專利名稱：一種β-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法
一種0 -內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法技術(shù)領(lǐng)域一種P -內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景7-氨基頭孢垸酸，英文名稱7-AminoCephalosporanicAcid (7-ACA)， CAS 號(hào)957-68-6，分子式為C1()H12N205S,是P-內(nèi)酰胺類中頭孢類抗生素中間體。P -內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有P-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青 霉素類和頭孢菌素類，其作用特點(diǎn)是能夠抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性,從而阻止 細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性。在畜類動(dòng)物詞養(yǎng)中，e-內(nèi)酰胺類抗生素廣 泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其 使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給 人類健康帶來嚴(yán)重危害，如產(chǎn)生過敏反應(yīng)、破壞胃腸道菌群平衡和增強(qiáng)細(xì)菌耐 藥性等。因此其在乳制品中的殘留也越來越引起了國內(nèi)外的重視。其中頭孢類 抗生素由于具有抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于人畜疾病的防治。且頭孢類抗生素 種類繁多，現(xiàn)有的微生物檢測法和儀器檢測法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)所有頭孢類抗生素進(jìn) 行快速、準(zhǔn)確的檢測，有必要研究快速、便攜的免疫檢測技術(shù)——膠體金免疫 技術(shù)。這就需要合成能產(chǎn)生簇特異性抗體的免疫原。目前為止，國內(nèi)尚沒有針 對(duì)頭孢類抗生素的膠體金免疫檢測方法的報(bào)道，為了彌補(bǔ)這一空白，設(shè)計(jì)合成 了以頭孢類抗生素的中間體7-氨基頭孢烷酸為半抗原的用于頭孢類抗生素檢測 的完全抗原。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種e -內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法。所制 備的產(chǎn)品用于頭孢類抗生素的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必 需的人工抗原。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種頭孢類抗生素中間體7-氨基頭孢垸酸人工抗原的 合成方法，7-氨基頭孢垸酸縮寫為7-ACA，以7-氨基頭孢垸酸為半抗原，用戊 二醛法將其與載體蛋白牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)，用紫外掃描儀 (UNICO，UV-2802pcs)測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。其反應(yīng)方程式為<formula>formula see original document page 3</formula>(1)人工抗原的合成7-ACA、戊二醛、'牛血清蛋白以摩爾比為100 : 10 : 1
的比例反應(yīng)，首先讓戊二醛與半抗原7-ACA的氨基室溫下反應(yīng)30min,然后加 入牛血清蛋白室溫下攪拌反應(yīng)3h，即得7-氨基頭孢烷酸人工抗原混合液。因?yàn)?7-ACA分子量為272，作為半抗原相對(duì)較小，采用戊二醛作為交聯(lián)劑，戊二醛 既是交聯(lián)劑又是連接臂，省去了加入連接臂的半抗原合成步驟。透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液和2X2L 的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人 工抗原7-ACA-牛血清蛋白。(2)人工抗原的鑒定7-ACA-牛血清蛋白采用紫外掃描儀測定其偶聯(lián)比， 分別在262nm、 278nm處測吸光值，并計(jì)算其偶聯(lián)比。偶聯(lián)比測定是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量 (或相對(duì)含量)的原理建立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃 度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián) 物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸收系數(shù)e:配制7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)濃度為0， 10， 20， 30吸mL—1 的超純水溶液，通過紫外掃描可知7-氨基頭孢烷酸的最大吸收波長為262nm， 牛血清白蛋白的最大吸收波長為278nm，分別在262nm、 278 nm處測其吸光值， 每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為^=吸光值/摩爾濃度。本發(fā)明計(jì)算得 Sa262=9850 L，l"、 s趣-6177L.m。r1。配制濃度分別為0 、 0.2 、 0.4 、 0.6、 0.8、 l.Omg'mL"的牛血清蛋白(BSA)， 通過紫外掃描可知BSA的最大吸收波長為278 nm，分別在278nm、 262 nm測 吸光值，每個(gè)濃度做平行樣。本發(fā)明計(jì)算得摩爾吸光系數(shù)分別為 s腦-40293L，r1 、 sB262=24954 L，l-1 。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mU1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴 溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清蛋白濃度 與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液 的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明計(jì)算得抗原溶液 的蛋白濃度為4.7916mgTnL"。偶聯(lián)比測定將偶聯(lián)產(chǎn)物用超純水稀釋到150嗎.mL—1，測262nm、 278nm 波長處的吸光值，以超純水作空白對(duì)照，測出的吸光值為Ap A2，則偶聯(lián)比率 Ca/Cb為Ca/Cb氣A!XsB278-A2XsB262)/(A2XsA262-AiXs甜8)，本發(fā)明計(jì)算得r" 16 。其中s為摩爾吸光系數(shù)(Lmor1)， 65000為牛血清蛋白的分子量，150xl(T3
為牛血清蛋白濃度(吸ml/1)。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了 7-ACA的人工抗原，合成步驟簡潔， 有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以 滿足國內(nèi)對(duì)其研究的需要。


圖l 7-ACA、 BSA及其偶聯(lián)物的紫外掃描組合圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(1) 人工抗原的制備稱取7-氨基頭孢垸酸27.2mg (O.lmmol)溶于8mLPBS(0.01mol/L)溶液中， 充分溶解后逐滴加入40nL25。/。的戊二醛(O.Olmmol)，反應(yīng)30min。另稱取BSA 68mg (O.OOlmmol)溶于2 mL PBS(0.01mol/L)溶液中后逐滴加入上述反應(yīng)液， 室溫下攪拌反應(yīng)3h。即得人工抗原混合液。透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4'C去離子水中備用。將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M pH7.4的PBS緩沖液 和2X2L的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末， 即得到人工抗原7-ACA-牛血清蛋白。(2) 7-氨基頭孢垸酸人工抗原的鑒定偶聯(lián)比測定估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法， 雖然方法很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對(duì)含量) 的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的 原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度。在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子 均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸收系數(shù)s:配制7-氨基頭孢垸酸(7-ACA)濃度為0， 10， 20， 30吸mU1 的超純水溶液，通過紫外掃描可知7-ACA的最大吸收波長為262nm，分別在 262nm、 278nm處測吸光值，每個(gè)濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計(jì)算為^=吸 光值/摩爾濃度。本發(fā)明計(jì)算得SA26f9850L'mor1、 SA27f6177L'mor1。配制濃度分別為0 、 0.2 、 0.4 、 0.6、 0.8、 1.0mg'mL"的牛血清蛋白(BSA)， 通過紫外掃描可知BSA的最大吸收波長為278 nm，分別在278 nm、 262 nm測 吸光值，每個(gè)濃度做平行樣。本發(fā)明計(jì)算得摩爾吸光系數(shù)分別為 SB27『術(shù)93L.mor1 、 sB262=24954 L，l-1 。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200昭'ml/1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，3(TC水浴 溫?zé)?分鐘，每個(gè)濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定7-ACA-牛血清蛋 白抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本發(fā)明計(jì)算 得抗原溶液的蛋白濃度為4.7916mg.mL"。偶聯(lián)比測定將偶聯(lián)產(chǎn)物7-ACA-牛血清蛋白用超純水稀釋到150昭.mL-1， 測262nm、 278nm波長處的吸光值，以超純水作空白對(duì)照，測出的吸光值為A,， A2，則偶聯(lián)比率r=Ca/Cb為i^Ca/Cb^Ai X eB278-A2X eB262)/( AzXsa^-AjX Sa278)，本發(fā)明計(jì)算得r"16。
權(quán)利要求
1.一種頭孢類抗生素中間體7-氨基頭孢烷酸人工抗原的合成方法，7-氨基頭孢烷酸縮寫為7-ACA，其特征是以7-ACA為半抗原，用戊二醛法將其與載體蛋白牛血清蛋白偶聯(lián)，用紫外掃描儀測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比；(1)人工抗原的合成7-ACA、戊二醛、牛血清蛋白以摩爾比為100∶10∶1的比例反應(yīng)，首先讓戊二醛與半抗原7-ACA的氨基室溫下反應(yīng)30min，然后加入牛血清蛋白室溫下攪拌反應(yīng)3h，即得7-氨基頭孢烷酸人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將7-氨基頭孢烷酸人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液和2×2L的去離子水透析3天，最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原7-ACA-牛血清蛋白；(2)人工抗原的鑒定7-ACA-牛血清蛋白采用紫外掃描儀測定其偶聯(lián)比，分別在262nm、278nm處測吸光值，并計(jì)算其偶聯(lián)比。
全文摘要
一種β-內(nèi)酰胺類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以7-氨基頭孢烷酸為半抗原，用戊二醛法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，用紫外掃描儀測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了7-氨基頭孢烷酸的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為今后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內(nèi)對(duì)其研究的需要。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101153871SQ200710134518
公開日2008年4月2日 申請(qǐng)日期2007年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者劉利強(qiáng), 彭池方, 胡擁明, 胥傳來, 謝會(huì)玲 申請(qǐng)人:江南大學(xué)