專利名稱：基于衍生方法的尿液代謝物的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術領域的尿液代謝物的檢測方法，具體涉及一 種基于衍生方法的尿液代謝物的檢測方法。
背景技術：
尿液中代謝物的測定對于了解正常的生理過程、疾病的機制、藥物治療的
靶點，以及藥物藥效的評價有著極為重要的意義。從上個世紀中期開始人們就
一直在通過代謝物的測定來了解疾病。例如， 一個經(jīng)典的例子是苯丙酮酸尿癥，
人們通過檢測尿液中的苯丙酮酸來反應人體是否有基因的缺陷。近年來，以測
定體液中代謝物為主要研究目標的代謝組學更是將代謝物的檢測推向一個新的
階段，人們嘗試用各種先進的儀器和方法測定體液包括尿液和血液等中的代謝
物，通過多維統(tǒng)計的計算方法，從整體上反映發(fā)病個體與健康對照之間的代謝
差異，從而提高對疾病的理解，并為探索疾病的診斷和治療提供新的突破口。
目前，能相對全面地檢測體液中代謝物的工具主要有核磁共振(NMR)、液相色
譜質譜聯(lián)用和氣相色譜質譜聯(lián)用技術。與另外兩種技術相比，氣相色譜質譜聯(lián)
用技術有更高的靈敏度和更強大的物質鑒定功能，可以為全面了解代謝產(chǎn)物提
供更豐富的信息。但是，氣相色譜質譜聯(lián)用技術只能檢測具有揮發(fā)性的物質，
而代謝物產(chǎn)物中，特別是尿液中的一般都是強極性物質，因此通常需要衍生的
方法降低被測物的極性以達到氣質聯(lián)用檢測的要求。
經(jīng)對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，迄今為止，代謝物的氣相色譜分析的前衍
生化方法主要是硅烷化，Zhang， Q等在《Journal of Chromatography B》(色
譜B) (2007年，第854期20-25頁)上發(fā)表的"GC/MS analysis of the rat
urine for metabonomic research."(氣相色譜質譜聯(lián)用分析大鼠尿樣的代謝
組學研究)，該文中主要是硅烷化，該法能衍生包括氨基酸、氨類、糖類、膽
固醇和有機酸等多類體液中的主要代謝物，但該衍生方法對檢測環(huán)境要求較高，
衍生物在空氣中容易被水分潮解，同時對氣相色譜質譜的檢測器污染嚴重，從
而影響測定的準確性，容易導致產(chǎn)生錯誤的信息，影響最終的分析研究結果。 氯甲酸甲酯的衍生方法也是氣相色譜質譜聯(lián)用經(jīng)常運用的一個衍生方法，可以 分析氨基酸類、氨類以及有機酸類等多種物質。氯甲酸甲酯的衍生最大優(yōu)勢是 可以在水相中直接對被分析物進行衍生，再用通過氯仿等有機溶劑萃取衍生物 進行分析，同時氯甲酸甲酯的衍生物不含硅垸基，不會對色譜柱和檢測器造成 污染，這樣可以提高分析物的可信度。另外，氯甲酸甲酯衍生操作還有反應時 間短、操作簡便、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。氯甲酸甲酯的衍生方法以往被用于氨基酸 和有機酸的測定，進一步檢索中，目前尚未發(fā)現(xiàn)在機體代謝物中運用的相關文 獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于衍生方法的尿液代謝物的檢測 方法，使其用于檢測有機體尿液中代謝特征，為了解正常的生理過程、疾病的 發(fā)生發(fā)展機制、藥物治療的靶點提供有效的信息和依據(jù)，該方法操作簡便、穩(wěn) 定性高、結果可靠。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，包括以下步驟
第一步，將收集的尿液離心后保存。
所述保存，其溫度為-80C。
第二步，取第一步得到的尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，并在超聲 儀上超聲作用進行衍生反應。
所述尿液，其用量為600μL，加入40μL甲醇、100μL吡啶、50叱氯甲酸甲酯。
所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。
第三步，取氯仿對第二步中衍生混合液進行萃取，并加入氫氧化鈉溶液。
所述氯仿用量為300μL。
所述氫氧化鈉溶液加入量為100μL。
所述氫氧化鈉溶液，其濃度為7 mol/L。
第四步，取氯甲酸甲酯加入第三步的溶液中，再次混合，并在超聲儀上超 聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下 的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定。
所述氯甲酸甲酯，其用量為50A。所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。 所述渦旋，其時間為30s。
所述離心，其時間為IO min，轉速為3000轉/分鐘。 第五步，取氯仿層用于氣相色譜色譜質譜聯(lián)用測定。 所述氯仿層用量為l化。
代謝特征研究的是代謝終產(chǎn)物，它不僅能反應基因變化所帶來的相應的機 體機能改變，同時也能反應外界環(huán)境刺激引起的變化，它是一種反應機體綜合 表征的方法。代謝組學利用高分辨率的檢測儀器，例如核磁共振、色譜與質譜 聯(lián)用等方法檢測體液中的代謝物，結合多維統(tǒng)計的數(shù)學計算，能準確尋找到疾 病狀態(tài)下的代謝產(chǎn)物變化。通過分析這些與疾病相關的代謝特征，從而建立潛 在的生物標志物，利用這些標志物可以進行疾病的早期診斷和分期，并為疾病 的治療提供新的可能的耙標。
尿液，作為機體代謝的最終排泄物，是一種包含了豐富代謝變化信息的體 液樣本，同時它的獲取屬于完全無創(chuàng)性的，適合于動物代謝組研究或臨床大規(guī) 模的體檢排査。本發(fā)明操作簡單，可以在水相中進行反應，反應快捷，超聲反 應2分鐘即可，穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。


圖1是本發(fā)明實施例1所得用氯甲酸甲酯衍生大鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖2是本發(fā)明實施例2所得用氯甲酸甲酯衍生小鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖3是本發(fā)明實施例3所得用氯甲酸甲酯衍生豚鼠尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
圖4是本發(fā)明實施例4所得用氯甲酸甲酯衍生人體尿液所得氣相質譜總離 子流圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方 案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的 保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1取-80'C下保存的大鼠尿樣(用代謝籠收集的大鼠24小時尿樣)，解凍后離 心去除沉淀。取上清液600yL，加入甲醇400^L、吡啶100uL，并加入50uL 氯甲酸甲酯，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍 生混合液進行萃取。并加入7 mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加5(mL氯甲酸 甲酯于上述溶液中，進行混合，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反 應；反應完畢將反應液蝸旋30s后，離心10min (3000轉/分鐘)，棄去水層， 剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定。結果如附 圖1所示。從中分析鑒定了尿液中的85個代謝物，包括20種氨基酸，32種有 機酸，12種胺類和20種其它的物質。
實施例2
取-8(TC下保存的小鼠尿樣(用代謝籠收集的小鼠24小時尿樣)，解凍后離 心去除沉淀。取上清液600uL，加入400uL甲醇、100uL吡啶，和50uL氯 甲酸甲酯，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍生 混合液進行萃取。并加入7 mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加50叱氯甲酸甲 于上述溶液中，進行混合，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應； 反應完畢將反應液蝸旋30s后，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩 下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定。測定結果如 附圖2所示。從中分析鑒定了尿液中的45個代謝物，包括12種氨基酸，18種 有機酸，5種胺類和10種其它的物質。
實施例3
取-8(TC下保存的豚鼠尿樣(用代謝籠收集的豚鼠24小時尿樣)，解凍后離 心去除沉淀。取上清液600u L，加入400uL甲醇、100uL吡啶，和50uL氯 甲酸甲酯，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行衍生反應。取300叱氯仿對衍生 混合液進行萃取。并加入7mol/L IOO叱的氫氧化鈉溶液，再加50ML氯甲酸甲 酯于上述溶液中，進行混合，并在40KHz超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應； 反應完畢將反應液蝸旋30s后，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩 下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定。測定結果如 附圖3所示。從中分析鑒定了尿液中的91個代謝物，包括18種氨基酸，35種 有機酸，9種胺類和29種其它的物質。 實施例4
取-8(TC下保存的人尿樣(晨尿)，解凍后離心去除沉淀。取上清液600ixL， 加入400pL甲醇、100wL吡啶和50uL氯甲酸甲酯，并在40KHz超聲儀上超聲 60s進行衍生反應。取300PL氯仿對衍生混合液進行萃取。并加入7 mol/L IOO叱 的氫氧化鈉溶液，再加50叱氯甲酸甲酯于上述溶液中，進行混合，并在40KHz 超聲儀上超聲60s進行二次衍生反應；反應完畢將反應液蝸旋30s后，離心10 min (3000轉/分鐘)，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相 色譜質譜聯(lián)用分析。測定結果如附圖4所示。從中分析鑒定了尿液中的81個代 謝物，其中21種氨基酸，30種有機酸，13種胺類和17種其它的物質。
權利要求
1、一種基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將收集的尿液離心后保存；第二步，取第一步得到的尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，并在超聲儀上超聲作用進行衍生反應；第三步，取氯仿對第二步中衍生混合液進行萃取，并加入氫氧化鈉溶液；第四步，取氯甲酸甲酯加入第三步的溶液中，再次混合，并在超聲儀上超聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定；第五步，取氯仿層用于氣相色譜色譜質譜聯(lián)用測定。
2、 根據(jù)權利要求1所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其特征是，第一步中，所述保存，其溫度為-80℃。
3、 根據(jù)權利要求1所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其特征是，第二步中，取尿液600uL，加入40uL甲醇、100uL吡啶、50uL氯甲酸甲酯。
4、 根據(jù)權利要求1或3所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法， 其特征是，第二步中，所述超聲儀，其超聲頻率為40KHz，超聲作用時間為60s。
5、 根據(jù)權利要求1所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其特征是，第三步中，所述氯仿用量為300uL，所述氫氧化鈉溶液加入量為100uL。
6、 根據(jù)權利要求1或5所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法， 其特征是，第三步中，所述氫氧化鈉溶液，其濃度為7 mol/L。
7、 根據(jù)權利要求1所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其特征是，第四步中，所述氯甲酸甲酯，其用量為50uL；所述超聲儀，其超聲頻率 為40KHz，超聲作用時間為60s。
8、 根據(jù)權利要求1或7所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法， 其特征是，第四步中，所述蝸旋，其時間為30s。
9、根據(jù)權利要求1或7所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法， 其特征是，第四步中，所述離心，其時間為1O min，轉速為3000轉/分鐘。
10、根據(jù)權利要求1所述的基于衍生方法的尿液代謝特征的檢測方法，其 特征是，第五步中，所述氯仿層用量為lμL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程技術領域的基于衍生方法的尿液代謝特征物的測定方法，具體為將收集的尿液離心后保存；取尿液，加入甲醇、吡啶、氯甲酸甲酯，并在超聲儀上超聲作用進行衍生反應；取氯仿對衍生混合液進行萃取，并加入氫氧化鈉溶液；取氯甲酸甲酯加入上步所得的溶液中，再次混合，并在超聲儀上超聲作用進行二次衍生反應，反應完畢將反應液蝸旋，再離心，棄去水層，剩下的氯仿層用少量無水硫酸氫鈉干燥，待氣相色譜質譜聯(lián)用測定；取氯仿層用于氣相色譜色譜質譜聯(lián)用測定。本發(fā)明具有操作簡單(可以在水相中進行反應)、反應快捷(超聲反應2分鐘即可)、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高等特點。
文檔編號G01N30/00GK101206203SQ200710172348
公開日2008年6月25日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權日2007年12月14日
發(fā)明者李后開, 墨 淡, 偉 賈, 邱云平 申請人:上海交通大學