專利名稱：通過同時(shí)測(cè)量至少兩種不同分子標(biāo)記物來提高檢測(cè)腫瘤及其前體階段時(shí)的臨床特異性的方法
通過同時(shí)測(cè)量至少兩種不同分子標(biāo)記物來提高檢測(cè)腫瘤 及其前體階段時(shí)的臨床特異性的方法
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?1143708.1、申請(qǐng)日為2001年12月18曰《 發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng).
背景技術(shù)：
癌性疾病仍然是全球最常見的致死原因之一.臨床上存在對(duì)癌癥 和癌前期的早期識(shí)別和特定檢測(cè)方法的需求.此外，腫瘤的更詳盡的 特征描述至關(guān)重要，以便得出有關(guān)治療和預(yù)后的推論.這是有效的， 因?yàn)椴煌陌┌Y亞型對(duì)所施用的治療措施產(chǎn)生相異的反應(yīng).因此，譬 如，當(dāng)被懷疑為乳腺癌時(shí)，會(huì)更加頻繁地求助于對(duì)分子標(biāo)記物的免疫 組織化學(xué)染色，例如細(xì)胞角蛋白、雌激素受體、her2/neu、 K167或 p53(例如Leek等，1994, Br. J. Cancer, 69, 135-139; Mokbel 等，1999， Am. L Surgery, 178, 69-72; Reiner等，1990, Cancer, Res. ， 50, 7057-7061).而這些染色常常通過乳腺活組織檢查進(jìn)行， 通過針穿刺(FNA-細(xì)針吸活檢)進(jìn)行染色也日益增多.分子標(biāo)記物也 用于有關(guān)判定腫瘤是否是原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移中.例如，對(duì)原發(fā)性感染 器官特異性的標(biāo)記物的表達(dá)可以有助于這種筌定.
近年來，業(yè)已養(yǎng)定了大量的基罔，作為突變的結(jié)果，它們以變化
了的方式表達(dá)其蛋白，罔而在癌的發(fā)生中起了作用.作為診斷標(biāo)記
物，可以在血清和細(xì)胞水平檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白質(zhì).這些蛋白質(zhì)參與細(xì)
胞中多樣性的生理調(diào)節(jié)過程，例如生長(zhǎng)調(diào)控(增殖基因，例如Ki67和
mcm-5:致癌基因和腫瘤抑制基因，例如p16、 EGF受體、her2/neu
和mdm-2)、細(xì)胞消亡(自然細(xì)胞死亡，例如p53和bcl-2)、 DNA修復(fù)
(msh-l)和細(xì)胞粘著(E-鈣粘著蛋白、p-連環(huán)蛋白和APC).譬如，試
驗(yàn)對(duì)抗上述蛋白質(zhì)的特異性抗體的免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢
測(cè)方法適合這樣的檢測(cè)(van Noorden, 1986, Immunocytochemistry,
Modern Methods and Applications, 2nd edition, Wright, Bristol, 26-53).
已經(jīng)多次證實(shí)單一標(biāo)記物不足以獲得有關(guān)識(shí)別病變細(xì)胞的特異 性，因?yàn)樗嬖谟谝恍┙】导?xì)胞中.這所基于的事實(shí)是，這些標(biāo)記物 可以是參與健康細(xì)胞中的生理調(diào)節(jié)過程且只被過分高度表達(dá)的蛋白 質(zhì)，所述的過分髙度表達(dá)是病變細(xì)胞的一個(gè)指征.Williams等(1998,
PNAS, 95, H932-H937〉描述了 DNA復(fù)制標(biāo)記物nc旭-5，其檢測(cè)出子 宮頸涂片的28種試驗(yàn)損傷/腫瘤(n-58),但在這28種正常涂片中也 提供2種錯(cuò)誤的陽性染色.Sano等(Pathology Intl. ， 1998, 48, 580-585)報(bào)導(dǎo)了標(biāo)記物pl6在15種正常宮頸活組織中的3種非特異 染色.雖然事實(shí)上可以在子宮勁的100%的全部損傷和腫瘤中檢測(cè)到 HPV,但也可以在許多正常子宮頸上皮中檢測(cè)到HPV;即，雖然檢測(cè) HPV的試驗(yàn)高度敏感，但它只具有低的特異性(例如Cuzick, 2000, JAMA. 283, 108-109).
在病理學(xué)中，人們對(duì)檢測(cè)生物樣本中多種標(biāo)記物日益感興趣.一 方面，這能夠獲得更多有關(guān)檢測(cè)和定性病變細(xì)胞或組織區(qū)域的可利用 信息；另一方面，可以識(shí)別出各個(gè)標(biāo)記物的非特異染色是什么并且由 此避免不正確結(jié)論.傳統(tǒng)上，出于這種肖的制備了可利用活組織的連 續(xù)切片或機(jī)體樣本的多種標(biāo)本(例如宮頸涂片在罔定劑中)，隨后其分 別用特定標(biāo)記物染色.這種方法存在若干缺點(diǎn)患者樣本材料的高度
耗費(fèi)，而樣本材料通常是有限的；染色試劑的高度消耗；需要大量的 時(shí)間且成本較高；而且也不可能在細(xì)胞或組織樣本的特定區(qū)域中同時(shí) 清晰地探測(cè)出兩種或多種標(biāo)記物.雖然文獻(xiàn)中業(yè)已報(bào)導(dǎo)了在生物樣本
中兩種或多種不同生物標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)(DAKO,免疫蘇雙染色法實(shí) 踐指南；Gomez等，Eur J. Histochem., 1997. 41, 255-259),但 該途徑至今無法應(yīng)用到常規(guī)診斷中，罔為這些方案在任何程度上都無 法標(biāo)準(zhǔn)化，Terhavauta等人(Cytopathology, 1994, 5， 282-293) 采用p53和Ki67在取自子官頸損傷的活組織中的雙重染色，并且在 一個(gè)細(xì)胞的某些情況中可以由HPV陽性和HPV陰性損傷衍生的基細(xì)胞 和副基細(xì)胞中檢測(cè)到這兩種標(biāo)記物.然而，同時(shí)，作者沒有利用由上 述雙重染色所獲得的信息，通過合并所得的結(jié)果，來描繪出有關(guān)這個(gè) 樣本中腫瘤細(xì)胞存在的可靠結(jié)論.完全沒有任何從自動(dòng)檢測(cè)腫瘤區(qū)域 的立場(chǎng)出發(fā)利用染色信息的嘗試.而且，除了這種聯(lián)合之外，沒有提 及任何其它可能有利于腫瘤區(qū)域的筌定和定性的標(biāo)記物聯(lián)合物.
其它在肺的腫瘤活組織上進(jìn)行的雙重染色在Kraeft等(Clin Cancer Res. 2000, 6, 434-442〉和Oshika等(Mod Pathol, 1998, 11, 1059-1063)中提及.這些參考文獻(xiàn)中提及的抗體聯(lián)合物完全不同于本 發(fā)明所基于的聯(lián)合物.而且，上述兩篇公開物另外要求評(píng)估活組織染
色的病理學(xué)家作出診斷.這種途徑在概念上與方法的自動(dòng)化毫不相 容，由此迄今無法加以考慮.
Rao 等 (1998, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Evolution. 7, 1027-1033)描述了多種腫瘤相關(guān)性標(biāo)記物(DNA含 量、G-肌動(dòng)蛋白和p53)在取自乳腺組織的針穿刺材料(FNA,細(xì)針吸活 檢)中的多重染色.他們解釋了其結(jié)果與使用多種標(biāo)記物獲得比由單 獨(dú)標(biāo)記物的觀察更加高的臨床特異性的影響，并此在乳腺癌的早期識(shí) 別中發(fā)揮重要作用，作者所指出的多重染色僅限于由乳腺組織獲得的 針穿刺材料，因?yàn)椴牧系牟煌匦?，無法應(yīng)用于其它生物材料(即活 組織和子宮頸涂片).而且，所述的標(biāo)記物聯(lián)合物不同于本發(fā)明所提 及的聯(lián)合物.他們不曾嘗試從腫瘤區(qū)域的檢測(cè)自動(dòng)化的立場(chǎng)上利用這 些染色信息.
現(xiàn)有臨床腫瘤診斷的進(jìn)一步改進(jìn)在于兩個(gè)方面， 一方面是樣本制
備和染色的自動(dòng)化，另一方面是自動(dòng)困像分析，自動(dòng)困像分析中包括 診斷的確立.除了節(jié)省時(shí)間且需要較少的人力以外，這條途徑也可以 更加客觀，并由此使診斷更加統(tǒng)一.用熒光或用顯色染料對(duì)腫瘤細(xì)胞 或其前體中的生物標(biāo)記物的染色能夠做到使信號(hào)定量并由此以自動(dòng) 方式讀取它們.能夠以自動(dòng)方式實(shí)現(xiàn)染色方案的體系業(yè)已存在.然 而，困象分析沒有被用于獲得自動(dòng)化診斷(LeNeel等，Clin Chim Acta, 1998, 278, 185-192).最先進(jìn)的體系包括利用形態(tài)學(xué)困象信息自動(dòng) 化檢測(cè)子宮頸涂片中的腫瘤細(xì)胞及其前體(Sawaya等，Clinical Obstetrics and Gynecology, 1999, 42， 922-938:Stoler, 2000, Mod. Pathol, 13, 275-284).
除了利用PAPNET體系自動(dòng)化形態(tài)檢測(cè)子宮頸涂片中的異常細(xì)胞 以外，Boon等(1995, Diagn. Cytopathol, 13, 423-428)也使用Ki67 抗體對(duì)增殖細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色.然而，這種單一分子標(biāo)記物的 使用無法進(jìn)行任何明確地區(qū)分良性增殖細(xì)胞和致癌細(xì)胞.但是，這些
作者不曽采用至少兩種分子標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)來鑒定異常細(xì)胞.
作者為Boon等的專利(US- 5544650〉描述了采用免疫化學(xué)標(biāo)記 物的染色如何有利子樣本中增殖(致癌性和非致癌性〉鈿胞的自動(dòng)化 檢測(cè)，并且如何在半自動(dòng)過程中，監(jiān)控病理學(xué)家/細(xì)胞學(xué)家進(jìn)而可以 判斷被染色細(xì)胞是否真的為致癌細(xì)胞.然而，其中沒有提及任何能夠
以自動(dòng)化方式檢測(cè)異?；蚍瘟黾?xì)胞的特異性抗體的聯(lián)合物.
專利US - 6005M6(其作者為McGlynn和Akkapeddi)提供了同時(shí) 檢測(cè)機(jī)體樣本中多種熒光標(biāo)記的標(biāo)記物的裝罝和方法的詳細(xì)描述，包 括出于鑒定癌細(xì)胞的目的裝置和方法，但并沒有涉及到癌癥診斷的具 體應(yīng)用中或提及適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物聯(lián)合物可以產(chǎn)生較高的特異性.
已知Ampersand Medical Systems Group (www, ampersandmedical. com) 正在開發(fā)一種新的用于宮頸涂片的篩選系統(tǒng)(InPath〉，除了公司內(nèi)部 所擁有的樣品標(biāo)本以外，還包括使用熒光進(jìn)行非特異生物標(biāo)記物的檢 測(cè).

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明描述了一種通過使用規(guī)定的標(biāo)記物聯(lián)合物可以用于測(cè)定 病變細(xì)胞、優(yōu)選癌細(xì)胞及其前體的自動(dòng)化方法.
根據(jù)本發(fā)明，這可以通過本專利權(quán)利要求書中所詳述的主題來獲得.
概述/目的實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明基于申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)是通過細(xì)胞或組織樣本中至少兩種特 異性分子標(biāo)記物(也就是基罔表達(dá)中與疾病有關(guān)的變化〉的同時(shí)檢測(cè) 可以提高對(duì)病變細(xì)胞、優(yōu)選癌及其前體的檢測(cè)的特異性；和一種更加 特異的檢測(cè)方法；和一種此后可以自動(dòng)化的方法；該方法是在檢測(cè)多 種標(biāo)記物并合并和確認(rèn)信號(hào)的基礎(chǔ)上得到的. 發(fā)明詳迷
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記物，其在單獨(dú)檢測(cè)時(shí)無法獲得有關(guān)識(shí)別病變 細(xì)胞或組織的足夠特異性，因?yàn)樗鼈円惨韵嗨苹蛳喈惖牧看嬖谟谀承?未病變的生物材料中.這是基于這些標(biāo)記物可以是參與健康細(xì)胞中生 理調(diào)節(jié)過程的蛋白質(zhì)的事實(shí).此外，由于抗體以非特異方式的交叉反 應(yīng)，分子標(biāo)記物的檢測(cè)可能不清晰，這表現(xiàn)在未含有分子標(biāo)記物的生 物材料的顆粒被染色.本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，通過同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞中或 生物材料的組成區(qū)域內(nèi)(例如組織切片的狹窄規(guī)定的區(qū)域內(nèi)〉至少兩 種標(biāo)記物，可以彌補(bǔ)羊一標(biāo)記物栓測(cè)的特異牲缺陷，從而在栓測(cè)異常 細(xì)胞或組織節(jié)片時(shí)確保較高水平的特異性.所以，當(dāng)診斷生物樣本時(shí) 通過聯(lián)合多種標(biāo)記物可以獲得比使用單一標(biāo)記物更高的信息價(jià)值.
標(biāo)記物聯(lián)合物包含屬于至少一種下列類型的基罔的改變表達(dá)的
顯色致癌基因、腫瘤抑制基因、細(xì)胞凋亡基因、增殖基因、修復(fù)基 罔和病毒基因；例如，通過分子標(biāo)記物her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdB-2、 bcl-2和EGF受體的聯(lián)合物所示.特別優(yōu)逸下列聯(lián)合物 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 he:r2/neu和bcl-2、 her2/neu 和pl6、 bcl-2和Ki67、 bcl-2和p53、 bcl-2和p16、 p16和p53、 p16和Ki67.
根據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用在疾病相關(guān)性細(xì)胞或組織節(jié) 片的早期診斷的方法中，所迷的方法包含以檢測(cè)癌及其前體為目標(biāo)檢 測(cè)上述分子標(biāo)記物的聯(lián)合物，而且另外如果必要以自動(dòng)方式檢測(cè)轉(zhuǎn)移 的起源.通過下面的方法可以達(dá)到腫瘤細(xì)胞的自動(dòng)化和特異性檢測(cè) 首先，細(xì)胞或機(jī)體樣本的限定區(qū)域內(nèi)必須存在這兩種信號(hào)，其次，兩 種標(biāo)記物所產(chǎn)生信號(hào)必須在各種情況中高于或低于各自的規(guī)定強(qiáng)度 或閾值.當(dāng)采用這兩種標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可以排除健康細(xì)胞，例如那些表達(dá)一 種標(biāo)記物高于設(shè)定閾的健康細(xì)胞，或表現(xiàn)兩種標(biāo)記物在各種情況中低 于所規(guī)定的信號(hào)強(qiáng)度的健康細(xì)胞.
術(shù)語"分子標(biāo)記物"包括細(xì)胞中的分子變化，特別是基因表達(dá)的變 化，已經(jīng)觀察到其與改變了的或病理性的細(xì)胞構(gòu)造有關(guān).檢測(cè)分子標(biāo) 記物的方法包含任何可以測(cè)定標(biāo)記物的數(shù)量或質(zhì)量的方法，優(yōu)選在蛋 白質(zhì)水平上測(cè)定的方法，
利用抗體或其他特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如抗cullins〉適合在蛋 白質(zhì)水平進(jìn)行檢測(cè)，其允許包括顯色和/或熒光檢測(cè)的后續(xù)細(xì)胞化學(xué) 或組織化學(xué)檢測(cè).
短語"至少兩種特異性分子標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)"包括使機(jī)體樣本 中至少兩種基因表達(dá)顯色的方法，特別是機(jī)體樣本的單一標(biāo)本中，由 此可以觀察到彼此有關(guān)的基因表達(dá).就此，不僅至少兩種信號(hào)的存 在，而且一種或多種附加信號(hào)的存在或不存在，其都是可能組合的信 息值.除了腫瘤特異性以外，這種進(jìn)一步的信息可以包含有關(guān)轉(zhuǎn)移的 起源的結(jié)論.因此，以相對(duì)空間鄰近檢測(cè)被測(cè)的標(biāo)記物非常重要，特 別是在一種細(xì)胞中或在樣本的狹窄規(guī)定區(qū)城內(nèi)，如組織切片的區(qū)城 內(nèi).
短語"合并和確認(rèn)信號(hào)"包括將至少兩項(xiàng)的信息連接，所述的信
息是在檢測(cè)機(jī)體樣本中的至少兩種標(biāo)記物的基礎(chǔ)上獲得.此外，通過 規(guī)定標(biāo)記物強(qiáng)度的閾值可以特異性地將健康細(xì)胞與患病細(xì)胞區(qū)分 開.
短語"細(xì)胞或組織樣本"包括由機(jī)體樣本分離的細(xì)胞，例如涂片、 唾液、器官穿剌液、活組織、分泌物、腦脊號(hào)液、膽汁、血液、淋巴
液、尿和糞便；或從器官取得的組織，例如乳腺、肺、腸、皮膚、子 宮頸、前列腺和胃.因此，組織樣本包含機(jī)能相關(guān)細(xì)胞或相鄰細(xì)胞的 區(qū)域.
短語"病變細(xì)胞"包括癌及其前體，優(yōu)選呼吸、生殖和胃碭道的 癌；和皮膚、乳腺和血管系統(tǒng)的腫瘤，而且特別是乳腺癌和子宮頸癌 及其前體，例如子宮頭上皮內(nèi)瘤形成(CIN I-III)和原發(fā)癌.
術(shù)語"自動(dòng)化檢測(cè)，，包括其中全部或只在組成步驟中代替人工的 手工操作的方法，并且特別是用于檢測(cè)過程的步槺中或相關(guān)后繼文件 或信息的處理中.這包括樣本制備、樣本染色、樣本讀取和信息處理 的步驤.因此，通過吸收測(cè)量、反射測(cè)量或熒光測(cè)量的方式可以實(shí)現(xiàn) 檢測(cè)，熒光測(cè)量方法包括所有方法如熒光顯徵鏡或FACS(流通式血細(xì) 胞計(jì)數(shù)器)分析.
術(shù)語"診斷專家系統(tǒng)，，包括將困象信息轉(zhuǎn)化為建議性診斷的計(jì)算 機(jī)軟件.基于軟件中存在的參數(shù)，或基于軟件可以存取的外部信息， 這種專家系統(tǒng)能夠?qū)⑷炕虿糠值目衫眯畔w納為建議性診斷.如 果需要其它參數(shù)來確立建議性診斷，軟件可以提出收集這些參數(shù)，或 通過鏈接到適當(dāng)分析設(shè)備上、利用反射性算法自動(dòng)地訪問這個(gè)系統(tǒng).
術(shù)語"擴(kuò)增系統(tǒng)"包括生物化學(xué)方法，其能夠增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度從而產(chǎn) 生更優(yōu)越的適合特異性檢測(cè)分子標(biāo)記物的信號(hào)/噪音比.這通常是利 用附加抗體和/或醃檢測(cè)反應(yīng)來獲得.
可以利用本發(fā)明特異性地檢測(cè)病變細(xì)胞，例如癌及其前體，并且 用于測(cè)定轉(zhuǎn)移的起源.本發(fā)明還涉及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，這種 試劑盒含有下列組成
(a) 檢測(cè)至少兩種分子標(biāo)記物的試劑，也就是標(biāo)記和/或未標(biāo)記的 抗her2/neu, p16、 pS3、 Ki67、 MN、 mda-2、 bcl-2和EGF受體的抗 體.
(b) 常規(guī)輔劑，例如緩沖刑、栽體、信號(hào)擴(kuò)增物質(zhì)、染色劑等. (C)制備和染色樣本以及檢測(cè)信號(hào)的自動(dòng)化方法. (d)作為對(duì)照反應(yīng)的細(xì)胞系的染色方案和試劑.
上述評(píng)價(jià)適于所述試劑盒的各個(gè)組分.所述試劑盒的單一組分或 多種組分還可以以改變了的形式使用，
本發(fā)明可以手動(dòng)或以部分或全部自動(dòng)化的方法來檢測(cè)病變細(xì) 胞，例如癌及其前體.由于按照本發(fā)明并由同時(shí)檢測(cè)至少兩種分子標(biāo) 記物獲得的結(jié)果未經(jīng)過任何主觀評(píng)估，而且相反地，卻有利于生物材 料中病理性變化的客觀的、自動(dòng)化檢測(cè)，所以形態(tài)學(xué)的發(fā)現(xiàn)可以用客 觀參數(shù)補(bǔ)充，也可以以"反射性試驗(yàn)"的形式.由于所述的方法可以 快速且以自動(dòng)化方式操作，所以其適合大規(guī)模的篩選方法，其在成本 和人力上均很經(jīng)濟(jì).除此以外，兩種以上標(biāo)記物的組合染色使診斷不 同的病理性變化并測(cè)定轉(zhuǎn)移的起源成為可能.
罔此，本發(fā)明給疾病的現(xiàn)代診斷帶來了重大貢獻(xiàn).具體實(shí)施方式
實(shí)施例
下文將通過舉例的方式提供實(shí)施上述發(fā)明的方案.這些實(shí)施例具
體化了精確條件，其在目前的情況中預(yù)先調(diào)整為使用Ventana自動(dòng)染 色儀NEXES的結(jié)果.但這不以任何方式改變不同參數(shù)可以改變的事 實(shí)，也就是可以與其它設(shè)備相匹配的事實(shí)，所述的參數(shù)例如是培養(yǎng)和 洗滌溫度、培養(yǎng)和洗滌時(shí)間以及抗體和其它試劑的濃度.此處所述的 擴(kuò)增系統(tǒng)同樣可以被忽略，或者可以增加新的，這取決于各自的抗體 或DNA探針.
使用特異性抗體并采用Ventana提供的Nexes自動(dòng)免疫染色儀同時(shí)檢 測(cè)活組織中兩種分子標(biāo)記物的試驗(yàn)的描述
首先從活組織制備4 - 5jiin厚的石蠟切片(Leica提供的RM2155 切片機(jī)〉，將其罔定并包埋在石蠟中，切片在37X:下干燥過夜.為了 避免切片在有關(guān)后續(xù)染色中漂浮，使用用硅坑涂層的顯微鏡栽玻片. 為了染色，將石蠟切片在二甲笨中脫蠟2 x 15分鐘并且隨后穿過一 組濃度降低的醇(100%， 90%, 70%,各種情況中2 x 5分鐘〉，以 便再次洗滌除去二甲笨.
用福爾馬林固定導(dǎo)致搭交聯(lián)鍵的形成，其掩蔽了抗原并由此使它 們無法被抗體利用.所以，需要進(jìn)一步預(yù)處理.抗原在lOmM檸檬酸
緩沖液，pH 6中在600W徵波中解蔽30分鐘.
經(jīng)微波預(yù)處理之后，在Nexes(Ventana Medical Systems)自動(dòng) 免疫染色儀中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色.由Ventana Medical Systems 分別或以試劑盒的形式得到出初級(jí)抗體和血清之外的所有試劑.培養(yǎng) 全部是在37C下進(jìn)行.該自動(dòng)染色儀在每次培養(yǎng)之后用下迷試劑自動(dòng)
洗條《
首先，內(nèi)源性過氣化物踩用試刑盒中所含的"抑制劑"滅活4分 鐘.任何可能的非特有結(jié)合位點(diǎn)隨后用1.596山羊血清(得自Vector) 封阻10分鐘.此后將切片用笫一單克隆抗體(her2/neu(克隆3B5〉， 得自O(shè)ncogene Scinece/BAYER, 2. 5ng/ml，存在于Ventana抗體稀 釋緩沖液中)培養(yǎng)30分鐘.
此后使用一種增強(qiáng)試劑盒來獲得更加強(qiáng)化的染色結(jié)果.這種試劑 盒由兔抗小鼠免疫球蛋白和小鼠抗兔免疫球蛋白組成，其中的兔抗小 鼠免疫球蛋白先與結(jié)合的初級(jí)抗體反應(yīng)，而且所迷的小鼠抗兔免疫球 蛋白依次與先前的兔抗小鼠免疫球蛋白結(jié)合.培養(yǎng)時(shí)間在各種情況中 為8分鐘.使用的下一步試劑是"多聯(lián)(MultiLink〉"抗體，其同樣 培養(yǎng)8分鐘，所述的"多聯(lián)"抗體能夠?qū)剐∈蠛屯貌⑶遗c生物素偶 聯(lián).這種抗體現(xiàn)在將結(jié)合全部三種先前培養(yǎng)的抗體并且大大提高了生 物素在初級(jí)抗體的反應(yīng)位點(diǎn)處的量.下一步采用的試劑是抗生蛋白鏈 菌素-HRP(辣根過氧化物酶)，其在8分鐘內(nèi)加入并且與生物素結(jié)合. DAB(二氨基聯(lián)苯胺)和作為該過氣化物酶底物的H202的加入進(jìn)行檢 測(cè)，同時(shí)這種底物被轉(zhuǎn)化為褐色沉淀.
與上迷方法準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)的第二種標(biāo)記物的檢測(cè)是從用1.5%山羊血 清封阻開始并且將第二種特異性初級(jí)抗體(p53，克隆DOl，得自 Oncogene Science/BAYER, 30叫/鵬1,存在于Ventana抗體稀幹緩沖 液中)培養(yǎng)30分鐘，結(jié)束時(shí)，用抗生蛋白鏈菌素-ALP(威性磷酸蘇) 偶聯(lián)物代替抗生蛋白鏈菌素-冊(cè)P偶聯(lián)物.培養(yǎng)后，內(nèi)源性威性磷酸 酶用左旋咪唑+ MgClz封阻.同時(shí)還加入ALP底物(堅(jiān)牢紅和萘酚〉. 此后，核用蘇木精對(duì)比染色2分鐘，進(jìn)而切片在"藍(lán)色試劑"中染色 2分鐘.果后，顯徵鏡我玻片用MoviolTM(Hoechest〉夜j1. 自動(dòng)檢測(cè)組織樣本中異常細(xì)胞的試驗(yàn)的描述，所述的細(xì)胞已通過同時(shí) 檢測(cè)兩種分子標(biāo)記物染色
其中至少兩種分子標(biāo)記物已經(jīng)按照上迷方法用抗體檢測(cè)的活組 織用一個(gè)熒光顯徵鏡分析，所述的熒光顯徵鏡帶有一 +可驅(qū)動(dòng)的交叉
栽物臺(tái)，栽物臺(tái)至多可栽8個(gè)顯微鏡栽玻片(Olympus AX70,帶有 肌lticontrol box 2000-3和"Modul Stage，，aimlySIS驅(qū)動(dòng)軟件)， 和Soft Imaging Systems GmbH(SIS)提供的analySIS3. 0軟件的升 級(jí)版，其作為"Grabbit Dual Pro"SIS軟件包包含附加模塊，特別是 FFT(-"快速付里葉變換")模塊、和MIA(-"多重困象校準(zhǔn)(Multiple Image Alignment)")模塊和C模塊.用高分辦黑白(MV2 Slo霄Scan Camera, 12位，得自SIS)和彩色(DXC- 950P 3CCD芯片，得自Sony) 照相機(jī)記錄田象.聯(lián)用后，這些系統(tǒng)適于16位Grauton困象分析并 且適于RGB中彩色困象分析和HSI彩色空間，最離可達(dá)24位困象深 度.
校準(zhǔn)可驅(qū)動(dòng)交叉栽物臺(tái)(analySIS Module Stage〉后，通過規(guī)定 "自動(dòng)"菜單(analysis模塊粒)中8個(gè)連續(xù)栽物臺(tái)路徑(stage path) 可以相對(duì)于"邏輯零點(diǎn)"記錄最多8個(gè)顯徵鏡栽玻片的全部位置.生物 樣本的總區(qū)域以綜合方式分解為獨(dú)立區(qū)域，所述的獨(dú)立區(qū)城大小為 158,7pm x 119.6pm,其對(duì)應(yīng)于用顯徵鏡部件放大的放大率為40倍 的相片的困象扇形區(qū).各生物樣本通過一個(gè)栽物臺(tái)路徑分析.各個(gè)栽 物臺(tái)路徑在水平方向上以曲折方式描繪出一系列的栽物臺(tái)路徑位 置，由此各個(gè)顯徵鏡玻片位置上的生物樣本的各個(gè)區(qū)城是以鄰接方式 而不是重疊方式、通過一個(gè)栽物臺(tái)珞徑位罝進(jìn)行記錄.規(guī)定相應(yīng)的行 數(shù)和列數(shù).在"自動(dòng)"菜單中輸入8個(gè)栽物臺(tái)路徑，使其能夠以自動(dòng)化 方式分析位于工作臺(tái)上的所有標(biāo)本，
各個(gè)栽物臺(tái)珞徑位置上的標(biāo)本染色在透射光中成象，并且困像信 息在"操作"菜單中"色彩匹配"下"與PGB比較" 這確保了后繼 的"測(cè)量"可以在"自動(dòng)"菜單中進(jìn)行.為了測(cè)量，通過"設(shè)定色彩 岡值"的方式規(guī)定"田像"茱單中最多8個(gè)不同混合色的閾值并用"象 素值/新"測(cè)定象素值.利用"測(cè)量"菜單中的"相分析"方式，借 助于色彩閾值測(cè)出各個(gè)栽物臺(tái)路徑位置的獨(dú)立相片，所迷的色彩閾值 業(yè)已被定義，而且特定混合色的區(qū)城作為面積定童顯示在Excel數(shù)振 文件中，當(dāng)同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)標(biāo)記物時(shí)，檢測(cè)反應(yīng)的顏色，即"褐色"(DAB) 和"紅色"(堅(jiān)牢紅)，以及其在樣本區(qū)域中的混合("紅-褐")特別令
人感興趣.因此，對(duì)于各個(gè)獨(dú)立栽物臺(tái)路徑(-樣本)可以得到一個(gè)
Excel表，而且各列表示特定混合色的面積.Excel表的行相應(yīng)于單 一樣本區(qū)域的獨(dú)立相片(-栽物臺(tái)路徑位置).
利用宏，將行(-栽物臺(tái)路徑位置〉中的各個(gè)值(-混合色的測(cè)量 面積)在各種情況中與規(guī)定的閾值對(duì)比，所迷的各列或混合色的閾值 已經(jīng)預(yù)先測(cè)定.隨后宏對(duì)獨(dú)立值進(jìn)行確認(rèn)，如果行中的一個(gè)以上的獨(dú) 立值大于各列中規(guī)定的混合色閾值，則該樣本被定性為患病.
可以保存相應(yīng)的困像位置，使它們能夠?yàn)楹罄m(xù)的視覺評(píng)估所利 用."自動(dòng)"茱單中的"協(xié)議列表實(shí)用程序"記錄卡可以用于自動(dòng)保 存田像和各栽物臺(tái)路徑位置的其它數(shù)據(jù).
盡管這些步碟可以手動(dòng)進(jìn)行，但它們也可以以自動(dòng)化方式、通過
"附加"菜單中"記錄宏"下創(chuàng)建的宏來進(jìn)行，并且隨后在"自動(dòng)"菜 單中檢索它們.最后，特定混合色的定量評(píng)估以面積值的形式(-生 物樣本的面積，其作為用分子標(biāo)記物染色的結(jié)果精確表現(xiàn)出規(guī)定的二
級(jí)色彩)獲得.以這種方式，通過定量分析確認(rèn)的混合色可以獲得生 物樣本的診斷性結(jié)論.
權(quán)利要求
1.用于鑒定癌細(xì)胞及其前體的自動(dòng)化體外方法的用途，其特征在于同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞或組織樣本中至少兩種標(biāo)記物，并且合并和匯總信號(hào)強(qiáng)度，并且至少一個(gè)分子標(biāo)記物選自her2/neu、p16、p53、Ki67、MN、mdm-2、bc1-2和EGF受體。
2. 按照權(quán)利要求1的用途，其特征在于標(biāo)記物的聯(lián)合物是 her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu 和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受體、bc卜2和Ki67、 bcl-2和MN、 bcl-2和njdm-2、 bcl-2和EGF受體、her2/neu和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受體、p16和p53、 p16和MN、 p16和邁dm-2、 p16和EGF受體、p16和Ki67、 p16和 her2/neu、 p16和bcl-2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受體、mdm-2和EGF 受體.
3. 按照權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述的自動(dòng)化信息處理與 一個(gè)診斷專家系統(tǒng)連接，該系統(tǒng)將困像信息歸納為建議性診斷.
4. 按照權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的用途，其特征在于通過分析 組織樣本的組成區(qū)域內(nèi)的顯色反應(yīng)或熒光信號(hào)定量檢測(cè)出所述的分子 標(biāo)記物，其中將二級(jí)色彩或各個(gè)色彩的空間接近在使用至少兩種標(biāo)記 物提供附加信息時(shí)與單一染色比較.
5. 按照權(quán)利要求l-4中任何一項(xiàng)的用途，其特征在于檢測(cè)乳腺、肺、子宮頸、結(jié)煬、皮膚和前列腺的腫瘤.
6. 按照權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的用途，其特征在于它包括反 射性試驗(yàn).
7. 用于鑒定癌細(xì)胞及其前體的自動(dòng)化體外方法，其特征在于同時(shí) 檢測(cè)細(xì)胞或組織樣本中至少兩種標(biāo)記物，并且合并和匯總信號(hào)強(qiáng)度， 并且至少一個(gè)分子標(biāo)記物選自her2/neu、 p16、 p53、 Ki67、 MN、 mdm-2、 bcl-2和EGF受體.
8. 按照權(quán)利要求7的自動(dòng)化體外方法，其特征在于標(biāo)記物的聯(lián)合 物是her2/neu和Ki67、 her2/neu和p53、 her2/neu和bcl-2、 her2/neu和MN、 her2/neu和mdm-2、 her2/neu和EGF受體、bcl-2 和Ki67、 bc卜2和MN、 bc卜2和mdm-2、 bc卜2和EGF受體、her2/neu 和bcl-2、 p53和bcl-2、 p53和MN、 p53和mdm-2、 p53和EGF受體、pl6和p53、 pl6和MN、 pl6和md邁-2、 p16和EGF受體、pl6和U67、 p16和her2/neu、 p16和bc卜2、 MN和mdm-2、 MN和EGF受體、幽-2 和EGF受體.
9. 按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述的自動(dòng)化信息處理與一個(gè)診斷專家系統(tǒng)連接，該系統(tǒng)將困像信息歸納為建議性診斷.
10. 按照權(quán)利要求7至9中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于通過分 析組織樣本的組成區(qū)域內(nèi)的顯色反應(yīng)或熒光信號(hào)定量檢測(cè)出所述的分 子標(biāo)記物，其中將二級(jí)色彩或各個(gè)色彩的空間接近在使用至少兩種標(biāo) 記物提供附加信息時(shí)與單一染色比較.
11. 按照權(quán)利要求7-10中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于檢測(cè)乳 腺、肺、子宮頭、結(jié)腸、皮趺和前列腺的腫瘤.
12. 按照權(quán)利要求7-11中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于它包括 反射性試驗(yàn)，
13. 用于實(shí)施權(quán)利要求7-12中任何一項(xiàng)的方法的試驗(yàn)試刑盒， 其中含有所有必要的試劑.
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)病變細(xì)胞的診斷的自動(dòng)化方法，所述的標(biāo)記物在與疾病相關(guān)的基因表達(dá)中顯示出變化，該方法通過應(yīng)用抗體和確認(rèn)信號(hào)強(qiáng)度的聯(lián)合同時(shí)使細(xì)胞或組織樣本的組成區(qū)域中的至少兩種不同分子標(biāo)記物染色。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101105496SQ20071014265
公開日2008年1月16日 申請(qǐng)日期2001年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月18日
發(fā)明者B·舍珀, G·亨尼格, K·波曼, R·維爾茨 申請(qǐng)人:拜爾公司