專利名稱：確定核酸濃度的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種確定微流體裝置中的試樣中的核酸濃度的方法，以及一種實施該方法的設備。
背景技術(shù)：
對于分子生物學研究和診斷中的很多設問來說，需要確定試樣中特定核酸的量或濃度。例如，為了控制艾滋患者的治療過程，需要確定血液中HIV病毒的病毒核酸復制(所謂的最終的病毒(Viruslast))的數(shù)目。由于要確定的核酸常常處于與許多其它核酸的混合物中，并常常處于很小的起始濃度中，因此大多需要將核酸放大并特別標記。應注意在本發(fā)明的語境中“核酸”的概念應包含核酸序列。它們可以是DNA或RNA序列。
為了專門放大核酸，在分子生物學中有不同的公知方法，例如US4683195中描述的聚合酶鏈反應(Polymerase-Kettenreaktion，PCR)。此外PCR方法還適用于對核酸的量化，例如通過在PCR反應中引入具有已知(內(nèi)部標準的)初始濃度的已知核酸，由此在檢測試樣中的其它核酸時可以回溯到其初始濃度，如在US5129727中描述的。由于在此確定濃度要到PCR反應成功實施之后才能進行，人們稱之為終點方法。
此外還開發(fā)了可以在PCR反應過程中確定濃度的方法，即所謂的實時方法(實時PCR)。由于在PCR中在每個反應周期中理想條件下要放大的核酸數(shù)可以翻倍，因此放大是呈指數(shù)進行的。在實時PCR方法中放大的核酸的濃度的增長例如可以通過實時加入熒光色素來跟蹤。
此外，還公知有其它用于確定濃度的光學的、質(zhì)譜學的以及電化學的方法。
另一種放大核酸的方法是連接酶鏈反應(LCR)方法，其過程與PCR相似，但其中采用核酸連接酶作為酶，參見例如Wiedmann等人的“Discrimination ofListeria monocytogenes from other Listeria species by ligase chain reaction”，ApplEnviron Microbiol.1992 Nov；58(11)3443-7。
但該方法的缺點在于，其具有受限的動態(tài)區(qū)域。典型的動態(tài)區(qū)域界于1∶100(1zu 100)與1∶1000(1zu 1000)之間，但要測量的核酸的濃度范圍常常要明顯地高，如1∶1,000,000(1zu 1,000,000)。因此為了確定濃度，常常要進行一系列稀釋，如1∶1(1zu 1)、1∶10(1zu 10)、1∶100(1zu 100)等等，由此然后可以在確定方法的測量范圍內(nèi)進行測量。這需要時間和附加資源，并且又意味著額外的誤差源。在此尤其有問題的是所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的濃度關(guān)于時間成S形的變化曲線，這首先是由于在進行的反應的持續(xù)時間(高PCR周期數(shù))中不斷地需要PCR反應劑(引物、核苷酸三磷酸酯等)，和/或達到檢測方法的飽和區(qū)。此刻不能有意義地確定濃度。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，提出一種能夠克服上述缺點的方法。
本發(fā)明的技術(shù)問題通過一種確定微流體裝置中的試樣中的核酸濃度的方法來解決，其具有以下步驟a)將試樣引入第一室；b)實施可周期性實施的放大反應，以對預定的周期數(shù)放大核酸；c)將作為該第一室的容積的一部分并具有放大的核酸的特定容積引入第二室，并用未使用過(新鮮)的用于該放大反應的反應劑來替代試樣容積的所引入容積；d)確定在具有用于確定濃度的裝置的第二室中放大的核酸的濃度；以及e)重復步驟b)-d)，直至在該第二室中確定了處于預定區(qū)域內(nèi)的放大的核酸的濃度。
要強調(diào)的是，按照本發(fā)明一個方面，預先給定的放大反應的周期的數(shù)目對于不同的重復步驟可以是不同的。因此例如可以考慮在第一輪中運行20個周期，并在第一輪重復中運行10個周期而在第二輪重復中運行5個周期。
在本發(fā)明的語境中“可周期性執(zhí)行的用于放大核酸的反應”應理解為其中在各個反應步驟中核酸逐步增多的反應，例如分別加倍。通過周期性地改變特定的反應參數(shù)(如溫度)，這樣的反應可以在預定的步驟數(shù)(即周期)之后選擇停止或繼續(xù)執(zhí)行。優(yōu)選對于可周期性執(zhí)行的用于放大核酸的反應采用聚合酶鏈反應(PCR)。但本發(fā)明的方法還可以利用其它周期性執(zhí)行的放大反應來實施，如LCR。
對于該可周期性執(zhí)行的反應，將特定容積引入第二室，并用未使用過(新鮮)的反應劑來替代可以在一個步驟中進行，如通過將容積從第一室壓入第二室并帶有相應容積的新鮮反應劑溶液來進行。但還可以考慮在分開的步驟中實施引入和替代。
術(shù)語微流體表示這樣的方法，其中處理在μl范圍內(nèi)的流體容積。在微流體裝置中可以設置可以在其中實施該方法的通道和空腔。優(yōu)選將微流體裝置設計為卡狀平面形的、其中設有用于實施反應的通道和空腔的所謂的盒式的。用于周期性放大反應的反應劑可以包括反應緩沖劑(如以相應的鹽形式的)、酶、核苷酸三磷酸酯以及引物(寡核苷酸)。該反應劑可以以儲存穩(wěn)定的形式、例如干燥的形式或者在通過熔化可去除的石蠟層下已經(jīng)設置在微流體裝置中。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，預定的濃度范圍是用于確定濃度的裝置的測量范圍。
對放大的核酸的濃度的確定可以是非特定的、例如通過光學方法來實現(xiàn)(例如吸收光譜的或熒光的，例如通過在放大的核酸中插入熒光色素)。
但根據(jù)本發(fā)明的另一方面，優(yōu)選特定于序列地實施對放大核酸的檢測，其中，用于確定核酸濃度的裝置具有一個微陣列，在該微陣列中在一個載體上穩(wěn)定(斑點化)用于結(jié)合放大核酸的特定于位置的捕獲寡核苷酸。
優(yōu)選利用標記實施對結(jié)合的放大核酸濃度的確定。該標記例如可以是光學標記或酶標記。該酶標記可以催化可光學檢測的酶反應，或者優(yōu)選催化可電化學檢測的酶反應。電化學檢測有很多優(yōu)點，例如對所產(chǎn)生的信號的信號處理簡單、與光學方法相比分析設備更低的結(jié)構(gòu)化開銷。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，優(yōu)選電化學反應是借助氧化還原循環(huán)增強的電流測量。
要確定的核酸或核酸的初始濃度例如可以采用內(nèi)部標準(添加到試樣中或并行放大并測量的、具有已知初始濃度的已知核酸)來確定，通過核酸放大后的濃度可以推斷出其在試樣中的初始濃度。此外還可以借助引入的特定容積與總試樣容積的容積之比以及借助實施的PCR周期數(shù)來計算試樣中的核酸。
此外本發(fā)明還涉及一種用于實現(xiàn)本發(fā)明方法的設備，其具有微流體裝置，該微流體裝置具有帶有用于加熱或/或冷卻以通過周期性實施的放大反應來放大核酸的裝置的第一室，和與該第一室連接可與其進行流體交換、具有用于確定放大的核酸的濃度的裝置的第二室，其中，該設備具有用于將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入該第一室中并將特定的容積從該第一室中引入該第二室的裝置。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，該設備具有控制裝置，其用于控制將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入第一室中并將特定的容積從第一室中引入第二室的裝置。優(yōu)選該控制裝置設計為，從用于確定濃度的裝置接收信號，并根據(jù)該信號對所述用于將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入第一室中并將特定的容積從第一室中引入第二室的裝置進行控制，由此為第一室供給具有放大反應劑的未使用的溶液。此外還優(yōu)選該控制裝置能夠控制放大反應的周期，例如通過為第一室的用于加熱和/或冷卻的裝置預先給定溫度特性。如果該控制裝置例如在第一輪放大反應周期之后在第一濃度測量中得到信號，表示該濃度尚處于預定的范圍之下，則控制裝置可以通過控制第一室中的溫度特性來對新一輪的周期起作用。
為了加速整個分析流程，在執(zhí)行用于確定濃度的步驟，如混合、標記耦合以及檢測具有傳輸?shù)娜莘e部分的已放大的核酸期間就已經(jīng)開始或?qū)嵤┢渌襟E。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，優(yōu)選該設備還具有計算機，用于根據(jù)用于確定濃度的裝置的信號來計算試樣中核酸的濃度。該計算機可以是微處理器控制的，并且對于專業(yè)人員來說運行這樣的計算機的硬件和軟件前提條件是已知的。
按照本發(fā)明的另一方面，該設備優(yōu)選具有至少一個包含反應劑的、用于檢測核酸的存儲池。該存儲池例如可以包含酶標記(即利用其可以標記或標簽核酸的酶)或由用酶標記或標簽的核酸轉(zhuǎn)化的酶底物。該存儲池優(yōu)選設在微流體裝置中。


借助示例性表示的附圖以及從以下對本發(fā)明實施方式的

中闡述以及本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。附圖中，圖1示意性示出用于實施本發(fā)明方法的設備；圖2以示意性局部視圖表示出實施為盒式機的微流體裝置，其可以用于實施本發(fā)明方法的設備中。
具體實施例方式
圖1示出用于實施本發(fā)明方法的設備，其具有微流體盒式機1(通過點劃線表示)，該微流體盒式機1具有第一室10和第二室20。通過輸入管道11和第一管道12可以將包含待檢查核酸的試樣引入第一室10。在該第一室中設置了用于加熱和/或冷卻的裝置(未示出)。該裝置可以是在該盒式機的側(cè)面上的例如由于相應薄的材料壁而具有非常高的導熱性的區(qū)域，在此，可以為該盒式機配備加熱和冷卻元件，如珀爾帖元件。用于實施PCR反應的反應劑(反應緩沖劑、酶、核苷酸三磷酸酯、引物等)可以在引入試樣時例如就已經(jīng)以干燥的形式存在于所述室中，從而使其在引入液體試樣時被溶解，或者它們也可以與試樣相混合并通過輸入管道11和第一管道12引入。
此外還設置了至第二室20的第二管道13。管道12、13可以通過第一閥門14或第二閥門1 5被有選擇地關(guān)閉。在以預定的周期數(shù)(例如20個周期)實施PCR反應之后，閥門14、15打開。通過裝置30可以將具有未使用的反應劑(例如反應緩沖劑、酶、核苷酸三磷酸酯、引物等)的溶液的、為第一室容積的一部分的特定容積通過管道12補充到第一室10中。該用于傳輸容積的裝置30可以是可調(diào)節(jié)的劑量泵、活塞泵等，利用該裝置可以移動特定的容積。由此擠壓第一室10的相應容積部分并傳輸?shù)降诙?0中。在第二室20中設置了用于確定核酸濃度的裝置22。通過排出口2 1可以將多余的容積排出第二室20。通過用于確定濃度的裝置22來確定所傳輸?shù)奶囟ㄈ莘e內(nèi)放大核酸的濃度，并向控制裝置40傳送相應的信號。如果放大核酸的濃度處于用于確定濃度的裝置的測量范圍以下，則通過控制裝置40關(guān)閉閥門14、15并開始另一輪PCR反應周期(例如另外10個周期)。在第二輪PCR反應周期結(jié)束之后再次通過控制裝置40打開閥門14、15并通過裝置30將具有未使用過的PCR反應劑的新鮮溶液通過管道12輸送到第一室10中。由此，又重新將具有放大核酸的相應定義的容積輸送到第二室20中。在那里又通過用于確定濃度的裝置22來確定濃度，并且該方法一直重復直到放大核酸的濃度處于測量范圍內(nèi)?，F(xiàn)在可以結(jié)束確定濃度，并且根據(jù)已知的PCR反應的反應動力學、周期數(shù)以及所傳送的容積在整個試樣容積中占有的份額，可以推斷出待確定的核酸的起始濃度。這可以通過連接的計算機實現(xiàn)，該計算機根據(jù)所測得的信號以及關(guān)于反應周期數(shù)、試樣容積等的其它信息可以計算出濃度。
按照本發(fā)明，室10和20以及輸入、連接、導出的管道11、12、13和21都設置在微流體裝置1中。參考圖2，其中與圖1相似的元件的附圖標記的最后兩位數(shù)字與圖1中相應的附圖標記一致，因此，圖1中的第一室10在圖2中相應地用附圖標記110表示，等等。
如圖2所示，盒式機101由塑料機身和設置于其中的槽或微通道以及以下將描述的其它結(jié)構(gòu)構(gòu)成。
在盒式機101中，可以將所設置的反應劑作為干反應劑斑點化。對于第一輪反應周期可以將PCR反應劑直接設置在第一室(PCR室)110中。在第二室120中，設置了實施為芯片的微陣列作為用于確定濃度的裝置。對于后續(xù)輪的PCR周期的PCR反應劑可以作為干反應劑設置在第一管道112的槽112′中。盒式機可以在將反應劑斑點化后在上側(cè)例如通過薄膜封閉。
試樣可以通過通道111引入第一室(PCR室)110。第一室可用第一閥門114和第二閥門115封閉。為了實施本發(fā)明的方法，將盒式機安裝到包含控制裝置、加熱元件、可以輸入水或緩沖劑的可能性等等的設備(未示出)中。PCR室110可以通過加熱或冷卻元件(如珀爾帖元件)來加熱和/或冷卻，從而可以通過控制裝置(未示出)借助預先給定的溫度特性實施PCR反應周期，如本領域技術(shù)人員所了解的。在預先給定的周期數(shù)之后閥門114、115打開，第一管道112通過設置在盒式機外的用于傳輸容積的裝置(未示出)將特定容積的溶液引入盒式機，盒式機由此將相應容積的具有放大核酸的試樣擠出第一室110。溶液可以已經(jīng)包含未使用的PCR反應劑。替代地，未使用的PCR反應劑還可以例如以干燥的狀態(tài)設置在第一管道112的槽112′中，從而在通過第一管道112將溶劑(如水或緩沖劑)泵入時將干燥的PCR反應劑溶解，然后引入第一室110的溶液中。試樣容積的相應被擠壓的部分通過第二管道113傳送到在其中確定濃度的第二室120。通過這種方式，在一個步驟中進行引入具有未使用的PCR反應劑的溶液以及傳送特定容積的溶液，并且在第一室中已有未使用的PCR反應劑可供可能的后續(xù)輪的PCR反應使用。放大核酸例如可以通過使用生物素標記的引物來標簽或標記，以便能夠進行隨后的檢測。
被擠壓的容積到達第二室120。第二室120中具有可結(jié)合放大核酸的、在載體上穩(wěn)定的(在載體上斑點化的)、具有已知序列的捕獲寡核苷酸微排列形式的微陣列。電化學地進行檢測，如在德國專利公開文獻DE 10126341A1中描述的那樣。為此對于每個檢測斑點都有兩個在硅表面上的電極，它們作為電極裝置由陽極和陰極構(gòu)成具有交叉連接的電極指的內(nèi)部數(shù)字結(jié)構(gòu)，通過該結(jié)構(gòu)可以采集電流。為了檢測在檢測室中引入酶，例如鏈霉親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酯。該酶結(jié)合在用生物素標記的放大的核酸上。然后將酶底物引入檢測室120。作為底物例如可以輸入對氨基磷酸酯，該底物通過結(jié)合在放大核酸上的堿性磷酸酯轉(zhuǎn)化為對氨基苯酚。對氨基苯酚在電極系統(tǒng)上氧化，或者使該氧化還原對-對氨基苯酚/Chinonimin循環(huán)，如在DE 10126341 A1中所述的。這使得在電極上產(chǎn)生能夠測量到的電流升高。這樣采集到的信號可以在連接的計算機中進行處理。如果在第一輪PCR反應周期中尚未形成足夠的放大核酸，則該信號處于測量范圍以下。在這種情況下控制裝置使得可以執(zhí)行新一輪的PCR周期。這可以一直進行，直至放大核酸達到處于所期望的范圍內(nèi)的濃度，例如用于確定濃度的裝置的測量范圍。
在第一PCR反應周期中，例如可以運行10個周期。然后例如傳送第一室的一半的容積并執(zhí)行第一濃度確定。保留在PCR室中的另一半容積以相應的容積充以新鮮的PCR反應緩沖劑，現(xiàn)在，在第二輪中可以再運行10個周期，以重新確定濃度。在了解用于確定濃度的裝置的動態(tài)測量范圍(例如1∶1000)的情況下，可以通過相應地選擇在各輪PCR反應中的周期數(shù)，達到連續(xù)地覆蓋所經(jīng)過的濃度范圍。
要強調(diào)的是，所描述的實施方式僅是示例性的，還可以考慮各種涉及室或管道(通道)的設置的變化方案，和檢測及實施反應的類型的變化方案。重要的是，通過中斷放大反應和傳送部分試樣容積以及利用新鮮的放大反應緩沖劑來替代被傳送的容積部分，可以在簡單而統(tǒng)一的方法中實現(xiàn)在比用于確定濃度的裝置的測量范圍明顯更大的范圍內(nèi)確定濃度。
權(quán)利要求
1.一種確定微流體裝置中的試樣中的核酸濃度的方法，具有以下步驟a)將試樣引入第一室；b)實施可周期性實施的放大反應，以對預定的周期數(shù)放大核酸；c)將作為該第一室的容積的一部分并具有放大的核酸的特定容積引入第二室，并用未使用過的用于該放大反應的反應劑來替代該引入的特定容積；d)確定在具有用于確定濃度的裝置的第二室中放大的核酸的濃度；以及e)重復步驟b)-d)，直至在該第二室中確定了處于預定區(qū)域內(nèi)的放大的核酸的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述預定區(qū)域是所述用于確定濃度的裝置的測量區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述用于確定濃度的裝置包括具有用于結(jié)合所述放大的核酸的特定于位置的穩(wěn)定的捕獲寡核苷酸的微陣列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，利用標記來確定所結(jié)合的放大核酸的濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述標記是光學標記。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述標記是酶標記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述標記是酶反應催化的、可光檢測的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述標記是酶反應催化的、可電化學檢測的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述電化學檢測是借助氧化還原周期增強的電流測量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中，為所述試樣給定具有已知起始濃度(內(nèi)部標準)的已知核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中，借助引入的特定容積與整個試樣容積的容積比和/或借助所實施放大周期的數(shù)目來計算核酸濃度。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中，所述放大反應是聚合酶鏈反應。
13.一種用于實施權(quán)利要求1所述的方法的設備，具有微流體裝置，該微流體裝置具有帶有通過周期性實施的放大反應來放大核酸的裝置的第一室，和與該第一室連接可與其進行流體交換、具有用于確定放大的核酸的濃度的裝置的第二室，其特征在于，該設備具有用于將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入該第一室中并將特定的容積從該第一室中引入該第二室的裝置。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的設備，其中，所述用于確定濃度的裝置包括具有用于檢測放大的核酸的特定于位置的穩(wěn)定的捕獲寡核苷酸的微陣列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的設備，其中，所述用于確定濃度的裝置包括用于進行光檢測的裝置。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的設備，其中，所述用于確定濃度的裝置包括用于進行電化學檢測的裝置。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的設備，其中，所述用于電化學檢測的裝置設計為用于測量電流和/或電勢。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項所述的設備，其中，具有用于控制所述用于將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入第一室中并將特定的容積從第一室中引入第二室的裝置的控制裝置。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的設備，其中，所述控制裝置構(gòu)成為，從所述用于確定濃度的裝置接收信號，并根據(jù)該信號對所述用于將具有用于放大反應的反應劑的溶液的特定容積引入第一室中并將特定的容積從第一室中引入第二室的裝置進行控制，以便為所述第一室供給特定容積的具有用于放大反應的反應劑的溶液以及將相應的特定容積從該第一室引入該第二室中。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的設備，其中，所述借助于周期性實施的放大反應來放大核酸的裝置包括用于加熱和/或冷卻的裝置。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的設備，其中，所述控制裝置還為第一室的用于加熱和/或冷卻的裝置預先給定溫度特性。
22.根據(jù)權(quán)利要求13至21中任一項所述的設備，還具有計算機，用于根據(jù)用于確定濃度的裝置的信號來計算試樣中核酸的濃度。
23.根據(jù)權(quán)利要求13至22中任一項所述的設備，其中，設有至少一個用于確定核酸濃度的反應劑的存儲池，其與所述第二室連接以進行流體交換。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設備，其中，所述存儲池包含酶標記。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設備，其中，所述存儲池包含酶底物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定微流體裝置中的試樣中的核酸濃度的方法，具有步驟a)將試樣引入第一室；b)實施可周期性執(zhí)行的放大反應，以對預定的周期數(shù)放大核酸；c)將作為該第一室的容積的一部分并具有放大的核酸的特定容積引入第二室，并用未使用過的用于該放大反應的反應劑來替代該引入的特定容積；d)確定在具有用于確定濃度的裝置的第二室中放大的核酸的濃度；以及e)重復步驟b)－d)，直至在該第二室中確定了處于預定區(qū)域內(nèi)的放大核酸的濃度。另外，本發(fā)明涉及一種實施上述方法的設備。
文檔編號G01R19/00GK101089196SQ200710110070
公開日2007年12月19日 申請日期2007年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月14日
發(fā)明者沃爾特·岡布雷赫特, 喬恩·莫斯納, 塞巴斯蒂安·施米特 申請人:西門子公司