專利名稱：：一種對白細胞進行分類的試劑和方法
技術領域：
：、本發(fā)明涉及一種細胞分類試劑及對細胞進行分類的方法，特別是涉及一種用于對血液中白細胞進行分類的試劑以及利用該試劑對血液中白細胞進行分類檢測的方法。
背景技術：
：用患者的全血對白細胞進行分類計數，為臨床診斷和治療提供依據，具有十分重要的意義。迄今為止，有關對白細胞進行分類的裝置和方法發(fā)表了許多。這些裝置是將血液用溶血劑或染色劑處理，基于處理后的細胞的物理學、電學或光學特性來對白細胞進行分類計數。例如，有的分類方法采用染色劑對白細胞進行染色，檢測染色后白細胞發(fā)出的熒光來對白細胞進行分類；有的分類方法采用溶血劑對白細胞進行特殊處理，檢測其電信號或光散射信號，從而對白細胞進行分類?，F(xiàn)有技術一公開了使用白細胞四分類測定用試劑和嗜堿細胞測定用試劑，將白細胞五分類的方法。白細胞四分類測定用試劑包括至少一種離子表面活性劑、至少一種帶負電的有機化合物、一種非離子表面活性劑和緩沖劑，其與第一份血樣作用，將血細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞和嗜堿細胞加中性粒細胞四個類群；嗜堿細胞測定用試劑，與第二份血樣作用，將血細胞分成嗜堿細胞和其他細胞類群。綜合兩種結果將白細胞五分類。檢測方法為兩角度激光散射法?，F(xiàn)有技術二提出了通過兩角度光散射使用白細胞四分類試劑和嗜堿細胞測定試劑將白細胞五分類和計數的方法，四分類試劑包括至少一種離子表面活性劑用以溶解紅細胞和損傷白細胞膜，至少一種帶負電的有機化合物用以與白細胞中帶正電荷的物質結合使白細胞形態(tài)發(fā)生變化，一種非離子表面活性劑和用以調pH的緩沖液。嗜堿細胞測定試劑包括至少一種聚合度3-10的聚氧乙烯類非離子表面活性劑，至少一種陽離子表面活性劑，一種緩沖液調pH至2.5-4.0。在第一份血樣中加入第一試劑將白細胞分成四個群:淋巴細胞群、單核細胞群、嗜酸細胞群、中性粒和嗜堿細胞群；在第二份血樣中加入第二試劑，根據細胞的形態(tài)和大小，用來區(qū)分白細胞中的嗜堿細胞，從而獲得白細胞五分類結果?，F(xiàn)有技術三是關于對白細胞四分類的試劑，這種試劑包括至少一種離子表面活性劑，可以是陽離子或兩性表面活性劑中一種，用來溶解紅細胞同時部分損傷白細胞膜；至少含一種帶陰離子的有機化合物，通過與白細胞上帶正電荷的組分結合使各類白細胞形態(tài)差異顯現(xiàn)；一種非離子表面活性劑和用來調整pH值的緩沖劑。檢測方法可為兩角度激光散射法?，F(xiàn)有技術四提出使用含至少一種陰離子或兩性表面活性劑短時間內溶解紅細胞，同時維持白細胞在一定時間內保持或接近原始狀態(tài)，通過收集前角光散射和側向光散射信號對白細胞進行四分類?，F(xiàn)有技術五提出了一種從全血樣本中快速分離、分析白細胞的方法和試劑系統(tǒng)。該溶血劑系統(tǒng)由第一試劑選自甲酸、乙酸及兩者的混合物和第二試劑抑制劑組成。試劑使紅細胞溶解并使白細胞發(fā)生微小改變以使可通過儀器對細胞進行五分類。其優(yōu)點和獨特性在于其驚人的溶血速度并能對白細胞進行進一步修飾。溶血后加入抑制劑，防止進一步的溶血及白細胞明顯的變化。血樣經過處理后能保持細胞的免疫化學特性。檢測方法可為兩角度光散射法，或直流阻抗和射頻阻抗法，或直流阻抗和光散射法。現(xiàn)有技術六公開了一種對白細胞進行五分類的溶血劑和方法。溶血劑包括芳香族氧乙醇、pK值接近8.5的有機緩沖劑、非離子去垢劑。首先，血樣與稀釋液混合，加入所述溶血劑溶解紅細胞，在至少30秒內不影響白細胞的光散射特性，通過收集四個角度光散射信號，從而對白細胞進行五分類?，F(xiàn)有技術七是通過一種pH2.6-4的酸性溶解劑對紅細胞快速溶解和白細胞保持完整后加入抑制劑可以對白細胞進行五分類的方法，其檢測系統(tǒng)可以使用光散射也可以使用射頻/直流阻抗法。但是，以上現(xiàn)有技術中還存在許多不足。比如，現(xiàn)有技術三、四都是通過兩角度光散射法將白細胞進行分成淋巴細胞，單核細胞，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞四個類群，但不能將嗜堿性粒細胞分離出來。現(xiàn)有技術一、二中公開的分類方法都是通過兩種試劑分別與兩份血樣作用，在兩個通道進行分類，綜合對白細胞進行五分類；現(xiàn)有技術六可以在一個通道中對白細胞進行五分類，但要檢測四個角度的散射光信號，儀器的構成變得復雜，儀器的成本較高?，F(xiàn)有技術五、七提到的分類技術，可在一個通道中對白細胞進行五分類，卻只能在常溫下反應，但隨著氣溫的變化環(huán)境溫度是有差異的，很難保證處于25度恒溫狀態(tài)，測量結果隨著溫度變化會產生波動，降低了結果的準確性。假如在此方法基礎上消除溫度對反應的影響，需要增加恒溫裝置，不僅需要加熱裝置，同時需要配備制冷裝置，大大提高了儀器成本。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種能夠在較寬溫度范圍內、在一個通道中準確地將白細胞進行五分類的試劑系統(tǒng)和方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種對白細胞進行分類的試劑，所述試劑包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少兩種陽離子表面活性劑；b、可與白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態(tài)差異的至少一種帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物；c、能夠將pH值調整在28范圍內的緩沖劑。所述對白細胞進行分類是指將白細胞分為與淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及嗜堿性粒細胞分別對應的五個集團。優(yōu)選的，所述陽離子表面活性劑為季銨鹽型陽離子表面活性劑。在本發(fā)明具體實施方式中，所述陽離子表面活性劑進一步優(yōu)選為具有下式所示結構的季銨鹽型陽離子表面活性劑，R4.X-IR2其中，R1為C原子數616的垸基或鏈烯基，R2及R3為C原子數14的烷基或鏈烯基，R4為C原子數14的垸基或鏈烯基或芐基，X為鹵素原子。所述有機化合物的疏水基團優(yōu)選自芳香族組成的基團、C原子數6以上的烴基形成的基團或者C原子數大于6的雜環(huán)，所述有機化合物的陰離子基團優(yōu)選為羧基或磺酸基。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述有機化合物為酸性色素。所述試劑可以進一步包括醇類，并且所述醇類占所述試劑的體積百分比濃度為0.110%。所述醇類優(yōu)選為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇或2-苯氧乙醇。本發(fā)明還公開了一種對白細胞進行分類的方法，所述方法包括將上述的白細胞分類試劑與血樣混合后測定細胞的大小和形態(tài)信息。具體地，所述方法包括在104(TC的溫度條件下，將所述白細胞分類試劑與血樣按10100:1的比例混合1230s后，通過低角度和高角度兩種散射光分別測定細胞的大小和形態(tài)信息，所述低角度散射光的測定角度為15度，高角度散射光的測定角度為620度。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于利用本發(fā)明的試劑及方法進行白細胞分類檢測，可以在快速將紅細胞溶解的同時，實現(xiàn)在同一個通道中將白細胞進行五分類，分為與淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及嗜堿性粒細胞分別對應的五個集團；并且，利用本發(fā)明的試劑及方法對白細胞進行分類檢測時，不僅可以在常溫下進行，也可以在1040。C的溫度條件下進行，一方面擴展了溫度適用范圍，另一方面在高于室溫的條件下反應有利于消除環(huán)境溫度對反應的影響，增加結果的可靠性和穩(wěn)定性，還可以避免使用制冷裝置，儀器成本較低；此外，利用本發(fā)明的試劑和方法可以實現(xiàn)只需檢測兩個角度的散射光信號即可對白細胞進行五分類，從而降低了儀器成本。圖l、2、3是利用本發(fā)明的一種白細胞分類試劑分別對三份血樣進行白細胞五分類的結果圖；'圖4是利用本發(fā)明的另一種白細胞分類試劑對白細胞進行五分類的結果圖5是利用本發(fā)明的又一種白細胞分類試劑對白細胞進行五分類的結果圖中0表示碎片，l表示淋巴細胞，2表示單核細胞，3表示中性粒細胞，4表示嗜酸性粒細胞，5表示嗜堿性粒細胞。具體實施例方式本發(fā)明的白細胞分類試劑，主要包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少兩種陽離子表面活性劑；b、可與白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態(tài)差異的足量的至少一種帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物；c、能夠將pH值調整在28范圍內的緩沖劑。將上述組成的白細胞五分類用試劑加入到全血樣本中，通過測定細胞大小和形態(tài)信息，能夠將白細胞中淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞相對應五個集團進行分類計數。所述的陽離子表面活性劑為季銨鹽型陽離子表面活性劑，其結構式如下所示R4I.X-I其中R1為C原子數616的垸基或鏈烯基；R2及R3為原子數14的烷基或鏈烯基；R4為C原子數為14的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。所述陽離子表面活性劑，其用量應足以溶解紅細胞，并造成白細胞的細胞膜部分損失。具體用量為10010000mg/L，優(yōu)選2006000mg/L，最優(yōu)選5005000mg/L，也可以根據使用的表面活性劑的種類作適當調整。下表l中舉例列出了可用于本發(fā)明的各表面活性劑及其最適用量。同時，這些表面活性劑可以只使用兩種或兩種以上任意組合使用。表l表面活性劑的最適用量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>無論使用哪種表面活性劑組合，其對白細胞的溶解力，只要能使白細胞膜開孔到胞質可以部分溢出，與陽離子結合的有機化合物能夠進入的程度即可，最好使用遠遠少于使細胞完全裸核時的用量。表面活性劑的溶血效果和R1的鏈長是成正比的，C原子數越多，溶血能力越強。本發(fā)明中，除表面活性劑外，還有一種化合物可以和細胞內陽離子結合導致細胞類群間形態(tài)差異顯現(xiàn)。這種化合物，帶有疏水基團(如由芳香族組成的基團、由C原子數6個以上的烴基形成的基團以及C原子數大于6的雜環(huán)等)及陰離子基團(如羧基、磺酸基等)，在水中帶負電荷，能與白細胞結合使白細胞形態(tài)發(fā)生改變。幾乎所有酸性色素如酸性藍系列、直接藍、酸性綠、酸性黃、甲基紅、甲基橙、苯胺藍、茜素黃等都可以滿足要求。使用量為101000mg/L，優(yōu)選20500mg/L。本發(fā)明中，還含有調整pH用的緩沖劑。對于緩沖劑沒有特定的要求，可以為常用緩沖體系如甲酸、鄰苯二甲酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、碳酸等。本發(fā)明試劑中pH調整到28范圍內。緩沖劑的使用量通常為5100mM。此外，本發(fā)明中還可以含有一定量的醇類作為助溶劑。醇類作為助溶劑對種類沒有特別要求，甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、2-苯氧乙醇等均可用于本發(fā)明。作為助溶劑的醇類，其用量占本發(fā)明的試劑的體積百分比濃度通常為0.110%左右。利用本發(fā)明的方法對白細胞進行分類的具體過程包括，將本發(fā)明的上述試劑加入全血中混合一定時間后，檢測細胞的形態(tài)和大小信息，根據細胞形態(tài)與大小的不同將細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞相對應五個集團，檢測系統(tǒng)同時對五類細胞進行分類計數o血樣與本發(fā)明試劑的混合比例沒有特別的限制，但通常按照血樣與本發(fā)明試劑的體積比為1:10100的比例混合。通常在兩者混合1230秒后就可以進行檢測。用本發(fā)明的試劑及方法進行白細胞分類時，在1040°C溫度范圍內均可以進行。對每一個具體的反應，只要將反應溫度固定在1040"C范圍的任一溫度下，就都能夠保證分類結果的穩(wěn)定。本發(fā)明優(yōu)選的溫度為35'C。選用該溫度的原因是由于該溫度高于室溫，因此在實際應用中只需加熱裝置就可以實現(xiàn)恒溫，而不必增加制冷裝置，大大節(jié)約了儀器成本。使用本發(fā)明可以在一個通道中對白細胞進行五分類，檢測細胞的形態(tài)和大小信息的方法優(yōu)選使用激光檢測法。該方法可以利用公知的裝置，采用測定角度為15度的低角度散射光來測定細胞的大小信息，并采用測定角度為620度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。該裝置可以選用如中國專利95115317衛(wèi)中所描述的裝置，也可以選用本領域技術人員所公知的其他裝置。而散射光的檢測可以通過常用的光電二極管傳感器完成。下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述。實施例l一種用于白細胞五分類的試劑，該試劑由以下成分組成鄰苯二甲酸lg2-苯氧乙醇2.5g癸基三甲基氯化銨3.5￡.辛基三甲基溴化銨1.75g甲苯胺藍0.025g補水到1LpH4.6按上述配方配制的試劑將pH調整到4.6。在溫度保持35度的條件下，在10lU血中加入lml上述試齊!j。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為15度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為620度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。用上述配制的試劑測試了三個血樣，結果如圖l、圖2、圖3所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞五個類群。實施例2一種用于白細胞五分類的試劑，該試劑由以下成分組成磷酸二氫鈉0.6g磷酸氫二鈉4.77g甲醇.8g十二烷基三甲基氯化銨0.5g辛基三甲基溴化銨3g酸性藍0.05g補水到1LpH7.5按上述配方配制的試劑將pH調整到7.5。在溫度保持35度的條件下，在lOlU血中加入lml上述試齊U。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為15度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為620度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結果如圖4所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞五個類群。實施例3一種用于白細胞五分類的試劑，該試劑由以下成分組成甲酸1.5g甘氨酸lg異丙醇10g十二烷基二甲基芐基氯化銨0.2g辛基三甲基氯化銨3g甲基紅0.05g補水到1LpH2.8按上述配方配制的試劑將pH調整到2.8。在溫度保持35度的條件下，在10ul血中加入lml上述試劑。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為15度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為620度的高角度散射光測定細胞的形態(tài)信息。結果如圖5所示，白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞五個類群。以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。權利要求1.一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損傷的至少兩種陽離子表面活性劑；b、可與白細胞內陽離子結合，使白細胞之間產生形態(tài)差異的至少一種帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物；c、能夠將pH值調整在2～8范圍內的緩沖劑。2、根據權利要求1所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述對白細胞進行分類是指將白細胞分為與淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞以及嗜堿性粒細胞分別對應的五個集團。3、根據權利要求2所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述陽離子表面活性劑為季銨鹽型陽離子表面活性劑。4、根據權利要求3所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述陽離子表面活性劑為具有下式所示結構的季銨鹽型陽離子表面活性劑，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中，R1為C原子數616的烷基或鏈烯基，R2及R3為C原子數14的烷基或鏈烯基，R4為C原子數14的烷基或鏈烯基或芐基，X為鹵素原子。5、根據權利要求2所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述有機化合物的疏水基團選自芳香族組成的基團、C原子數6以上的烴基形成的基團或者C原子數大于6的雜環(huán)，所述有機化合物的陰離子基團為羧基或磺酸基。6、根據權利要求2所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于:所述有機化合物為酸性色素。7、根據權利要求2所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑包括醇類，并且所述醇類占所述試劑的體積百分比濃度為0.110%。8、根據權利要求7所述的一種對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述醇類為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇或2-苯氧乙醇。9、一種對白細胞進行分類的方法，所述方法包括將權利要求18中任意一項所述的白細胞分類試劑與血樣混合后測定細胞的大小和形態(tài)信息。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述方法包括在104(TC的溫度條件下，將所述白細胞分類試劑與血樣按10100:1的比例混合1230s后，通過低角度和高角度兩種散射光分別測定細胞的大小和形態(tài)信息，所述低角度散射光的測定角度為15度，高角度散射光的測定角度為620度。全文摘要本發(fā)明公開了一種對白細胞進行分類的試劑，包括a.至少兩種陽離子表面活性劑；b.至少一種帶疏水基團及陰離子基團的有機化合物；c.能夠將pH值調整在2～8范圍內的緩沖劑。本發(fā)明還公開了采用上述試劑對白細胞進行分類的方法。利用本發(fā)明的試劑及方法可快速溶解紅細胞，實現(xiàn)在同一個通道中將白細胞進行五分類，反應可以在10～40℃的溫度條件下進行并且只需檢測兩個角度的散射光信號即可對白細胞進行五分類檢測。文檔編號G01N33/48GK101470108SQ20071012546公開日2009年7月1日申請日期2007年12月24日優(yōu)先權日2007年12月24日發(fā)明者喬巖梅,兵劉,劉牧龍,孟祥平,許文娟申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司