專利名稱：一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物ca50的免疫放射分析試劑盒及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物CA50的免 疫放射分析試劑盒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
癌癥對(duì)人類的生存健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前腫瘤治療的關(guān)鍵在于早 期發(fā)現(xiàn)、早期治療，這已是人們的共識(shí)。隨著肺瘤早期診斷進(jìn)入蛋白質(zhì)時(shí) 代，越來越多肺瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為建立發(fā)展快速、高靈敏、高特異腫瘤標(biāo) 志物的新型檢測技術(shù)提出了更高的要求。糖類蛋白50 (CA50)主要分布于糖 脂和糖蛋白中，是一種廣譜的腫瘤糖類抗原，屬鞘糖脂類肺瘤標(biāo)志物，其 對(duì)多種上皮類惡性腫瘤有較高的陽性檢出率。通常在消化道腫瘤的病人中 可以觀察到血清中CA 50含量的升高，將其與CEA、 CA125、 CA199等標(biāo)志 物聯(lián)檢，可為疾病的前期篩查、輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)移以及預(yù)后提供有參考價(jià)值的依據(jù)。在實(shí)際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多， 一定程 度上影響了檢測靈敏度和準(zhǔn)確性，所以從復(fù)雜的背景中快速分離、純化出 目的待測物，是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題之一。免疫磁性微粒子技術(shù)是 利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒子作載體，以化學(xué)偶聯(lián) 法包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏 為免疫磁性粒子，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡單、不 需要昂貴的儀器設(shè)備；不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和 功能等特點(diǎn)，在外加磁場作用下定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成分得以分離、 濃集或純化。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過一種檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放 射分析方法，即將驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體、親和素、抗FITC抗體中的任一5種偶聯(lián)或包被于磁顆粒表面作為反應(yīng)固相，并對(duì)應(yīng)捕獲溶液中的免疫夾心 物，形成抗抗體-單抗-抗原-單抗、親和素-生物素化單抗-抗原-單抗、抗FITC抗體-FITC標(biāo)記單抗-抗原-單抗等三種雙夾心免疫復(fù)合物，洗滌分離 后，根據(jù)放射性計(jì)數(shù)對(duì)樣品中CA50進(jìn)行定量測定。本發(fā)明提供了一種檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其中包括包被有二抗的磁性微粒子；標(biāo)記的CA50單克隆抗體及1251 標(biāo)記的CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品； 濃縮洗滌液。其中二抗指的是驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體、親和素、抗FITC抗體中的任 一種，根據(jù)二抗體系的不同，試劑盒的組成可以具體表述為(1)包被有 驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體的^茲性微粒子；抗CA50單克隆抗體及'"I標(biāo)記的抗 CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗 滌液；(2)包#:有親和素的磁性微粒子；生物素標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體 及1251標(biāo)記的抗CA5 O單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA5 0標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì) 控品；濃縮洗滌液；(3)包被有抗FITC抗體的磁性微粒子；FITC標(biāo)記的抗 CA50單克隆抗體及i"I標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA50 標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。本發(fā)明中包被二抗的磁性微粒子為粒徑為2-3 jLim、使用濃度為5-10 mg/mL、內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe3(W 、表面包裹帶有活性基團(tuán)如氨基 (NH廣)、羧基(-COOH)的聚合物；所述二抗的包被是通過戊二醛兩步法將磁 性微粒子與二抗進(jìn)行偶聯(lián)，并以含有O. 5。/。牛血清白蛋白(BSA)、 1%酪蛋白 的pH為7. 2, 0.02 mol/L的磷酸緩沖液進(jìn)行封閉完成。當(dāng)本發(fā)明中包凈皮二抗為驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體時(shí)，所用兩^M元CA50單 克隆抗體一^f朱不必標(biāo)記，一^f朱標(biāo)記1251。當(dāng)本發(fā)明中包凈皮二抗為親和素時(shí)，所用兩才朱抗CA50單克隆抗體一4朱標(biāo) 記生物素， 一抹標(biāo)記1251。所述生物素的標(biāo)記是以碳化酰二亞胺法制備生物 素與單抗的偶聯(lián)物。生物素標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；所 述生物素標(biāo)記抗體液以20%小牛血清稀釋存放。當(dāng)本發(fā)明中包被二抗為抗FITC抗體時(shí)，所用兩抹抗CA50單克隆抗體一 株標(biāo)記FITC， 一株標(biāo)記1251。所述FITC的標(biāo)記是以堿性液標(biāo)記法制備FITC 與單抗的偶聯(lián)物。FITC標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；所述FITC 標(biāo)記抗體液以20%小牛血清稀釋存放。本發(fā)明中1251標(biāo)記抗體采用氯胺T法進(jìn)行，1251和標(biāo)記物應(yīng)妥善保管。本發(fā)明中混合標(biāo)記物液是按體積比為l: 1 - 1: 3,將標(biāo)記的CA50單克隆 抗體及1251標(biāo)記的CA5 O單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液。所述標(biāo)記物混合液 的溶劑成分為O. 05%甘油、0. 05°歸、0.2 g/L的石克柳汞。本發(fā)明中標(biāo)準(zhǔn)品溶液為5個(gè)濃度梯度CA50的溶液；所述配制標(biāo)準(zhǔn)品的 基質(zhì)為50%馬血清。本發(fā)明中質(zhì)控品及其含量是以正常人血清投入已知量的CA50標(biāo)準(zhǔn)品， 并根據(jù)臨床參考值以及劑量-反應(yīng)曲線的工作范圍而定。本發(fā)明中濃縮洗滌液為pH值為7. 4，含有O. 1 - 0. 5%吐溫-20， 0. 1°/。疊 氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中所用的反應(yīng)管材料可為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。本發(fā)明提供的檢測CA5 0的方法，是利用所述包被二抗的磁性微粒子免 疫放射分析試劑盒^r測血清中CA5 0。所述^r測CA5 0的方法還可包括樣品的前處理。本發(fā)明所提供的^r測CA50的方法，包括以下步驟1) 樣品前處理對(duì)臨床血清血漿，3000rpm離心5分鐘，耳又上層液即可進(jìn)行分析測定。2) 利用上述檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑盒檢 測才羊品。本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測人血清樣品中CA50含量。 本發(fā)明所述的檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑盒 主要采用二抗包被的磁性微粒子固相分離及雙抗夾心的反應(yīng)模式定性或 定量檢測人體血清血漿等樣品中CA50含量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品 前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品。CA50是一種糖類抗原，屬蛋白大分子，對(duì)此類分子一般采用雙抗體夾 心的方法進(jìn)行測定。上世紀(jì)70年代開始，科學(xué)家們通過雜交瘤技術(shù)陸續(xù)得 到了糖類抗原的單克隆抗體，從而為建立雙抗體夾心的免疫檢測模式提供 了保證。本發(fā)明的檢測原理是當(dāng)反應(yīng)液中有CA50單克隆抗體(或FITC標(biāo)記CA50 單克隆抗體、或生物素標(biāo)記CA50單克隆抗體)和"si標(biāo)記CA50單克隆抗體時(shí)， 加入CA50系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液后，通過"識(shí)別"抗原分子上的抗原決定 簇，在溶液中形成標(biāo)記抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物。然后加入包被有二抗的磁性微粒子，使其充分分散于溶液中，通過免疫反應(yīng)即可將免疫復(fù)合物 偶聯(lián)富集到磁性微粒子表面，在試管底部施加磁場后即可將偶聯(lián)有免疫復(fù) 合物的磁性粒子富集于試管底部。洗滌分離后，即可將反應(yīng)管直接置于自 動(dòng)放免儀中測定。樣品的輻射強(qiáng)度與樣品中抗原含量成正相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較即可得出相應(yīng)的抗原含量。本發(fā)明的檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑盒主要 釆用直接夾心法定性或定量檢測人血清、血漿等樣品中CA50的含量；對(duì)樣 品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品；采 用了高特異的單克隆抗體和超順磁、高分散、比表面積大的磁性微粒子， 主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏 度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的二抗包被磁性微粒子免疫放 射分析試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利，與市場上的 酶聯(lián)免疫試劑盒、板式化學(xué)發(fā)光試劑盒相比，線性范圍寬，有效避免彎鉤 效應(yīng)，不需樣品稀釋，適用于大批量樣品篩選的定性、定量。本發(fā)明提供的檢測CA5 0的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析方法及 其試劑盒，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)磁性微粒子大大提高蛋白的有效包被量從 而節(jié)省原料，同時(shí)可檢測的線性范圍大為拓寬，從而有效避免彎鉤效應(yīng)的 發(fā)生；(2) 二抗體系可以克服抗體直接物理吸附于固相所造成的結(jié)合行為 的非均一性，減少了反應(yīng)的溫育時(shí)間，重現(xiàn)性好；(3)改善了抗體直接包 被固相后活性下降的狀況，使得抗體的免疫活性在很大程度上可以得到保 存；(4)分離速度快、效率高、操作筒便，非常適合于自動(dòng)化檢測。


圖l是以二抗(為驢抗鼠多克隆抗體)包被的磁性微粒子免疫放射分析 試劑盒檢測CA50的標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)圖2是以二抗(抗FITC抗體)包被的磁性微粒子免疫放射分析試劑盒檢 測CA50的標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)圖3是以二抗(鏈霉親和素)包被的磁性微粒子免疫放射分析試劑盒檢 測CA50的標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1 、包被驢抗鼠多克隆抗體的磁性微粒子免疫放射分析試劑盒檢測血清中CA50。包被驢抗鼠多克隆抗體的CA50磁性微粒子免疫放射分析試劑盒包括(1) 包被有驢抗鼠多克隆抗體的磁性微粒子粒徑為2-3 jum、使用 濃度為5-10 mg/mL, 20 mL/瓶，l瓶；(2) CA50單克隆抗體液及標(biāo)記'"I的CA50單克隆抗體液混合作為標(biāo)記 物液體積比為l:l, 15 mL/瓶，l瓶。其中CA50單克隆抗體液以0. 05°/。甘 油、0. 2 g/L的硫柳汞和0. 5y。BSA稀釋為2. 5 ju g/mL, ^I標(biāo)記的CA50單克隆 抗體液以O(shè). 05°/。甘油、0. 2 g/L的疏柳汞和0. 5。/。BSA稀釋為3. 0 p g/mL。(3) CA50標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品用50。/。馬血清將CA50濃標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成標(biāo)準(zhǔn) 溶液6瓶，0 U/mL, 10 U/mL， 20 U/mL, 40 U/mL， 80 U/mL， 140 U/mL， 0. 5mL/瓶;質(zhì)控品為2瓶，20 U/mL、 80 U/mL， 0. 5mL/瓶;(4) 濃縮洗滌液pH值為7. 4，含有O. 1 - 0. 5%吐溫-20, 0. 1 °/ 疊氮化 鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。30 mL/瓶，l瓶。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍；(6)反應(yīng)試管所用的反應(yīng)管材料為聚苯乙烯，鋁膜真空封裝，100 支/包，l包。其中，驢抗鼠多克隆抗體包被磁性微粒子、^I標(biāo)記的CA50單克隆抗體 制備方法如下一、驢抗鼠多克隆抗體包被磁性微粒子的制備1、 驢抗鼠多克隆抗體包被磁性微粒子的制備原理磁性微粒子是內(nèi) 核為FeA、表面包裹了帶有活性基團(tuán)氨基的聚合物，可采用戊二醛兩步法 將磁性微粒子與驢抗鼠多克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)。如此合成的包被有驢抗鼠多 克隆抗體的顆粒，不僅有效包被量增加，而且在微觀空間具有"長臂，，， 從而減少空間位阻，使得抗體IgG對(duì)抗原的識(shí)別域充分展開，有利于抗體-抗原的空間匹配與非共價(jià)結(jié)合。2、 驢抗鼠多克隆抗體包被磁性微粒子的制備方法取濃度為50-100 mg/mL、粒徑為2-3 jim的磁性微粒子5 mL，加入O. 5 - 1. 5%的戊二醛0. 1 -O. 5mL進(jìn)行活化，室溫?cái)嚢?，混?小時(shí)后，加磁場，靜置IO-15min, 倒出上清，用pH值為7. 4的0. 01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶 液進(jìn)行懸浮，濃度為50 - 100 mg/mL;每毫升懸浮液中加入驢抗鼠多克隆 抗體20 - 80jig，在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置10-15min，倒出上清，用含有O. 5%牛血清白蛋白、1。/。酪蛋白的pH為7. 2， 0.02mol/L的磷酸 緩沖液于室溫封閉3 - 4小時(shí)；最后用pH值為7.4、含0. 5。ABSA的0. 02 mol/LTris-HCl緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成5 - 10mg/mL的工作液。 磁性微粒子分離劑在4。C保存，不應(yīng)凍存，用時(shí)輕輕搖勻。 二、 ^I標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備1、 '"I標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備原理'"I標(biāo)記的CA50單克隆抗體 以氯胺T標(biāo)記法進(jìn)行制備。氯胺T是一種氧化劑，在水溶液中可以緩慢地釋 放次氯酸，因而可以在標(biāo)記的過程中形成一種能產(chǎn)生溫和氧化效果的中間 體，它可使放射性碘離子氧化而呈活潑形式的石典離子，并取代抗原分子中 酪氨酸苯環(huán)羥基鄰位的一個(gè)或二個(gè)氫原子，使之成為含有碘化酪氨酸的多 肽鏈。2、 ^I標(biāo)記CA50單克隆抗體的制備方法(1) 將抗體以0. 5mol/L pH7. 5的磷酸鹽緩沖液稀釋為20 |ig/|aL, 取5 10juL。(2) 取Na1251 5luL(含2mc卜3mci)。(3) 將lmg氯胺T溶于0. 5 mol/L pH7. 5磷酸鹽緩沖液0. lmL中。(4) 再將Na1251和氯胺T分別緩緩加入抗體液中，于水浴中邊加邊攪 拌，加完后再攪拌5min。(5) 加30 mg/mL的偏重硫酸鈉0. lmL，稀釋液為0. 5 raol/L pH7. 5磷 酸鹽緩沖液。(6) 過SephadexG50柱，第一峰即為碘標(biāo)記抗體。 利用該試劑盒檢測樣品中CA5 0含量的方法如下一、 樣品前處理對(duì)人血清血漿取空腹晨血樣本，3000rpm離心5min,取上層液25 |i L進(jìn)行分析。待測樣品2-8。C存放不得超過48小時(shí)，若48小時(shí)未檢測，應(yīng) 于-2(TC以下保存，但不應(yīng)超過30天。二、 4企測方法向試管中加入50 ju L血清樣品或同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入標(biāo) 記物混合液50jnL, 37。C水浴反應(yīng)30min。加入磁性微粒子溶液IOO |a L,室 溫放置5min后，將試管架置于磁分離器上分離2min,然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出 上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加 入洗滌液500 pL,用圓周運(yùn)動(dòng)使其充分混勻，置于磁分離器上分離5min,然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復(fù)3次。取出試管，測各管放射性計(jì)數(shù)。 三、結(jié)果分析放射性計(jì)數(shù)-劑量反應(yīng)曲線以雙對(duì)數(shù)曲線表示，即所獲得的每個(gè)濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本放射性計(jì)數(shù)的平均值(B)減去第一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的放射性計(jì) 數(shù)(B。)，再取對(duì)數(shù)，即縱軸(Y軸卜ln(B-B。)以CA50濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。相應(yīng) 每一個(gè)樣品中CA50濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用多參數(shù)回歸方程 法進(jìn)行擬合，計(jì)算出樣本溶液中CA50的濃度。本試劑盒提供的線性范圍為 0-150U/mL,;險(xiǎn)測限為3. 5 U/mL，整個(gè)4僉測過程只需1. 5個(gè)小時(shí)即可完成， 完全符合臨床要求。并且由于線性較寬，避免了高濃度樣品的稀釋，彎鉤 效應(yīng)也可以得到避免。實(shí)施例2、包^皮抗FITC抗體的磁性微粒子免疫放射分析試劑盒4會(huì)測血 清中CA50。包被抗FITC抗體的CA50磁性微粒子免疫放射分析試劑盒包括(1) 包被有抗FITC抗體的磁性微粒子粒徑為2-3 ju m、使用濃度為 5 - 10 mg/mL, 20 mL/瓶，l瓶；(2) 標(biāo)記FITC的CA50單克隆抗體液及標(biāo)記i"I的CA50單克隆抗體液混 合作為標(biāo)記物液體積比為1:2， 15 mL/瓶，l瓶。其中FITC標(biāo)記的CA50單 克隆抗體液以O(shè). 05%甘油、0. 2 g/L的硫柳汞和0. 5。/。BSA稀釋為1. 25 ja g/mL， "si標(biāo)記的CA50單克隆抗體液以0. 05%甘油、0.2 g/L的硫柳汞和0. 5。/。BSA稀 釋為2. 5 jag/mL。(3) CA50標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品用50y。馬血清將CA50濃標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成標(biāo)準(zhǔn) 溶液6瓶，0 U/mL， 10 U/mL， 20 U/mL， 40 U/mL， 80 U/mL， 140 U/mL, 0. 5mL/瓶；質(zhì)控品為2并瓦，20 U/mL、 80 U/mL, 0. 5mL/并瓦；(4) 濃縮洗滌液pH值為7. 4,含有O. 1 - 0. 5°/。吐溫-20, 0. 1 °/。疊氮化 鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。30 mL/瓶，l瓶。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍；(6)反應(yīng)試管所用的反應(yīng)管材料為聚苯乙烯，鋁膜真空封裝，100 支/包，l包。其中，抗FITC抗體包被磁性微粒子、FITC標(biāo)記CA50單克隆抗體、1251標(biāo)記的CA5 0單克隆抗體制備方法如下一、 抗FITC抗體與；茲性微粒子偶聯(lián)物的制備1、 抗FITC抗體與磁性微粒子偶聯(lián)物的制備原理磁性微粒子是內(nèi)核 為FeA、表面包裹了帶有活性基團(tuán)氨基的聚合物，可采用戊二醛兩步法將 磁性微粒子與抗FITC抗體進(jìn)行偶聯(lián)。如此合成的包被有抗FITC抗體的顆 粒，不僅有效包被量增加，而且在微觀空間具有"長臂"，從而減少空間 位阻，使得抗體IgG對(duì)抗原的識(shí)別域充分展開，有利于抗體-抗原的空間匹 配與非共價(jià)結(jié)合。2、 抗FITC抗體與f茲性微粒子偶聯(lián)物的制備方法將粒徑為2-3 ju m 的磁性微粒子用戊二醛進(jìn)行活化，室溫?cái)嚢?，混?小時(shí)后，加磁場，靜 置10-lSmin，倒出上清，用pH值為7. 4的0. 01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三 次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50 - 100 mg/mL;每毫升懸浮液中加入 抗FITC抗體20 - 80 jug,在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置10-15min， 倒出上清，用含有O. 5%牛血清白蛋白、1。/。酪蛋白的pH為7.2, 0. 02mol/L 的磷酸緩沖液于室溫封閉3-4小時(shí)；最后用pH值為7. 4、含O. 5。/。BSA的0. 02 mol/LTris-HC1緩沖液清洗三次，并用該溶液配制成5 - 10mg/mL的工作液。 磁性微粒子分離劑在4。C保存，不應(yīng)凍存，用時(shí)輕輕搖勻。二、 FITC標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備1、 FITC標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備原理FITC分子與CA50單克隆 抗體的偶聯(lián)物是以常見的石咸性液標(biāo)記法對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。2、 FITC標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備方法(1) A液取CA50單克隆抗體0. 5mg置于50mmol/L pH值為9. 3的 Na2C03-NaHC03緩沖液中；(2) B液:取FITC 2mg溶于lmL 50 mmol/L pH值為9. 3的Na2C03-NaHC03 緩沖液中；(3) 將A液置于磁力攪拌器，取B液緩緩滴加至A液中，約在5-8分鐘間 加完，防止出現(xiàn)氣泡，然后置4 'C攪拌12-16小時(shí)；(4) 將反應(yīng)液裝透析袋，置10 mmol/L pH值為7. 4的磷酸緩沖液中透 析2天，每天更換透析液2次；(5) 將標(biāo)記物以20%小牛血清稀釋為1.25 jiig/mL,加入適量 proclin300,分裝，20。C下保存。三、 ^I標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備方法同實(shí)施例l12利用該試劑盒檢測樣品中CA5 0含量的方法如下一、 樣品前處理對(duì)人血清血漿取空腹晨血樣本，3000rpm離心5min，取上層液25 |u L進(jìn)行分析。待測樣品2 - 8"C存放不得超過48小時(shí)，若48小時(shí)未檢測，應(yīng) 于-20。C以下保存，^f旦不應(yīng)超過30天。二、 4企測方法向試管中加入50 ju L血清樣品或同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入標(biāo) 記物混合液50jaL， 37。C水浴反應(yīng)30min。加入石茲性樣i粒子溶液100 |a L,室 溫放置5min后，將試管架置于磁分離器上分離2min，然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出 上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加 入洗滌液500jaL，用圓周運(yùn)動(dòng)使其充分混勻，置于磁分離器上分離5min， 然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除 去掛壁液體，重復(fù)3次。取出試管，測各管放射性計(jì)數(shù)。三、 結(jié)果分析放射性計(jì)數(shù)-劑量反應(yīng)曲線以雙對(duì)數(shù)曲線表示，即所獲得的每個(gè)濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本放射性計(jì)數(shù)的平均值(B)減去第一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的放射性計(jì) 數(shù)(B。)，再取對(duì)數(shù)，即縱軸(Y軸)-ln(B-B。)以CA50濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。相應(yīng) 每一個(gè)樣品中CA5O濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用多參數(shù)回歸方程 法進(jìn)行擬合，計(jì)算出樣本溶液中CA50的濃度。本試劑盒提供的線性范圍為 0-150U/mL，檢測限為4. OU/mL，整個(gè)檢測過程只需l. 5個(gè)小時(shí)即可完成， 完全符合臨床要求。并且由于線性較寬，避免了高濃度樣品的稀釋，彎鉤 效應(yīng)也可以得到避免。實(shí)施例3、包被鏈霉親和素的磁性微粒子免疫放射分析試劑盒檢測血 清中CA50。包被鏈霉親和素的CA5 O磁性微粒子免疫放射分析試劑盒包括(1) 包被有鏈霉親和素的磁性微粒子粒徑為2-3 jum、使用濃度為 5 _ 10 mg/mL， 20 mL/瓶，l瓶；(2) 標(biāo)記鏈霉親和素CA50單克隆抗體液及標(biāo)記^I的CA50單克隆抗體 液混合作為標(biāo)記物液體積比為1:3， 15 mL/瓶，l瓶。其中鏈霉親和素標(biāo)記的CA50單克隆抗體液以0. 05°/。甘油、0.2 g/L的石危柳汞和0. 5。/。BSA稀釋為 1.25 jug/mL, i"I標(biāo)記的CA50單克隆抗體液以0. 05%甘油、0.2 g/L的碌u柳 汞和O. 5。/。BSA稀釋為2. 5 ji g/mL。(3) CA50標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品用50。/。馬血清將CA50濃標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成標(biāo)準(zhǔn) 溶液6瓶，0 U/mL， 10 U/mL, 20 U/mL, 40 U/mL， 80 U/mL， 140 U/mL， 0. 5mL/瓶；質(zhì)控品為2并瓦，20 U/mL、 80 U/mL， 0. 5mL/并瓦；(4) 濃縮洗涂液pH值為7. 4，含有O. 1 - 0. 5°/。吐溫-20, 0， 1 %疊氮化 鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。30 mL/瓶，l瓶。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍；(6)反應(yīng)試管所用的反應(yīng)管材料為聚苯乙烯，鋁膜真空封裝，100 支/包，l包。其中，鏈霉親和素包被磁性微粒子、生物素標(biāo)記CA50單克隆抗體、1251 標(biāo)記的CA5 O單克隆抗體制備方法如下一、 鏈霉親和素包被磁性微粒子的制備1、 鏈霉親和素包被磁性微粒子的制備原理磁性微粒子是內(nèi)核為 Fe304、表面為包裹了帶有活性基團(tuán)氨基的聚合物，可采用直接包被法將鏈 霉親和素包被于聚合物表面。2、 鏈霉親和素包被^茲性微粒子的制備方法將親和素溶于50 mmol/L 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH7. 0)，與磁性微粒子攪拌混合，4 。C下 放置15 h后，用相同的緩沖液懸浮清洗三次，倒出上清后，用含有0.5%牛 血清白蛋白、1。/。酪蛋白的pH為7. 2， 0. 02 mol/L的磷酸緩沖液于室溫封閉 3-4小時(shí);最后用pH值為7.4、含O. 5。/。BSA的0. 02 mol/LTris-HC1緩沖液清 洗三次，并用該溶液配制成5-10 mg/mL的工作液。石茲性微粒子分離劑在4 'C保存，不應(yīng)凍存，用時(shí)輕輕搖勻。二、 親和素標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備1、 親和素標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備原理以碳化酰二亞胺法制 備生物素與單抗的偶聯(lián)物，生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián) 反應(yīng)而完成才示i己。2、 親和素標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備方法(1) 用二甲基亞砜配制IO mg/mL的N-羥琥珀酰亞胺生物素；(2) 用O. lmol/L、 pH值為8， 0的硼酸鈉緩沖液稀釋CA50抗體溶液至1 4 mg/mL;(3) 按照每毫克抗體加入50-250 ]Jg的生物素酯，混勻后，室溫?cái)嚢?小時(shí)；(4) 按照每180iag生物素酯加入20uL的lmol/L Nm:i終止反應(yīng)，室溫 放置10min;(5) 以磷酸鹽緩沖液充分透析除去游離生物素和鹽類，標(biāo)記的抗體在 -4'C凍存。三、^I標(biāo)記的CA50單克隆抗體的制備方法同實(shí)施例1 利用該試劑盒^r測樣品中CA5 0含量的方法如下一、 樣品前處理對(duì)人血清血漿取空腹晨血樣本，3000rpm離心5min,取上層液25 ju L進(jìn)行分析。待測樣品2 - 8。C存放不得超過48小時(shí)，若48小時(shí)未檢測，應(yīng) 于-20。C以下保存，^旦不應(yīng)超過30天。二、 檢測方法向試管中加入25 juL血清樣品或同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入標(biāo) 記物混合液50iaL， 37。C水浴反應(yīng)30min。加入磁性微粒子溶液50 jli L,室 溫放置5min后，將試管架置于磁分離器上分離2min，然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出 上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加 入洗滌液300 jaL，用圓周運(yùn)動(dòng)使其充分混勻，置于磁分離器上分離5min， 然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除 去掛壁液體，重復(fù)3次。取出試管，測各管放射性計(jì)數(shù)。三、 結(jié)果分析放射性計(jì)數(shù)-劑量反應(yīng)曲線以雙對(duì)數(shù)曲線表示，即所獲得的每個(gè)濃度 標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本放射性計(jì)數(shù)的平均值(B)減去第一個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的放射性計(jì) 數(shù)(B。)，再取對(duì)數(shù)，即縱軸(Y軸卜ln(B-B。)以CA50濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。相應(yīng) 每一個(gè)樣品中CA50濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用多參數(shù)回歸方程 法進(jìn)行擬合，計(jì)算出樣本溶液中CA50的濃度。本試劑盒提供的線性范圍為 0-l飼/mL，檢測限為3.5U/mL,整個(gè)檢測過程只需1. 5個(gè)小時(shí)即可完成， 完全符合臨床要求。提示在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì) 本發(fā)明作各種改動(dòng)或^務(wù)改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書 所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測腫瘤標(biāo)志物CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括包被有二抗的磁性微粒子；標(biāo)記的CA50單克隆抗體及125I標(biāo)記的CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于所述包被磁性微粒子的二抗可以是驢抗鼠或兔抗鼠多 克隆抗體、抗FITC多克隆或單克隆抗體、親和素或鏈霉親和素中的任一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑 盒，其特征在于該試劑盒包括包被有驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體的/F茲性微粒 子；抗CA50單克隆抗體及^I標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物 液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于該試劑盒包括包被有親和素或鏈霉親和素的磁性微粒 子；生物素標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體及'"I標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體混合而 成的標(biāo)記物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于該試劑盒包括包被有抗FITC抗體的磁性微粒子；FITC 標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體及'"I標(biāo)記的抗CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記 物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于所述二抗的包被是通過戊二醛兩步法將^f茲性微粒子與 驢抗鼠或兔抗鼠多克隆抗體、或者抗FITC多克隆或單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)； 或者通過物理吸附法將親和素或鏈霉親和素進(jìn)行包被。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于包被時(shí)使用的封閉液為含有O. 5%牛血清白蛋白、1% 酪蛋白、pH值為7. 2的0. 02 raol/L磷酸緩沖液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l - 7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試劑盒，其特征在于所述包被有二抗的磁性微粒子為粒徑為2 -3 |im、內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe30J 、表面包裹帶有活性基團(tuán)如氨基(NH廣)、 羧基(-COOH)的聚合物，其使用濃度為5-10 mg/mL。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于所述二抗為抗FITC多克隆或單克隆抗體，F(xiàn)ITC分子與 CA50單克隆抗體的偶I關(guān)物是以堿性液標(biāo)記法對(duì)抗體進(jìn)4于標(biāo)記，F(xiàn)ITC標(biāo)記物 形式可為凍干粉、濃縮液和工作液，存放FITC標(biāo)記抗體液的溶液為20。/o小 牛A清。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于所述二抗為親和素或鏈霉親和素，生物素的標(biāo)記是以 碳化酰二亞胺法制備生物素與CA50單克隆抗體的偶聯(lián)物，生物素標(biāo)記物形 式可為凍干4分、濃縮液和工作液，存力文生物素標(biāo)記抗體液的溶液為20%小 牛A清。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記的單克隆抗體都是CA50特異性單 克隆抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被^f茲性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于所述放射性核素標(biāo)記抗體的標(biāo)記物為1251， 標(biāo)記方法為氯胺T法。
13. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析試 劑盒，其特征在于所述混合標(biāo)記物液選自體積比為l: 1 - 1: 3的下述溶液 混合液(1) 當(dāng)包被二抗為驢抗鼠或兔抗鼠抗抗體時(shí)，以抗CA50單克隆抗體液 與標(biāo)記"I的抗CA5 O單克隆抗體液混合；(2) 當(dāng)包被二抗為親和素或鏈霉親和素時(shí)，以標(biāo)記生物素的抗CA50單 克隆抗體液與標(biāo)記'"I的抗CA50單克隆抗體液混合；或(3) 當(dāng)包被二抗為抗FITC抗體時(shí)，以標(biāo)記FITC的抗CA50單克隆抗體液 與標(biāo)記^I的抗CA50單克隆抗體液混合，所述標(biāo)記物混合液溶劑成分為O. 05%甘油、0. 05%BSA、 0. 2g/L的疏柳汞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被;磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液為5個(gè)濃度梯度CA50的溶液；所述配制標(biāo)準(zhǔn)品的基質(zhì)為50%馬血清。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于所述質(zhì)控品及其含量是以正常人血清投入 已知量的CA5 0標(biāo)準(zhǔn)品，并根據(jù)臨床參考值以及劑量-反應(yīng)曲線的工作范圍而定。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值為7. 4,含有O. l-0. 5%吐溫-20, 0.1 %疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于還包括使用的反應(yīng)管，其材料可為聚苯乙 烯、聚乙烯、聚丙烯等，優(yōu)選為聚苯乙烯。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫 放射分析試劑盒，其特征在于待檢物質(zhì)為血清或血漿樣品中的CA50。
19. 一種應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求1-18所述的任一種CA50二抗包被磁性微粒 子免疫放射分析試劑盒檢測CA50的方法，其特征在于，包括以下步驟(1) 樣品前處理對(duì)臨床血清血漿，3000rpm離心5分鐘，取上層液即可進(jìn)行分析測定；(2) 利用權(quán)利要求l - 18中任一所述的檢測CA50的二抗包被磁性微粒 子免疫放射分析試劑盒檢測樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析方法試劑盒及其應(yīng)用方法，該試劑盒中包括包被有二抗的磁性微粒子；標(biāo)記的CA50單克隆抗體及¹²⁵I標(biāo)記的CA50單克隆抗體混合而成的標(biāo)記物液；CA50標(biāo)準(zhǔn)品溶液及質(zhì)控品；濃縮洗滌液。本發(fā)明與已知的測定CA50的放射免疫試劑盒相比，具有高通量、高靈敏度、線性范圍寬、快速等諸多優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/546GK101324578SQ20071011888
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者林金明, 栩 王 申請(qǐng)人:清華大學(xué)