專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，由這種方法制備的抗體，和這種抗體的用途。
背景技術(shù)：
：口蹄疫是對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)威脅最大的一種動(dòng)物疫病，不僅會(huì)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，而且會(huì)引起惡劣的政治影響。尤其是2001年英國(guó)等無(wú)口蹄疫國(guó)家暴發(fā)口蹄疫后，世界各國(guó)都高度重視對(duì)該病的檢驗(yàn)檢疫、預(yù)防控制。目前檢測(cè)、診斷口蹄疫的主要方法是檢測(cè)發(fā)病或帶毒動(dòng)物體內(nèi)的口蹄疫病毒及其抗體水平，如分離病毒、ELISA等方法。直接分離病毒是對(duì)口蹄疫的最可靠的診斷，但較長(zhǎng)的周期會(huì)延誤對(duì)該烈性傳染病的最佳控制時(shí)間；ELISA雖然簡(jiǎn)單易行、但需要區(qū)分是自然感染還是由于疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，不能及時(shí)做出診斷。為了便于準(zhǔn)確及時(shí)診斷口蹄疫，直接檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)口蹄疫病毒，避免由于出結(jié)果慢、做鑒別診斷等給口蹄疫防制帶來(lái)的不利因素，生產(chǎn)特異性高的抗口蹄疫病毒單克隆抗體具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。我國(guó)曾于2005年突發(fā)大面積的Asial型口蹄疫，疫情波及十幾個(gè)省市，給我國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。此次暴發(fā)不僅持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而且疫情復(fù)雜。由于我國(guó)多年來(lái)沒(méi)有暴發(fā)過(guò)Asial型口蹄疫，因此也沒(méi)有研制針對(duì)Asial型口蹄疫的快速診斷方法。此次暴發(fā)警示我們要及早開(kāi)發(fā)研究便捷、快速、敏感、特異的快速診斷試劑以及研制快速診斷試劑盒。綜上所述，研制針對(duì)Asial型口蹄疫的高特異性單克隆抗體以及用該試劑研制快速診斷試劑盒是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是為了提供一種特異性高的抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明還提供用前述方法得到的這種抗體以及這種抗體的用途。本發(fā)明的抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法是用Asial型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asial型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，再將VP1插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，將菌體超聲破碎后除雜蛋白，層析法純化得到表達(dá)的重組蛋白，用重組蛋白給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，取免疫后小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞，再經(jīng)分散處理后離心得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比5~10:1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，沉淀物中按體積比1:2加入濃度為50%的聚乙二醇PEG4000,靜置12分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的2535倍的HAT培養(yǎng)液，再將融合細(xì)胞按100^1/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100^1用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，再用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株，取培養(yǎng)液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法進(jìn)行純化得到抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體。本發(fā)明的抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的最佳制備方法是以Asial型口蹄疫病毒(該病毒株保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室)的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asial型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1。將VPl插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，再用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株。將前述菌體超聲破碎后除雜蛋白，用層析法得到純化表達(dá)的重組蛋白，將重組蛋白與等體積佐劑充分混勻，給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，其中第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑，第二次免疫所用佐劑為不完全弗氏佐劑，第三次免疫不用佐劑，免疫后的3~4天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1:30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比510:1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比l:2加入濃度為50。/o的聚乙二醇PEG4000，再靜置12分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的25~35倍的HAT培養(yǎng)液，再將融合細(xì)胞按100^1/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加lOO(il用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性、滴度高的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，再用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株，大量生產(chǎn)單克隆抗體。本發(fā)明的另一種抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法與前述方法基本相同，但在后期大量生產(chǎn)單克隆抗體時(shí)是采用小鼠體內(nèi)誘生法，即先用Asial型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asial型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，再將VP1插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，再用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，將菌體超聲破碎后除雜蛋白，用層析法得到純化表達(dá)的重組蛋白，將重組蛋白與等體積佐劑充分混勻，給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，其中第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑，第二次免疫所用佐劑為不完全弗氏佐劑，第三次免疫不用佐劑，免疫后的34天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1:30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，將所得到的雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植垸處理的雌性小鼠腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成分，取其上清液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法純化，得到抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體。由前述方法所得抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析法進(jìn)行純化。由前述的方法可制備抗Asial型口蹄疫病毒的單抗隆抗體。這種單抗隆抗體用于制備檢測(cè)Asial型口蹄疫病毒的試劑盒，如Asial型口蹄疫病毒的ELISA檢測(cè)試劑盒，或者Asial型口蹄疫病毒的膠體金檢測(cè)試劑盒。單抗的效價(jià)高，不與O型抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，該單克隆抗體特異性地針對(duì)Asial型抗原由本發(fā)明所得到的雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定，得到的抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體具有高度的血清型特異性，且不與其它血清型發(fā)生交叉反應(yīng)，適合進(jìn)行快速診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)研究。本發(fā)明的Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體將為我國(guó)口蹄疫的防控提供重要的技術(shù)支撐。具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的一個(gè)具體制備過(guò)程介紹(1)用RNeasyMiniKit(Qiagen)試劑盒從Asial型口蹄疫病毒(注該毒株保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室)中提取的總mRNA為模板，用針對(duì)Asial型VPl的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，獲得Asial型口蹄疫病毒VP1基因。在本發(fā)明中所用的引物為上游引物5'-CCGGAATTCGCTTACCAGTGGATGCTCG-3'下游引物5陽(yáng)'CCCAAGCTTCGCTAGCTTGAGCAGGTC-3'按照通常連接方法將PCR擴(kuò)增的目的基因與PGEM-Teasy載體連接，采用通常方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建含有重組克隆載體的大腸桿菌菌株，用瓊脂糖平板(amp+)及藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，挑取白斑克隆進(jìn)行擴(kuò)增。用PCR、酶切以及序列分析鑒定陽(yáng)性克隆，采用雙酶切從鑒定為陽(yáng)性的克隆上切下目的基因，以分子生物學(xué)通常采用的方法回收酶切目的基因片段，將獲得的目的基因定向插入表達(dá)載體pPRoEXHTb，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5ot)構(gòu)建重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，釆用細(xì)菌涂板(Kan+抗性)篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR、酶切和序列分析等方法鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)。當(dāng)重組表達(dá)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期A55。二0.5-1.0時(shí)，通常As5。二0.6時(shí)，用終濃度為lmmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)6小時(shí)后收獲表達(dá)菌，8000rpm離心10min收集沉淀，棄上清。按每克重加5ml20mM/LTris緩沖液(pH8.0)懸浮菌體后，超聲破碎菌體，12000rpm離心15分鐘后留沉淀?xiàng)壣锨?，用包涵體洗滌緩沖液(1MTrispH8.0，0.5MEDTApH8.0，3MNaCl，0.5%TritonX-100)充分洗滌后，12000rpm離心30min以去除雜蛋白，重復(fù)4-5次。用8M尿素緩沖液(0.5MNaCl，0.02MTris，8M尿素，pH8.0)懸浮沉淀，用親和層析法(Ni-NTAHis)純化表達(dá)的重組蛋白，獲得的重組蛋白用紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量后-2(TC凍存。(2)制備免疫脾細(xì)胞取前述的純化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原與等體積佐劑充分混勻，分別注入健康小鼠頸背部?jī)蓚?cè)、腹股溝部皮下；每只每次注射的病毒劑量為2080嗎抗原，間隔24周后，用同樣的方法再次重復(fù)注入至少1次；第一次免疫用的佐劑為完全弗氏佐劑、第二次免疫所用佐劑改為不完全弗氏佐劑、第三次免疫不用佐劑、佐劑與抗原的比例為l:l(體積比)最后一次免疫后2周，測(cè)小鼠血清中的抗口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的抗體滴度，將顯示有足夠抗體滴度的小鼠作為免疫脾細(xì)胞的來(lái)源。測(cè)定抗體滴度的方法，可用放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定法等，本發(fā)明中采用通常的ELISA法。(3)制備骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞通常使用從小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0細(xì)胞系。在進(jìn)行細(xì)胞融合前，將其在加有10%胎牛血清的DMEM(100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素)的常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天，以便在融合時(shí)可以得到2xl(f或更多的融合細(xì)胞。本發(fā)明通常選用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞。(4)細(xì)胞融合將2080嗎前述所得的純化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原向已按步驟(2)的方式免疫接種小鼠，并且在免疫后的34天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞。分散脾細(xì)胞，然后按體積比1:30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀。將上述(3)培養(yǎng)的小鼠骨髓細(xì)胞瘤SP2/0離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀。用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比(510):1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1:2加入濃度為50。/。的聚乙二醇PEG4000，再靜置12分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的25~35倍的HAT培養(yǎng)液，所用的HAT溶液為次黃嘌呤1(T61(T3M，氨基喋呤1(T81(T7M，胸苷1(T6~I(T4M，懸浮融合細(xì)胞，最后補(bǔ)加HAT培養(yǎng)液至沉淀物體積的140-160倍。再將融合細(xì)胞按lOOpl/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加lOOpl用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞。將上述培養(yǎng)孔置于濃度為37%的C02培養(yǎng)箱中，在溫度為3538"C條件下培養(yǎng)1014小時(shí)，從第3天開(kāi)始，每隔23天用每孔半量HAT培養(yǎng)液換液體一次。當(dāng)觀察培養(yǎng)孔中出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落時(shí)，先取培養(yǎng)上清液，然后再在每孔加半量HAT培養(yǎng)液。再用ELISA檢測(cè)抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的抗體及滴度。當(dāng)檢測(cè)表明其與對(duì)照相比有明顯的升高時(shí)即視為合格。將上述抗Asial型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性、滴度高的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株?？梢酝ㄟ^(guò)一種經(jīng)有限稀釋該雜交瘤細(xì)胞使每一孔中只含有一個(gè)單一雜交瘤細(xì)胞的方法，或一種從軟瓊脂培養(yǎng)基中分離集落的軟瓊脂方法，或一種采用顯微操作器，挑取單一雜交瘤細(xì)胞的方法，或一種釆用細(xì)胞分選儀分離單一的雜交瘤細(xì)胞的"分選儀克隆"方法。(5)制備單克隆抗體用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述(4)中得到的雜交瘤細(xì)胞株。大量生產(chǎn)單克隆抗體，可采用大轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法?；蛲敌∈篌w內(nèi)誘生法。其中大轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法可通過(guò)培養(yǎng)上述(3)雜交瘤細(xì)胞純化得到抗口蹄疫病毒單克隆抗體。同系鼠(本發(fā)明用Balb/c小鼠)體內(nèi)誘生法可通過(guò)將上述(3)得到的產(chǎn)生抗口蹄疫病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞(5X105106)注入經(jīng)降植垸處理的雌性小鼠(48周齡)腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成分，其上清液即含有抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體。如果需要進(jìn)一步純化，可采用硫酸銨沉淀和凝膠層析法純化。將抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表達(dá)抗原的單克隆抗體分別與包被Asial、O、A和C型口蹄疫病毒抗原進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果顯示，我們生產(chǎn)的抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體具有高度的血清型特異性，不與其它血清型發(fā)生交叉反應(yīng)。經(jīng)上培養(yǎng)及純化處理的抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體即可用以制備檢測(cè)Asial型口蹄疫病毒的ELISA檢測(cè)試劑盒，或者用于制備檢測(cè)Asial型口蹄疫病毒的膠體金檢測(cè)試劑盒。以下是有關(guān)的檢測(cè)情況表1單克隆抗體腹水與Asial型FMDV抗原反應(yīng)OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表l中結(jié)果顯示，陰性對(duì)照AsialOD45。值為0.225-0.356;陽(yáng)性對(duì)照OD450值為1.2771.417;而與Asial型抗原的0045。值為0.5521.942之間，與陰性對(duì)照相比具有顯著的差異，說(shuō)明該單克隆抗體特異性地針對(duì)Asial型抗原。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2屮結(jié)果顯示，所有篩選的單抗與A型抗原的反應(yīng)后的OD45Q值與陰性對(duì)照和空白對(duì)照相比沒(méi)有顯著的差異，不發(fā)生反應(yīng)，而與陽(yáng)性對(duì)照的值相比具有很大的差異，說(shuō)明該單克隆抗體不與A型抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。表3單克隆抗體腹水與C型FMDV抗原反應(yīng)的OD4so值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3中結(jié)果顯示，所有篩選的單抗與C型抗原的反應(yīng)后的OD45o值與陰性對(duì)照和空白對(duì)照相比沒(méi)有顯著的差異，不發(fā)生反應(yīng)，而與陽(yáng)性對(duì)照的值相比具有很大的差異，說(shuō)明該單克隆抗體不與C型抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。表4單克隆抗體與O型FMDV抗原反應(yīng)的OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4中結(jié)果顯示，所有篩選的單抗與O型抗原的反應(yīng)后的OD45。值與陰性對(duì)照和空白對(duì)照相比沒(méi)有顯著的差異，不發(fā)生反應(yīng)，而與陽(yáng)性對(duì)照的值相比具有很大的差異，說(shuō)明該單克隆抗體不與O型抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。表5細(xì)胞培養(yǎng)液上清、腹水效價(jià)測(cè)定與亞類(lèi)鑒定總表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在表5中亞類(lèi)鑒定為抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體為IgG，其中1B8孔的為IgGi、5El孔為IgG^、5E2孔為IgG^，細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)最高孔5E2為1:2X105，腹水效價(jià)能達(dá)到1:4X105，說(shuō)明單抗的效價(jià)高，適合進(jìn)行試劑盒的開(kāi)發(fā)研究。表6對(duì)雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性鑒定(多次傳代后的腹水上清的效價(jià))<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表6可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)對(duì)分泌抗Asial型口蹄疫病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)Balb/c小鼠腹腔傳代，發(fā)現(xiàn)14代的抗體效價(jià)都穩(wěn)定在1:4X105，不僅說(shuō)明抗體效價(jià)高，而且所得到的雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定，適合進(jìn)行快速診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)研究。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的這種抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因表達(dá)抗原的單克隆抗體不僅特異性高，敏感性好，效價(jià)高，而且穩(wěn)定，適合用于快速診斷試劑盒的研制。權(quán)利要求1、抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，其特征在于用Asial型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asial型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，再將VP1插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，將菌體超聲破碎后除雜蛋白，層析法純化得到表達(dá)的重組蛋白，用重組蛋白給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，取免疫后小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞，再經(jīng)分散處理后離心得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比5～10∶1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，沉淀物中按體積比1∶2加入濃度為50％的聚乙二醇PEG4000，靜置1～2分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的25～35倍的HAT培養(yǎng)液，再將融合細(xì)胞按100μl/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100μl用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，再用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株，取培養(yǎng)液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法進(jìn)行純化得到抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，其特征是用重組蛋白給小鼠免疫按以下方法進(jìn)行第一次用完全弗氏佐劑與等體積重組蛋白進(jìn)行免疫，第二次用不完全弗氏佐劑與等體積的重組蛋白進(jìn)行免疫，第三次免疫不用佐劑；免疫后的3~4天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1:30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，用1640培養(yǎng)液懸浮上述脾細(xì)胞沉淀和骨髓瘤細(xì)胞沉淀，并將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞按數(shù)量比5~10:1混合兩種細(xì)胞，然后離心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按體積比1:2加入濃度為50%的聚乙二醇PEG4000，再靜置1~2分鐘后離心去上清液，在沉淀物中緩慢加入沉淀物體積的2535倍的HAT培養(yǎng)液，再將融合細(xì)胞按100^1/孔加入至96孔培養(yǎng)板中，每孔中再加100(il用HAT培養(yǎng)液洗取的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性、滴度高的雜交瘤細(xì)胞，再將雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一塊96孔板中進(jìn)行克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株，再用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)上述所得到的雜交瘤細(xì)胞株，取培養(yǎng)液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法進(jìn)行純化得到抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體。3、抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，其特征在于用Asial型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得Asial型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，再將VPl插入原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)質(zhì)粒，再用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到重組表達(dá)載體的大腸桿菌菌株，將菌體超聲破碎后除雜蛋白，用層析法得到純化表達(dá)的重組蛋白，用重組蛋白給健康小鼠皮下注射進(jìn)行免疫，取免疫后小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞，再經(jīng)分散處理后離心得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3~4天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉淀，將所得到的雜交瘤細(xì)胞注入經(jīng)降植烷處理的雌性小鼠腹腔內(nèi)，2至3周后收集腹水，離心除去固體成分，取其上清液用硫酸銨沉淀和凝膠層析法純化，得到抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗Asial型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，其特征是用重組蛋白給小鼠免疫按以下方法進(jìn)行第一次用完全弗氏佐劑與等體積的重組蛋白進(jìn)行免疫，第二次用不完全弗氏佐劑與等體積的重組蛋白進(jìn)行免疫，第三次免疫只用重組蛋白而不用佐劑；免疫后的34天取小鼠的脾臟獲得脾細(xì)胞進(jìn)行分散處理，然后按體積比1:30加入1640培養(yǎng)液，輕輕吹打數(shù)次，再將脾細(xì)胞離心去上清液得到脾細(xì)胞沉淀，取從小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0細(xì)胞系，在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)34天后，離心去上清液得到骨髓瘤細(xì)胞沉5、權(quán)利要求1至4所述的任一方法制備的單抗隆抗體。6、權(quán)利要求5所述的單抗隆抗體用于制備檢測(cè)Asial型口蹄疫病毒的試劑盒。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)一種用于抗Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法，用這種方法制備的抗體，和這種抗體的用途。本發(fā)明的抗Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體的制備方法是用Asia1型口蹄疫病毒的總mRNA為模板，獲得Asia1型口蹄疫病毒衣殼蛋白的基因VP1，用VP1制備重組表達(dá)質(zhì)粒，用重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株得重組蛋白，再用重組蛋白制備并獲得骨髓瘤細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤進(jìn)行克隆純化，最終得到抗Asia1型口蹄疫病毒的單克隆抗體。文檔編號(hào)G01N33/577GK101096657SQ200710126178公開(kāi)日2008年1月2日申請(qǐng)日期2007年6月14日優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日發(fā)明者叢國(guó)正,周廣青,常惠蕓,李克生,杜惠芬,彤林,獨(dú)軍政,謝慶閣,邵軍軍申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所