專利名稱：提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境樣品免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域中一種提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液。
背景技術(shù)：
基質(zhì)(Matrix)是指一種分析物(Analyte)的環(huán)境(Milieu)，即指樣品中除了目標(biāo)分析物以外的一切成份及其物理、化學(xué)性質(zhì)(例如粘度、pH、溫度等)。
基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect)在醫(yī)學(xué)上按臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化組織的定義是指(1)樣品中除分析物以外的其他成份對(duì)分析物測(cè)定值的影響；(2)基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物的能力的干擾。
環(huán)境樣品中的各種基質(zhì)與其它樣本中(如醫(yī)學(xué)上的血液樣品)的基質(zhì)有著較大的不同，這是環(huán)境樣品免疫檢測(cè)技術(shù)非常重要的特點(diǎn)之一。為了能實(shí)現(xiàn)對(duì)水樣進(jìn)行直接的免疫檢測(cè)，減少或省略預(yù)處理步驟，因此，有必要考察水中的各種基質(zhì)對(duì)免疫檢測(cè)的影響，做出全面的評(píng)價(jià)，并對(duì)不利的影響和干擾提出解決方案，以保證免疫檢測(cè)的穩(wěn)定性、重復(fù)性和可靠性。
目前，環(huán)境樣品的免疫檢測(cè)研究中，有關(guān)環(huán)境樣品中復(fù)雜基質(zhì)對(duì)免疫檢測(cè)的干擾規(guī)律以及對(duì)干擾的消除方法等尚未開(kāi)展起來(lái)。而這些對(duì)保證免疫檢測(cè)的穩(wěn)定性、重復(fù)性和可靠性十分關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液。
本發(fā)明所提供的緩沖溶液，是在現(xiàn)有的濃度為0.05-0.12mol/L、pH為7.0-8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為10-100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2-20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應(yīng)體系發(fā)生反應(yīng)的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2-20g/L。
所述現(xiàn)有的緩沖液具體可為磷酸鹽緩沖液。
所述惰性蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白和兔血清白蛋白。
其中，所述NaCl的濃度優(yōu)選為50g/L。
所述惰性蛋白或明膠的濃度優(yōu)選為10g/L。
所述乙二胺四乙酸二鈉的濃度優(yōu)選為5g/L。
本發(fā)明所提供的提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法，是在環(huán)境樣品免疫檢測(cè)中，將上述任一種環(huán)境樣品免疫檢測(cè)專用緩沖溶液作為緩沖體系，進(jìn)行境樣品的免疫檢測(cè)。
本發(fā)明的提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液可用于各種環(huán)境樣品(如水樣)的免疫檢測(cè)中，可有效地減小或消除來(lái)自環(huán)境樣品(如水樣)中各種復(fù)雜基質(zhì)在其自然界存在的邊界范圍內(nèi)給免疫檢測(cè)帶來(lái)的干擾，使實(shí)際環(huán)境樣品免疫檢測(cè)的穩(wěn)定性增強(qiáng)。
本發(fā)明的提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液能應(yīng)用在環(huán)境樣品各種免疫檢測(cè)技術(shù)上，包括環(huán)境樣品的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(ELISAkit)、環(huán)境樣品膠體金試紙檢測(cè)、環(huán)境樣品免疫傳感器/抗體芯片(免疫芯片，抗體陣列)等檢測(cè)技術(shù)方面，能顯著提高上述免疫檢測(cè)技術(shù)的穩(wěn)定性和一致性。


圖1為添加普通緩沖液的不同pH值條件下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖3為添加專用緩沖液1的不同pH值條件下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4為圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖5為添加普通緩沖液的不同硬度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6為圖5標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和ICX50的比較圖7為添加專用緩沖液1的不同硬度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8為圖7標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖9為添加普通緩沖液的不同腐殖酸濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖10為圖10標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖11為添加專用緩沖液1的不同腐殖酸濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖12為圖11標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較圖13為添加普通緩沖液的不同CuSO4濃度下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖14為添加普通緩沖液的不同CuSO4濃度下A0和IC50值的變化圖15為添加專用緩沖液1的不同CuSO4濃度下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖16為添加專用緩沖液1的不同CuSO4濃度下A0和IC50值的變化圖17為添加專用緩沖液1的不同COD濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖18為添加專用緩沖液1的不同COD濃度下A0和IC50值的變化圖19為添加專用緩沖液1的不同葉綠素a濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖20為添加專用緩沖液1的不同葉綠素a濃度下A0和IC50值的變化圖21為添加普通緩沖液的不同甲醇濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖22為添加普通緩沖液的不同甲醇濃度下A0和IC50值的變化圖23為添加專用緩沖液1的不同甲醇濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖24為添加專用緩沖液1的不同甲醇濃度下A0和IC50值的變化圖25為添加專用緩沖液1的不同甲苯濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖26為添加專用緩沖液1的不同甲苯濃度下A0和IC50值的變化圖27為添加專用緩沖液1的不同2，4-D濃度下的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖28為添加專用緩沖液1的不同2，，4-D濃度下A0和IC50值的變化圖29為添加專用緩沖液2的不同pH值條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖30為添加專用緩沖液2的不同硬度條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖31為添加專用緩沖液2的不同腐殖質(zhì)酸濃度下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖32為添加專用緩沖液3的不同pH值條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖33為添加專用緩沖液3的不同硬度條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較圖34為添加專用緩沖液3的不同腐殖質(zhì)酸濃度下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最大吸光度A0和IC50的比較具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過(guò)全面分析和系統(tǒng)考察環(huán)境中的各種基質(zhì)對(duì)免疫檢測(cè)的影響，提出一種免疫檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的緩沖體系。具體方法如下首先將環(huán)境樣中有代表性的基質(zhì)進(jìn)行分類，以免疫檢測(cè)為基礎(chǔ)，綜合分析了各類基質(zhì)對(duì)免疫檢測(cè)的影響規(guī)律及機(jī)理，并提出了相應(yīng)的干擾減小或消除方案。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中選取的可能影響抗體性質(zhì)或影響抗原抗體反應(yīng)的代表性基質(zhì)包括以下幾類(1)水中的環(huán)境條件干擾因素pH值、硬度和無(wú)機(jī)鹽濃度；(2)水體綜合污染指標(biāo)選取生活污水作為干擾基質(zhì)；(3)富營(yíng)養(yǎng)化水體中普遍存在的物質(zhì)腐殖酸和葉綠素a；(4)水中可能存在的有毒污染物選取甲苯作為有機(jī)干擾基質(zhì)、選取2，4-D作為農(nóng)藥類干擾基質(zhì)、選取銅離子作為重金屬干擾基質(zhì)。
(5)樣品提取或濃縮過(guò)程、以及免疫檢測(cè)過(guò)程可能引入的有機(jī)溶劑甲醇、乙酸和表面活性劑。
考察環(huán)境樣品中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)免疫檢測(cè)的干擾，并提出抗干擾解決方案，基本步驟如下(1)研究上述各基質(zhì)在不同濃度條件下對(duì)免疫檢測(cè)的影響規(guī)律。即比較干擾基質(zhì)不同濃度條件下對(duì)免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化，觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線受不同濃度基質(zhì)影響變化的趨勢(shì)和程度，通過(guò)對(duì)比，定性描述各包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的高低、旋轉(zhuǎn)及偏移等在內(nèi)的影響規(guī)律；同時(shí)定量的評(píng)價(jià)各干擾基質(zhì)對(duì)免疫檢測(cè)最低檢測(cè)能力和定量檢測(cè)區(qū)間的影響。
(3)通過(guò)配制相應(yīng)的緩沖溶液用作反應(yīng)稀釋液，并在稀釋液中添加不同的抗干擾物質(zhì)來(lái)減小或消除這些不利的干擾因素。并重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定，同時(shí)評(píng)價(jià)對(duì)不利干擾因素的抑制效果。
(4)最后評(píng)價(jià)在稀釋液中添加的抗干擾物質(zhì)本身對(duì)免疫檢測(cè)的影響。在系統(tǒng)考慮各基質(zhì)的影響規(guī)律及消除方法的基礎(chǔ)上，得出本發(fā)明的環(huán)境樣品免疫檢測(cè)專用緩沖溶液。
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
骨髓瘤細(xì)胞SP2/0種子來(lái)源于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。6周齡的Balb/c純系雌性小鼠購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新生牛血清(PAA，LotB00104-0786)，細(xì)胞融合用PEG 1500(Roche，11423800)，50×HAT儲(chǔ)液(Sigma，H0262，Lot 093K8931)，50×HT儲(chǔ)液(Sigma H0137，Lot 064K8927)，IMDM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036)，氨芐青霉素鈉(Amresco 0339)，硫酸鏈霉素(Amresco 0382)，8-Azaguanine(Sigma A5284)，DMSO(Amresco 0231)，石蠟油，無(wú)水乙醚、異丙醇(北京化學(xué)試劑公司)。MC-LR(Alexis公司(Lausen，Switzerland)，產(chǎn)品編號(hào)ALX-350-012)。BSA(Sigma，A7638)。OVA(Sigma，A5378)。
實(shí)施例1、抗微囊藻毒素-LR的單克隆抗體MC8C10的獲得一、雜交瘤細(xì)胞株MC8C10 CGMCC No.2101的獲得1、微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA的合成將微囊藻毒素-LR采用2-巰基乙胺進(jìn)行化學(xué)修飾，在其第七位氨基酸(Mdha)上引入一個(gè)活性基團(tuán)——氨基，再采用戊二醛法將修飾后的微囊藻毒素-LR(MC-LR)與牛血清白蛋白偶聯(lián)，經(jīng)過(guò)濾層析后得到完全抗原，經(jīng)MALDI-TOF/MS確定完全抗原的偶聯(lián)比。具體方法如下(1)對(duì)微囊藻毒素-LR進(jìn)行氨基修飾①將2-巰基乙胺和MC-LR按照摩爾比3000∶1充分混和在堿性的碳酸鹽緩沖液中(pH＝8.0)；混合物充分搖勻，在50℃反應(yīng)1.5小時(shí)；②反應(yīng)完畢，降到室溫，加入與2-巰基乙胺等摩爾的乙酸使反應(yīng)停止；③中間產(chǎn)物的純化采用固相萃取技術(shù)，得到經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR。材料為500mg 6mL C18BondElut cartridge(Varian，Walnut Creek，CA)，具體步驟如下
活化用4mL甲醇活化，并用6mL高純水調(diào)整，分為2-3次使用；上樣將水樣以5-10mL/min的流速流過(guò)固相萃取柱進(jìn)行富集濃縮。重力過(guò)濾；淋洗裝樣完畢后，用5％甲醇水溶液6mL淋洗以凈化樣品，分為3次使用；洗脫待固相萃取柱吹干后，以4mL甲醇(分為2次)將微囊藻毒素洗脫并收集。
(2)半抗原多肽與載體蛋白偶聯(lián)選擇牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白，采用戊二醛法將步驟(1)獲得的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，具體方法包括以下步驟(a)取10mg BSA(1.5×10-7摩爾)，完全溶解于5mL 0.01mol/L PBS(Na2HPO4·12H2O 2.96g，KH2PO40.2g，NaCl 8.0g加水至1000mL，pH7.2)中，再加入4mg步驟(1)獲得的經(jīng)氨基修飾的微囊藻毒素-LR(4×10-6摩爾)，使其完全溶解；(b)緩慢加入5mL 0.2％的戊二醛溶液，與步驟(a)獲得的溶液混合，并在室溫下，攪拌反應(yīng)2小時(shí)；(c)加入0.2mL 1M甘氨酸，在室溫下攪拌1小時(shí)，以終止反應(yīng)；(d)將步驟(c)獲得的溶液用Sephadex G-25凝膠層析柱(Pharmacia)進(jìn)行過(guò)濾層析，得到微囊藻毒素-LR完全抗原MC-LR-BSA。MALDI-TOF/MS檢測(cè)，結(jié)果表明該完全抗原的偶聯(lián)比為5.12，符合要求。將純化的完全抗原經(jīng)-40℃冷凍后，真空濃縮干燥，保存于-20℃冰箱中。
2、免疫動(dòng)物選取6周齡的雌性Balb/c小鼠，采用低劑量長(zhǎng)程免疫法進(jìn)行免疫，方法為皮下多點(diǎn)注射，30μg MC-LR-BSA/只，共免疫4次，初次免疫加福氏完全佐劑(0.1mL/只)，后三次加強(qiáng)免疫加福氏不完全佐劑(0.1mL/只)，免疫間隔時(shí)間為30天。在第三次加強(qiáng)免疫后的第10天，對(duì)小鼠進(jìn)行尾部靜脈取血，用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)，其中，包被的MC-LR-BSA的濃度為5μg/mL。對(duì)抗血清效價(jià)達(dá)到1×105以上的小鼠，進(jìn)行一次沖擊免疫，即每只小鼠采用10μl MC-LR-BSA+90μl生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
3、細(xì)胞融合1)免疫脾細(xì)胞的制備將步驟2沖擊免疫三天后的BALB/c小鼠處死，無(wú)菌狀態(tài)下取出脾臟，去表面包膜及脂肪，剪碎，置于平皿中研磨，加GKN溶液(NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000mL水中)制成單細(xì)胞懸液，用200目銅網(wǎng)過(guò)濾，去除大的細(xì)胞團(tuán)塊后，離心，用GKN溶液洗滌并重懸脾細(xì)胞，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，約為1×108個(gè)/mL。
2)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的處理取指數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，離心，用GKN溶液洗一次并懸浮于其中，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，為1×108個(gè)/mL。
3)免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合將步驟2)的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與步驟1)的免疫脾細(xì)胞融合，具體過(guò)程包括以下步驟1.聚乙二醇(PEG)的配制(50％PEG)PE6(MW1500，Roche，11423800)10.0g置于30mL容量小燒瓶中，高壓3.6×105Pa 15min，冷卻至50℃后加入完全培養(yǎng)基(IMDM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen Corp.Lot 1272036))10.0mL，混勻，分裝1.0mL/管，4℃保存。
2.取HAT培養(yǎng)液40mL(50×HAT儲(chǔ)液，Sigma，H0262，Lot 093K8931)，完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)15mL和50％PEG分別放入37℃水浴箱中預(yù)熱，另將一只盛水的燒杯同時(shí)放入水浴箱中備用。
3.分別吸取含7.0×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和7.0×108個(gè)脾細(xì)胞的懸液加入50mL離心管中，充分混勻，并加IMDM培養(yǎng)基至40mL。
4.1200rpm離心8min，棄去上清液，用吸管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使兩種細(xì)胞充分混勻，直至成糊狀。
5.將離心管置于預(yù)溫的燒杯中，用1mL已用7.5％NaHCO3調(diào)整pH值至8.0(7.8-8.2均可)的PEG 0.8mL，將吸管插入管底，繼而輕輕攪動(dòng)沉淀，并緩緩滴加PEG，1min內(nèi)加完，再在水浴中靜置90s。
6.立即滴加37℃預(yù)溫的完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)15mL，使PEG稀釋而失去作用。滴加的方法是在30s內(nèi)加1mL，次30s加3mL，接下來(lái)1min加完。注意，當(dāng)PEG溶液加入后，即可見(jiàn)細(xì)胞凝集成小團(tuán)塊狀，此時(shí)操作宜輕柔，以免干擾細(xì)胞融合過(guò)程。
7.補(bǔ)加完全培養(yǎng)液(IMDM培養(yǎng)基)至40mL，1000rpm離心10min，棄上清。
8.將細(xì)胞沉淀輕懸于預(yù)溫的HAT培養(yǎng)液40mL中，加到4塊已有飼養(yǎng)細(xì)胞層(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。繼而將培養(yǎng)板移至37℃、5％CO2飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)。
4、融合細(xì)胞的篩選及克隆化培養(yǎng)約3天后，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/4-1/2時(shí)，培養(yǎng)基變黃，此時(shí)用常用的ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中的抗體，具體方法包括以下步驟1.吸取96孔板每孔的一半上清，采用ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選(一篩)，具體方法為用50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)稀釋包被抗原至2mg/L，加入到96孔酶聯(lián)板中進(jìn)行包被，每孔100μl，4℃包被12-24小時(shí)，無(wú)需封閉；每孔加入各個(gè)克隆孔上清液100μL，37℃溫育1h，充分洗滌后加入100μL 1∶10000的酶標(biāo)二抗(HRP-羊抗鼠IgG)，37℃溫育1h后，加入底物顯色，10min后終止，讀取A450nm，A450nm值為陰性對(duì)照2.1倍的為陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。對(duì)于一篩呈陽(yáng)性的克隆株，進(jìn)一步培養(yǎng)后，按照同樣方法進(jìn)行第二次篩選。
其中，包被抗原為MC-LR-OVA，它按照下述方法制備取3mL OVA，加入0.3mg上述氨基修飾后的MC-LR，加入0.1mL 1.25％戊二醛充分混合，室溫反應(yīng)24h。
2.吸取檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的孔中的剩余上清，加入新鮮HT培養(yǎng)基(50×HT儲(chǔ)液(Sigma H0137，Lot 064K8927))做進(jìn)一步培養(yǎng)；3.第二天用與步驟1相同的ELISA法復(fù)測(cè)第一次呈陽(yáng)性的上清及吸取的剩余上清(二篩)；4.將2次ELISA檢測(cè)均為陽(yáng)性的克隆細(xì)胞吸出，轉(zhuǎn)移至含BALB/c小鼠腹腔細(xì)胞的HT培養(yǎng)基制成的24孔(每孔0.9mL HT培養(yǎng)基)營(yíng)養(yǎng)板的3-4個(gè)孔內(nèi)，進(jìn)行再克隆。然后吸取上清，采用與步驟1相同的ELISA法對(duì)陽(yáng)性克隆株進(jìn)行再次確定(三篩)。
對(duì)于三篩后的陽(yáng)性克隆株，采用MC-LR單體、BSA及OVA再進(jìn)行一次篩選，包被濃度分別為5μg/mL，2μg/mL及2μg/mL，4℃包被過(guò)夜，其它條件同上。選取對(duì)OVA及BSA均為陰性、對(duì)MC-LR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的克隆株。結(jié)果得到4株陽(yáng)性克隆株。將其中一株陽(yáng)性克隆株，名稱為能分泌抗Microcystin-LR單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株MC8C10，于2007年06月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址是中國(guó)北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC No.2101。
二、單克隆抗體MC8C10的獲得及亞型鑒定1、獲取抗體腹水選取10周齡BALB/C小鼠，接種細(xì)胞前7-10天，預(yù)先腹腔注射液體石蠟0.5mL/只。用生理鹽水調(diào)整雜交瘤細(xì)胞株MC8C10 CGMCC No.2101濃度至2×106個(gè)/mL，腹腔接種雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。
2、腹水的純化采用HiTrap rProtein A FF 1mL免疫親和層析柱(Bio-Science AB，Sweden.LotNo.309591)來(lái)純化步驟1獲得的小鼠單克隆抗體腹水，得到MC8C10。該層析柱所含的1mL介質(zhì)最多能結(jié)合23mg由小鼠產(chǎn)生的IgG2b型單克隆抗體，并且對(duì)于IgG2b型抗體的結(jié)合能力是最高的，而對(duì)于小鼠產(chǎn)生的其它抗體亞類(如IgG1、IgG2a、IgG3等)的結(jié)合能力較弱。偶聯(lián)緩沖液為0.2mol/L、pH 7的磷酸鹽緩沖液(將NaH2PO4·2H2O1.216g，Na2HPO4·12H2O 4.369g溶解于100mL雙蒸水中)。洗脫緩沖液采用0.1M檸檬酸鈉溶液(pH3.5)。結(jié)果得到3mg固態(tài)的MC8C10。將純化的抗體分裝，-20℃保存。
3、抗體亞型鑒定采用單克隆抗體亞型檢測(cè)試盒(ImmunoTypeTM Kit，Sigma)對(duì)步驟2獲得的抗體進(jìn)行免疫球蛋白亞型的鑒定，具體方法為用PBS以1∶1000比例稀釋各類抗體(小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA及IgM)，然后用稀釋抗體包被96孔酶聯(lián)板(每孔0.1mL，每類抗體兩個(gè)孔)，37℃溫育1小時(shí)后，棄包被液，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入步驟2純化的抗體，室溫溫育1小時(shí)后洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購(gòu)自邦定生物公司)，室溫溫育30分鐘后，洗滌3次，按0.1mL/孔的量加入辣根過(guò)氧化物酶底物反應(yīng)液(1mg/mL TMB)，室溫10-15分鐘，出現(xiàn)褐色即為陽(yáng)性結(jié)果，最后按0.05mL/孔的量加入2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞MC8C10分泌的抗體為IgG2b亞類。
這里配制緩沖液均使用雙蒸水，化學(xué)試劑純度為分析純或更高。最后配制的緩沖液采用0.45μm的濾器過(guò)濾。
實(shí)施例2、利用專用緩沖溶液1提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)所用的專用緩沖液1是在0.1mol/L、pH為7.4的PBS(配置方法KCl 2.0g；KH2PO42.4g；Na2HPO4·12H2O 29g；雙蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為50g/L；b)牛血清白蛋白，使其終濃度為10g/L；b)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為5g/L。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。
所用的試劑和酶標(biāo)板按照如下方法制備1、待測(cè)水樣的配制a.濃鹽酸中HCl含量為36％-38％，用純水稀釋10倍配制成1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，pH＝0.0；b.稱取4g NaOH，溶于100mL純水中，配制成濃度為1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，pH＝14.0；c.利用a和b的兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液的不同配比，配制如下pH梯度溶液3，4，5，6，7，8，9，10共8個(gè)梯度。利用pH計(jì)校正。
d.用c中的溶液配制pH分別為3、4、5、6、7、8、9和10，以及濃度(單位μg/L)分別為1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0.219、0.0656、0.020、0.006、0的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)pH的待測(cè)水樣采用2個(gè)平行，測(cè)定不同pH條件下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、抗體溶液配制A、抗體溶液1的配制單克隆抗體MC8C10的稀釋采用0.01mol/L pH＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液(配置方法NaCl 8g；KCl 0.2g；KH2P040.24g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；蒸餾水加至1000mL。)，即普通緩沖液，稀釋度1∶6000。
B、抗體溶液2的配制將單克隆抗體MC8C10改用專用緩沖液1進(jìn)行稀釋，稀釋度1∶6000。重復(fù)試驗(yàn)，以確定本發(fā)明的專用緩沖液對(duì)pH值干擾的抑制效果。
3、酶標(biāo)二抗溶液配制辣根過(guò)氧化物酶-羊抗鼠IgG原液，灌裝入試劑瓶中，使用時(shí)用洗滌液按1∶10000配制成工作濃度。
4、洗滌液配制(10×PBST)含0.5％(體積百分含量)吐溫-20和80g/L氯化鈉的0.1mol/L pH＝7.5磷酸鹽緩沖液，灌裝入試劑瓶中。使用時(shí)，將該溶液用純水稀釋10倍再用。
5、底物溶液配制使用0.1mol/L pH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液，每1ml緩沖液中加入50μL 0.1％的H2O2溶液，灌裝入試劑瓶中。
6、顯色劑溶液配制用丙酮配制成10mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，用0.1mol/LpH5.0的醋酸鈉-檸檬酸緩沖液配制成0.2mg/mL的四甲基聯(lián)苯胺溶液，灌裝入試劑瓶中。
7、終止液配制2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
8、酶標(biāo)板是包被了包被抗原的96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板。
酶標(biāo)板的包被包被抗原采用實(shí)施例1的MC-LR-BSA，包被濃度0.25μg/mL，取120μL包被抗原加入反應(yīng)板孔中，4℃冰箱中過(guò)夜，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在已包被抗原的酶標(biāo)板小孔中加入150μL 1％的BSA(質(zhì)量百分含量)封閉，37℃溫育1h，用洗滌液1×PBST洗滌3-5次，用吸水紙吸干，真空封裝。
具體測(cè)定方法如下將待測(cè)水樣與抗體溶液同時(shí)加入酶標(biāo)板小孔中，同時(shí)設(shè)置空白孔(將添加的抗體換成高純水，其它一致)和陰性對(duì)照孔(待測(cè)水樣用高純水代替，即不含MC-LR，其它-致)，37℃溫育0.5h，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)用洗滌液(10×PBST)洗滌2-5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標(biāo)二抗溶液于酶標(biāo)板小孔中，37℃溫育0.5h，用洗滌液重復(fù)洗3-5次，吸干；加入底物溶液和顯色溶液到酶標(biāo)板小孔中，室溫下反應(yīng)10-15min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450m處測(cè)定吸光度A，以不加抗體的小孔作為空白調(diào)零。以各濃度的吸光度A為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)MC-LR濃度的log10值為橫坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行模型擬合及評(píng)價(jià)，采用4參數(shù)Logistic模型A=A2+A1-A21+(xx0)p]]>(4參數(shù)Logistic模型)其中x未標(biāo)記抗原濃度(質(zhì)量濃度或物質(zhì)的量濃度)，自變量；Ax對(duì)應(yīng)的吸光度(Absorbance)，因變量；A1上端漸近線(x＝0)，常數(shù)；A2下端漸近線(x→∞)，常數(shù)；p與曲線的斜率有關(guān)，常數(shù)；
x0曲線的中點(diǎn)，或稱拐點(diǎn)，常數(shù)；(1)半抑制濃度IC50是競(jìng)爭(zhēng)ELISA一個(gè)很重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，IC50≡x0。
(2)在競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，依據(jù)上述Logistic模型，定義最大吸光度A0如下式。
A0＝A1添加普通緩沖液的不同pH值條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度A0和IC50的比較如圖2所示。表明酸性條件對(duì)免疫反應(yīng)有強(qiáng)烈的影響，而在堿性條件下則有利于反應(yīng)的進(jìn)行；隨著pH值的增大，最大吸光度有所增加，但幅度不大；pH值對(duì)IC50的值影響比較大，因此而直接影響ELISA的靈敏度。pH值在7-8之間時(shí)，IC50值達(dá)到最小值，隨著酸度或堿度的增加，IC50都會(huì)增加，靈敏度下降?？乖贵w之間的氫鍵結(jié)合力以及離子化抗體配位受體受pH值影響較大，pH值同時(shí)又可能影響抗原和抗體的分子結(jié)構(gòu)。說(shuō)明pH值接近中性或動(dòng)物體液環(huán)境時(shí)(pH＝7.4)，最利于抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)。
為了消除pH值對(duì)抗原抗體反應(yīng)的影響，采用本發(fā)明的專用緩沖液1，加大對(duì)酸堿度的緩沖能力。添加專用緩沖液1的各標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，進(jìn)一步結(jié)合圖4表明，該方法是有效的。各標(biāo)準(zhǔn)曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明pH值的影響已經(jīng)消除。結(jié)果表明，采用專用緩沖液1作為抗體稀釋液，該緩沖液pH值為7.4左右，最有利于抗原抗體的反應(yīng)，并且還能消除樣品中的酸或堿(pH＝3-10)帶來(lái)的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.稱取1.11g無(wú)水CaCl2，溶解于10mL純水中，配制1mmol/L的Ca2+溶液。
2.稱取2.03g MgCl2·6H2O，溶解于10mL純水中，配制1mmol/L的Mg2+溶液。
3.用純水配制如下濃度梯度的Ca2+和Mg2+混合液(摩爾比1∶1，單位mmol/L)20、15、10、8、6、4、2、0，對(duì)應(yīng)的硬度梯度為(單位德國(guó)度HGo)112、84、56、44.8、33.6、22.4、11.2、0。
4.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，用步驟3的溶液分別配制不同硬度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)硬度條件下采用2個(gè)平行，測(cè)定不同硬度下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加普通緩沖液的硬度對(duì)ELISA反應(yīng)有一定的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5及6所示。結(jié)果表明，當(dāng)鈣鎂離子濃度大于等于8mmol/L時(shí)(對(duì)應(yīng)的硬度為44.8HGo)，會(huì)較大程度上影響間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線部分變形，本底值升高，重復(fù)性降低，標(biāo)準(zhǔn)偏差增大，無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算。
為了降低樣品中的硬度帶來(lái)的影響，抗體稀釋液采用本發(fā)明的專用緩沖液1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7及8所示。結(jié)果表明，此時(shí)硬度對(duì)免疫檢測(cè)的影響明顯地被消除。當(dāng)鈣鎂離子濃度小于等于20mmol/L(對(duì)應(yīng)的硬度為112HGo)時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒(méi)有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質(zhì)酸給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制0.3倍濃度梯度的腐殖酸(HA)(北京化學(xué)試劑公司)溶液如下(單位mg/L)1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同腐殖酸濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)腐殖酸濃度采用2個(gè)平行，測(cè)定不同硬度下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加普通緩沖液的不同濃度的腐殖酸溶液條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖10所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HA濃度大于1g/L時(shí)，便明顯地影響間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，致使反應(yīng)沒(méi)有梯度產(chǎn)生。腐殖酸的溶解度隨著pH升高而增加，實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，腐殖酸溶解度在純水中較難溶解，當(dāng)配制濃度為1g/L時(shí)，仍然可見(jiàn)沉淀。當(dāng)有沉淀存在時(shí)，可能因?yàn)闆](méi)有溶解的腐殖酸能吸附微囊藻毒素或者抗體，并一起吸附到酶標(biāo)板上，導(dǎo)致免疫反應(yīng)失敗。當(dāng)腐殖酸濃度大于等于27mg/L時(shí)，會(huì)較大程度上影響間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線部分變形，重復(fù)性降低，標(biāo)準(zhǔn)偏差增大，曲線變得不可預(yù)測(cè)，也無(wú)法擬合，因而無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算。另外，隨著腐殖酸濃度的升高，空白樣品的吸光度(A0)下降，而非特異性吸附并沒(méi)有明顯的提高；IC50值也不斷增加。
腐殖酸的影響不僅是其酸性帶來(lái)的影響，結(jié)果表明，即使采用10×PBS也未能徹底消除其酸度的影響，可見(jiàn)腐殖酸還有其它的影響途徑。進(jìn)一步分析得出，腐殖酸分子量由數(shù)千到數(shù)萬(wàn)，分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，屬于大分子聚合物。其分子上存在很多不同直徑的空間或洞穴，這些空隙中可以容納吸收有機(jī)污染物和重金屬離子等。有可能MC-LR分子被其吸附，而無(wú)法與抗體結(jié)合，即競(jìng)爭(zhēng)性的有利半抗原濃度降低，會(huì)導(dǎo)致ELISA吸光度下降和半抑制濃度的升高。
為了消除腐殖酸帶來(lái)的影響，采用本發(fā)明的專用緩沖液1來(lái)稀釋抗體，并進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖11及12所示。結(jié)果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來(lái)的影響。但當(dāng)腐殖酸濃度為1000mg/L時(shí)，IC50略有上升，達(dá)到了6.6μg/L。說(shuō)明對(duì)于腐殖質(zhì)適用的邊界條件為0-300mg/L。
四、消除水中重金屬給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制CuSO4·5H2O(北京化學(xué)試劑公司)溶液如下(單位mg/L)5000、1000、200、40、8、1.6、0.32。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同硫酸銅濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)硫酸銅濃度采用2個(gè)平行，測(cè)定不同硫酸銅濃度下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加普通緩沖液的不同濃度的硫酸銅溶液條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖13所示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖14所示。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)CuSO4濃度為5g/L時(shí)，加入一抗后溶液即變藍(lán)，出現(xiàn)混濁，并有藍(lán)色沉淀；顯色后，該濃度條件下的吸光度比其它濃度條件下高許多，梯度不明顯，數(shù)據(jù)不可擬合。可能原因是抗體被銅離子沉淀下來(lái)并吸附到酶標(biāo)板上，3次洗滌液沒(méi)有將其洗脫下來(lái)。
另外，隨著銅離子濃度的升高，本底值也有升高趨勢(shì)，表明部分抗體被銅離子沉淀下來(lái)；并且，標(biāo)準(zhǔn)曲線變形嚴(yán)重，說(shuō)明抗原抗體反應(yīng)受到了明顯地影響。
為了降低樣品中銅離子帶來(lái)的影響，采用本發(fā)明的專用緩沖液1來(lái)稀釋抗體，并進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖15及16所示。結(jié)果表明，此時(shí)銅離子對(duì)免疫檢測(cè)的影響明顯地受到抑制。當(dāng)硫酸銅濃度小于等于1000mg/L時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒(méi)有明顯的跳躍；當(dāng)樣品中的硫酸銅濃度為5000mg/L時(shí)，由于濃度太高，對(duì)免疫反應(yīng)的影響仍然很?chē)?yán)重。所以對(duì)于硫酸銅適用的邊界條件為0-1000mg/L。
五、消除水中綜合污染物給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)只設(shè)抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.生活污水取自清華大學(xué)學(xué)生宿舍1號(hào)樓下水道，水樣采集后采用普通濾紙過(guò)濾，濾液CODCr測(cè)定結(jié)果為469mg/L。用純水梯度稀釋生活污水如下100％、80％、60％、50％、40％、20％、10％、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同生活污水濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)樣品采用2個(gè)平行，測(cè)定不同生活污水濃度條件下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加專用緩沖液1的不同污染程度的生活污水對(duì)ELISA檢測(cè)的影響結(jié)果如圖17及圖18所示，可以看出，生活污水對(duì)ELISA的影響比較明顯，隨著污水濃度的升高，其中的基質(zhì)會(huì)明顯地影響ELISA的吸光度，使吸光度整體下降。而且標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值也會(huì)有起伏的變化。當(dāng)CODCr濃度高于200mg/L時(shí)，A0值有明顯的下降，曲線的上平臺(tái)吸光度從0.6下降到0.45左右。當(dāng)CODCr濃度高于375mg/L時(shí)，曲線的形狀與標(biāo)準(zhǔn)的反S型相差較大，變得不規(guī)則，因而不能進(jìn)行定量檢測(cè)。綜上所述，本研究確定的CODCr邊界條件為0-200mg/L。
六、消除水中葉綠素給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)只設(shè)抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的葉綠素a(Fluka 44014，分離自Cyanobacteriasp.，純度≥96.0％)溶液如下(mg/L)1000、300、90、27、8.1、2.43、0.729、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同葉綠素a濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)樣品采用2個(gè)平行，測(cè)定不同葉綠素a濃度條件下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加專用緩沖液1的葉綠素a對(duì)MC-LR免疫檢測(cè)的影響結(jié)果如圖19及圖20所示，由圖可知，采用本發(fā)明的專用緩沖液，葉綠素a對(duì)ELISA的影響不明顯。即使葉綠素a濃度達(dá)到了1000mg/L時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀仍然符合標(biāo)準(zhǔn)的反S型，并且各條標(biāo)準(zhǔn)曲線一致性良好。進(jìn)一步分析A0和IC50值的變化趨勢(shì)，結(jié)果表明，葉綠素a濃度達(dá)到了1000mg/L后，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大吸光度和半抑制濃度都沒(méi)有明顯的變化。因此，本研究確定的葉綠素a的邊界條件為0-1000mg/L。
七、消除水中有機(jī)溶劑給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理抗體溶液1和抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制梯度濃度的甲醇(北京化學(xué)試劑公司)溶液如下(體積百分比)50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，分別用步驟1的溶液配制不同甲醇濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)甲醇濃度采用2個(gè)平行，測(cè)定不同甲醇濃度下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加普通緩沖液的不同濃度的甲醇溶液條件下ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖21所示，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白樣品吸光度(最大吸光度，A0)及半抑制濃度IC50的比較如圖22所示。由圖可以看出，甲醇對(duì)于免疫反應(yīng)的影響是明顯的。隨著甲醇濃度的提高，最大吸光度下降，IC50值降低，ELISA的靈敏度降低。當(dāng)樣品中甲醇的濃度超過(guò)40％(v/v)時(shí)，曲線發(fā)生明顯地變形，ELISA被明顯地干擾。研究表明，若不采取其它措施，樣品中甲醇的允許濃度最高為15％。
有機(jī)溶劑主要來(lái)自于固體樣品的提取過(guò)程，有機(jī)溶劑可能破壞抗原-抗體之間的范德華鍵和疏水作用力，使抗原-抗體復(fù)合物解離，可大大降低檢測(cè)的靈敏度。
為了降低樣品中甲醇帶來(lái)的影響，采用本發(fā)明的專用緩沖液1來(lái)稀釋抗體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖23及24所示。結(jié)果表明，此時(shí)甲醇對(duì)免疫檢測(cè)的影響明顯地受到抑制。即使樣品中的甲醇濃度為50％時(shí)，盡管最大吸光度略有上升，但I(xiàn)C50值沒(méi)有明顯變化，方法的靈敏度因而也沒(méi)有很大變化。綜合分析，甲醇的邊界條件為體積百分比0-20％。
八、消除水中有毒有機(jī)污染物給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)只設(shè)抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的甲苯(北京化學(xué)試劑公司)溶液如下(單位mg/L)500、150、45、13.5、4.05、1.215、0.36、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同甲苯條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)樣品采用2個(gè)平行，測(cè)定不同甲苯濃度條件下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加專用緩沖液1的甲苯對(duì)MC-LR免疫檢測(cè)的影響結(jié)果如圖25及26所示，盡管在抗體緩沖液中已經(jīng)加入惰性蛋白即1％BSA，但當(dāng)甲苯濃度超過(guò)1mg/L時(shí)，免疫反應(yīng)仍然受到明顯的影響，即最大吸光度隨著甲苯濃度的升高而降低；IC50值隨著甲苯濃度的升高而升高，但幅度都不是很大，IC50值最高可達(dá)10μg/L。綜上所述，本研究提出的甲苯邊界條件為0-1mg/L。
九、消除水中農(nóng)藥給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。實(shí)驗(yàn)只設(shè)抗體溶液2處理。除了待測(cè)水樣外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同步驟一。
(一)待測(cè)水樣的配制1.用純水配制0.3倍梯度稀釋的2，4-D(北京化學(xué)試劑公司)溶液如下(單位mg/L)2000、600、180、54、16.2、4.86、1.46、0。
2.MC-LR的貯備液濃度為100mg/L，采用步驟1的溶液配制不同2，4-D濃度條件下的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為待測(cè)水樣梯度如下(μg/L)0，0.006，0.02，0.0656，0.22，0.729，2.43，8.1，27，90，300，1000。共96個(gè)待測(cè)水樣。每個(gè)樣品采用2個(gè)平行，測(cè)定不同2，4-D濃度條件下MC-LR間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)結(jié)果分析添加專用緩沖液1的不同2，4-D濃度對(duì)免疫檢測(cè)的影響如圖27及圖28所示?？梢钥闯?，2，4-D的影響不是很明顯，當(dāng)2，4-D濃度超過(guò)100mg/L時(shí)，IC50值有緩慢增加的趨勢(shì)，而最大吸光度沒(méi)有明顯的變化，研究得出2，4-D的邊界條件為0-100mg/L。
本發(fā)明針對(duì)環(huán)境樣品中各種基質(zhì)條件所適合的邊界如下pH3-10；硬度0-112HGo；腐殖酸0-300mg/L；重金屬離子以CuSO4·5H2O作為研究對(duì)象，濃度范圍0-1000mg/L；綜合污染指標(biāo)以CODcr為指標(biāo)，濃度范圍0-200mg/L；葉綠素a0-1000mg/L；有機(jī)溶劑以甲醇為例，體積百分比范圍0-20％；有毒有機(jī)污染物以甲苯為例，邊界為0-1mg/L；農(nóng)藥以2，4-D為例濃度范圍0-100mg/L。
實(shí)施例3、利用專用緩沖溶液2提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)所用的專用緩沖液2是在0.05mol/L、pH為7.0的PBS(配置方法KCl 1.0g；KH2PO41.4g；Na2HPO4·12H2O 13g；雙蒸水加至1000mL)中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為10g/L；a)牛血清白蛋白，使其終濃度為2g/L；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2g/L。
采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。除了專用緩沖溶液替換為專用緩沖溶液2外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例2的步驟一、二和三。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟一。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖29所示，結(jié)果表明該方法是有效的。各標(biāo)準(zhǔn)曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明pH值的影響已經(jīng)消除。結(jié)果表明，采用專用緩沖液2作為抗體稀釋液，能消除樣品中的酸或堿(pH＝4-10)帶來(lái)的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖30所示。結(jié)果表明，此時(shí)硬度對(duì)免疫檢測(cè)的影響明顯地被消除。當(dāng)硬度為112HGo時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒(méi)有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質(zhì)酸給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖31所示。結(jié)果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來(lái)的影響。但當(dāng)腐殖酸濃度為300mg/L時(shí)，IC50有較大變化實(shí)施例4、利用專用緩沖溶液3提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)所用的專用緩沖液3是在0.12mol/L、pH為8.0的PBS(配置方法KCl 2.4g；KH2PO42.5g；Na2HPO4·12H2O 38g；雙蒸水加至1000mL。)中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為100g/L；a)牛血清白蛋白，使其終濃度為20g/L；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為20g/L。
采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)待測(cè)水樣中的微囊藻毒素-LR。除了專用緩沖溶液替換為專用緩沖溶液2外，實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例2的步驟一、二和三。
一、消除水中酸堿度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟一。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖32所示，結(jié)果表明，該方法是有效的。各標(biāo)準(zhǔn)曲線一致性良好，最大吸光度A0和IC50值都沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明pH值的影響已經(jīng)消除。結(jié)果表明，采用專用緩沖液2作為抗體稀釋液，能消除樣品中的酸或堿(pH＝4-9)帶來(lái)的干擾。
二、消除水中硬度給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖33所示。結(jié)果表明，此時(shí)硬度對(duì)免疫檢測(cè)的影響明顯地被消除。當(dāng)水中的硬度為112HGo時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性良好，最大吸光度和半抑制濃度都沒(méi)有明顯的變化。
三、消除水中腐殖質(zhì)酸給免疫檢測(cè)帶來(lái)的影響添加普通緩沖液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同實(shí)施例2的步驟二。
添加專用緩沖溶液2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖34所示。結(jié)果表明，BSA能有效地抑制腐殖酸帶來(lái)的影響。即使當(dāng)腐殖酸濃度為1000mg/L時(shí)，IC50變化很小。
權(quán)利要求
1.一種緩沖溶液，是在現(xiàn)有的濃度為0.05-0.12mol/L、pH為7.0-8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為10-100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2-20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應(yīng)體系發(fā)生反應(yīng)的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2-20g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述現(xiàn)有的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的緩沖溶液，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液包括KH2PO4、Na2HPO4·12H2O和KCl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述NaCl的濃度為50g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述惰性蛋白或明膠的濃度為10g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述乙二胺四乙酸二鈉的濃度為5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩沖溶液，其特征在于所述惰性蛋白為牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白或兔血清白蛋白。
8.權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的緩沖溶液在環(huán)境樣品免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.一種提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法，是在環(huán)境樣品免疫檢測(cè)中，將權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的緩沖溶液作為緩沖體系，進(jìn)行境樣品的免疫檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述基質(zhì)效應(yīng)由環(huán)境樣品的酸堿度和/或水中硬度和/或腐殖質(zhì)酸和/或重金屬和/或有毒有機(jī)污染物和/或農(nóng)藥和/或葉綠素引起。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液。本發(fā)明所提供的環(huán)境樣品免疫檢測(cè)專用緩沖溶液，是在現(xiàn)有的濃度為0.05－0.12mol/L、pH為7.0－8.0的緩沖液中，加入下述a)、b)和c)的物質(zhì)a)NaCl，使其終濃度為10－100g/L；b)惰性蛋白或明膠，使其終濃度為2－20g/L；所述惰性蛋白是不與免疫反應(yīng)體系發(fā)生反應(yīng)的蛋白；c)乙二胺四乙酸二鈉，使其終濃度為2－20g/L。本發(fā)明的提高環(huán)境樣品免疫檢測(cè)抗基質(zhì)效應(yīng)的方法及其專用緩沖溶液可用于各種環(huán)境樣品(如水樣)的免疫檢測(cè)中，可有效地減小或消除來(lái)自環(huán)境樣品(如水樣)中各種復(fù)雜基質(zhì)在其自然界存在的邊界范圍內(nèi)給免疫檢測(cè)帶來(lái)的干擾，使實(shí)際環(huán)境樣品免疫檢測(cè)的穩(wěn)定性增強(qiáng)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101093223SQ200710119210
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月18日
發(fā)明者何苗, 盛建武, 施漢昌 申請(qǐng)人:清華大學(xué)