專利名稱：酶電極,酶電極生產方法,使用酶電極的傳感器和燃料電池的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶電極和生產酶電極的方法。
技術背景氧化還原(redox)酶當與底物反應時在底物和輔因子之間轉移電 子。因此，如果這些電子能夠被轉移到導電元件上，則能夠實現利用 酶特征的傳感器和燃料電池。在許多情況下，氧化還原酶的氧化還原中心位于具有三維結構的 蛋白質內部深處(氧化還原中心也被稱為活性位置或活性部位)。由 于這個原因，通常難以有效地4全測活性部位和導電元件之間的電子轉 移。為了克服這個困難，發(fā)展了一種方法，該方法將酶和導電元件通 過一種被稱為介質的物質電連接。該介質能夠進入構成酶的蛋白質內 部。因此，當介質位于活性部位附近時，在氧化還原反應過程中產生 的電荷能夠通過介質被轉移到導電元件上。換句話說，作為參與活性 部位電子轉移的介質擴散或介質之間電子跳躍的結果，通過導電元件 檢測酶反應產生的電荷。特開平8-271472號公報公開了一種利用共價鍵將起介質作用的二茂鐵導入酶的主體或側鏈中的技術。但是，通過特開平8-271472號公報公開的技術導入酶中的介質 的導入位置未受控制。因此，介質被導入酶內的隨機位置。當以這種方式導入介質時，除了 二茂鐵偶爾位于活性部位附近的 情況以外，預期電荷不會從活性部位有效轉移。特別是，當該公開的 技術應用于酶傳感器時，需要準確地感測底物的濃度，即，將要測量 的耙物質的濃度，并且需要進一步的改進。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及當介質被導入酶中時，控制介質導入位置位于活性部 位附近的技術。根據本發(fā)明的第一方面，酶電極包括酶、在其上面固定有該酶的 導電元件、與該導電元件電連接的金屬絡合物、和設置在該酶內的活 性部位處或該活性部位附近的受控位置處并且與該金屬絡合物配位結 合的氨基酸。根據本發(fā)明的第二方面， 一種酶電極生產方法包括以下步驟制 備在其上面固定有金屬絡合物的導電元件；通過基因工程操作重組編 碼酶的基因，從而將氨基酸設置在該酶內的活性部位處或該活性部位 附近的受控位置處；使該氨基酸和金屬絡合物互相配位結合。參照附圖，根據以下示例性實施方式的描述，本發(fā)明的其他特征 將是顯而易見的。


圖1是說明根據本發(fā)明第一實施方式的酶電極的圖。圖2是說明生產根據本發(fā)明第一實施方式的酶電極的步驟的流程圖。圖3是說明根據本發(fā)明第三實施方式的傳感器的示意圖。 圖4是說明根據本發(fā)明第四實施方式的燃料電池的示意圖。 圖5是說明根據本發(fā)明實施例1的酶電極的圖。 圖6是說明根據本發(fā)明實施例2的酶電極的圖。
具體實施方式
第一實施方式酶電極圖1是說明根據本發(fā)明第一實施方式的酶電極的概念圖。 參見圖1,該酶電極包括酶1000、酶1000固定在其上面的導電 元件1010、與導電元件1010電連接的金屬絡合物1020、酶內的活
性部位1030。附圖標記1040表示設置在酶內的活性部位1030處或 活性部位1030附近的氨基酸。附圖標記1005表示構成該酶并且被部 分修飾的蛋白質。在第一實施方式中，與作為介質的金屬絡合物結合的氨基酸預先 設置在酶內的活性部位處或該活性部位附近。氨基酸和金屬絡合物彼 此化學結合。因此，介質相對于活性部位的位置可以受到控制。1)氨基酸和酶首先描述設置在酶內的活性部位處或該活性部位附近的氨基酸。 氨基酸的上述設置如下實現，例如，通過基因工程方法在使用基 因重組細菌的酶表達系統(tǒng)中向該酶的重組基因中導入位點特異性變異。在此，術語"活性部位附近"意思是在氧化還原(redox)酶中， 一個原子與構成經歷氧化或還原的酶的底物、輔基或輔因子并且參與 氧4匕或還原的原子相3巨1. 6 nm、優(yōu)選1. 29 nm以內?；钚圆縙立的位置 通過X射線晶體分析或核磁共振譜分析來確定。例如，當酶是葡萄糖 氧化酶時，黃素腺噪呤二核苷酸作為活性部位。當酶是辣根過氧化物 酶時，血紅素作為活性部位。當酶是漆酶時，銅原子作為活性部位。術語"參與氧化或還原的原子，，意思是在位于活性部位處的原子中具 體參與氧化或還原的原子。例如，當活性部位是黃素腺噤呤二核苷酸時，位于黃素環(huán)1和10位的氮原子對應于相關原子。當活性部位是 煙酰胺腺噤呤二核苷酸時，位于煙酰胺4位的碳原子對應于相關原 子。當活性部位是吡咯并喹啉醌時，位于4和5位的氧原子是相關原 子。當活性部位是血紅素時，鐵原子對應于相關原子。1.6 nm、優(yōu)選 1.29 nm的距離基于以下兩份報告。 一份報告稱，如果距蛋白質活性 中心的距離超過1.6 mn,電子轉移速度將顯著降低(Qijin Chi，等 人，"Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 2005， Vol. 102， p. 16203 )。另一 份報告稱，1.29 nm的電子轉移距離是迄今為止測到的兩個氧化還原 中心之間生理距離的最長距離之一 (Arthur Oubrie，等人，"TheJournal of Biological Chemistry", 2002， Vol. 277, p. 3727 )。氨基酸的一個例子是組氨酸。后面詳細描述的實施例1代表了使用辣才艮過氧化物酶作為酶并且 組氨酸設置在作為辣根過氧化物酶活性部位的血紅素附近的情況。后面詳細描述的實施例2代表了使用葡萄糖氧化酶作為酶并且組 氨酸設置在作為葡萄糖氧化酶活性部位的黃素腺。票呤二核苦酸(FAD) 附近的情況。作為在第一實施方式中使用的酶，除了辣根過氧化物酶和葡萄糖 氧化酶以外，其他常用的氧化還原酶，包括膽紅素氧化酶、漆酶和硫 氧還蛋白還原酶，也是可以使用的。設置在酶內的活性部位處或該活性部位附近的氨基酸不限于具體 的某一個，只要它能夠通過配位鍵與金屬絡合物結合即可。例如，該 氨基酸可以是組氨酸或胱氨酸，或對于金屬中心具有配位結合能力的 非天然氨基酸。在第一實施方式中使用的術語"活性部位"意思是在酶內轉移電 荷的部位。例如，活性部位是氧化還原中心或接受來自氧化還原中心 的電荷的部位。氧化還原中心包括以下兩個概念。一種類型的氧化還原中心位于酶內，如葡萄糖氧化酶的FAD,另 一種類型基本上不位于酶內，例如葡萄糖脫氫酶的煙酰胺腺嘌呤二核 苦酸(畫+)。人工導入氨基酸的位置可以是氨基酸通過構成酶的蛋白質間接接 觸活性部位的位置，也可以是與活性部位相距預定距離的位置，只要 該氨基酸位于附近即可。必要時，也可以向酶內導入與另一個金屬絡 合物結合的另 一個氨基酸，該另 一個金屬絡合物作為繼電器，用于將 電荷從與設置在活性部位處或活性部位附近的氨基酸結合的金屬絡合 物轉移至電極。2)金屬絡合物
在第 一 實施方式中可以使用的金屬絡合物的實例如下。 金屬絡合物的金屬中心可以是，例如，鐵、鈷、釕、鋨或鉻。金 屬絡合物的配體可以是，例如雜環(huán)化合物，如二吡啶、三聯(lián)吡啶(terpyridine )或咪唑、環(huán)戊二烯基或其書t生物。金屬絡合物理想 地能夠在其本身與導電元件之間進行快速電荷轉移。為了滿足這一要 求，金屬絡合物可以含有(例如)71-共軛分子作為配體。金屬絡合物 的中心金屬可以是單個或多個。當中心金屬是多個時，金屬可以是相 同的也可以是不同的元素。當金屬絡合物含有多種元素時，重要的是 考慮不同金屬中心之間的電勢關系來排列元素，以使電子以所需的方 向轉移。此外，當金屬絡合物具有離去基團時，金屬絡合物可以與氨基酸 如組氨酸配位結合。離去基團的例子包括囟素、四氟化硼和六氟化磷。當金屬絡合物與導電元件結合時，可以通過改變金屬絡合物的分 子長度來控制酶和導電元件之間的距離。通過這種分子長度的控制， 以下兩個因素可以平衡。即，(a)通過降低分子量可以提高從酶的活 性部位到導電元件的電荷輸送速度，(b)通過提高分子長度可以保持 酶活性，^吏其不因與導電元件相互作用而降〗氐。可以通過改變配體的 分子設計的方法或提高多核絡合物階段數的方法實際改變分子長度。3)導電元件導電元件可以構建為，例如，諸如金或鉑的金屬電極、碳電極或 氧化銦錫電^1。金屬絡合物和導電元件需要相互電連接。例如，金屬絡合物和導 電元件可以通過置于它們之間的一些物質相互電連接，也可以直4妾電 連接而不需要插入任何物質。此外，它們在需要時也可以物理和/或 化學地結合。當酶被固定在導電元件上時，該酶保持與導電元件直接接觸，或 者可以通過金屬絡合物固定到導電元件上。作為一個替代方案，通過 使用具有反應性官能團的聚合物或橋連劑也可以實際實現酶的固定化。盡管在相關技術中僅可以在酶內的隨機位置處導入介質，^f旦是根 據上述第一實施方式可以基本上控制介質導入位置。 第二實施方式酶電極生產方法下面將參照圖2說明根據第二實施方式的酶電極生產方法。 首先制備包括固定在其上面的金屬絡合物的導電元件(S1)。 更具體地，例如，如下所述在步驟Sl中制備導電元件。首先，通過使用導電材料的方法或在例如玻璃或聚合物的絕緣材 料上形成導電層的方法制備導電元件。形成導電層的方法可以通過例 如氣相淀積、噴濺涂4隻或印刷來實現。然后，將金屬絡合物固定在導電元件上。金屬絡合物的固定可以通過以下兩種方法之一來實現即，(l)使金屬絡合物的溶液與導電 元件相接觸的方法，該金屬絡合物具有配體的官能團、能夠與導電元 件或固定在導電元件表面上的物質結合的基團，和(2)包括以下步驟 的方法使導電元件與具有能夠與導電元件或固定在導電元件表面上 的物質結合的官能團的配體溶液相接觸，從而固定該配體，然后使該 導電元件與含有具有離去基團的金屬絡合物的中心金屬的化合物溶液 相4妻觸。然后，通過基因工程操作重組編碼酶的基因，將氨基酸設置在酶 內的活性部位處或該活性部位附近的另一個受控位置處(S2)。更具體地，用編碼目標氨基酸的密碼子置換或插入到包含在編碼 酶的基因中并且位于活性部位附近的氨基酸。為了將組氨酸設置在受 控位置，例如，用編碼組氨酸的密碼子CAT或CAC置換或插入到編碼 位于酶內的活性部位附近的氨基酸的密碼子。通過以這種方式設置氨 基酸，同時人工控制置換或插入密碼子的位置，金屬絡合物可以最終 設置在活性部位附近。關于將氨基酸人工導入酶內、同時控制被導入的氨基酸的位置的 操作，第一實施方式中所述的技術主題同樣也使用在該第二實施方式中。
然后，氨基酸與金屬絡合物配位結合(S3)。更具體地，例如，通過使酶溶液與已經固定有具有離去基團的金 屬絡合物的導電元件相接觸，進行氨基酸的配位結合。 由此獲得酶電極。 第三實施方式傳感器下面參照圖3說明使用以上第一實施方式所述的酶電極構成的傳 感器。參見圖3，該傳感器包括酶電極2000和對電極2010,它們通過 導線2020與外部裝置2030連接。酶電極和對電極設置在電解質 2040中。需要時，也可以使用參比電極和/或用于保持電解質的機構。 通過測量外部裝置2030通過上述設置的酶電極獲得的電信號， 能夠檢測包含在電解質中的被檢物質的存在/不存在和濃度。從而實 現了使用酶電極的傳感器。電信號可以以電流、電荷量、電壓、電勢 或電阻的形式測量。此外，例如，電勢或電壓可以由外部裝置施加到 酶電極上。通過預先存儲電信號和特定底物的濃度之間的關系，例如, 存儲在數據庫中，可以將獲得的信號與存儲在數據庫中的信息進行比 較。第四實施方式燃料電池下面參照圖4說明4吏用以上第一實施方式所述的酶電極構成的燃 料電池。參見圖4,該燃料電池包括陽極3000和陰極3010。陽極和陰極 中的至少一個使用酶電極。陽極和陰極與負載3030通過導線3020連 接。陽極和陰極設置在電解質3040中。需要時，也可以使用保持電 解質的機構。當電解質中存在燃料時，在陽極和陰極之間產生電壓， 于是電流流向負載，從而實現工作。本文使用的術語"負載"的意思是，例如，用于供應藥物的泵或 用于傳送電信號的傳送器。
實施例現在參照實施例詳細說明本發(fā)明。請注意本發(fā)明的酶電極生產方 法不限于以下實施例。實施例1圖5是在實施例1中產生的酶電極的概念圖。參見圖5，玻璃基板5000和金電極5010構成導電元件。鈷絡合 物5020通過金/硫醇基結合被固定在該導電元件上。被導入到辣根過 氧化物酶5040分子中的組氨酸殘基5050與鈷絡合物5020末端的鈷 5030結合。組氨酸殘基5050被導入到作為辣根過氧化物酶5040活性 部位的血紅素5060的鄰近區(qū)5070中。因此，通過酶反應轉移到血紅 素的電子能夠通過鈷絡合物快速移動到導電元件上。在實施例1中，對于以下各項說明了酶電極的制備和作為過氧化 氫傳感器的應用的實例。1. 固定在電極上的金屬絡合物配體的合成2. 向特定位置導入組氨酸的辣根過氧化物酶的制備3. 酶電極的制備4. 過氧化氫的測定1.固定在電極上的金屬絡合物配體的合成現在描述一種合成下式(1)所示的絡合物配體的方法:(化學式1) 在向等摩爾的2-乙酰吡啶和4-甲基硫代苯甲醛的乙醇溶液中加 入體積為乙醇溶液一半的1.5 M氬氧化鈉水溶液進行反應后，通過過 濾、用水和甲醇清洗以及干燥等步驟獲得中間產物。在氮氣氛下，向^又丁醇鉀的四氫呋喃溶液中加入0.1 mL的2-乙 酰吡啶，在室溫下攪拌該混合物。向該混合物中加入0.16 g上述中 間產物并在室溫下進行反應后，加入過量的醋酸銨和乙醇，并將得到 的溶液進行回流。然后，將溶液減壓蒸發(fā)。用水洗滌得到的產物，再 次使用甲醇從氯仿中沉淀。這樣獲得式(l)所示的配體。2.向特定位置導入組氨酸的辣根過氧化物酶的制備現在說明通過將組氨酸(即氨基酸)導入活性部位附近的特定位 置并且使金屬絡合物與導入的組氨酸配位結合而產生的酶電極。按照普通方法從辣根幼苗中制備cDNA。使用制備的cDNA作為模板，并且使用以下給出的合成寡核苷酸 作為引物:5'-AATAATGGATCCCAACTTACCCCTACCTTCTACGACAATTCA-3' (BamHI) [SEQ ID NO: 1]和 5'-AATAATCTCGAGAGAGTTGGAGTTCACCACCCTACAATTCAA_3/ (Xhol) [SEQ ID NO: 2]，進行PCR擴增反應，獲得大約920個堿基對的擴增產物。通過分析擴增產物的DNA堿基序列，能夠證實PCR擴增產物[SEQ ID NO: 3]含有編碼具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的過氧化物酶 的基因(prxCla)。通過用限制酶BamHI和Xhol消化，酶切DNA擴增產物，將產生 的大約920個石成基對的DNA片l殳插入pGEX-6P-l (GE Healthcare Bio-Sciences Co.)中與上述限制酶相同的位點內。由此獲得GST-融 合過氧化物酶表達載體pGEX-prxCla。使用商售試劑盒向純化的pGEX-prxCla中引入位點特異性變異， 由此產生變異的過氧化物酶表達載體pGEX-mprxCla。向過氧化物酶基因中引入位點特異性變異通過以下步驟進行選 擇滿足以下所有條件的氨基酸，并將編碼這些氨基酸的每一個基因都 替換為編碼組氨酸的基因 (1) 在具有過氧化物酶活性的氨基酸序列中，氨基酸在物理上位 于血紅素附近，即電子被轉移的部位。(2) 氨基酸位于酶表面附近。(3) 將氨基酸置換為組氨酸不會降低酶的過氧化物酶活性。(4) 與設置在酶外的金屬絡合物的結合可以用構成被置換的組氨 酸側鏈的咪唑基來實現。滿足上述條件的一組氨基酸包括，例如，SEQ ID NO: 4所示的氨 基酸序列中的精氨酸31、絲氨酸73和谷氨酰胺176。以這種方式， 組氨酸可以設置在作為酶內活性部位的血紅素附近，距離大約0.95 rnn,同時控制設置組氨酸的位置。按照商售試劑盒所附的手冊所述，通過設計引物并置換堿基，用 組氨酸置換這些氨基酸。按照常規(guī)方法將變異的GST-融合過氧化物酶表達載體pGEX-mprxCla轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中。獲得的轉化子可以作為抗生素氨千青霉素的抗性株來選擇。獲得的轉化子在添加抗生素氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中預培養(yǎng)。 然后將一部分轉化子加入到LB-Amp培養(yǎng)基中，并在振搖下培養(yǎng)。在 加入IPTG同時繼續(xù)培養(yǎng)后，收集被轉化的細菌，并再次懸浮在PBS 中。然后，通過破碎細菌并對其進行離心而獲得粗酶提取物。使用谷胱甘肽Sepharose珠從粗酶提取物中純化GST-融合過氧化 物酶。更具體地說，通過預先在谷胱甘肽Sepharose上吸附BSA預處 理谷胱甘肽Sepharose,以抑制非特異性吸附，并在攪拌下將其加入 到粗酶提取物中，由此GST-融合過氧化物酶被吸附到谷胱甘肽 Sepharose上。在吸附后，經離心回收谷胱甘肽S印harose，并用PBS清洗。然 后在攪拌下加入谷胱甘肽，洗脫吸附的融合蛋白。在離心回收上清液 后，通過用PBS進行透析純化GST-融合過氧化物酶。純化的GST-融 合過氧化物酶用GST-融合蛋白酶消化，以在GST位點處切開。然后， Y吏酶切的GST-融合過IU匕物酶通過谷胱甘肽Sepharose,以除去 GST-融合過氧化物酶和GST。進一步，通過在使用PBS平衡的 Sephadex G200柱上進行流通分級分離，獲得最終純化的變異過氧化 物酶產物，其含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。過氧化物酶活性可以如下測定。例如，使用2， 2'-連氮-雙-[3-乙 基苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽(ABTS)作為顯色底物。然后，通過測定 420 nm處的吸光度改變來測定過氧化物酶活性。3.酶電極的制備將商售載玻片在丙酮中通過超聲處理清洗，并在氮氣流中干燥。 將鈦/金以20/200 nm的厚度蒸汽沉積在載玻片上，從而制備導電基 板。在切割該基板后，將切割后的基板浸泡在過氧化氬溶液/濃硫酸 的3/7-溶液中20分鐘，然后用水洗滌，并在氮氣流中干燥。(a) 將基板浸泡在式(l)所示的配體的氯仿溶液中。之后用氯仿 清洗基板，并在氮氣流中干燥。(b) 然后，將基板浸泡在氯化鈷(II)水溶液中。之后用水洗滌基板，并在氮氣流中千燥。(c) 然后，將基板浸泡在4'，4""-(1,4-亞苯基)二(2,2':6'，2〃-三聯(lián)吡。定)的氯仿溶液中。之后用氯仿清洗基4反，并在 氮氣流中干燥。按照(b) - (c) - (b) - (c) - (b)的順序重復步驟(b)和(c),獲得固定 在導電基板上的金屬絡合物。制備如上所述向其中導入組氨酸的辣根過氧化物酶的緩沖液，將 包含固定化金屬絡合物的導電基板浸泡在該緩沖液中，由此將酶固定 在該金屬絡合物上。固定化酶的量可以(例如)通過石英晶體微量天 平法來測量。之后通過清洗導電基板并除去未與金屬絡合物配位結合 的酶來制備酶電極。這樣，設置在酶內活性部位附近的組氨酸和作為金屬絡合物的金 屬中心的鈷原子彼此配位結合。結果，起介質作用的金屬絡合物可以 被設置，同時其相對于活性部位的位置受到控制。 4.過氧化氫濃度的測定
構建3電極電池，使制備的酶電極為工作電極，柏絲為對電極， 銀/氯化銀電極為參比電極。該3電極電池與穩(wěn)壓器相連接，0.1 M磷 酸緩沖液作為電解液。在測定之前，使用已知濃度的過氧化氳緩沖 液，對工作電極施加相對于Ag/AgCl為500 mV的電勢，觀察穩(wěn)定電 流(酶電流)，制作校準曲線。然后，向電解液中加入含有未知濃度的 過氧化氫的物質并施加相同的電勢，觀察穩(wěn)定電流，以測定加入的物 質的濃度。實施例2圖6是實施例2中產生的酶電極的概念圖。參見圖6,硅基板6000和金電極6010構成導電元件。鈷絡合物 6020通過金/硫醇基結合被固定在該導電元件上。被導入到葡萄糖氧 化酶6040分子中的組氨酸殘基6050與鈷絡合物6020末端的鈷6030 結合。向葡萄糖氧化酶中導入將要與金屬絡合物結合的另一個組氨 酸。附圖標記6060代表與鈷絡合物結合的另一個組氨酸。與鈷絡合 物結合的組氨酸6060被導入到作為葡萄糖氧化酶活性部位的FAD 6070的鄰近區(qū)6080中。因此，通過酶反應轉移到FAD的電子可以通 過鈷絡合物快速移動到導電元件上。在實施例2中，對于以下各項說明了酶電極的制備和作為葡萄糖傳感器和生物燃料電池的應用的實例。1. 用于固定酶的金屬絡合物(即構成606Q的鈷絡合物)的合成2. 向特定位置導入組氨酸的葡萄糖氧化酶的制備3. 酶電極的制備4. 葡萄糖濃度的測定5. 生物燃料電池的工作1.用于固定酶的金屬絡合物的合成 現在描述一種合成下式(2)所示絡合物的方法 (化學式2) <formula>formula see original document page 16</formula>通過在氮氣氛下進行回流，等摩爾的2，2。6'，2〃-三聯(lián)吡咬和氯 化鈷(II)在乙二醇溶劑中彼此反應。在空氣冷卻反應溶液后，在強烈 攪拌下將冷卻的溶液滴加到500 mL 二乙醚中。用水和二乙醚洗滌獲 得的沉淀物，并干燥。從而獲得式(2)所示的絡合物。2.向特定位置導入組氨酸的葡萄糖氧化酶的制備 將Penicillium amagasakiense (ATCC 28686)接種到含有馬鈴 薯和葡萄糖的瓊脂平板上，在25°C下培養(yǎng)，從而獲得培養(yǎng)的細胞。 在將獲得的培養(yǎng)的細胞重懸浮在磷酸緩沖液中后，經離心回收細胞并 清洗。按照常規(guī)方法從這些培養(yǎng)的細胞中制備cDNA。使用制備的 cDNA作為模板，使用以下列出的合成寡核苷酸作為引物5'-AATAATCATATGGCCTACCTGCCTGCCCAACAGATTGATGTCCAG -3' (Ndel) [SEQ ID NO: 5] 和 5'-AATAATCGGCCGCTAGGCACTTTTGGCATAGTCATCCAAAAT -V (Eagl) [SEQ ID NO: 6],進行PCR擴增反應，獲得大約1,700個堿基對的擴增產 物。通過分析擴增產物的DNA堿基序列，能夠證實該PCR擴增產物 [序列號7]含有編碼具有SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的葡萄糖氧 化酶的基因。通過用限制酶Ndel和Eagl消化，酶切該DM擴增產物，將產生 的大約1，700個石威基對的DNA片段插入pET-21a(+) (Novagen Co.) 中與上述限制酶相同的位點內。由此獲得葡萄糖氧化酶表達載體 pET21-G0X。使用商售試劑盒向純化的pET21-G0X中引入位點特異性變異，由 此產生變異的葡萄糖氧化酶表達載體pET-mG0X。
向葡萄糖氧化酶基因中引入位點特異性變異如下進行。選擇滿足以下條件1-3或2-4的氨基酸，并將編碼這些氨基酸的 基因都置換為編碼組氨酸的基因。如果能夠獲得，也可以選擇本身滿 足所有條件1-4的氨基酸。(1) 在具有葡萄糖氧化酶活性的氨基酸序列中，氨基酸在物理上 位于黃素腺嘌呤二核苷酸附近，即電子被轉移的部位。(2) 用組氨酸置換氨基酸不會降低葡萄糖氧化酶活性。(3) 氨基酸可以通過構成被置換的組氨酸側鏈的咪唑基與金屬原 子形成絡合物。(4) 在位于酶表面附近的氨基酸中，有關氨基酸當被組氨酸置換 時，可以用于與設置在酶外的金屬絡合物結合。滿足上迷條件的 一 組氨基酸的實例如下。這組的一個實例包括SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列中的蘇氨酸 108-天冬氨酸231-絲氨酸61-谷氨酰胺6。另一個實例包括甘氨酸 112-天冬酰胺221-絲氨酸177-丙氨酸150。再另一個實例包括天冬 酰胺111-天冬氨酸231-絲氨酸61-谷氨酰胺6。在該實施例2中，說明了蘇氨酸108-天冬氨酸231-絲氨酸61-谷氨酰胺6這4個氨基酸被置換的情況。按照商售試劑盒所附的手冊，通過設計引物并置換堿基，將這些氨基酸置換為組氨酸。按照常規(guī)方法將變異的葡萄糖氧化酶表達載體pET-mG0X轉化到 大腸桿菌BL21 (DE3)中。獲得的轉化子可以作為抗生素氨芐青霉素的 抗性抹來選擇。將獲得的轉化子在添加抗生素氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中預培養(yǎng) 過夜。然后將一部分轉化子加入到LB-Amp培養(yǎng)基中，在振搖下培 養(yǎng)。在加入IPTG同時繼續(xù)培養(yǎng)。收集IPTG誘導轉化的細菌，并再次 懸浮在PBS中。通過凍融和超聲處理石皮碎細菌，并對其進4亍離心，,人而獲得含有包涵體的固體外源物質。該含有包涵體的固體外源物質用 含有NaCl和EDTA的Tris-HC1緩沖液(pH 8. O)清洗兩次，并用含有Triton X-100的Tris-HC1緩沖液(pH 8. O)進一步清洗。然后通過用 尿素溶液清洗除去雜質蛋白質，由此純化包涵體。將純化的包涵體懸浮在含有二硫蘇糖醇的8 M尿素溶液中，置于 冰浴中進行增溶。將增溶的蛋白質置于透析管中，對于含有谷胱甘肽、甘油和FAD 的Tris-HCl緩沖液(pH 8. O)透析，以進行重折疊。重折疊的蛋白質溶液經離心除去凝集的蛋白質。上清液中含有的 蛋白質過用醋酸鈉緩沖液(pH 6. O)平衡的凝膠過濾柱，以進行分級分 離。通過選擇性取出葡萄糖氧化酶活性級分，獲得含有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的變異葡萄糖氧化酶的純化產物。葡萄糖氧化酶的活性可以通過(例如)在25。C和酶飽和條件下 測定葡萄糖在醋酸鈉緩沖液中氧化產生的過氧化氬的量來確定。作為 另一種方法，可以使用例如2， 2'-連氮-雙-[3-乙基苯并"塞唑啉-6-磺 酸]二銨鹽(ABTS)作為顯色底物，并測量420 nm處的吸光度改變，來 測定葡萄糖氧化酶的活性。3.酶電極的制備將鈦/金以20/200 nm的厚度蒸汽沉積在珪基板上，由此制備導 電基板。在切割該基板后，將切割后的基板浸泡在過氧化氫溶液/濃 硫酸的3/7-溶液中20分鐘，然后用水洗滌，并在氮氣流中干燥。(a) 將基板浸泡在式(l)所示的配體的氯仿溶液中。之后用氯仿 清洗基板，并在氮氣流中干燥。(b) 然后，將基板浸泡在氯化鈷(II)水溶液中。之后用水洗滌基 板，并在氮氣流中干燥。(c) 然后，將基板浸泡在4、4〃〃-(1，4-亞苯基)二 (2，2。6'，2〃-三聯(lián)吡咬)的氯仿溶液中。之后用氯仿清洗基板，并在 氮氣流中干燥。按照(b) - (c) - (b)的順序重復步驟(b)和(c),獲得固定在導電基 板上的金屬絡合物。制備如上所述向其中導入組氨酸的葡萄糖氧化酶的緩沖液，將包 含固定化金屬絡合物的導電基板浸泡在該緩沖液中，由此將酶固定在 金屬絡合物上。固定化酶的量可以(例如)通過石英晶體微量天平法 來測量。之后通過用緩沖液清洗導電基板除去未與金屬絡合物配位結合的酶。然后將導電基板浸泡在化合物(2)的0.1 M磷酸緩沖液中制 備酶電極。這樣，設置在酶內活性部位附近的組氨酸和作為金屬絡合物的金 屬中心的鈷原子彼此配位結合。結果，起介質作用的金屬絡合物可以 被設置，同時其相對于活性部位的位置受到控制。4. 葡萄糖濃度的測定構建3電極電池，使制備的酶電極為工作電極，鉑絲為對電極， 銀/氯化銀電極為參比電極。該3電極電池與穩(wěn)壓器相連接，0.1 M磷 酸緩沖液作為電解液。必要時，通過用惰性氣體鼓泡除去溶液中的 氧。在測定之前，使用已知濃度的葡萄糖緩沖液，對工作電極施加相 對于Ag/AgCl為500 mV的電勢，觀察穩(wěn)定電流(酶電流)，并制作校 準曲線。然后，向電解液中加入含有未知濃度的葡萄糖的物質并施加 相同的電勢，觀察穩(wěn)定電流，以測定加入的物質的濃度。5. 生物燃料電池的工作使用制備的酶電極作為陽極并且使用鉑絲作為陰極來構成生物燃 料電池。負載，例如液晶顯示裝置，與從陽極和陰極引出的導線連 接。當作為燃料的葡萄糖和含有酶的電解液充滿陽極和陰極之間時，產生電動勢，液晶顯示裝置工作。 實施例的優(yōu)點在上述實施例的酶電極中，通過分子生物學技術向作為辣根過氧 化物酶活性部位的血紅素附近的位置或作為葡萄糖氧化酶活性部位的 FAD附近的位置引入了能夠與金屬絡合物配位結合的組氨酸。通過在 分子內以離去基團形式含氯的鈷絡合物與引入的組氨酸結合，作為介 質的鈷絡合物被固定在活性部位附近。因此，與采用向酶分子內隨機導入介質的酶的已知酶電極相比，
電子可以更快地從酶的活性部位移動到介質分子上。因此，在從酶活性中心傳送電子是酶反應的限速步驟的系統(tǒng)中， 實施例的酶電極可以克服限速步驟。結果，可以獲得比已知系統(tǒng)顯示 更大轉換數、更高電流值、更大積累電荷量的酶電極。這些特征在實 踐中可以如下應用。1. 在從酶活性中心傳送電子是酶反應的限速步驟的系統(tǒng)中，即 在底物濃度高且底物擴散過程難以達到限速步驟的系統(tǒng)中，實施例的 酶電極可以提供較大的電流。當利用這種特征將酶電極應用到例如傳 感器上時，可以提供具有較高的濃度測定范圍限度的傳感器。另外， 當應用于燃料電池時，也可能提供具有較高的電流密度和按比例改善 的功率密度的燃料電池。2. 使用實施例的酶電極，從酶活性中心轉移電子的速度可以提 高，并且每個酶分子的電流值可以提高。換句話說，使用較少量的酶 可以達到所需的電流值。因此，酶的用量可以減少，并且生產該酶電 極所需的資源和費用可以削減。3. 如上所述，使用實施例的酶電極，可以提高從酶活性中心轉 移電子的速度，并且可以提高每個酶分子的電流值。換句話說，可以 使用較少量的酶達到需要的電流值。因此，在固定有酶的電極中，如 果該電極具有與已知電極相同的固定化酶密度，則電極面積可以減 小，而同時保持輸出電流值和電荷量不變。利用電極面積減小這個優(yōu) 點，可以減少背景電流，并且可以提高信/噪比。裝置大小也可以縮 小。因此，可以獲得具有較低噪音的傳感器、小型化傳感器和燃料電 池。盡管已經參照示例性的實施方式描述了本發(fā)明，但是應當理解， 本發(fā)明不限于所公開的示例性的實施方式。以下權利要求書的范圍具 有最廣的解釋，包括所有改變、等同結構和功能。本申請要求2006年8月23日提交的日本申請2006 - 226699的 權利，在此將其整體引入作為參考。
序列表<110>佳能株式會社 久保亙 野本毅<120>酶電極、酶電極生產方法、使用酶電極的傳感器和燃料電池 <130>申請文檔號 <160> 10<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 42<212> DNA <213>人工序列<220><223> PCR引物 <400> 1aataatggat cccaacttac ccctaccttc tacgacaatt ca 42<210> 2<211> 42<212> DNA <213>人工序列<220><223> PCR引物<400> 2aataatctcg agagagttgg agttcaccac cctacaattc aa 42<210> 3<211> 948<212> DNA <213>人工序列<220>
<223> PCR產物 <400> 3aataatggat cccaacttac ccctaccttc tacgacaatt catgtcctaa tgtctctaac 60 atcgtacggg atactattgt caatgagcta agatcagacc ctcgtattgc cgcgagcatc 120 cttcgtcttc acttccacga ctgctttgtt aatggttgtg acgcatcgat cttgttagac 180 aacacaacat catttcgaac agagaaagat gcgtttggaa acgcaaactc ggcaagagga 240 tttccagtga ttgatagaat gaaagccgcg gtggagagtg catgcccaag aaccgtttca 300 tgcgcagatt tgctcaccat tgcagctcaa caatctgtca ctttggcggg aggtccttct 360 tggagagttc ctttgggcag aagagatagc ttacaagcat ttctggatct tgctaatgca 420 aatcttccag ctccattctt cacacttcca caacttaaag acagctttag aaatgttggc 480 ctcaaccgtt cttctgatct cgttgcactg tccgggggcc acacatttgg taaaaatcag 540 tgtcggttta ttatggacag attatacaac ttcagcaaca ccggtttacc cgatcctact 600 ctcaacacta cttatctcca aactcttcgt ggactatgtc ccctcaatgg taatctaagc 660 gctttggtgg attttgatct acgtacgcca acgatttttg acaacaaata ctatgtgaat 720 ctcgaagagg aaaaaggact tatccaaagc gaccaagagt tgttctctag ccccaatgcc 780 actgacacaa tccctttggt gagatcattt gctaatagca cacaaacatt cttcaatgca 840 tttgtggagg cgatggatag gatgggaaac attacacctc ttacaggaac tcaaggacag 900 atcaggttga attgtagggt ggtgaactcc aactctctcg agattatt 948<210> 4<211> 308<212> PRT <213>辣根<220><221>辣根過氧化物酶
<222> (1)..(308) <400> 4Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 15 10 15lie Val Arg Asp Thr lie Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg lie20 25 30Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val lie 65 70 75Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser85 90 95Cys Ala Asp Leu Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110Gly Gly Pro Ser Tip Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser 145 150 15580160Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gin165 170 175Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220Thr Pro Thr lie Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Glu225 230 235 240Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala245 250 255Thr Asp Thr lie Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gin Thr260 265 270Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn lie Thr 275 280 285Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300Asn Ser Asn Ser 305<210> 5<211> 308<212> PRT <213>辣根<220><221>辣根過氧化物酶突變體 <222> (1)..(308)<400> 5Gin Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 15 10 15lie Val Arg Asp Thr lie Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro His He20 25 30Ala Ala Ser lie Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45Cys Asp Ala Ser lie Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn His Ala Arg Gly Phe Pro Val lie 65 70 75Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser85 90 95Cys Ala Asp Leu Leu Thr lie Ala Ala Gin Gin Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110Gly Gly Pro Ser Tip Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gin 115 120 125Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 14080 Leu Pro Gin Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser145 150 155 160Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn His165 170 175Cys Arg Phe lie Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gin Thr Leu Arg Gy Leu 195 200 205Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220Thr Pro Thr lie Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Glu225 230 235 240Lys Gly Leu lie Gin Ser Asp Gin Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala245 250 255Thr Asp Thr He Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gin Thr260 265 270Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn He Thr 275 280 285Pro Leu Thr Gly Thr Gin Gly Gin lie Arg Leu Asn Cys Arg Val Val' 290 295 300Asn Ser Asn Ser 305 <210> 6<211> 45<212> DNA <213>人工序列<220><223> PCR引物 <400> 6aataatcata tggcctacct gcctgcccaa cagattgatg tccag 45<210> 7<211> 42<212> DNA <213>人工序列<220><223> PCR引物 <400> 7aataatcggc cgctaggcac ttttggcata gtcatccaaa at 42<210> 8<211> 1791<212> DNA <213>人工序列<220><223> PCR產物 <400> 8aataatcata tggcctacct gcctgcccaa cagattgatg tccagtctag tcttctcagt 60gaccctagca aggttgcagg aaagacctat gattacatca ttgctggtgg tggtttgact 120ggccttactg ttgctgccaa attgacagaa aaccccaaga tcaaagtcct ggtcattgaa 180aagggcttct atgagtccaa cgatggagcc atcatcgagg atccaaatgc ttatggacaa 240atctttggca ccactgttga ccagaactac ctcaccgttc ccctgatcaa caaccgcacg 300aacaatatca aggccggtaa aggtcttgga ggatcaacct tgataaacgg tgactcctgg 360 制備1S- (loc， 3a， 4&n-2-氨基-l， 9-二氫-9-4-羥基 -3-(羥曱基)-2-亞甲基環(huán)戊基l-6H-噪呤-6-酮(21)的方逸(-)-(loc， 2&， 3oc) -2-(苯基甲氣基)甲基l-4-環(huán) 戊烯-1， 3-二醇單乙酸酯(13)的制備(不將酶固定)利用得自洋蔥假單胞菌的固定化脂酶PS - 30進行二醇1的對映選 擇性乙?；７磻旌衔锖懈?叔丁基曱基醚(10/1體積比，l升)、 二醇1 (5g)、固定化脂酶PS-30 (25g)、和乙酸異丙烯基酯(2當 量)作為?；瘎７磻?3TC進^f亍。反應的進程用高壓液相色譜法監(jiān) 測。當余下的底物1的濃度降至0.1mg/mL以下時終止反應。4小時后 對于(-)-單乙酸酯13的反應產率為80%, ee為980/。。IR- (loc, 4a， 50 ) l碳酸，甲基4-(乙酰氧基)-5-(苯 基甲氧基)甲基l-2-環(huán)戊烯-l-基酯(10)的制備在裝有磁攪拌器和氮氣出入口的圓底燒瓶中將化合物13 (2.62g， lOmmol)、吡咬(1.18g， 12mmo1)和CH2C12 (5mL)混合。將混合 物冷卻至-5TC，以保持反應溫度不超過OTC的加料速度向反應懸浮液 中加入氯曱酸曱酯(1.134g， 12mmo1)。將反應混合物在OTC攪拌1小 時，溫熱至室溫l小時。形成的混合物在O"C用氯化銨飽和溶液猝滅反 應，然后用1:2的乙酸乙酯/己烷萃取(30mLx2).合并的有機層用 鹽水(30mL)洗，干燥(Na2S04)，減壓濃縮，在高真空下干燥，得 到粗制的化合物14 (3.32g， 100%),為淺棕色油。它在用于下一步驟 前不作進一步純化?！篒R- (lcx， 4oc， 50 ) 1-『硝基4-(乙酰氣基)-5-(笨基 甲氣基)曱基l-2-環(huán)戊烯-l-基l甲基l磺酰l苯(15)的制備在裝有磁攪拌器的圓底燒瓶中將苯磺酰硝基甲烷(2.41g， 12mmo1)溶于無水THF (25mL)中。在OTC下于5分鐘內加入氫化鈉 (0.46g， 60%礦物油分散體，12mmo1).溫熱至室溫后，在室溫下攪 拌1小時，于約IO分鐘內加入粗制的化合物14(3.3g, 10mmol在5mL THF中)。將反應混合物在室溫下攪拌30分，50TC下攪拌1小時.向 反應混合物中加入飽和氯化鈉溶液(30mL)并用乙酸乙酯(2x40mL) 萃取，進行后處理。合并的有機相用鹽水(30mL)洗，千燥(Na2S04)， 減壓濃縮，得到化合物15，為粗制的棕色油(5.12g， >100%)，它在cctccgactc aggtgtcttc ccatgtcatg accattttct acggaatggc tttgaaggtt1740 gctgatgcca ttttggatga ctatgccaaa a魄cctagc ggccgattat t 1791<210> 9<211> 587<212> PRT<213> Penicillium amagasakience<220><221>葡萄糖氧化酶 <222> (1)..(587)<400> 9Tyr Leu Pro Ala Gin Gin lie Asp Val Gin Ser Ser Leu Leu Ser Asp 15 10 15Pro Ser Lys Val Ala Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr lie lie Ala Gly Gly20 25 30Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Thr Glu Asn Pro Lys 35 40 45lie Lys Val Leu Val He Glu Lys Gly Phe Tyr Glu Ser Asn Asp Gly 50 55 60Ala lie lie Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Gin lie Phe Gly Thr Thr65 70 75 80Val Asp Gin Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu lie Asn Asn Arg Thr Asn85 90 95Asn lie Lys Ala Gly Lys Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu lie Asn Gly 100 105 110 Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gin He Asp Ser Trp Glu Lys 115 120 125Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Met Phe Glu Tyr Met 130 135 140Lys Lys Ala Glu Ala Ala Arg Thr Pro Thr Ala Ala Gin Leu Ala Ala145 150 155 160Gly His Ser Phe Asn Ala Thr Cys His Gly Thr Asn Gly Thr Val Gin165 170 175Ser Gly Ala Arg Asp Asn Gly Gin Pro Trp Ser Pro lie Met Lys Ala 180 185 190Leu Met Asn Thr Val Ser Ala Leu Gly Val Pro Val Gin Gin Asp Phe 195 200 205Leu Cys Gly His Pro Arg Gly Val Ser Met He Met Asn Asn Leu Asp 210 215 220Glu Asn Gin Val Arg Val Asp Ala Ala Arg Ala Trp Leu Leu Pra Asn225 230 235 240.Tyr Gin Arg Ser Asn Leu Glu lie Leu Thr Gly Gin Met Val Gly Lys245 250 255Val Leu Phe Lys Gin Thr Ala Ser Gly Pro Gin Ala Val Gly Val Asn 260 265 270Phe Gly Thr Asn Lys Ala Val Asn Phe Asp Val Phe Ala Lys His Glu 275 280 285 Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Ala lie Ser Pro Leu lie Leu Glu Tyr 290 295 300Ser Gly lie Gly Leu Lys Ser Val Leu Asp Gin Ala Asn Val Thr Gin305 310 315 320Leu Leu Asp Leu Pro Val Gly lie Asn Met Gin Asp Gin Thr Thr Thr325 330 335Thr Val Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ala Gly Ala Gly Gin Gly Gin Ala340 345 350Val Phe Phe Ala Asn Phe Thr Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Pro Gin 355 360 365Ala Arg Asp Leu Leu Asn Thr Lys Leu Asp Gin Tip Ala Glu Glu Thr :370 375 380Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Val Gin Tyr385 390 395 400Glu Asn Tyr Arg Asn Tip Leu Leu Asp Glu Asp Val Ala Phe Ala Glu405 415Leu Phe Met Asp Thr Glu Gly Lys lie Asn Phe Asp Leu Tip Asp Leu 420 425 430lie Pro Phe Thr Arg Gly Ser Val His lie Leu Ser Ser Asp Pro Tyr 435 440 445Leu Tip Gin Phe Ala Asn Asp Pro Lys Phe Phe Leu Asn Glu Phe Asp 450 455 460Leu Leu Gly Gin Ala Ala Ala Ser Lys Leu Ala Arg Asp Leu Thr Ser465 470 475 480Gin Gly Ala Met Lys Glu Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Leu Pro Gly Tyr485 490 495Asn Leu Val Gin Asn Ala Thr Leu Ser Gin Tip Ser Asp Tyr Val Leu 500 505 510Gin Asn Phe Arg Pro Asn Tip His Ala Val Ser Ser Cys Ser Met Met 515 520 525Ser Arg Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ala Thr Ala Lys Val Tyr Gly 530 535 540Thr Gin Gly Leu Arg Val He Asp Gly Ser lie Pro Pro Thr Gin Val545 550 555 560Ser Ser His Val Met Thr lie Phe Tyr Gly Met Ala Leu Lys Val Ala565 570 575Asp Ala lie Leu Asp Asp Tyr Ala Lys Ser Ala 580 585<210> 10<211> 587<212> PRT<213> Penicillium amagasakience<220><221>葡萄糖氧化酶突變體 <222> (1)..(587)<400> 10Tyr Leu Pro Ala Gin His lie Asp Val Gin Ser Ser Leu Leu Ser Asp 15 10 15Pro Ser Lys Val Ala Gly Lys Thr Tyr Asp Tyr He lie Ala Gly Gly20 25 30Gly Leu Thr Gly Leu Thr Val Ala Ala Lys Leu Thr Glu Asn Pro Lys 35 40 45He Lys Val Leu Val lie Glu Lys Gly Phe Tyr Glu His Asn Asp Gly 50 55 60Ala lie lie Glu Asp Pro Asn Ala Tyr Gly Gin lie Phe Gly Thr Thr65 70 75 80Val Asp Gin Asn Tyr Leu Thr Val Pro Leu lie Asn Asn Arg Thr Asn85 90 95Asn lie Lys Ala Gly Lys Gly Leu Gly Gly Ser His Leu lie Asn Gly 100 105 110Asp Ser Trp Thr Arg Pro Asp Lys Val Gin lie Asp Ser Trp Glu Lys 115 120 125Val Phe Gly Met Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Met Phe Glu Tyr Met 130 135 140Lys Lys Ala Glu Ala Ala Arg Thr Pro Thr Ala Ala Gin Leu Ala Ala145 150 155 160Gly His Ser Phe Asn Ala Thr Cys His Gly Thr Asn Gly Thr Val Gin165 170 175<formula>formula see original document page 34</formula>Val Phe Phe Ala Asn Phe Thr Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Pro Gin 355 360 365Ala Arg Asp Leu Leu Asn Thr Lys Leu Asp Gin Trp Ala Glu Glu Thr 370 375 380Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Val Thr Ala Leu Lys Val Gin Tyr385 390 395 400Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Leu Asp Glu Asp Val 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1.一種酶電極，包括酶；在上面固定有該酶的導電元件；與該導電元件電連接的金屬絡合物；和設置在該酶內的活性部位處或該活性部位附近的受控位置處的氨基酸，其中該氨基酸與該金屬絡合物配位結合。
2. 如權利要求1所述的酶電極，其中通過基因工程操作重組編 碼所述酶的基因，將所述氨基酸人工導入酶內的活性部位處或該活性 部位附近。
3. 如權利要求1所述的酶電極，其中所述氨基酸是組氨酸。
4. 一種酶傳感器，包括酶電極和設置為向酶電極施加電壓或電 勢的單元，該酶電極包括酶；該酶固定在其上面的導電元件； 與該導電元件電連接的金屬絡合物；和位于該酶內的活性部位處或該活性部位附近的受控位置處的氨基酸，其中該氨基酸與該金屬絡合物配位結合。
5. —種燃料電池，包括酶電極、對電極和設置在酶電極和對電 極之間的電解質，該酶電極包括酶；在其上面固定有該酶的導電元件； 與該導電元件電連接的金屬絡合物；和位于該酶內的活性部位處或該活性部位附近的受控位置處的氨基酸，其中該氨基酸與該金屬絡合物配位結合。
6. —種酶電極生產方法，包括以下步驟 制備在其上面固定有金屬絡合物的導電元件； 通過基因工程操作重組編碼酶的基因，從而將氨基酸設置在酶內的活性部位處或該活'性部位附近的受控位置處；和 使該氨基酸和金屬絡合物互相配位結合。
7. 根據權利要求6所述的酶電極生產方法，其中通過使導電元 件接觸具有能夠與導電元件結合或與固定在導電元件表面上的物質結合的官能團的金屬絡合物溶液，將金屬絡合物固定在導電元件上。
8. 根據權利要求6所述的酶電極生產方法，其中通過使導電元 件接觸具有能夠與導電元件結合或與固定在導電元件表面上的物質結合的官能團的配體溶液，然后使導電元件接觸含有具有離去基團的金 屬絡合物的中心金屬的化合物溶液，將金屬絡合物固定在導電元件上。
全文摘要
將能夠與金屬絡合物配位結合的氨基酸導入酶內的活性部位或該活性部位附近的另一個受控位置。因此，當將介質導入該酶內時，介質導入位置受控保持在活性部位處或者活性部位附近。
文檔編號G01N27/327GK101131374SQ20071014662
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月23日 優(yōu)先權日2006年8月23日
發(fā)明者久保亙, 野本毅 申請人:佳能株式會社