專利名稱：鑒別急性呼吸短促的心源性和肺源性病因的裝置和方法
鑒別急性呼吸短促的心源性柳市源性病因的^g和方法 本發(fā)明涉及鑒別診斷急性呼吸短促病因的方法、裝置和試劑盒。具體的，
本發(fā)明涉及在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾 病或(iv)非心源性或肺源性的呼吸困難之間，鑒別患有急性呼吸短促(呼吸 困難)的患者的方法，所述方法包括以下步驟，檢測患者樣本中SP-B的量， 檢測所述患者的樣本中利尿鈉肽的量，通過檢測量與參照量的比較，在(i)肺 疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或 肺源性病因的急性呼吸困難之間進行鑒別。此外，本發(fā)明涉及實施所述方法的 裝置和試劑盒。
心血管并發(fā)癥，尤其是急性心血管疾病是最常見的威脅生命的醫(yī)學狀況， 需要緊急救助。但是，這些狀況不是總能被清楚診斷。具體的，不同類型心臟 疾病伴發(fā)的某些最常見癥狀，包括急性心血管疾病，也包括慢性心臟功能障礙 例如慢性心力衰竭，也是其他(非心血管)疾病的特征癥狀。因此，鑒別觀察 到的癥狀是心血管或者其他病因通常是困難、麻煩和耗時的。所述鑒別可能還 需要專家例如心臟病學家的幫助。
心血管并發(fā)癥尤其是急性心血管疾病或者更嚴重慢性心力衰竭的典型癥狀 是呼吸短促(呼吸困難)。與其他癥狀一樣，呼吸困難可能有不同的病因，包 括心血管并發(fā)癥和非心血管肺疾病。為查明癥狀的潛在心血管病因，敵能夠 正確診斷特定患者例如急診患者的病因。
W099/13337公開了表面活性蛋白可用作幾種特異肺疾病包括急性呼吸窘 迫綜合征(ARDS)的生物標記物。
WO2004/077056公開了表面活性蛋白的全身水平可用作心力衰竭的標記 物。但是，公幵的技術不肖嫩鑒別診斷表面活性蛋白水平升高的病因。具體的， 已知肺疾病或損傷也可能導致所述蛋白全身水平的升高(Doyle 1997， Am J Respir Crit Care Med Vol. 156: 1217-1229)。因此，所述的公開方法不可避免的 會產(chǎn)生假陽性診斷結果，從而導致不正確的治療(SvendstrupNiels叫2004， The European Journal of Heart Failure 6: 63-70)。 此外，表面活性蛋白與N-端腦利尿鈉肽(NT-proBNP) —起已用于指示 根據(jù)紐約心臟協(xié)會(NYHA)分類的心力衰竭的嚴重度(DePasquale, 2004， Circulation 110:1091-1096)。
NT-proBNP還和七種其他參數(shù)一起已作為呼吸困難患者急性心力衰竭的 指示物(Baggish 2005, American Heart Journal, 151:48-54)。
因此，長期以來顯然需要肖瀕鑒別診,如患者呼吸困難，尤其是急性呼 吸困難癥狀的病因的裝置和方法。所述裝置和方法能夠提供可靠的有效診斷， 并肖繊免現(xiàn)有技術的缺陷。
因此，本發(fā)明的根本技術問題是在以前裝置和方法基礎上為解決上述需要 產(chǎn)生的。所述技術問題通過特征在于權利要求中的以及下述的實施方，^Sf決。
由此，本發(fā)明涉及在(i)肺疾病、Gi)心血管并發(fā)癥、(m)心血管并發(fā) 癥合并肺疾病或(iv)非心源性鄉(xiāng)市源性病因的急性呼吸困難之間，鑒別患有 急性呼吸短促(呼吸困難)的患者的方法，所述方法包括以下步驟
a) 檢測患者樣本中肺表面活性蛋白SP-B的量；
b) 檢測所述患者的樣本中利尿鈉肽的量；
c) 通過比較a)和b)中的檢測量與參照量，在(i)肺疾病、(ii)心血 管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或肺源性病因的急 性呼吸困難之間進行鑒別。
本發(fā)明的方法優(yōu)選是一種體外方法。此外，除了上面清楚提及的步驟外， 所述方法還可包括其他步驟例如進一步的樣本前M步驟或者評定步驟。
此處使用的術語"鑒別"的含義是在患有(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā) 癥、(in)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv) ^H、源性劍市源性病因的急性呼吸 困難的患者之間，在患有所述疾病的患者顯示基本相同的癥狀即呼吸短促的情 況下進行區(qū)分。此處使用的術語優(yōu)選的包括鑒別診斷肺疾病、表現(xiàn)出肺癥狀的 心血管并發(fā)癥、心血管并發(fā)癥合并肺疾病或者非心源性鄉(xiāng)市源性病因的急性呼 吸困難。
此處使用的診斷是指患者患本說明書所述疾病的可能性。本領域技術人員 應該了解，對被診斷的患者來說這種VH古通常不期望達到100%的正確率。但 是所述術語需要具有統(tǒng)計學上顯著性比例的患者能夠被診斷出患有所述疾病
(例如人群研究中的一個人群)。本領域技術人員采用各種眾所周知的統(tǒng)計評
估工具，例如檢驢信區(qū)間、Mi檢驗、Student's t-檢驗、Mann-Whitney檢驗
等等，不需額外費力就可以檢測一個比例是否具有統(tǒng)計學上顯著性。細節(jié)參見 Dowdy和Wearden^ Statistics for Research^ John Wiley & Sons, New York 1983。優(yōu) 選的置信區(qū)間是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或者至少99%。 p-值雌是O.l、 0.05、 0.01、 0.005或者0細1。
根據(jù)本發(fā)明的診斷還包括相關疾病、癥狀或者其風險的監(jiān)控、確診、亞分 類和預報。監(jiān)控涉及追蹤已診斷的疾病或者并發(fā)癥，例如分析疾病的進程或者 特定治療對疾病或者并發(fā)癥進程的影響。確診涉及利用其他指示物或者標記物 強化或者證實已迸行的診斷。亞分類涉及根據(jù)被診斷疾病的不同亞類進一步定 義診斷，例如根據(jù)疾病的輕微和嚴重形式定義。預報涉及在其他癥狀或者標記 物變得明顯或者顯著改變之前預測疾病或者并發(fā)癥。
短語"急性呼吸短促"或者"急性呼吸困難"指受損的呼吸，其導致呼 吸頻率增加和/或呼吸量增加。因此，呼吸短促可能導致，，的，通氣，。 呼吸短ifiM常發(fā)生在氧飽和度水,氏于正常氧飽和度水平的至少95%。此處使 用的急性呼吸困難指非持久性發(fā)生的呼吸短促，即突然發(fā)生的(急性發(fā)作呼吸 困難)禾卩與特定剝牛無關的(例如只發(fā)生在特定壓力類型下的)呼吸短促等。 此外，急性呼吸困難從急性發(fā)作開始l^不超過2周，而慢性呼吸困難的特征 在于持續(xù)時間超過2周。而且，急性呼吸困難通常JiJa行性惡化的。
術語"肺疾病"指任何導致呼吸短促的疾病。財卜，應該知道根據(jù)本發(fā)明 所述的肺疾病會導致受損的肺泡毛細管膜屏障，從而對表面活性蛋白，尤其是 對此處具體所述的肺表面活性蛋白的^i^性增加。所述疾病優(yōu)選的是急性和慢 性呼吸衰竭、肺纖維化、肺蛋白沉積、肺水腫、肺炎癥、肺，中、肥胖、甲狀
腺疾病或者更i^的肺栓塞。
此處使用的術語"心血管并發(fā)癥"指心血管系統(tǒng)的任何急性或者慢性病征。 心血管系統(tǒng)的急性病征包括急性心血管狀況。因此，更，的包括穩(wěn)定心絞痛 (SAP)或者急性冠狀動脈綜合癥(ACS)。 ACS患者顯示不穩(wěn)定心鄉(xiāng)(UAP) 或者這些個體已經(jīng)患有心Ul^塞(MI)。 MI可能是ST上升的MI或者無ST 上升的ML MI發(fā)生后可能發(fā)生左心室功能障礙(LVD)。所述術語還包括慢 性病征，優(yōu)選的，心力衰竭。應該了解所述術語還包括除了上述急性心血管狀
況外，造膝1>力衰竭的醫(yī)學情況和疾病，例如先天或者后天的心臟瓣膜疾病或 病癥，心肌炎，非炎性心肌病，淀粉樣變或者血色素沉著病。進一步雌的心 血管疾病是血栓癥，優(yōu)選動脈血栓癥，或者造成血管鈣化的疾病，，動脈粥 樣硬化，以及中風。
患有心血管并發(fā)癥的個體可顯示臨床癥狀(例如呼吸困難，胸痛，同樣參
見下面的NYHA分類)。具體的，紐約心臟齢(NYHA)已經(jīng)將心血管赫 的癥狀分類為功能性分類系統(tǒng)。I型患者沒有明顯的心血管疾病癥狀。體力活 動不受限制，平常的體力活動不會造成過度疲勞，心悸或者呼吸困難。II型患 者體力活動輕微受限。他們在休息時感覺舒適，但平常的活動會造成疲勞，心
悸或者呼吸困難。m型患者體力活動顯著受限。他們在休息時感覺舒適，但強
度低于平?；顒訒r就會造成疲勞，心悸或者呼吸困難。IV型患者進行任何體力 、^J都會感覺不適。他們在休息時表現(xiàn)心功能不全的癥狀。進行任何體力活動 都會增加不適感。心臟并發(fā)癥的另一特征是"左心室射血分數(shù)"(LVEF)，也 稱為"射血分數(shù)"。心臟健康的人通常具有未受損的LVEF， 一般高于50%。 具有明顯癥狀的心臟收縮疾病的大部分患者的LVEF通常是40%或者更低。
優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的患有心血管并發(fā)癥并顯示急性呼吸困難的患者可被 分類到中間NYHA級，雌的，到NYHAI、 n或m級，最雌的，到NYHAn級。
"心血管并發(fā)癥合并肺疾病"的含義是患者患有心血管并發(fā)癥和肺自。 應該了解該兩種疾病或病征可獨立出現(xiàn)，即一種不會造成另一種。但是，此處 所述的原發(fā)性心血管并發(fā)癥導致繼發(fā)性肺疾病(而且反之亦然)的情況也, 地包括在上述表述中。
此外，無論怎樣，急性呼吸困難可在既沒患有心血管并發(fā)癥也沒患有肺疾 病的患者中觀察到。為了本發(fā)明的目的，術語"非W原性鄉(xiāng)市源性病因的急性 呼吸困難"應包括這些例子。急性呼吸短促的優(yōu)選的非心源性和剕市源性病因 是，雌的，月巴胖癥，體翻重，患者的未鍛煉或者鍛煉不足的身微況，心 理狀況例如焦慮狀態(tài)。
此處4頓的術語"患者"涉及動物，鵬的是哺乳動物，更雌的是人。 但是，從本發(fā)明應該看出患者應該，雌的，顯輸性呼吸短促。
根據(jù)本發(fā)明的檢測利尿鈉肽或割市表面活性蛋白的量涉及測量濃度的量，
優(yōu)選的半定量或者定量。測量可直接或者間接進行。直接測量涉及測定利尿鈉 肽或者肺表面活性蛋白的量或者濃度，這基于從利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白 自身獲得的信號以及與樣本中存在的肽分子數(shù)目直接相關的強度。這種信號(本 文中有時稱為強度信號)可通過例如測定利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的特定 物理或者化學性質的強度值來獲得。間接測量包括測定獲自次級物質(即不是 利尿鈉肽本身的物質)的或者生物讀數(shù)系統(tǒng)，例如可測細胞反應、配體、標記 物^酶反應產(chǎn)物的信號。
根據(jù)本發(fā)明，可采用檢測樣本中肽量的眾所周知的方式來實現(xiàn)檢測利尿鈉 肽或者肺表面活性蛋白的量。所述方式包括在多種夾心、競爭或者其他分析方 式中利用標記分子的免疫分析設備和方法。所述分析會產(chǎn)生信號，其指示是否 存在利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白。此外，信號強度，優(yōu)選的，與樣本中的肽 體接或者間接(例如反比)相關。其他合適的方法包括測定利尿鈉肽特異的
物理或者化學性質，例如其精確的分子量或者NMR光譜。所述方法包括，優(yōu) 選的，生物檢測器，與免疫分析偶聯(lián)的光學設備，生物芯片，分析設備例如質 譜儀，NMR分析儀或者層析設備。此外，方B括基于微板ELISA的方法， 全自動或者機器人免疫分析(例如Elecsys^分析^^ 提供的)，CBA (酶性鈷 結合分析，例如Roche-Hitachi 分析儀所提供的)，和膠乳凝集分析(例如 Roche-Hitachi 分析儀所提供的)。
優(yōu)選的，檢測利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白量的方法包括下列步驟(a) 將能夠誘發(fā)細胞反應的細胞與肽溫育足夠時間，其中所述細胞反應的強度可以 指示肽的量，(b)測量細胞反應。
為測量細胞反應，樣本或者處理的樣本，優(yōu)選的，加入到細胞培養(yǎng)物中， 然后測量內部或者外部的細胞反應。細胞反應可包括可檢測的報告基因表達或 者物質例如肽、多肽或者小分子的分泌。表達或者物質應該產(chǎn)生與肽量相關的 鵬信號。
優(yōu)選的，檢測利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白量的方法包括檢測從樣本的利 尿鈉肽或者肺表面活性蛋白獲得的特定強度信號的步驟。
如上所述，這種信號可以是特異性針對利尿鈉肽^肺表面活性蛋白的質 譜或者NMR光譜中觀察到的特異性針對利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的以m/z ^M形式所觀測至啲信號 艘。
檢測利尿鈉肽量的方法還可以優(yōu)選的包括下列步驟(a)肽與特異性配體 接觸，(b)(任選地)除去未結合配體，(c)測量結合配體的量。
結合的配術每產(chǎn)生強度信號。根據(jù)本發(fā)明的結合包括共價和非共價結合。 根據(jù)本發(fā)明的配體可以是與此處所述的利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白結合的任 何化合物，例如肽、多肽、核酸或者小分子。優(yōu)選的配體包括抗體、核酸、肽 或者多肽例如利尿鈉肽的受體或者肺表面活性蛋白的結合伴侶(partner),及其 包含所述肽結合域的片段，和適體，例如核酸或者肽適體(aptamer)。制備所 述配體的方法是本領域公知的。例如，商業(yè)化供應商提供鑒定和制備合適抗體 或者適體的服務。本領域技術人員可以熟練的使用所述方法開發(fā)具有更高親和 力和特異性的所述配體的衍生物。例如，在核酸、肽或者多肽中引入隨機突變。 采用本領域公知的步驟，例如噬菌體展示，可以檢測這些衍生物的結合。如此 處所述的抗體包括多克隆和單克隆抗體，以及其片段，例如肖激結合抗原或者 半抗原的Fv、 Fab和F(ab)2。本發(fā)明還包括人源化雜合抗體，其中顯示所需抗 原特異性的非人類供體抗體的氨基,列與人類受體抗體的序列組合。供體序 列通常至少包括供體的抗原結合氨基酸殘基，但也可包括供體抗體的其他結構 敏和功能相關氨基^^戔基。這種雜合體可用本領域公知的多種方法制備。優(yōu)選 的，配體或者試劑特異結合利尿鈉肽。本發(fā)明的特異結合的含義是配體或者試 劑基本上不結合(與其"交叉反應")待分析樣本中的其他肽、多肽或者物質。 優(yōu)選的，特異結合的利尿鈉肽應當以比任何其他相關肽或者多肽高至少3倍，
更itiS少高10倍，甚至更，至少高50倍的親和力被結合。如果非特異的 結合同樣可以例如根據(jù)，Western Bolt上的大小，或者根據(jù)樣本中其相對較 高的豐度從而進行明確的區(qū)分和測量，貝排特異的結合也是可接受的。配體的 結合可通過本領域公知的任何方法測量。優(yōu)選的，所述方法是半定量或者定量 的。魏的方法如下所述。
首先，配體的結合可以例如通過NMR、質譜或者表面等離子體共振直接 測定。
其次，如果配體還是感興趣的肽或者多肽的酶活性的底物，則可測定酶反 應產(chǎn)物(例如，可M例如在Western印^Lt測定酶切底物的量來測定蛋白酶 的量)。或者，配體自身呈現(xiàn)出酶的性質，而配彬利尿鈉肽或者配W肺表面活 性蛋白復合物或者與利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白分別結合的配體可以與合適 的底物接觸，從而艦產(chǎn)生強度信號進行檢測。為測定酶反應產(chǎn)抓底物量優(yōu) 選是飽和的。在反應前還可以用可檢測的標記物標記底物。優(yōu)選的，樣本與底 物接觸充足的時間。充足的時間是指產(chǎn)生能夠檢測的雌可以測量的產(chǎn)品量所 需的時間。除了檢測產(chǎn)物量，還可以檢測特定(例如可檢測的)量產(chǎn)物出l^/f 需的時間。
第三，配體可以共價或者非共價偶聯(lián)到標記物，以便檢測和湖懂配體。標 記可采用直接或者間接的方法。直接標記涉及將標記物直接(共價或者非共價) 偶聯(lián)到配體。間接標記涉及將第二配體結合(共價或者非共價)到第一配體。 第二配體應該是特異結合第一配體。所述第二配體可以用合適的標記物偶聯(lián)和/ 或是結合第二配體的第三配體的靶(受體)。第二、第三甚至更高次序配體的 ^ffi通常用于增強信號。合適的第二和更髙次序配體可以包括抗體，第二抗體
和已知的鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)(Vector Laboratories, Inc.)。配體或者底物還 可以用本領域已知的一種或者多種標記物進行標記。這種標記物可以是更高級 配體的靶。合適的標記物包括生物素、地高辛、His-Tag、谷胺,-S-轉移酶、 FLAG、 GFP、 myc-tag、流感A病毒血球》,素(HA)、麥芽糖結合蛋白等等。 御太或者多肽情況下，標記物雌的在N-端和/或C-端。誠的標記物是用適 宜檢測方法能夠檢測到的任何標記物。典型的標記物包括金顆粒、乳膠珠、吖 啶酯(acridan ester)、魯米諾、釕、酶活性標記物、放射性標記物、磁性標記 物(例如磁珠，包括順磁和超順磁標記物)，和熒光標記物。酶活性標記物包 括，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、熒光素酶及其衍生物。 用于檢測的合適底物包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、 3，3'-5,5'-四甲基聯(lián)苯胺、 NBT-BCIP (四氮唑藍(4-nitro blue tetrazolium chloride)和5-、^4-氯-3』引f]^^ 酸酯，羅氏診斷提供預制儲存液)，CDP-SatrTm (AmershamBioscience), ECF
(Amersham Bioscience).合適的SI"底物組合會產(chǎn)生顯色的反應產(chǎn)物、熒光或 者化學發(fā)光，可根據(jù)本領域已知的方法(例如利用光i(M或者合適的成像系統(tǒng)) 對其測定。為檢測酶反應，類^ilMOTJ^標準。典型的熒光標記物包括熒光 蛋白(例如GFP及其衍生物)，Cy3， Cy5，德克薩斯紅，熒光素和Alexa染料
(例如A]exa 568)。其他熒光標記物可獲自例如Molcular Probes (Oregon)。也 可以使用量子點作為熒光標記物。典型的放射性標記物包括"S、 1251、 3乎等等。 放射性標記物可以用已知和合適的方法檢測，例如光 或者熒光成像儀。根
據(jù)本發(fā)明的合適檢測方法還包括沉淀(尤其是免疫沉淀)，電化學發(fā)光(電產(chǎn)
生的化學發(fā)光)，RIA (娜免疫分析)，ELISA (酶聯(lián)免疫吸附分析)，夾心酶 免疫檢測，電化學發(fā)光夾心免疫分析(ECUA),解離增益鑭系熒光免疫分析 (DELFIA)，閃爍皿分析法(SPA),比濁法，濁度法，膠乳增益比濁法或 者濁度法，或者固相免疫檢測。本領域已知的其他方法(例如電泳，2D凝膠 電泳，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), Western印跡和質譜)，可以 斜蟲或者與上述標記或者其他檢測方法^使用。
此外，檢測利尿鈉肽量的方法雌包括(a)將含有利尿鈉肽或者肺表面 活性蛋白的樣本與固相載體接觸，所述固相載體含有上述利尿鈉肽或者肺表面 活性蛋白的配體，和(b)檢測結合到載體上的利尿鈉肽或割市表面活性蛋白 的量。所述配體，雌的選自核酸、肽、多肽、抗體和適體，雌的固定在固 相載體上。制造固相載體的材料是本領域已知的，包括，尤其是，商品化的柱 材料，聚苯乙烯珠、膠乳珠、磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅芯片和表面、 硝酸纖維素條、膜、片、duracytes、反應室的孔和壁、塑料管等等。配體或者 試劑可以結合到許多不同載體。已知載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙 烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龍、直鏈淀粉、天然和雌纖 維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵。載體的性質根據(jù)發(fā)明目的可以是可溶或者 不溶的。固忠定位所述配體的合適方法是眾所周知的，包括但不限于離子、疏 水、共價作用等等。根據(jù)本發(fā)明使用"懸浮陣列(suspension arrays)"作為陣 列也是可以的(Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm. Trends Biotechnol. 20(1): 9-12)。在這種懸浮陣列中，載體， 例如微珠或者微球，存在懸浮相中。該陣列由不同微珠或者微球組成，可能被 標記的，攜帶不同配體。制備這種陣列的方法，例如基于固相化學和光敏保護 基團，是公知的(US 5,744,305)。
此處j柳的術語"量"包括利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的纟樹量，禾廿尿 鈉肽或者肺表面活性蛋白的相對量或者濃度，以及與此相關的任意值或者參 數(shù)。這種值或者參數(shù)包含艦直接測量得到的利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的 所有特定物理或者化學性質所獲得的強度信號值，例如質譜^t NMR光譜中 的弓賊值。此外，還包括說明書中其他地方描述的通過間接測量得至啲所有值 或者參數(shù)，例如響應利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的生物讀數(shù)系統(tǒng)所測定的表
達水平或者獲自特異結合配體的強度信號。應該知道與iJ^量或者參數(shù)相關的 值還可通過所有標準數(shù)學公式獲得。
本說明書中所使用的術語"肺表面活性蛋白"涉及肺表面活性蛋白B (SP-B)。所述術語，優(yōu)選的，涉及人蛋白及其變體，優(yōu)選的，等位基因變體 或者種特異同源物、旁系同源物或者直系同源物。人蛋白在現(xiàn)有技術中已經(jīng)詳 細描述了其特征，并公開在例如，HawgooA 1989，AmJ Physiol-Lung Cellular and Molecular Physiology, Vol 257， Issue 2:13-L22(針對所有表面活性蛋白)，Takahashi 2006, Out Pharm Des, 12(5):589-598(針對SP-A和SP-D),以及Kurutz 2002, Biochemistry, 41(30):9627-9636, Guttentag 1998， Am J Physiol -Lung Cellular and Molecular Physiology, Vol 275, Issue 3:L559-L566(針對SP-B)。
具體的，還涉及肺表面活性蛋白的變體，其氨基酸水平與A^市表面活性蛋
白具有至少60%同一性，更ifc^M少70X、至少80%、至少90%、至少95%、 至少98%或者至少99%同一性?；九c之相似并且還涉及能夠被診斷裝置或 者ffi31針對相應全長肽的配體所識別的蛋白降解產(chǎn)物。還包括變體多肽，其與 Al市表面活性蛋白的氨基,列相比，存在氨基,失、替^^/或添加，并且 所述多肽具有肺表面活性蛋白性質。此處所述的肺表面活性蛋白性質是指免疫 學和/或生物學特性。{腿的，月市表面活性蛋白變體具有免疫學特性(即表位構 成)，該特性與此處具體描述的肺表面活性蛋白的特性相當。因此，所述變體 應能夠被上述用于檢測肺表面活性蛋白的裝置或者配體識別。變體還包括翻譯 后修飾的肺表面活性蛋白例如糖基化蛋白。
此外，應該知道所述術語還包括J^特異肺表面活性蛋白或者其變體的任 意組合。例如，SP-B可以與SP-D或者SP-A或者兩者組合在一起檢測。
術語"利尿鈉肽"包含心鈉素肽(ANP)型和腦鈉素肽(BNP)型及其 具有相同預知效果的變體。根據(jù)本發(fā)明的利尿鈉肽包含ANP型和BNP 及 其變體(參見例如Bonow， R.O.(1996). New insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93:1946-1950)。
ANPMI太包含pre-proANP、 proANP、 NT-pro ANP和ANP 。 BNP娜包含pre-proBNP、 proBNP、 NT-proBNP和BNP。 前肽前體(對于pre-proBNP是134個氨基酸)包含一條短的信號肽，該 信號肽經(jīng)酶切從而釋方她前體(對于pre-proBNP是108個氨基酸)。肽前體被進一步剪切成氨基端的肽前體(氨基端-肽前體，對于NT-proBNP是76個氨基 酸)和活性激素(對于BNP是32個氨基酸，對于ANP是28個氨基酸)。
本發(fā)明優(yōu)選的利尿鈉肽是NT-proANP、 ANP、 NT-proBNP、 BNP及其變 體。ANP和BNP均是活性激素，半衰期短于它們的各自的非活性對應物， NT-proANP和NT-proBNP。 BNP在血液里代謝，而NT-proBNP作為完，子 在血液中循環(huán)，由此經(jīng)腎臟清除。NT-proBNP的體內半衰期是120 ^H中，長于 BNP的20射中(Smith MW, Espiner E入Yandle TG， Charles CJ, Richards AM. Delayed metabolism of human brain natriuretic peptide reflects resistance to neutral endopeptidase. J Endocrinol. 2000; 167: 23946)。
采用NT-proBNP可使預分析更強大，使樣本可以方便的轉移到中心實驗 室(Mueller T， Gegenhuber入Dieplinger B, Poelz W, Haltmayer M. Long-term stability of endogenous B-type natriuretic peptide (BNP) and amino terminal proBNP (NT-proBNP) in frozen plasma samples. Clin Chem Lab Med 2004; 42: 9424.)。血 液樣M室溫可保存幾天，或者郵寄或者運輸，不會造成損失。與此相反，BNP 在室溫或者4'C保存48小時會導致至少20%的濃度損失(Mueller T， Gegenhuber A等，Clin Chem Lab Med 2004; 42: 9424，如前;Wu AH^ Packer 1Vt Smilh入Bijou 民Fink D, Mair J， Wallentin L, Johnston N, Feldcamp CS, Haverstick DIv^ Ahnadi CE， Grant入Despres N, Bluestein B, Ghani F. Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVTA Centaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure: a multisite study. Clin Chem 2004; 50: 867-73.)。因此，根據(jù)時程和感 興趣的性質，檢測利尿鈉肽的活性或者非活性形式均是有益的。
根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的利尿鈉肽是NT-proBNP，及其變體。如上簡述，根 據(jù)本發(fā)明所述的人NT-proBNP是一種多肽，其包含，的對應人NT-proBNP 5HF氨基端部分的76個氨基酸。人BNP和NT-proBNP的結構在現(xiàn)有技術中 己有詳盡描述，例如WO 02/089657, WO 02/083913, Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946-1950。 t^的，此處所使 用的人NT-proBNP是在EP 0 648 228 Bl中公開的人NT-proBNP。這些現(xiàn)有技 術文件在此處弓l入作為本文公開的NT-proBNP及其變體特定序列的參考。
根據(jù)本發(fā)明所述的人NT-proBNP還包括Jd^人NT-proBNP的所述特定序 列的等位基因變體禾唭他變體。具體的，還涉及變體多肽，其氨基酸7K平與人
NT-proBNP具有至少60^的同一性，更it^M少70X、至少80%、至少90%、 至少95%、至少98%或者至少99%的同一性?；九c之相似并且還構想了能 夠被診斷裝置或者通過針對相應全長肽的配體所識別的蛋白降解產(chǎn)物。還包括 變體多肽，其與人NT-proBNP的氨基酸序列相比，存在氨基酸缺失、替代和/ 或添加，并且所述多肽具有人NT-proBNP性質。此處所述的人NT-proBNP性 質是指免疫學和/或生物學特性。,的，人NT-proBNP變體具有免疫學特性
(即表位構成)，該特性與此處具體描述的人NT-proBNP的特性相當。因此， 所述變體應能被上述用于檢測利尿鈉肽量的^fi或者配體特異識別(即無交叉 反應)。NT-proBNP的生物學和/或免疫學特性的檢測方法可以參見,Karl等(Kari 1999. Development of a novel, N-Terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit Scand J Clin Invest 230: 177-181)， Yeo等(Yeo 2003. Multicenter evaluation of the Roche NT-proBNP assay and comparison to the Biosite Triage assay. CbmcaChimicaActa338: 107-115),以及以下實施例。
變體還包括翻譯后斷布的利尿鈉肽例如糖基化蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的變體還可以是樣本收集后進行修飾的肽或者多肽，例如共價
或者非共價結合標記物尤其是放射性或者熒光標記物到肽。
此外，應該知道所述術語還涉及J^特定利尿鈉肽的任意組合。 術語"樣本"是指,樣本，分離的細胞樣本或者組織或者器官的樣本。 ，樣本可用公知技術獲得，包括，優(yōu)選的，血液、血漿、血清或者尿的樣本。 組織或者器官的樣本可以取自任意組織或者器官，例如通過活組織檢查。通過 分離技術例如離心或者細胞分選，分離的細胞可以取自體液或者組織或者器 官。
此處使用的比較包括將待分析樣本包含的利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白的 量，與說明書中下述合適參照源的量進行比較。應該知道此處使用的比較是指 相應參數(shù)或者值的比較，例如絕對量與絕對參照量比較，而濃度與參照濃度比 較，或者待測樣本所獲得的強度信號與參照樣本的同型強度信號比較。本發(fā)明
方法的步驟(b)中所述的比較可以是人工或者計算機輔助進行的。對計算機 輔助比較來說，測定量的值可以與由計算^lf呈序儲存在數(shù)據(jù)庫中的合適參照所 對應的值進行比較。計算機3呈序可用于進一步評價比較結果，即以合適的輸出 形式自動提供本文所述疾病的鑒別診斷。
此處4OT的術語"參照量"是矛lilii上述比較，可以評價患者是否患有任 意一種上述疾病或者病征的量。相應的，該參照可以來自患有(i)肺疾病、Gi) 心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非'1>源性，源性病因 的急性呼吸困難的患者，即來自關于心血管并發(fā)癥和肺疾病的健康個體。應該 了解如果使用的參照是來自患有疾病或者疾病組合的患者，與所述參照量基本 一致的待檢患者樣本中的肽或者蛋白量標示患有相應的疾病或者疾病組合。如 果使用來自健康個體的參照，與參照顯著不同的待檢患者樣本中的肽或者蛋白 量(即不同于此處所述的表面活性蛋白和利尿鈉肽的標準值)將標示患有疾病。 用于個體的參照量根據(jù)不同生理參數(shù)例如年齡、性別或舒巾族而不同。因此， 釆用本發(fā)明的方法將參照樣本與檢測樣本一起即同時或者先后分析，可以確定 合適的參照量。
本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)如果檢測到肺表面活性蛋白的量升高，而檢測到利尿鈉 肽的量沒有升高或者微弱升高，該患者應該是僅患有肺疾病。如果檢測到利尿 鈉肽和表面活性蛋白的量相對于正常范圍都升高，該患者應該患有心血管并發(fā) 癥。如果利尿鈉肽的量顯著增強，而表面活性蛋白的量也升高，該患者應該患 有心血管并發(fā)癥合并肺疾病。最后，如果相對參照，檢測到的量都不升高，該 患者應該患有本說明書中其他地方描述的非心源性、非肺源性病因導致的急性 呼吸困難。SP-B量的正常生理范圍(即未升高)是12,000至20,000 ng/ml，優(yōu) 選20，000 ng/ml。利尿鈉肽尤其是NT-proBNP的正常生理范圍(即未升高)是 80至150 pg/ml，雌125 pg/ml。此^H頓的顯著增強的升高是指利尿鈉肽優(yōu) 選NT-proBNP的量大于或者等于3，200 pg/ml。應該了解±3^量根據(jù)測量的統(tǒng) 計和誤差會有不同。
有利地，發(fā)現(xiàn)濕示出肺癥狀尤其是急性呼吸短促的患者樣本中存在肺表面 活性蛋白的量與NT-proBNP的量組合，可以鑒別診斷所述癥狀的病因。由于 本發(fā)明，患者尤其是急診患者可以更為方便可靠的診斷，并然后根據(jù)所述鑒別
診斷的結mia行治療。
上面以及下文所作的術語解釋和定義適用于特征在于本說明書和權禾腰求 的所有實施方案。
以下實施方案是本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實施方案。 在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，心血管并發(fā)癥合并肺疾病(參見上面
(iii))的肺疾病是心血管并發(fā)癥引起的。
在本發(fā)明方法的tt^實施方案中，(iii)的心血管并發(fā)癥劍市疾病引起的。 在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，(iii)的肺疾病與心血管并發(fā)癥無關。
在本發(fā)明方法的其他優(yōu)選實施方案中，低于125 pg/ml的利尿鈉肽參照量 和高于20,000ng/ml的SP-B參照量標示(i)肺疾病。
在本發(fā)明方法的另一個雌實駄案中，高于125 pg/mJ倒氏于3,200 p^ml 的禾ij尿鈉肽參照量和低于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示Gi)心血管并發(fā)癥。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實 案中，高于3，200 p^ml的利尿鈉肽參 照量和高于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病。
在本發(fā)明方法的另一，實施方案中，低于125 pg/ml的利尿鈉肽參照量 和低于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(iv)非ll、源性鋤市源性病因的急性呼 吸困難。
而且，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述樣本是血液、血漿、血清或者尿。
在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實施方案中，所述利尿鈉肽是NT-proBNP。
此外，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述患者是人。
財卜，本發(fā)明涉及在(i)肺疾病、(ii)表現(xiàn)出肺癥狀的心血管并發(fā)癥、(iii)
心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非'。源性繃市源性病因的急性呼吸困難之間，
鑒別患有急性呼吸困難的患者的設備，包括
a) 檢測患者樣本中肺表面活性蛋白SP-B濃度的體；
b) 檢測患者樣本中禾脲鈉肽或者其變體的量的錢；
c) 比較檢測量與適宜的參照量的裝置，由此在(i)肺疾病、(ii)心血管 并發(fā)癥、(iiO心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性繃市源性病因的急性 呼吸困難之間進行鑒別。
此處使用的術語"設備"是指裝置系統(tǒng)，至少包拔彼,作性相連從而進 行預測的，裝置。優(yōu)選的檢測利尿鈉肽或者肺表面活性蛋白量的裝置和進行 比較的裝置在上述于本發(fā)明相關的方法中已經(jīng)公幵。如何將這些^S操作性相 連應 于所述設備包括的裝置類型。例如，如果i頓自動檢測肽量的裝置， 所述自動操作裝置獲得的 可通過例如計算機程序處理，以便進行診斷或者
鑒別本文所述的疾病。優(yōu)選的，在這種情況下所有裝置被包含在單一設備中。 所述設備相應的包括檢測樣本中肽量的分析單元和處理分析結果用于鑒別診斷 的計^t幾單元。任艦，如果4頓諸如檢測條的體檢測肽量，診斷裝置可以
包括將測定量與以下量進行比照的對照條或者表，所腿已知與(0肺翻、 (ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或Gv)非心源性劍市源 性病因的急性呼吸困難或者健康對照個體相關。檢測皿選偶聯(lián)與利尿鈉肽或 者肺表面活性蛋白特異結合的配體。所述條或者設備，i^包括檢測所述肽與 所述配體結合的裝置。優(yōu)選的檢測裝置在與上述本發(fā)明方法相關的實施方案中
已經(jīng)公開。在這種情況下，裝置按如下方式操作性連接所述系統(tǒng)的使用者根
據(jù)操作手冊里的使用說明和解釋匯總檢測量結果及其診斷值。在這種實施方案 中裝置可以是分離的設備，但優(yōu)選，組裝為試劑盒。本領域技術人員無需額外 費力即可知曉如何連接這些裝置。優(yōu)選設備是那些不需要專業(yè)臨床醫(yī)師的專業(yè) 知識Jt可以操作的設備，例如，僅需上樣的檢測條或者電子設備。結果可以用 診斷原始 的形式輸出，其需要醫(yī)師的解釋。但是，鵬輸出設備對原始數(shù)
據(jù)進行處理，而無需專業(yè)醫(yī)師的解釋。其^lia—步優(yōu)選的設備包括根據(jù)本發(fā)明 方法的上述分析單^/設備(例如生物傳 、陣列、與特異性識另訴iJ尿鈉肽的 配體偶聯(lián)的固相載體、表面等離子體共振設備、NMR光譜儀、質譜儀等等) 或者評估單你設備。
最后，本發(fā)明涉及實施本發(fā)明方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括-
a) 檢測患者樣本中肺表面活性蛋白SP-B濃度的裝置；
b) 檢測患者樣本中禾脲鈉肽或者其變體量的裝置；
c) 比較檢測量與適宜的參照量的裝置，由此在(i)肺疾病、(ii)心血管 并發(fā)癥、(iiO心血管并發(fā)癥合并肺疾病或Gv)非心源性繃市源性病因的急性 呼吸困難之間進行彼此鑒別。
此處使用的術語"試劑盒"是指上述裝置的匯總，優(yōu)選的，分別或者在單 一容器中提供。所述容器，優(yōu)選的，包括實施本發(fā)明方法的使用說明書。
所有在本說明書中弓間的參考文獻以其完全公開的內容以及在本說明書中 特別艦的公開內容引A^文作為參考。
附圖顯示


圖1:該圖顯示檢測到患有心力衰竭(HF)、月市疾病(LD)或者兩者(Comb.HF+LD)的患者群的NT-proBNP濃度，以及對照人群(Ctr.)的濃度的柱狀圖。 N^^患者數(shù)目。此外，還標出了中值以及第75%、 95%、 5%和25%。
圖2:該圖顯示檢測到患有心力衰竭(HF)、肺疾病(LD)或者兩者(Comb. HF+LD)的患者群的SP-B濃度，以及對照人群(Ctr.)的濃度的柱狀圖。N代 表患者數(shù)目。此外，還標出了中值以麟75%、 95%、 5%和25%。
以下實施例只是為了說明本發(fā)明。無論任何情況，其均不應被理解為對本 發(fā)明范圍的限制。
實施例急性呼吸困難患者的預期性研究
對包括214名急性呼吸困難患者的人群進行臨床研究，分析他們是否患有 心力衰竭、月市疾病或者兩種疾病的組合。M臨床檢查、ECG和超聲心動圖確 診，將這些患者分為三個疾病組?；颊叩难簶颖居迷蚐P-B ELISA進行分 析(對于SP-B量使用Flinders分析操作步驟,而對于NT-proBNP濃度使用Elecsys NT-proBNP 分析(羅氏診啲)。
NT-proBNP濃度的檢測結果如圖1所示?；加袃煞N自組合(心力衰竭 和肺疾病)的患者顯示顯著升高的NT-proBNP水平，心力衰竭患者顯示升高 的NT-proBNP水平。但是，肺疾病患者只顯示稍微升高或者正常的NT-proBNP水平。
圖2顯示不同患者組中SP-B量的檢測結果。肺疾病或者兩種疾病的組合 顯示SP-B量的升高。與文獻中描述的參照值相比，表現(xiàn)出由非心源性繃市源 性病因導致的呼吸困難的患者未顯示顯著升高的SP-B。
權利要求
1、一種在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或肺源性病因的急性呼吸困難之間，鑒別患有急性呼吸短促(呼吸困難)的患者的方法，所述方法包括以下步驟a)檢測患者樣本中SP-B的量；b)檢測所述患者的樣本中利尿鈉肽的量；和c)通過比較a)和b)中的檢測量與參照量，在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或肺源性病因的急性呼吸困難之間進行鑒別。
2、 權利要求l的方法，其中(iii)中的肺疾病是由心血管并發(fā)癥引起的。
3、 權禾腰求l的方法，其中(iii)中的心血管并發(fā)癥是由肺疾病弓胞的。
4、 權利要求1的方法，其中(iii)中的肺疾病與心血管并發(fā)癥無關。
5、 權利要求1至4中任一項的方法，其中低于125 pg/ml的利尿鈉肽參照 量和高于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(i)肺疾病。
6、 權利要求1至4中任一項的方法，其中高于125 pg/ml但低于3，200 pg/ml 的禾IJ尿鈉肽參照量和高于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(ii)心血管并發(fā)癥。
7、 權利要求1至4中任一項的方法，其中高于3,200 pg/ml的利尿鈉肽參 照量和高于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病。
8、 權利要求1至4中任一項的方法，其中低于125 pg/ml的利尿鈉肽參照 量和低于20,000 ng/ml的SP-B參照量標示(iv〉非4頓性劍市源性病因的急性 呼吸困難。
9、 權利要求1至8中任一項的方法，其中所述樣本是血液、血漿、血清 或者尿。
10、 權利要求1至9中任一項的方法，其中所述利尿鈉肽是NT-proBNP。
11、 權利要求1至10中任一項的方法，其中所述患者是人。
12、 一種在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺 疾病或(iv)非心源性劍市源性病因的急性呼吸困難之間，鑒別患有急性呼吸 困難的患者的設備，所述設備包括-a)檢測患者樣本中SP-B濃度的裝置；b) 檢測患者樣本中利尿鈉肽或者其變體的量的裝置c) 比較檢測量與適宜的參照量的^S，由此在(i)肺疾病、Gi)心血管 并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)表現(xiàn)出肺癥狀的非心源性劇市 源性病因的急性呼吸困難之間進行鑒別。
13、一種實施權利要求1至11中任一項的方法的試劑盒，其中所述試劑 盒包括實施所述方法的說明書以及a) 檢測患者樣本中SP-B濃度的裝置；b) 檢測患者樣本中禾脲鈉肽的量的裝置；c) 比較檢測量與適宜的參照量的裝置，由此可以在(0肺疾病、(ii)表 現(xiàn)出肺癥狀的心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非'll、源性 鄉(xiāng)市源性病因的急性呼吸困難之間進行彼此鑒別。
全文摘要
本發(fā)明涉及在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或肺源性病因的急性呼吸困難之間，鑒別患有急性呼吸短促(呼吸困難)的患者的方法，所述方法包括以下步驟，檢測患者樣本中SP-B的量，檢測所述患者的樣本中利尿鈉肽的量，以及通過檢測量與參照量的比較，在(i)肺疾病、(ii)心血管并發(fā)癥、(iii)心血管并發(fā)癥合并肺疾病或(iv)非心源性或肺源性病因的急性呼吸困難之間進行鑒別。此外，本發(fā)明涉及實施所述方法的裝置和試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK101173928SQ200710159668
公開日2008年5月7日 申請日期2007年7月27日 優(yōu)先權日2006年7月28日
發(fā)明者A·霍施, G·赫斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司