專利名稱：：人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥診斷試劑，特別是一種人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑，該診斷試劑采用基因工程重組HIV—I型特異性蛋白gpl60、gpl20、gp41、P66、p24以及HIV—II型特異性蛋白gp36獨(dú)立包被的混合纖維素膜、酶結(jié)合物及其他組份組成，應(yīng)用間接法的原理供HIV—I型和HIV—II型抗體確認(rèn)用。
背景技術(shù)：
：人類獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS,艾滋病)傳播的廣泛性和危害性已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題。艾滋病的傳播在我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入了快速增長(zhǎng)期，除了在沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)HIV感染的人較多外，在一些經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)、醫(yī)療衛(wèi)生較差的部分地區(qū)尤其農(nóng)村地區(qū)，由于勞務(wù)輸出流動(dòng)人口不斷增加以及部分由采漿感染HIV的人群，給我國(guó)的HIV預(yù)防和控制增加了不少的壓力。提高HIV診斷試劑水平顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)對(duì)艾滋病的診斷方法主要采用ELISA方法檢測(cè)，該方法有較高的靈敏度和特異性，但其操作方法復(fù)雜，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，并且需要一定的操作經(jīng)驗(yàn)和儀器設(shè)備，在一些醫(yī)療條件差的部分地區(qū)尤其是在邊遠(yuǎn)的農(nóng)村地區(qū)限制了該方法的使用，因此丌發(fā)一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)試劑十分必要。本發(fā)明提供一種快速，簡(jiǎn)便的人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑，該試劑由一組產(chǎn)品組成一個(gè)試劑盒，其中主要組成成分如下HIV抗體確認(rèn)條，反應(yīng)液，洗液，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，BCIP/NBT顯色底物，陽(yáng)性參考血清，陰性參考血清，另外還有，反應(yīng)板，對(duì)比卡片，結(jié)果報(bào)告單，產(chǎn)品說(shuō)明書等。每一試劑盒中包括以下組成-1、HIV抗體確認(rèn)條(避光，防潮)20條2、反應(yīng)液(配置完成后為乳白色)l瓶(20毫升)3、洗液(藍(lán)色)1瓶(200毫升)4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物(紅色)1瓶(20毫升)5、BCIP/NBT顯色底物(淡黃色)1瓶(20毫升)6、陽(yáng)性參考血清(生物危險(xiǎn)品)1瓶(50微)7、陰性參考血清1瓶(100微升)8、反應(yīng)板(每板IO個(gè)反應(yīng)槽)9、對(duì)比卡片10、結(jié)果報(bào)告單11、說(shuō)明書其中的各組成說(shuō)明如下HIV抗體確認(rèn)條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液(O.OlMTris-HCl，pH7.4)將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度(gpl60、gpl20、P66、gp41、P24、gp36的包被濃度分別為80Mg/ml、80/ig/ml、50/ig/ml、60Mg/ml、80]Ug/ml和5Mg/ml;兔抗人IgG的濃度分別為4.5Mg/ml和100/ig/ml;人源IgG的濃度為50/xg/ml);B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2^1/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫(16-25°C)吹干2小時(shí)的方法進(jìn)行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處(2-8°C，相對(duì)濕度不高于45%)備用。反應(yīng)液，組成為0.8。/。NaCl、0.02%KC1和0.05%吐溫-20的0.01MTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到7.4;C.使用0.45ptm濾膜過(guò)濾除菌；D.密封貯存于2-8'C環(huán)境中。洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG，500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到9.8-10.0;C.加入100PPM(質(zhì)量體積比)的指示劑(溴百里酚藍(lán))，使其在正常狀態(tài)下(2-30°C，PH=9.9)呈藍(lán)色D.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環(huán)境中。堿性磷酸酶—羊抗人IgG結(jié)合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物(1:4000)，10mMTris-cl，20%胎牛血清，100PPMPEG,500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調(diào)到6.4-6.7;C.加入100PPM(質(zhì)量體積比)的指示劑(氯酚紅)，使其在正常狀態(tài)下(2-30。C，PH=6-7)呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；E.密封C:存于2-8'C環(huán)境中。BCIP/NBT顯色底物，BCHVNBTPURPLELIQUIDSUBSTRATEFORMEMBRANES)購(gòu)自Sigma公司(125K1189)。陽(yáng)性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測(cè)定效價(jià)不低于1:200，HIV抗體全病毒確認(rèn)試劑檢測(cè)結(jié)果為全條帶陽(yáng)性的血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時(shí)；C.使用0.45lum濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中。陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經(jīng)兩種ELISA試劑測(cè)定、一種確認(rèn)試劑檢測(cè)、一種核酸檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)結(jié)果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時(shí)；C.使用0.45/im濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中。本發(fā)明的試劑盒配套包裝，配套使用，使用方法如下樣品從測(cè)試者身上獲得的血清或血漿。儀器微量加樣器，搖床，37"C烘箱。，37"C水浴箱。試劑準(zhǔn)備第一次使用時(shí)將脫脂奶粉加入到反應(yīng)液中，溫柔震蕩使其混合均勻。所有試劑在使用前在室溫(16—25"C)平衡半個(gè)小時(shí)或37°(:水浴IO分鐘。(顯色底物請(qǐng)取所需量分裝入配液瓶中水浴)所有試劑在使用前溫柔震蕩使其混合均勻。使用后盡快將所用試劑放入2—8"C環(huán)境中。操作方法快速反應(yīng)模式(1)將待測(cè)樣本及反應(yīng)液在室溫(16—25"C)平衡半個(gè)小時(shí)，或放入37。C水浴箱中水浴10分鐘(2)從管中取出所需數(shù)量的HIV抗體確認(rèn)試紙條，放在反應(yīng)槽中，有數(shù)字標(biāo)記的一面朝上；(3)向每個(gè)槽內(nèi)加入1毫升反應(yīng)液(乳白色)，置于搖床上室溫?fù)u動(dòng)5_10分鐘，然后在反應(yīng)槽的上方加入IO微升待檢樣本；(4)蓋上反應(yīng)槽，置于搖床上，室溫(16—25"C)孵育45分鐘；(51)完全去除槽中反應(yīng)液，用1毫升洗液(藍(lán)色)洗膜，共進(jìn)行4次，每次5分鐘；(6)完全去除槽中洗液，向每個(gè)槽內(nèi)加入酶結(jié)合物，(紅色)l毫升，蓋上反應(yīng)槽，置于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)孵育30分鐘；(7)完全去除槽中酶結(jié)合物，用l毫升洗液(藍(lán)色)將洗膜，共進(jìn)行4次，每次5分鐘；(8)完全去除槽中洗液，向每個(gè)槽內(nèi)加入l毫升顯色劑(淡黃色)，蓋上反應(yīng)槽，室溫?fù)u動(dòng)反應(yīng)IO分鐘；(9)完全去除槽中顯色劑，用蒸餾水沖2次，之后用蒸餾水浸泡1分鐘終止反應(yīng)；(10)取出確認(rèn)條，置于吸水紙上，放入烘箱中，37"C烘烤15分鐘徹底干燥；(11)使用對(duì)比卡片讀取結(jié)果，在室溫避光條件下，結(jié)果可以長(zhǎng)期保存。過(guò)夜反應(yīng)模式歩驟(4)的反應(yīng)時(shí)間為過(guò)夜反應(yīng)，其他步驟與快速反應(yīng)一致。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋(1)圖1為膜上相應(yīng)固相化蛋白的位置。使用對(duì)比卡片讀取確認(rèn)條的實(shí)驗(yàn)結(jié)果《曰息。(2)參照以下2個(gè)表格計(jì)算總得分。表1符號(hào)及其對(duì)應(yīng)含義<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>陰性結(jié)果不確認(rèn)結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果A《0.50.75《A《1.25A禮5(總得分不超過(guò)0.5)(總得分介于O.75至1.25之間)(總得分不少于1.5)(4)確認(rèn)條失效(在確認(rèn)所有組份均合理使用的情況下，出現(xiàn)下列任意一種情況判定為失效)無(wú)任何可辨認(rèn)的條帶出現(xiàn)。顯色20min后，質(zhì)控線3+的顯色仍然沒(méi)有達(dá)到明顯可見的強(qiáng)度。(5)特殊情況及可能原因(質(zhì)控線±的顯色結(jié)果強(qiáng)于質(zhì)控線+)當(dāng)樣本使用量比較大以及樣本中抗體含量比較大時(shí)有可能出現(xiàn)這種情況。這種情況下以質(zhì)控線土作為陽(yáng)性條帶的平均顯色標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)控線+作為條帶是否存在的判定標(biāo)準(zhǔn)。(6)HIV—2型(滿足以下3個(gè)條件可以初步判斷為HIV—2型抗體陽(yáng)性)滿足陽(yáng)性判定的條件；gp36的顯色結(jié)果強(qiáng)于質(zhì)控線+;gp41的顯色結(jié)果不強(qiáng)于gp36的顯色結(jié)果。(異常檢測(cè)結(jié)果及可能原因)質(zhì)控線3+未顯色未加入酶結(jié)合物未加入顯色底物顯色底物PH值過(guò)低酶結(jié)合物活性完全喪失質(zhì)控線+未顯色顯色底物溫度過(guò)低未加入人類血清顯色時(shí)間過(guò)短顯色底物ra值過(guò)低背景太高，所有條帶顯色結(jié)果均達(dá)到質(zhì)控線3+的水平顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)未用蒸餾水終止反應(yīng)未烤干試紙條使用回收的顯色底物背景較臟用手/手套直接拉觸確認(rèn)條表面確認(rèn)條潮濕確認(rèn)條表面被污染(該試驗(yàn)方法的局限性)本確認(rèn)試劑盒專供HIV—I型和HIV—II型抗體確認(rèn)用。(產(chǎn)品性能指標(biāo))試驗(yàn)完成后質(zhì)控線+，質(zhì)控線3+的顯色結(jié)果必須明顯可辨認(rèn)；背景顏色不超過(guò)質(zhì)控線土的顏色；否則實(shí)驗(yàn)不成立。本發(fā)明的試劑，其反應(yīng)原理如下固定在混合纖維素膜上的基因工程重組HIV—I/HIV—I1特異性蛋白將與待測(cè)人類血清中的相應(yīng)抗體特異結(jié)合，兔抗人IgG多克隆抗體將與人類血清中的IgG結(jié)合之后加入羊抗人IgG-堿性磷酸酶結(jié)合物，其將與重組抗原結(jié)合的HIV特異抗體、與兔抗人IgG結(jié)合的抗體以及包被在膜上的人源IgG相結(jié)合，加入底物后發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致顯色。如果待測(cè)樣本中含有HIV—I/HIV—II特異性抗體，在固定有相應(yīng)重組蛋白的地方將出現(xiàn)特異性顯色的條帶，反之將不出現(xiàn)。無(wú)論待測(cè)樣本中是否含有HIV—I/HIV—II特異性抗體，固定兔抗人IgG、人源IgG的條帶均將顯色。本HIV抗體確認(rèn)條的檢測(cè)線共包括6條，從上至下依次為gpl60、gpl20、p66、gp41、p24和gp36，用于檢測(cè)人類血清中的HIV特異抗體；其質(zhì)控線共包括3條，從上至下依次為質(zhì)控線土、質(zhì)控線+和質(zhì)控線3+。質(zhì)控線±(兔抗人IgG)用于指示樣品中免疫球蛋白IgG的含量；質(zhì)控線+(兔抗人IgG)用于指示陽(yáng)性條帶的平均顯色強(qiáng)度；質(zhì)控線3十(人源IgG)用于指示堿性磷酸酶的活性。質(zhì)控線土和質(zhì)控線+為動(dòng)態(tài)質(zhì)控線，不同待測(cè)樣本中的人源IgG含量的差別將導(dǎo)致這兩條質(zhì)控線顯色強(qiáng)度的差別；質(zhì)控線3+為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控線，其顯色強(qiáng)度與待測(cè)樣本無(wú)關(guān)。用于本試劑盒的抗原均為通過(guò)基因工程制備的、體外表達(dá)獲取的重組蛋白，這些重組蛋白均不具有生物危險(xiǎn)性。反應(yīng)模式本確認(rèn)試劑盒的反應(yīng)模式共有三種間接法、夾心法以及免疫反應(yīng)。HIV—I/HIV—I1特異性抗體的檢測(cè)采用的是間接法。將gpl60gpl20p66gp41p24和gp36重組抗原獨(dú)立包被在混合膜上；加入待測(cè)樣本，其中的相應(yīng)抗體將與這些抗原發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)；之后加入的羊抗人IgG(堿性磷酸酶標(biāo)記)將與這些HIV特異抗體相結(jié)合；加入顯色底物，在堿性磷酸酶的催化下，結(jié)合特異抗體的條帶將出現(xiàn)肉眼可見的顯色。人類血清中的免疫球蛋白IgG的含量檢測(cè)采用的是夾心法。將兔抗人IgG多克隆抗體分別以不同的濃度,被在混合膜上作為質(zhì)控線土和質(zhì)控線+，加入待測(cè)樣本，其中的人類血清免疫球蛋白IgG將與兔抗人IgG多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；之后加入的羊抗人IgG(堿性磷酸酶標(biāo)記)將與人源IgG相結(jié)合；加入顯色底物，在堿性磷酯酶的催化下，結(jié)合人源IgG的條帶將出現(xiàn)肉眼可見的顯色。在同一待測(cè)樣本中，包被濃度的不同將此兩條質(zhì)控線導(dǎo)致顯色深度的不同；在不同待檢測(cè)樣本中，人源IgG含量的差別將同時(shí)導(dǎo)致這兩條質(zhì)控線顯色強(qiáng)度的差別。堿性磷酸酶活性的檢測(cè)采用的是特異性免疫反應(yīng)。將人源IgG包被在混合膜上作為質(zhì)控線3+，羊抗人IgG(堿性磷酸酶標(biāo)記)將與其相結(jié)合；加入顯色底物，在堿性磷酸酶的催化下，該位置將出現(xiàn)肉眼可見的顯色。其顯色強(qiáng)度與待測(cè)樣本無(wú)關(guān)，僅用于指示堿性磷酸酶的活性。重組抗原的選擇目前在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于診斷HIV感染的確認(rèn)試驗(yàn)一般都要求檢測(cè)三類抗原(即env基因編碼的外膜蛋白抗原、pol基因編碼的聚合酶抗原和gag基因編碼的核心抗原)。根據(jù)廣東省衛(wèi)生防疫站艾滋病監(jiān)測(cè)檢測(cè)中心HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)1991至1995年間HIV初篩陽(yáng)性和可疑的103份樣本進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果以及湖北省疾病預(yù)防控制中心對(duì)1995至2001年間289例HIV—1確認(rèn)陽(yáng)性樣本帶型分析的結(jié)果；同時(shí)在參照了美國(guó)CDC,美國(guó)FDA，冊(cè)0以及中國(guó)衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，確定用于本HIV確認(rèn)試劑盒的抗原分別為env基因編碼產(chǎn)物gpl60，gpl20,gp41和HIV—2型特異抗原gp36;po1基因編碼產(chǎn)物p66;gag基因編碼產(chǎn)物p24。重組抗原的生產(chǎn)序列的獲得和引物的構(gòu)建通過(guò)信息檢索獲得HIV病毒gpl60,gpl20,gp41和gp36(HIV—II)的核酸編碼序列；p66的核酸編碼序列以及p24的核酸編碼序列。在廣泛査閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及與同行業(yè)廠家交流的基礎(chǔ)上，選取了各個(gè)蛋白的多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位的核酸編碼序列。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物(引物含有接頭，正向引物含有EcoIRI位點(diǎn)；反向引物含有Bam.HI位點(diǎn))用于體外克隆。序列擴(kuò)增以及檢定以裂解的HIV(病毒為模板，用上述引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在體外克隆獲得目的片段。使用0.8n/。TBE—瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段的長(zhǎng)度。連接轉(zhuǎn)化經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)為正確的克隆子，用E.coIRI,Bam.HI雙酶切處理之。使用T4連接酶，將其分別連接到PUC表達(dá)載體中。之后轉(zhuǎn)化基因工程用大腸桿菌JM109。用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基初篩含有表達(dá)載體的工程菌株，用雙酶切檢測(cè)出含有目的基因片段的工程菌株，用測(cè)序確認(rèn)含有目的基因片段的菌株。重組蛋白的表達(dá)和純化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用IM的IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白。采用溶菌酶結(jié)合超聲波方法破碎菌體，經(jīng)離心回收后，使用TritonX-IOO洗滌去除膜碎片和膜蛋白，用鹽酸胍(6mo1/1)溶解包涵體蛋白。然后先后使用離子交換層析純化和Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。用SDS—PAGE的方法檢測(cè)重組蛋白的純度(圖2)，應(yīng)用WesternBlot原理檢測(cè)重組蛋白的特異性以及抗原性。圖1為測(cè)試結(jié)果比較使用的對(duì)比圖，為膜上相應(yīng)固相化蛋白的位置具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1(1)確認(rèn)試紙條的制備及檢測(cè)用包被緩沖液。按一定的濃度用流試劃膜儀將檢測(cè)線和質(zhì)控線均勻，整齊的固定于混合纖維素膜上。確認(rèn)試紙條的干燥包被完成后置于超凈工作臺(tái)上室溫吹風(fēng)干燥2小時(shí)。保存于室溫干燥環(huán)境中(16一25"C，相對(duì)溫度不高于45%)。半成品檢定用HIV抗體確認(rèn)試劑國(guó)家參考品進(jìn)行檢定。HIV抗體陽(yáng)性參考品符合率10份，要求陽(yáng)性符合率為10/10。HIV抗體陰性參考品符合率12份，要求陰性符合率為12/12。HIV抗體不確定型樣品符合率5份，檢測(cè)結(jié)果不能為陰性。無(wú)菌試驗(yàn)液體組分按照<中國(guó)生物制品規(guī)程〉中<生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程〉第A3.2.3項(xiàng)進(jìn)行。穩(wěn)定性試驗(yàn)試劑各組分37"C放置6天，檢定結(jié)果應(yīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。分裝半成品檢定合格后及時(shí)分裝，分裝后保存于2—8"C。(相對(duì)濕度不高于45%)。(2)其他組分的制備HIV抗體確認(rèn)條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液(0.01MTris-HCl，pH7.4)將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度(gpl60、gpl20、P66、gp41、P24、gp36的包被濃度分別為80/Ag/mI、80/_ig/ml、50jLtg/ml、60jng/ml、80/ig/ml和5jUg/ml;兔抗人IgG的濃度分別為4.5/xg/ml和100|Ug/ml;人源IgG的濃度為50pig/ml);B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2/xl/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫(16-25°C)吹干2小時(shí)的方法進(jìn)行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處(2-8°C，相對(duì)濕度不高于45%)備用。反應(yīng)液，組成為0.8。/。NaCl、0.02Q/。KC1和0.05%吐溫-20的O.OlMTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到7.4;C.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；D.密封貯存于2-8'C環(huán)境中。洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將ra值調(diào)到9.8-10.0;C.加入100PPM(質(zhì)量體積比)的指示劑(溴百里酚藍(lán))，使其在正常狀態(tài)下(2-30°C，PH=9.9)呈藍(lán)色D.使用0.45jum濾膜過(guò)濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環(huán)境中。堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物(1:4000)，10mMTris-cl，20%胎牛血清，100PPMPEG,500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調(diào)到6.4-6.7;C.加入100PPM(質(zhì)量體積比)的指示劑(氯酚紅)，使其在正常狀態(tài)下(2-30。C，PH=6-7)呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；F.密封貯存于2-8'C環(huán)境中。BCIP/NBT顯色底物，BCIP/NBTPURPLELIQUIDSUBSTRATEFORMEMBRANES)購(gòu)自Sigma公司(125K1189)。陽(yáng)性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測(cè)定效價(jià)不低于1:200，HIV抗體全病毒確認(rèn)試劑檢測(cè)結(jié)果為全條帶陽(yáng)性的血清10份；B.混合血清，采用60'C處理1小時(shí)；C.使用0.45ium濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8i:環(huán)境中。陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經(jīng)兩種ELISA試劑測(cè)定、一種確認(rèn)試劑檢測(cè)、一種核酸檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)結(jié)果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時(shí)；C.使用0.45nmi濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8"C環(huán)境中。分裝半成品檢定合格后及時(shí)分裝。分裝后保存于2-8°C。(相對(duì)濕度不高于45%)。組裝按試劑盒組成成份進(jìn)行組裝。每一試劑盒中包括以下組成1、HIV抗體確認(rèn)條(避光，防潮)20條2、反應(yīng)液(配置完成后為乳白色)1瓶(20毫升)3、洗液(藍(lán)色)1瓶(200毫升)4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物(紅色)l瓶(20毫升)5、BCTP/NBT顯色底物(淡黃色)1瓶(20毫升)6、陽(yáng)性參考血清(生物危險(xiǎn)品)1瓶(50微)7、陰性參考血清1瓶(100微升)8、反應(yīng)板(每板io個(gè)反應(yīng)槽)2個(gè)9、對(duì)比卡片l個(gè)10、結(jié)果報(bào)告單l張11、說(shuō)明書l份最后進(jìn)行成品檢定。權(quán)利要求1、一種人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑，其特征在于，包括HIV抗體確認(rèn)條，反應(yīng)液，洗液，堿性磷酸酶-羊抗人IgG結(jié)合物，BCIP/NBT顯色底物，陽(yáng)性參考血清，陰性參考血清，所述試劑采用HIV-I型特異性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特異性蛋白gp36與待測(cè)人類血清中的相應(yīng)抗體特異結(jié)合，兔抗人IgG多克隆抗體與人類血清中的IgG結(jié)合，之后加入羊抗人IgG-堿性磷酸酶結(jié)合物，其將與重組抗原結(jié)合的HIV特異抗體、與兔抗人IgG結(jié)合的抗體以及包被在膜上的人源IgG相結(jié)合，加入底物后發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致顯色反應(yīng)的原理制備而成。2、權(quán)利要求1的確認(rèn)試劑，所述試劑由一組產(chǎn)品組成一個(gè)試劑盒，其中主要組成成分如下HIV抗體確認(rèn)條，反應(yīng)液，洗液，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，BCIP/NBT顯色底物，陽(yáng)性參考血清，陰性參考血清，另外還有，反應(yīng)板，對(duì)比卡片，結(jié)果報(bào)告單，產(chǎn)品說(shuō)明書。3、權(quán)利要求2的確認(rèn)試劑，每一試劑盒中包括以下組成1、HIV抗體確認(rèn)條20條2、反應(yīng)液l瓶3、洗液l瓶4、堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物1瓶5、BCIP/NBT顯色底物l瓶6、陽(yáng)性參考血清l瓶7、陰性參考血清l瓶8、反應(yīng)板2個(gè)9、對(duì)比卡片l個(gè)10、結(jié)果報(bào)告單l張11、說(shuō)明書l份。4、權(quán)利要求3的確認(rèn)試劑，其中HIV抗體確認(rèn)條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下.-A.使用包被緩沖液將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度；B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2/xl/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫吹干2小時(shí)的方法進(jìn)行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處備用；反應(yīng)液，組成為0.8。/。NaCl、0.02。/。KC1和0.05%吐溫-20的O.OlMTris-HCl，其制備方法如下A.按照上述配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到7.4;C.使用0.45]um濾膜過(guò)濾除菌；D.密封貯存于2-8匸環(huán)境中，洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上述配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到9.8-10.0;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態(tài)下呈藍(lán)色D.使用0.45pm濾膜過(guò)濾除菌；E.密封fc存于2-8'C環(huán)境中，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，10mMTris-cl，20%胎牛血清，IOOPPMPEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調(diào)到6.4-6.7;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態(tài)下呈紅色D.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；E.密封貯存于2-『C環(huán)境中，BCIP/NBT顯色底物，陽(yáng)性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測(cè)定效價(jià)不低于1:200，HIV抗體全病毒確認(rèn)試劑檢測(cè)結(jié)果為全條帶陽(yáng)性的血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時(shí)；C.使用0.45Mm濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中，陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經(jīng)兩種ELISA試劑測(cè)定、一種確認(rèn)試劑檢測(cè)、一種核酸檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)結(jié)果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時(shí)；C.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中。5、權(quán)利要求3的確認(rèn)試劑的使用方法，包括以下步驟樣品從測(cè)試者身上獲得的血清或血漿，儀器微量加樣器，搖床，37"C烘箱，，37"C水浴箱，試劑準(zhǔn)備第一次使用時(shí)將脫脂奶粉加入到反應(yīng)液中，溫柔震蕩使其混合均勻，所有試劑在使用前在室溫平衡半個(gè)小時(shí)或37"C水浴10分鐘，所有試劑在使用前溫柔震蕩使其混合均勻，使用后盡快將所用試劑放入2—8"C環(huán)境中，操作方法快速反應(yīng)模式(1)將待測(cè)樣本及反應(yīng)液在室溫平衡半個(gè)小時(shí)，或放入37°C水浴箱中水浴10分鐘(2)從管中取出所需數(shù)量的HIV抗體確認(rèn)試紙條，放在反應(yīng)槽中，有數(shù)字標(biāo)記的一面朝上；(3)向每個(gè)槽內(nèi)加入l毫升反應(yīng)液，置于搖床上室溫?fù)u動(dòng)5—IO分鐘，然后在反應(yīng)槽的上方加入10微升待檢樣本；(4)蓋上反應(yīng)槽，置于搖床上，室溫孵育45分鐘；(5)完全去除槽中反應(yīng)液，用l毫升洗液洗膜，共進(jìn)行4次，每次5分鐘；(6)完全去除槽中洗液，向每個(gè)槽內(nèi)加入酶結(jié)合物，1毫升，蓋上反應(yīng)槽，置于搖床上，室溫?fù)u動(dòng)孵育30分鐘；(7)完全去除槽中酶結(jié)合物，用l毫升洗液將洗膜，共進(jìn)行4次，每次5分鐘；(8)完全去除槽中洗液，向每個(gè)槽內(nèi)加入1毫升顯色劑，蓋上反應(yīng)槽，室溫?fù)u動(dòng)反應(yīng)IO分鐘；(9)完全去除槽中顯色劑，用蒸餾水沖2次，之后用蒸餾水浸泡1分鐘終止反應(yīng)；(10)取出確認(rèn)條，置于吸水紙上，放入烘箱中，37"C烘烤15分鐘徹底干燥；(11)使用對(duì)比卡片讀取結(jié)果，在室溫避光條件下，結(jié)果可以長(zhǎng)期保存，過(guò)夜反應(yīng)模式步驟(4)的反應(yīng)時(shí)間為過(guò)夜反應(yīng)，其他步驟與快速反應(yīng)一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋(1)右圖為膜上相應(yīng)固相化蛋白的位置，使用對(duì)比卡片讀取確認(rèn)條的實(shí)驗(yàn)結(jié)果{曰息，(2)計(jì)算總得分，HIV—2型滿足以下3個(gè)條件可以初步判斷為HIV—2型抗體陽(yáng)性滿足陽(yáng)性判定的條件；gp36的顯色結(jié)果強(qiáng)于質(zhì)控線+;gp41的顯色結(jié)果不強(qiáng)于gp36的顯色結(jié)果。6、權(quán)利要求3的確認(rèn)試劑的制備方法，包括以下步驟(1)重組抗原的生產(chǎn)序列的獲得和引物的構(gòu)建通過(guò)信息檢索獲得HIV病毒gpl60，gpl20，gp41和gp36的核酸編碼序列；p66的核酸編碼序列以及p24的核酸編碼序列，在廣泛査閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及與同行業(yè)廠家交流的基礎(chǔ)上，選取了各個(gè)蛋白的多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位的核酸編碼序列，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物用于體外克隆，序列擴(kuò)增以及檢定以裂解的HIV病毒為模板，用上述引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在體外克隆獲得目的片段，使用0.8y。TBE—瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段的長(zhǎng)度，連接轉(zhuǎn)化經(jīng)檢測(cè)確認(rèn)為正確的克隆子，用E.coIRI，Bam.HI雙酶切處理之，使用T4連接酶，將其分別連接到PUC表達(dá)載體中，之后轉(zhuǎn)化基因工程用大腸桿菌JM109，用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基初篩含有表達(dá)載體的工程菌株，用雙酶切檢測(cè)出含有目的基因片段的工程菌株，用測(cè)序確認(rèn)含有目的基因片段的菌株，重組蛋白的表達(dá)和純化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用IM的IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白，采用溶菌酶結(jié)合超聲波方法破碎菌體，經(jīng)離心回收后，使用TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白，用鹽酸胍溶解包涵體蛋白，然后先后使用離子交換層析純化和Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，用SDS—PAGE的方法檢測(cè)重組蛋白的純度，應(yīng)用WesternBlot原理檢測(cè)重組蛋白的特異性以及抗原性，(2)其他組分的制備HIV抗體確認(rèn)條，組成為混合纖維素膜以及包被在該膜上的重組抗原，其制備方法如下A.使用包被緩沖液將重組抗原以及兔抗人IgG和人源IgG稀釋到合適的濃度；B.使用流式劃線儀以劃膜速度為20mm/s，噴量為0.2pd/mm將各蛋白均勻包被于混合纖維素膜上；C.包被完成的混合膜采用室溫吹干2小時(shí)的方法進(jìn)行干燥；D.干燥后真空包裝，放在寒冷干燥處備用，反應(yīng)液，組成為0.8。/。NaCl、0.02。/。KC1和0.05%吐溫-20的0.01MTris-HCl，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用Na0H顆粒將PH值調(diào)到7.4;C.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；D.密封!C存于2-8'C環(huán)境中，洗液，組成為10mMCB緩沖液添加200PPMPEG,500PPMTween-20，500PPM甘油，100PPMProclin300，其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用NaOH顆粒將PH值調(diào)到9.8-10.0;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態(tài)下呈藍(lán)色D.使用0.45/im濾膜過(guò)濾除菌；E.密封貯存于2-8'C環(huán)境中，堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，組成為堿性磷酸酶一羊抗人IgG結(jié)合物，10mMTris-cl，20。/。胎牛血清，IOOPPMPEG，500PPM甘油和100PPMProclin300其制備方法如下A.按照上訴配方配制；B.使用HC1將PH值調(diào)到6.4-6.7;C.加入100PPM的指示劑，使其在正常狀態(tài)下呈紅色D.使用0.45/xm濾膜過(guò)濾除菌；F.密封貯存于2-8'C環(huán)境中，BCIP/NBT顯色底物，陽(yáng)性參考血清，其制備方法如下A.選用ELISA測(cè)定效價(jià)不低于1:200，HIV抗體全病毒確認(rèn)試劑檢測(cè)結(jié)果為全條帶陽(yáng)性的血清10份；B.混合血清，采用60。C處理1小時(shí)；C.使用0.45/mi濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中，陰性參考血清，其制備方法如下A.選用經(jīng)兩種ELISAi^式劑測(cè)定、一種確認(rèn)試劑檢測(cè)、一種核酸檢測(cè)試劑同時(shí)檢測(cè)結(jié)果為HIV抗體陰性血清10份；B.混合血清，采用6(TC處理1小時(shí)；C.使用0.45Mm濾膜過(guò)濾除菌；D.除菌過(guò)濾后密封貯存于2-8'C環(huán)境中，分裝半成品檢定合格后及時(shí)分裝，分裝后保存于2-8X:，組裝按試劑盒組成成份進(jìn)行組裝。全文摘要本發(fā)明涉及一種人類免疫缺陷病毒抗體確認(rèn)試劑，該診斷試劑采用基因工程重組HIV-I型特異性蛋白gp160、gp120、gp41、p66、p24以及HIV-II型特異性蛋白gp36獨(dú)立包被的混合纖維素膜、酶結(jié)合物及其他組份組成，應(yīng)用間接法的原理供HIV-I型和HIV-II型抗體確認(rèn)用。文檔編號(hào)G01N21/78GK101097216SQ20071011140公開日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月18日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者誌張,張海燕,曹健榮,王宇帆,王建麗申請(qǐng)人:曹健榮;張誌