有機地結(jié)合起來，實現(xiàn)近似共焦熒光顯微(也就是準共焦熒光顯微)的新方法和新裝置。本發(fā)明采用氬離子激光器作為光源，激發(fā)光經(jīng)散射體后通過擴束、整形等中繼光路系統(tǒng)后耦合到熒光顯微鏡中，并聚焦到樣品上。用計算機控制散射體的步進旋轉(zhuǎn)，在樣品上產(chǎn)生動態(tài)散斑照明圖案。對接收到的一系列熒光圖像處理后可在無需掃描的情況下，獲得高空間分辨的層析圖像。該方法能夠以非侵入的方式，獲取生物組織樣品的高時間和空間分辨三維層析顯微圖像信息，裝置結(jié)構(gòu)簡單、性價比高、后期數(shù)據(jù)處理方便、易于操作和推廣，有巨大的應(yīng)用前景和市場，對于臨床疾病診斷和生命科學(xué)研究等都具有非常重要的意義。
文檔編號G01N21/64GK101303302SQ200710106240
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日
發(fā)明者君 尹, 屈軍樂, 牛憨笨, 磊 王, 趙羚伶 申請人:深圳大學(xué)