專利名稱：稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱—熒光光度的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定谷物中黃曲霉毒素的方法有薄層色譜法、髙效液相色譜法、酶聯(lián)免疫 吸附測(cè)定法、質(zhì)譜法、放射免疫測(cè)定法。這些方法或多或少都具有如下不足之 處
(1) 在操作過(guò)程中，需要使用劇毒的黃曲霉毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物，對(duì)操作人員安 全造成危害。
(2) 操作過(guò)程煩瑣、復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大。
(3) 儀器設(shè)備昂貴、笨重、操作復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速分析。
(4) 靈敏度較差，重復(fù)性很難得到滿意結(jié)果。
目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用的"黃曲霉毒素免疫親合柱——熒光光度計(jì)法"是 以單克隆免疫親合柱為分離手段，用熒光計(jì)作為檢測(cè)工具的快速分析方法。它 克服了TLC (薄層色譜法)和HPLC (高效液相色譜法)法在操作過(guò)程中使用劇 毒的真菌毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物和在樣品預(yù)處理過(guò)程中使用多種有毒、異味的有 機(jī)溶劑，危害操作人員人身安全和污染環(huán)境的缺點(diǎn)。黃曲霉毒素免疫親合柱熒 光光度計(jì)法比傳統(tǒng)的HPLC法更加安全、可靠、靈敏度和準(zhǔn)確度高。它采用單
克隆抗體免疫技術(shù)，可以特效性地將黃曲霉毒素或其它真菌毒素分離出來(lái)，分 離效率和回收率髙。
國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18979-2003 (食品中的黃曲霉毒素的測(cè)定——免疫親和 層析凈化髙效液相色譜法和熒光光度法)，此方法適用于玉米、花生及其制品 (花生醬、花生仁、花生米、大米、植物油脂、醬油、食醋等食品中的黃曲霉 毒素的測(cè)定；GB/T 18980-2003 (牛奶和奶粉中黃曲霉毒素的測(cè)定——免疫 親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法)主要適用范圍牛奶、奶粉中黃 曲霉毒素Mi含量的測(cè)定。
免疫親和柱一熒光光度法的檢測(cè)黃曲霉毒素的原理
經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、 B2、 Gl、 G2具有專 一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)的抗體上。用清水將免疫親和柱上的雜質(zhì) 除去，以甲醇通過(guò)免疫親和柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。 甲醇洗脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素的總量。
國(guó)標(biāo)GB/T18979-2003中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法中2.4.1中大米、玉米、小 麥、花生的黃曲霉毒素檢測(cè)方法如下 1試劑和溶液
1.1水本方法提到的水均指重蒸水 1.2甲醇色譜純
1.3甲醇一水(7+3):取70mL甲醇加水30mL 1.4氯化鈉(Nacl):分析純
1.5PBS緩沖溶液8.0g氯化鈉，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g 氯化鉀，
用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)ffl值至7.0，最后用純水稀釋到 1000mL。
1. 6吐溫-20/PBS溶液(0.1%):取lnL吐溫-20，加入PBS溶液稀釋至1000mL。 1.7溴溶液儲(chǔ)備液溶液(0.01%):稱取適量溴，溶于水，配成0.01%的儲(chǔ)備液， 41C避光保存。
1. 8溴溶液工作液(O. 002%):取lOmLO. 01%的儲(chǔ)備液加入40ml水混勻。于棕色 瓶中保存?zhèn)溆?。需每次使用前配制?br> 1.9硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量的水中，冷卻后定
容到1000mL. 1.10熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液稱取3.40g硫酸奎寧用0.05 mol/L
硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液熒光光度計(jì)讀數(shù)相當(dāng)于20ug/L黃曲霉毒素標(biāo)
準(zhǔn)溶液。
2儀器和設(shè)備
2.1熒光光度計(jì)
2.2髙速均質(zhì)器18, 000r/min ~22，000 r/min 2.3黃曲霉毒素免疫親和柱 2.4玻璃纖維過(guò)濾紙直徑llcm,孔徑1.5um
2.5玻璃注射器10mL， 20mL。
2.6玻璃試管直徑12mm，知75mm，無(wú)熒光性。
2.7空氣壓力泵。
3分析步驟
3.1提取
準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)磨細(xì)的(小于2mm)的25.0g于250mL具塞三角瓶中，加入 5.0g氯化鈉及準(zhǔn)確125.0mL(V0甲醇-水(7+3)，以均質(zhì)器髙速攪拌2min。定量 濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取lS.0mL(V2)濾液并m0mL(V3)稀釋。用玻璃纖維濾紙1~ 2過(guò)濾次，至濾液澄清，備用。 3.2凈化
將免疫親和柱連接于20.0mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取15.0mL(V4)樣品提 取液注入玻璃注射器下，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以 約6mL/min流速緩慢通過(guò)親和柱，直至2 3mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入 l.OmL(V)色譜級(jí)甲醇溶液洗脫，流速為lmL/miii~2 mL/min,收入全部洗脫液 于玻璃試管中，供檢測(cè)用。 3.3測(cè)定
3.3.1熒光光度計(jì)校準(zhǔn)
在激光波光360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm條件下，以0.05mon/L硫酸溶液為 空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值O.Oiig/L;以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)計(jì)調(diào)節(jié)熒光光度 計(jì)的計(jì)數(shù)值為20.0li g/L。 3.3.2樣液測(cè)定
取上述凈化后的甲醇洗脫液l.OmL， 0.002%溴溶液，靜置lmin,按3.3.1條 件進(jìn)行操作，于熒光光度計(jì)中讀取中的黃曲霉毒素(B"B2+GrHG2)r的濃度c (u g/L)。
3.3.3空白試驗(yàn)
用水代替試樣，按33.1 3丄2做空白試驗(yàn)。 3.3.4結(jié)果計(jì)算
檢測(cè)結(jié)果按公式(l)計(jì)算 X =(Cl-C2) V
<formula>formula see original document page 6</formula>
式中X——試樣中黃曲霉毒素(Bh B2、 Gt或G2)含量，lig/kg;
CI——試樣中黃曲霉毒素B1、 B2、 G1或G2的含量，iig/L; C2——空白試驗(yàn)黃曲霉B1、 B2、 G1或G2的含量，u g/L;
V——最終甲醇洗脫液體積，mL;
W——最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，g; m——i^樣稱取量，g;
VI——樣品提取液體積，mL;
V2——稀釋用樣品濾液體積，mL; V3——稀釋液體積，mL; V4——通過(guò)親和柱的樣品提取液體積，mL。 計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱一熒光 光度的測(cè)定方法，它具有回收率更接近真實(shí)值，精密度更高，減少試劑的使用 量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染，計(jì)算方便等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱一熒光光度的測(cè) 定方法，它依次包括提取、凈化、測(cè)定和計(jì)算步驟，經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取 液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱，層 析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、 B2、 Gl、 G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián) 在親和柱層析介質(zhì)的抗體上，清洗親和柱，后以甲醇通過(guò)免疫親和柱洗脫， 加入溴溶液衍生，以提髙測(cè)定靈敏度，用甲醇洗脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃 曲霉毒素的總量；
其特征在于
提取步驟中取lO.Og樣品，加入2.0—2.5g氯化鈉及60-80%甲醇-水溶液 50.0mL,超聲10—20min提取；
凈化步驟中清洗親和柱時(shí)，先用吐溫-20/PBS溶液淋洗親和柱，后用甲醇: 水=2: 8的溶液淋洗親和柱，最后用水清洗親和柱。
如上所述的稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱一熒光光度的測(cè)定方法，其特
征在于提取步驟中，樣品濾液與稀釋它的水體積比例為1:3。
本發(fā)明的稻谷中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)相比主要有以下不同點(diǎn)
1. 試樣和試劑用量
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，樣品25.0g，甲醇(7+3)水溶液125. 0mL;與本 發(fā)明方法則是取樣品10.0g，甲醇一水溶液50.0mL。主要是為了減少試劑的使 用量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染。
2. 提取方法
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，是用髙速攪拌器提??；本發(fā)明的檢測(cè)方法中是 用超聲提取。這主要是由于試劑減少，用超聲提取更為方便。
3. 樣品稀釋比例
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，取15. OmL濾液加入30. OmL水稀釋；本發(fā)明方法 是用10.0mL濾液加入30.0mL水稀釋。這樣可以使回收率高，且計(jì)算方便。 3.凈化過(guò)程
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003用10. OmL水清洗柱子2次；而本發(fā)明的檢測(cè)方法則 是用先用吐溫-20/PBS溶液淋洗柱，再用甲醇(2+8)溶液清洗柱子，最后用水 清洗柱子。這主要助于有效除去柱上的雜質(zhì)，減少雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，平 行樣品的檢測(cè)重現(xiàn)性更好。
本發(fā)明的方法與國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003方法相比較，回收率更接近真實(shí)值， 精密度更髙，減少了試劑的使用量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染，計(jì)算 方便等優(yōu)點(diǎn)。
具體的實(shí)施方式
本發(fā)明的具體實(shí)施例如下。本發(fā)明經(jīng)過(guò)試驗(yàn)與研究，對(duì)此現(xiàn)有技術(shù)的方法 進(jìn)行了改進(jìn)與優(yōu)化，改進(jìn)后的稻谷中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法按下列步驟進(jìn)行 1試劑和溶液
1.1水本發(fā)明實(shí)施例的方法提到的水均指重蒸水
1.2甲醇色譜純
1.3 60-80%甲醇一水溶液取60mL甲醇加水40mL,依此累推，配制70%或的甲 醇溶液.
1.4甲醇一水(2+8):取20mL甲醇加水80mL 1.5氯化鈉(Nacl):分析純
1.6 PBS緩沖溶液8. Og氯化鈉，1. 2g磷酸氫二鈉，0. 2g磷酸二氫鉀，0. 2g 氯化鉀，用990mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)ra值至7.0，最后用純水稀釋 到1000mL。
1. 7吐溫-20/PBS溶液(0.1%):取lmL吐溫-20，加入PBS溶液稀釋至1000mL。 1.8原裝顯色溶液北京中檢維康公司提供。
1.9配制顯色溶液取lmL的原裝顯色溶液，加入9ml水混勻，需每次使用前 配制。
1.10熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液北京中檢維康公司提供。紅色標(biāo)定液熒光光度計(jì)中
讀數(shù)相當(dāng)于22 " g/L黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，綠色標(biāo)定液相當(dāng)于-0.100 ii g/L黃
曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，黃色標(biāo)定液相當(dāng)于11P g/L黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2儀器和設(shè)備
2.1 VICAM-4熒光光度計(jì)
2.2超聲波提取器
2.3黃曲霉毒素免疫親和柱
2.4玻璃纖維過(guò)濾紙直徑llcm,孔徑1.5um
2.5玻璃注射器10mL， 20mL。
2.6玻璃試管直徑12mm,長(zhǎng)75mm，無(wú)熒光性。
2.7空氣壓力泵。
3分析步驟
3.1提取
準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)磨細(xì)的(小于2mm)的10.0g于150mL具塞三角瓶中，加入 2.0g氯化鈉及準(zhǔn)確50.0mL(V060-80。/。甲醇-水溶液，超聲10min。定量濾紙過(guò) 濾，準(zhǔn)確移取10.0mL(V2)濾液并30.0mL(V3)稀釋。用玻璃纖維濾紙過(guò)濾1 2 次，至濾液澄清，備用。
3.2凈化
將免疫親和柱連接于lO.OmL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0mL(V4)樣品提 取液注入玻璃注射器下，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以 約6mL/min流速緩慢通過(guò)親和柱，直至2 3mL空氣通過(guò)柱體。先用lO.OmL 吐溫-20/PBS溶液淋洗柱1 2次，后用10.0mL甲醇-水(2+8)溶液淋洗柱子， 最后用10.0mL水清洗親和柱，棄去全部流出液，并使柱內(nèi)液體排空。準(zhǔn)確加 入l.OmL(V)色譜級(jí)甲醇溶液洗脫，流速為lmL/min 2 mL/min,收入全部洗 脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。 3.3測(cè)定
3.3.1熒光光度計(jì)校準(zhǔn)
根據(jù)儀器的操作說(shuō)明，對(duì)儀器進(jìn)行校正。先用紅色的標(biāo)定管進(jìn)行標(biāo)定，鍵 入正確的讀數(shù)44ppb;再用綠色的標(biāo)定管進(jìn)行標(biāo)定，鍵入正確的讀數(shù)-0.1ppb; 最后檢測(cè)黃色的標(biāo)定管，讀數(shù)應(yīng)為22土2ppb。 3.3.2樣液測(cè)定
取上述凈化后的甲醇洗脫液加入l.OmL顯色溶液，混勻，靜置lmin，按3.3.1 條件進(jìn)行操作，于熒光光度計(jì)中讀取中的黃曲霉毒素(B,+B2+G一G2)的濃度c
3.3.3空白試驗(yàn)
用水代替試樣，按4.3.1 3.3.2做空白試驗(yàn)。 3.3.4結(jié)果計(jì)算 檢測(cè)結(jié)果按公式(2)計(jì)算
X=Ci - c。
.......(2)
式中X~~試樣中黃曲霉毒素的含量，lig/kg; Cl——樣液中黃曲霉毒素的含量，Ug/L; C。一一空白試樣黃曲霉毒素含量，U^L。 六、本發(fā)明稻谷中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)相比主要有以下不同點(diǎn) 2.試樣和試劑用量
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，樣品25.0g，甲醇(6+4)溶液125. OmL;與本發(fā) 明方法則是取樣品10.0g，甲醇(6+4)溶液50.0mL。主要是為了減少試劑的使用
量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染。
2. 提取方法
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，是用髙速攪拌器提取本發(fā)明的檢測(cè)方法中是 用超聲提取。這主要是由于試劑減少，用超聲提取更為方便。
3. 樣品稀釋比例
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003中，取15. 0mL濾液加入30.0mL水稀釋；本發(fā)明方法 是用10. 0mL濾液加入30. 0mL水稀釋。這主要為計(jì)算方便。
3. 凈化過(guò)程
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003用10.0mL水清洗柱子2次；而本發(fā)明的檢測(cè)方法則 是用先用10.0mL吐溫-20/PBS溶液淋洗柱1 2次，再用10. OmL甲醇(2+8) 溶液清洗柱子，最后用10.0mL水清洗柱子。這主要助于有效除去柱上的雜質(zhì)， 減少雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，平行樣品的檢測(cè)重現(xiàn)性更好，檢測(cè)結(jié)果更接近真 實(shí)值。
4. 與國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003相比，本發(fā)明方法檢測(cè)稻谷中的黃曲霉毒素加樣回 收率和精密度比較。
國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003檢測(cè)稻谷，加樣回收率在110% 250%之間，平均回 收率為155%,平行樣品精密度為31. 6%;
本發(fā)明方法檢測(cè)稻谷，加樣回收率在85% 92%,平均回收率為89%，平行樣 品精密度為4.4%。
七.與國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003相比，本發(fā)明方法檢測(cè)稻谷中的黃曲霉毒素具有 以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明通過(guò)修改后的方法與國(guó)標(biāo)GB/T 18979-2003方法相比較，回收率更 接近真實(shí)值，精密度更髙，減少了試劑的使用量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境 的污染，計(jì)算方便等優(yōu)點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱-熒光光度的測(cè)定方法，它依次包括提取、凈化、測(cè)定和計(jì)算步驟，經(jīng)過(guò)甲醇-水提取，提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和柱，層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在親和柱層析介質(zhì)的抗體上，清洗親和柱，后以甲醇通過(guò)免疫親和柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度，用甲醇洗脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素的總量；其特征在于提取步驟中取10.0g樣品，加入2.0-2.5g氯化鈉及60-80％甲醇-水溶液50.0mL，超聲10-20min提?。粌艋襟E中清洗親和柱時(shí)，先用吐溫-20/PBS溶液淋洗親和柱，后用甲醇∶水＝2∶8的溶液淋洗親和柱，最后用水清洗親和柱。
2、如權(quán)利要求1所述的稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱一熒光光度的測(cè)定 方法，其特征在于提取步驟中，樣品濾液與稀釋它的水體積比例為1:3。
全文摘要
稻谷中黃曲霉毒素的免疫親和柱—熒光光度的測(cè)定方法，它依次包括提取、凈化、測(cè)定和計(jì)算步驟，其特征在于提取步驟中取10.0g樣品，加入2.0-2.5g氯化鈉及60-80％甲醇-水溶液50.0mL，超聲10-20min提?。粌艋襟E中清洗親和柱時(shí)，先用吐溫-20/PBS溶液淋洗親和柱，后用甲醇∶水＝2∶8的溶液淋洗親和柱，最后用水清洗親和柱。它具有回收率更接近真實(shí)值，精密度更高，減少試劑的使用量，降低檢測(cè)成本，減少對(duì)環(huán)境的污染，計(jì)算方便等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101109735SQ200710141590
公開(kāi)日2008年1月23日 申請(qǐng)日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者張繼斌, 汪詠曾 申請(qǐng)人:勁牌有限公司