專利名稱：：乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)測定試劑盒及其制備方法，結(jié)合了生物素一親和素免疫放大技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒屬嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。中國是乙型肝炎的高流行區(qū)，但目前尚無有效的抗病毒方法治療乙型肝炎病毒慢性感染，因此病毒的預(yù)防和檢測就是避免感染的重要手段，對病毒感染的動態(tài)監(jiān)測也能為乙肝的發(fā)展、預(yù)后提供重要的信息。乙肝病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的外膜蛋白，由乙型肝炎病毒基因組的s區(qū)所編碼。乙型肝炎病毒表面抗原依靠三個啟動子進(jìn)行表達(dá)后，產(chǎn)物分別為大蛋白(LHBs，包括前S1，前S2和S);中蛋白(MHBs，包括前S2和S);小蛋白(SHBs，包括S)，我們通常檢測的乙肝表面抗原實(shí)際指的是小蛋白(SHBs)。乙型肝炎病毒可以分泌三種病毒顆粒小球形顆粒(直徑約22mn)，主要由MHBs和SHBs組成，管狀顆粒(直徑約22nm，長度約100-1000nm)，由LHBs，MHBs和SHBs組成；Dane顆粒，其外膜結(jié)構(gòu)蛋白組成與管狀顆粒一致，Dane顆粒包含有乙型肝炎病毒DNA。完整病毒顆粒外膜的組成依賴于LHBs，MHBs和SHBs三種蛋白的共同作用，而在LHBs缺失的情況下，后兩者只能形成小球形顆粒，因此LHBs的表達(dá)實(shí)際上起著調(diào)節(jié)病毒外膜組裝能力的作用。只有當(dāng)LHBs蛋白表達(dá)達(dá)到一定的量時，病毒顆粒才能以有包膜的形式(包括管狀顆粒和Dane顆粒)被釋放。因此，檢測LHBs，實(shí)際反應(yīng)的是體內(nèi)管狀顆粒和Dane顆粒的實(shí)際水平，由于Dane顆粒代表著病毒基因在血液中的實(shí)際存在，因此LHBs的存在實(shí)際上不僅因意味著病毒基因，也代表著無病毒基因管狀顆粒形式的存在。而臨床的慢性肝炎病人中，血液中和肝細(xì)胞中都有管狀顆粒，其濃度甚至是真病毒顆粒的上萬倍。因此可以根據(jù)檢測血液中LHBs的含量，來判斷病毒攜帶者體內(nèi)的乙型肝炎病毒是否雜進(jìn)行復(fù)制。近年來，臨床開始出現(xiàn)前S1抗原診斷試劑盒，其利用單獨(dú)表達(dá)前S1片段制備單克隆抗體，進(jìn)行免疫學(xué)檢測血清中前S1蛋白的存在，但是臨床數(shù)據(jù)顯示這種試劑盒存在諸多不足，最顯著的就是漏檢，臨床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量PCR檢測乙型肝炎病毒DNA陽性的標(biāo)本使用前S1抗原診斷試劑盒檢測是陰性。而大量基礎(chǔ)研究表明在乙肝病毒大蛋白上并不存在單獨(dú)的前Sl區(qū)段，而是存在前Sl和前S2區(qū)組成的構(gòu)象型前S區(qū)，前S區(qū)和S區(qū)一起構(gòu)成大蛋白。大蛋白的前S序列對于乙型肝炎病毒的形成具有重要功能，該區(qū)域內(nèi)的少量氨基酸的替換都會阻斷病毒粒子的形成，這個區(qū)域也橫跨了前S1和前S2的銜接區(qū)，因此前S區(qū)更應(yīng)當(dāng)作為一個整體來研究?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是把高靈敏的化學(xué)發(fā)光分析方法和特異性強(qiáng)的免疫分析方法相結(jié)合發(fā)展起來的一項(xiàng)具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性的新的免疫分析技術(shù)。利用雙抗體夾心法檢測乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白，兩株配對的單克隆抗體分別針對一個抗原表位，因而具有極高的特異性，可<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>以Hk遝tf、J從111L涫屮尚反符開tf、J識別相tfJ饑股。早判刊用柳埋吸附忙早兄瞎饑，包被到固相上(聚苯乙烯板，磁顆粒等)會存在單抗用量大，活性損失大等缺點(diǎn)，而且工藝優(yōu)化較為繁瑣，而將鏈親和素包被于固相載體上，使捕獲抗體生物素化，以上問題即可迎刃而解，本發(fā)明利用鏈親和素固相，將生物素化單抗和堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記單抗以適當(dāng)?shù)谋壤y(tǒng)一于一種液相內(nèi)，將血清樣品加入固相抗體，再加入兩種標(biāo)記單抗的混合液，固相上的鏈親和素迅速與生物素結(jié)合，生物素化單抗和ALP標(biāo)記單抗與血清中的大蛋白分子形成特異性的夾心結(jié)合，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，利用化學(xué)發(fā)光儀檢測相對發(fā)光強(qiáng)度，就可以定量分析反映血清中乙型肝炎病毒大蛋白的含量，進(jìn)而體現(xiàn)乙型肝炎病毒的感染水平。生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem,BAS)具有多級的信號放大作用，并且不增加非特異性千擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。生物素親和素免疫放大技術(shù)可以直接用標(biāo)記親和素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，這種方法稱為標(biāo)記親和素-生物素法。待測反應(yīng)體系可以利用生物素化抗體，使得親和素-生物素系統(tǒng)與免疫分析檢測體系偶聯(lián)，放大終反應(yīng)先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標(biāo)準(zhǔn)抗原和待測抗原)同時反應(yīng)，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，再加入親和素與復(fù)合物中的生物素結(jié)合，最終使反應(yīng)信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。本發(fā)明的目的正是為了解決目前臨床上用前Sl單克隆抗體作為乙型肝炎大蛋白指標(biāo)檢測手段的不足，利用基因工程技術(shù)，表達(dá)出與體內(nèi)大蛋白序列基本一致、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似的大蛋白，利用此大蛋白制備篩選出兩株配對的單抗，以此為基礎(chǔ)，研制出特異性診斷乙型肝炎病毒大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)證明，操作簡便，靈敏度高，特異性好，與PCR檢測乙型肝炎病毒DNA結(jié)果符合度極高，提高了乙型肝炎病毒大蛋白前S區(qū)的檢出率，輔助臨床在蛋白水平上觀察病毒復(fù)制的水平，為盡早采取有效綜合治療方案，預(yù)防肝硬化和肝癌的發(fā)生。另外，現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)，既可應(yīng)用于開放式的半自動化學(xué)發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應(yīng)用
發(fā)明內(nèi)容題，即將生物素一親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)與乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)的免疫分析學(xué)有效地結(jié)合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)的試劑盒，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析測定乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)的試劑盒。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品；2)鏈親和素化的固相載體；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；4)堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；以及5)上述堿性磷酸酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物1，2-二氧乙烷類衍生物。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學(xué)發(fā)光底物1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙二垸、CSPD或CDP-Star。優(yōu)選地，上述試劑盒中，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含24gTris、160glNaCI、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)以乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)純品配制乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品；2)以鏈親和素包被固相載體；3)使乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體生物素化；4)用堿性磷酸酶標(biāo)記乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；5)配制化學(xué)發(fā)光底物l，2-二氧乙烷類衍牛物；6)分裝上述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品、牛物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物1，2-二氧乙烷類衍生物；以及7)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選，所述鏈親和素包被固相載體的步驟2)包括以下步驟1)包被采用0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及'3)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO4.2H2O、2.9gNaH2PCV12H2O、10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。具體地，所述包被方法可以包括1)包被采用lOOOmL的0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液(包含4.44g的檸檬酸和7.3g的檸檬酸三鈉去離子水溶液制成緩沖液)，與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO4'2H2O、2.9gNaH2PO4'12H2O、10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。在上述方法中，優(yōu)選，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。在上述方法中，優(yōu)選，所述1，2-二氧乙烷類衍牛物為(金剛烷)-1，2-二氧乙院、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star;更優(yōu)選地，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基陽l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。具體的上述試劑盒可以包括乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品、鏈親和素化的微孔板、生物素化的單抗、堿性磷酸酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物液、洗滌緩沖液等。其中，所述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級，純度不低于90%;鏈親和素化的微孔板為48或96孔的微孔板條；標(biāo)記抗體的酶為偶聯(lián)堿性磷酸酶(ALP);化學(xué)發(fā)光底物液為3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷(AMPPD)溶液；洗滌緩沖液為Tris-HCl。本發(fā)明"乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以準(zhǔn)確的診斷出乙型肝炎病毒的復(fù)制感染情況。該發(fā)明使用了針對構(gòu)象型乙型肝炎大蛋白前s區(qū)的高度特異性單克隆抗體，真實(shí)地反應(yīng)出血清中大蛋白前s區(qū)的實(shí)際水平，顯示出極高的靈敏度，沒有交叉反應(yīng)，特異性良好，便于產(chǎn)業(yè)化及質(zhì)量控制。該試劑盒可以根據(jù)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)含量的多少判斷治療效果及其病情的變化，具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。該乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法與生物素-親和素免疫放大技術(shù)結(jié)合)的各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到酶聯(lián)免疫分析試劑盒的分析法水平。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學(xué)發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，酶標(biāo)記的抗體與載體i:包被的抗體和被測樣品的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)形成"雙抗體夾心"結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明采用的"雙抗體夾心法"反應(yīng)模式，既有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，這種模式還便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而臨床符合率大大提高，可為乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。近年大量研究證實(shí)，生物素一親合素系統(tǒng)可以與包括酶在內(nèi)的多種標(biāo)記試劑結(jié)合。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用生物素一親合素系統(tǒng)，與酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體高親合力的牢固結(jié)合，并產(chǎn)生多級放大效應(yīng)，使生物素一親合素系統(tǒng)免疫標(biāo)記和示蹤分析更加靈敏，能夠更高效地診斷乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)。圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒校準(zhǔn)曲線的線性圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l制備本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒一、酶標(biāo)抗體制備和生物素偶聯(lián)抗體的制備1.乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)單克隆抗體用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯(lián)，對PBS充分透析，加等體積甘油，一2(TC以下保存。2.生物素偶聯(lián)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體的制備(1)用常規(guī)方法將生物素(BNHS)溶于N,N—二甲基甲酰胺(DMF)配成lmg/ml>;(2)用0.1mol/LpH值為9.0的NaHC03將純化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體稀釋為12mg/mL;(3)按BNHS與抗體容積比為1:8或重量比1:7左右混合，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24h;(4)裝入透析對0.05mol/LpH值為7.2的PBS，4'C透析過夜，結(jié)合物加等體積甘油，小量分裝，一2(TC以下保存?zhèn)溆谩?.生物素化單抗和酶標(biāo)記單抗混合工作液的配制將制備好的生物素化單抗和酶標(biāo)記單抗以不同的配比混合，使用酶稀釋液將酶標(biāo)記單抗稀釋成不同的稀釋度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的配比為3:4、最佳的酶稀釋度為1:20000。二、乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品的制備用乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)純品配制校準(zhǔn)品，濃度分別為0、2、5、20、50、100ng/mL，分裝6瓶。三、鏈親和素化的固相微孔板制備(1)包被采用0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上；具體地，所述包被方法包括檸檬酸4.44g檸檬酸三鈉7.3g去離子水1000mL溶解混勻后，調(diào)整pH值至4.6，加入5.0mg鏈親和素混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL，4'C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin300lmL雙蒸水定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7,0。每孔分別加入封閉液300jLiL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進(jìn)行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置28'C保存。四、酶標(biāo)單抗稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlmL雙蒸水lOOOmL五、化學(xué)發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法-Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL雙蒸水lOOOmLProclin300lmLAMPPD200mL六、洗滌緩沖液Tris24gNaCl160gKC14gHC115ml」去離子水lOOOmL調(diào)整pH值至7.4。七、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進(jìn)行了篩選試驗(yàn)和質(zhì)量鑒定，包括標(biāo)記抗體與生物素化抗體的活性、親和素化載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對親和素化載體的方法進(jìn)行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進(jìn)行試驗(yàn)，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，通過親和素不同包被濃度試驗(yàn)找到最佳的濃度條件。對于生物素偶聯(lián)抗體和對于ALP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比試驗(yàn)最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法，并對生物素偶聯(lián)抗體和酶標(biāo)記物使用的稀釋液進(jìn)行了長期的考察試驗(yàn)，配制出了能夠使生物素偶聯(lián)抗體和酶標(biāo)記物長期保持活性而穩(wěn)定的稀釋液。再次通過多次方陣交叉試驗(yàn)確定了生物素化的抗體與酶標(biāo)記物混合的適當(dāng)比例為3:4。利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國臨床檢測篩查。實(shí)施例24制備本發(fā)明的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以分別以塑料珠、塑料管或磁性顆粒作為載體，以及封閉液pH值為7.2、7.4、7.6外，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實(shí)施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實(shí)施例l制備的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)洗滌緩沖液配制將試劑盒提供的洗滌液緩沖液加蒸餾水20倍稀釋；2)將鏈親和素包被的固相載體(微孔板條)、校準(zhǔn)品/待測樣品、化學(xué)發(fā)光底物液、酶標(biāo)記抗體從4'C冰箱中取出，放置15min，平衡至室溫；3)將實(shí)驗(yàn)需要的微孔板條(已包被好鏈親和素)固定在板架上；4)反應(yīng)孔中分別加待測樣品和各濃度校準(zhǔn)品每孔加0、2、5、20、50、100ng/mL各25nL，每次試驗(yàn)設(shè)空白l孔，然后除空白孔外各孔加生物素化的抗體和酶標(biāo)記物混合體積100pL，于微量振蕩器上振蕩30秒混勻，室溫溫育45分鐘；5)棄去孔中溶液，用PBS洗液，自動洗板機(jī)或者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；6)每孔加化學(xué)發(fā)光底物10(HiL，振蕩混勻，室溫(2028°C)反應(yīng)30分鐘；7)在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測量時間1秒/孔；8)分別對校準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)RLU取對數(shù)，在雙對數(shù)坐標(biāo)圖上建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以校準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，RLU值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見附圖1，以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)的濃度；9)打印檢測結(jié)果報(bào)告。實(shí)施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果見下表l:表l試劑盒的技術(shù)指標(biāo)檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上結(jié)果表明"乙肝表面抗原大蛋白前s區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，，的準(zhǔn)確性、特異性、精密性、靈敏度和穩(wěn)定性是完全符合要求的。實(shí)施例7使用本發(fā)明的試劑盒與市場上的酶聯(lián)免疫試劑盒對病人血樣測值的比較使用本發(fā)明的試劑盒和酶聯(lián)免疫大蛋白檢測試劑盒同時檢測45份乙肝大三陽病人標(biāo)本，兩種試劑盒的比較結(jié)果見下表2:表2本試劑盒與酶聯(lián)試劑盒檢測對比結(jié)果酶免試劑盒的檢測結(jié)果合計(jì)+—+30434本試劑的檢測結(jié)果一01111合計(jì)301545從所列檢測結(jié)果數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑盒在45份大三陽標(biāo)本中檢出34份陽性，陽性率為76%，而酶免試劑盒檢出30份陽性，陽性率為67%。結(jié)果顯示本試劑盒的檢測結(jié)果與臨床具有更高的符合率，更便于推廣應(yīng)用，安全可靠。權(quán)利要求1、一種乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品；2)鏈親和素化的固相載體；3)生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；4)堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；以及5)上述堿性磷酸酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物1，2-二氧乙烷類衍生物。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈親和素化的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基—4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。4、如權(quán)利要求1或3所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為溶液，其包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、1000mL雙蒸水。5、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)純品配制乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品；2)以鏈親和素包被固相載體；3)使乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體生物素化；4)用堿性磷酸酶標(biāo)記乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；5)配制化學(xué)發(fā)光底物l，2-二氧乙垸類衍生物；6)分裝上述乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品、生物素化的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前s區(qū)單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)單克隆抗體和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物1，2-二氧乙烷類衍生物；以及7)組裝為成品。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述鏈親和素包被固相載體的步驟2)采用以下方法1)包被采用0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉，配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P(V2H20、2.9gNaH2P(V12H2O、10gBSA和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。7、如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述鏈親和素包被的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。8、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。9、如權(quán)利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為溶液，其包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHC1、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、lmLProclin300、lOOOmL雙蒸全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S區(qū)測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)大蛋白前S區(qū)校準(zhǔn)品；2)鏈親和素化的載體；3)生物素化的大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；4)堿性磷酸酶標(biāo)記的大蛋白前S區(qū)單克隆抗體；以及5)化學(xué)發(fā)光底物。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以大蛋白前S區(qū)純品配制校準(zhǔn)品；2)以鏈親和素包被載體；3)使大蛋白前S區(qū)單抗生物素化；4)以堿性磷酸酶標(biāo)記大蛋白前S區(qū)單抗；5)配制化學(xué)發(fā)光底物；6)分裝上述校準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物和化學(xué)發(fā)光底物；以及7)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號G01N21/76GK101382553SQ20071017633公開日2009年3月11日申請日期2007年10月25日優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日發(fā)明者姚洪濤,應(yīng)希堂,根石,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司