專利名稱：：一種測定人血漿和/或血清中重組雙功能水蛭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及一種測定人血漿/血清中重組雙功能水蛭素的方法。
背景技術(shù)：
：水蛭素是一種特異的凝血酶抑制劑，它能與血漿中游離的和與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶結(jié)合，以防止血栓形成。由于其抗栓抗凝作用優(yōu)于傳統(tǒng)抗凝藥肝素，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已通過基因工程技術(shù)獲得重組水蛭素。重組雙功能水蛭素(RGD-Hirudin)是一種新型高效的抗凝血藥物，目前處于臨床I期研究階段，為了開展該藥物的體內(nèi)藥動學(xué)研究，體內(nèi)藥物的濃度測定是關(guān)鍵的技術(shù)之一。目前國內(nèi)外有關(guān)測定水蛭素的方法主要采用凝血酶時間測定法(TT法)、APTT測定法、生物底色法、蝰蛇毒凝血時間測定法(ECT法)、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法(EMIT)以及熒光標(biāo)記測定法等。上述這些方法存在種種缺陷如操作繁瑣費時，效率低，選擇性差，靈敏度低等。由于水蛭素是水溶性物質(zhì)，將其從血漿中分離存在很大的困難，迄今未見有效的方法將其分離并濃縮，也使血漿中低濃度的有關(guān)水蛭素藥物的定量分析無法實現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏測定人血漿中水蛭素濃度的方法，具體涉及一種測定人血漿和/或血清中重組雙功能水蛭素的方法。本方法對血漿或血清樣品進行定量分取，用超濾法分離出超濾液，超濾液經(jīng)冷凍干燥，復(fù)溶解后進色譜柱分離，經(jīng)色譜柱分離后，用質(zhì)譜檢測器檢測，進行血漿/血清中水蛭素濃度的測定。本方法具有準(zhǔn)確、靈敏，選擇性好，血漿用量少等優(yōu)點，適合該水蛭素藥物的體內(nèi)濃度測定和體內(nèi)過程的研究。本發(fā)明方法通過下述方法和步驟進行對待測樣品經(jīng)過預(yù)處理后，利用超濾技術(shù)將蛋白從藥物中分離出來，采用乙腈0.1甲酸為流動相，梯度洗脫，質(zhì)譜檢測；包括以下步驟(1)蛋白分離水溶性的水蛭素樣品與血漿蛋白的分離以20%甲酸水溶液酸化并稀釋血樣，混勻后置于超濾管(Millipore，50K)于4000g，25。C條件下超濾20min;(2)樣品富集水蛭素的濃縮超濾液置于1.5ralEppendorf管中，-7(TC條件下冷凍干燥，完全凍干后取出；-70'C條件下保存；(3)樣品分析將凍干后的樣品取出，加入10%甲酸50^1復(fù)溶解，10pl進樣做LC/MS分析；色譜條件采用填料為十八垸基鍵合相硅膠為填料的液相色譜柱，高效液相系統(tǒng)采用通用型高壓泵，流動相采用甲醇和0.1%甲酸溶液，梯度洗脫；質(zhì)譜條件單級四極桿質(zhì)譜檢測器，電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下選擇離子監(jiān)測(M/Z1433)，干燥氣流速13L/min，霧化氣壓力50psig，干燥氣溫度350°C，碎片電壓220V,毛細(xì)管電壓5500V，內(nèi)標(biāo)法定量。所述的待測樣品為人血漿和/或血清；所述的色譜條件其中色譜柱采用AgilentExtendCw分析柱(150X2.lmm，i.d.，5ym);柱溫為35'C;流動相是甲醇一0.1%甲酸水溶液梯度洗脫，流速為O.3ml/min;質(zhì)譜條件采用電噴霧離子化，采集正離子。本方法可用于血槳/血清中水蛭素定量測定。本方法樣品取樣少，前處理簡單、快速、靈敏，分析周期短，可使水蛭素測定的選擇性和靈敏度均得到明顯的提高，使重組雙功能水蛭素的靈敏度提高兩個數(shù)量級，可對游離重組雙功能水蛭素的濃度進行測定，適合于重組雙功能水蛭素體內(nèi)藥物的濃度測定。本方法還可對游離重組雙功能水蛭素的濃度進行測定。本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點采用超濾法分離蛋白，解決了水溶性的水蛭素和蛋白的分離問題；采用冷凍干燥技術(shù)，使血樣中微量的水蛭素得以富集；采用質(zhì)譜檢測器，大大提高了檢測的選擇性和靈敏度；整個色譜分析過程時間為15min以內(nèi)。重組雙功能水蛭素的最低檢出量為25ng/ml血漿。線性范圍為25250pg.1/1，線性相關(guān)系數(shù)良好，方法回收率大于50%,RSD小于10%。圖l是典型色譜圖，其中，上圖為空白血槳；中圖為空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品；下圖為血漿供試品；1為重組雙功能水蛭素，2為硫酸奎寧(I.S.)。具體實施方式實施例1高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件Agilent1100LC/MSD系統(tǒng):G1312A二元泵、G1312A自動進樣器、G1946D質(zhì)譜檢測器、AgilentLC-MS色譜工作站；色譜柱ZorbaxExtendC18(150mmX2.1mm,5um);柱溫:35'C;流動相乙腈0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(梯度程序設(shè)置為乙腈0%_90%0-15min)，流速l.OmL*mirT1;ESI離子源(正離子檢測，M/Z1433)，干燥氣流速13L/min，霧化氣壓力30psig，干燥氣溫度350°C，碎片電壓220V，毛細(xì)管電壓5500V。色譜行為空白血漿、加樣血漿的色譜圖見圖1。從圖中可見，內(nèi)標(biāo)和重組雙功能水蛭素的典型色譜保留時間分別為6min和10niin。血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對樣品的測定無干擾，兩者峰形良好，分離完全。整個色譜分析過程時間為15min以內(nèi)。樣品前處理取待測血漿樣品適量，加入3倍于樣品量的20%甲酸水溶液，混勻后置于超濾管(Millipore，50K)于4000g，25。C條件下超濾20min。精密吸取超濾液300^1置于1.5ml印管中，-70'C條件下冷凍干燥，完全凍干后取出，加入流動相100pl復(fù)溶解，5^1進樣做LC/MS分析。線性試驗分別精密吸取1000，100,10mg.L—'重組雙功能水蛭素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白血漿稀釋定容至5mL,配制成含重組雙功能水蛭素0.025，0.05，0.1，0.2，0.5,1，2.5，5ug.L—'的系列血樣，各取血清150uL，按"血漿樣品預(yù)處理"方法操作。以重組雙功能水蛭素與內(nèi)標(biāo)峰面積比(力)和重組雙功能水蛭素的濃度(O作加權(quán)(l/0線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為/4=0.1307C-2.848X1(T3r=0.9999,線性范圍為0.0255ugL—'。重組雙功能水蛭素的最低檢測限(L0D，信噪比〉3)為0.025ugL—1。精密度和回收率試驗精密吸取重組雙功能水蛭素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用空白血漿配制成含重組雙功能水蛭素0.025，0.1，0.5，2.5ugL一'的系列血樣,各取血漿150uL，按"血漿樣品預(yù)處理"方法操作。根據(jù)線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，(C實測/C理論)X100%即為回收率。表1是血漿中重組雙功能水蛭素濃度的日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種測定人血漿和/或血清中重組雙功能水蛭素的方法，其特征是采用超濾法和冷凍干燥法對待測樣品進行預(yù)處理，在分析色譜柱分離后用質(zhì)譜檢測器檢測，包括以下步驟(1)蛋白分離水溶性的水蛭素樣品與血漿蛋白的分離以20％甲酸水溶液酸化并稀釋血樣，混勻后置于超濾管Millipore，50K于4000g，25℃條件下超濾20min；(2)樣品富集水蛭素的濃縮超濾液置于1.5mlEppendorf管中，-70℃條件下冷凍干燥，完全凍干后取出，-70℃條件下保存；(3)樣品分析將凍干后的樣品取出，加入10％甲酸50μl復(fù)溶解，10μl進樣做LC/MS分析，色譜條件采用填料為十八烷基鍵合相硅膠為填料的液相色譜柱，高效液相系統(tǒng)采用通用型高壓泵，流動相采用甲醇和0.1％甲酸溶液，梯度洗脫；質(zhì)譜條件單級四極桿質(zhì)譜檢測器，電噴霧離子源，正離子模式下選擇離子監(jiān)測M/Z1433，干燥氣流速13L/min，霧化氣壓力50psig，干燥氣溫度350℃，碎片電壓220V，毛細(xì)管電壓5500V。內(nèi)標(biāo)法定量。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定人血漿和/或血清中重組雙功能水蛭素的方法，其特征是所述的待測樣品為人血漿或血清。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的測定人血漿和/或血清中重組雙功能水蛭素的方法，其特征是所述的步驟(3)的色譜條件其中色譜柱采用AgilentExtendds分析柱150X2.1mm,i.d.，5nm;柱溫為35'C;流動相是甲醇一O.l%甲酸水溶液梯度洗脫，流速為0.3ml/min;質(zhì)譜條件采用電噴霧離子化，采集正離子。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測定方法，具體涉及一種測定人血漿/血清中重組雙功能水蛭素的分析方法。本方法采用超濾法分離蛋白，解決了水溶性的水蛭素和蛋白的分離問題；采用冷凍干燥技術(shù)，使血樣中微量的水蛭素得以富集；采用質(zhì)譜檢測器，明顯提高了檢測的選擇性和靈敏度；整個色譜分析過程時間為15min以內(nèi)。本方法樣品取樣少，前處理簡單、快速、靈敏，分析周期短，可使水蛭素測定的選擇性提高，靈敏度提高兩個數(shù)量級，適合于重組雙功能水蛭素體內(nèi)藥物的濃度測定。本方法還可對游離重組雙功能水蛭素的濃度進行測定。文檔編號G01N33/48GK101162228SQ20071017041公開日2008年4月16日申請日期2007年11月14日優(yōu)先權(quán)日2007年11月14日發(fā)明者宋后燕,蘇圣民,煒莫,郁韻秋申請人:復(fù)旦大學(xué)