專利名稱：化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測rbp4試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)，特別是涉及一種化學(xué)發(fā)光磁酶免
疫法定量檢測血清視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)的試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高、生活方式的改變，2型糖尿病已經(jīng)成為一種嚴重危害 人類健康的慢性疾病，在過去的20年間，糖尿病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)增加。據(jù) 估計，2010年全球糖尿病人數(shù)將增加至2.2億左右，糖尿病前期人數(shù)，包括糖耐量 異常和空腹血糖受損，也將達到甚至超過糖尿病人數(shù)，2型糖尿病及其并發(fā)癥的治療 已經(jīng)成為沉重的經(jīng)濟負擔，因此對其早期診斷和積極預(yù)防具有重要意義。胰島素抵 抗是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和主要病理生理基礎(chǔ)，所謂胰島素抵抗是指胰島素 作用的靶組織中胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙及胰島素的生物學(xué)作用降低。目前研究顯示， 90%以上的2型糖尿病患者都存在胰島素抵抗，其在糖尿病前期階段即可出現(xiàn)。不 僅如此，現(xiàn)有資料還證實胰島素抵抗是冠心病，高血壓等多種心血管疾病的高危因 素，因此對胰島素抵抗的早期識別和正確評價不僅有助于早期診斷和積極預(yù)防2型 糖尿病，而且對于冠心病，高血壓等心血管疾病風(fēng)險評價和一級預(yù)防也具有重要意 義。目前臨床上對于胰島素抵抗多采用血清C肽測定，胰島素釋放試驗，葡萄糖耐 量試驗等間接指標進行評價和診斷，這些檢測方法相對容易受患者飲食及藥物治療 情況的干擾，從而影響檢查結(jié)果的準確性和客觀性，另一方面操作過程復(fù)雜， 一次 檢測中患者需要多次反復(fù)抽血。因此尋求客觀、準確、靈敏、簡便的評價胰島素抵 抗的指標成為臨床迫切需要解決的問題。
視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)是近年來Nature (2005 Jul 21 ;436(7049) :356-62) 和New England J Med (2006 Jun 15:354(24) :2596-8.)等雜志報道的與2型糖尿病 患者胰島素抵抗形成密切相關(guān)的血清蛋白分子。人RBP4基因位于染色體10q，其轉(zhuǎn) 錄的mRNA全長為941bp，編碼的RBP4蛋白由181個氨基酸組成。RBP4蛋白是一 血清轉(zhuǎn)運蛋白，其主要功能是在血液循環(huán)中轉(zhuǎn)運視黃醇，正常情況下RBP4主要由肝細胞分泌，其次為脂肪組織。現(xiàn)有動物試驗已經(jīng)證實，在脂肪組織特異性葡萄糖 轉(zhuǎn)運子4 (GLUT4)基因敲除的胰島素抵抗小鼠模型中RBP4水平選擇性增加，通過 轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高小鼠RBP4的血清水平，可導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，而對其表達的 抑制可改善小鼠胰島素敏感性和增加血糖穩(wěn)定性；RBP4在血液循環(huán)中與甲狀腺素運 載蛋白結(jié)合成大分子的復(fù)合物，不易從腎臟代謝，而人工合成的視黃醇衍生物芬維A 胺能解除RBP4與甲狀腺素運載蛋白的結(jié)合，促進RBP4從腎臟的排泄，可以降低胰 島素抵抗肥胖鼠模型血清RBP4水平，從而改善胰島素抵抗狀態(tài)。這些研究結(jié)果顯 示RBP4為一種新的脂肪源性信號，參與胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生。在動物 試驗的基礎(chǔ)上多個臨床觀察亦顯示血清RBP4水平與2型糖尿病患者胰島素抵抗狀 態(tài)密切相關(guān)，在胰島素抵抗患者其血清水平顯著升高，而治療后RBP4水平的下降， 則提示患者胰島素抵抗狀態(tài)的改善和胰島素敏感性增加。目前研究結(jié)果顯示血清 RBP4水平可成為直接評價2型糖尿病患者胰島素抵抗的獨立相關(guān)性指標，并有可能 成為改善2型糖尿病患者胰島素抵抗狀態(tài)的治療靶點。由于RBP4蛋白在正常人群 有基礎(chǔ)量表達和分泌，因此對血清RBP4水平精確、靈敏的定量檢測，是確保其可 成為臨床輔助診斷和評價胰島素抵抗實驗室指標的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是繼酶免疫測定，放射免疫測定之后發(fā)展起來的一種新 型免疫標記診斷技術(shù)。其在繼承了放射免疫測定高靈敏度優(yōu)點的同時，克服了其放 射性污染及半衰期短的缺點。在20余年的發(fā)展應(yīng)用中，其方法的敏感性，準確性， 操作的簡捷性和可重復(fù)性均得到了認可?；瘜W(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法是在化學(xué)發(fā)光免 疫分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，同時結(jié)合磁酶免疫技術(shù)，以磁性微珠為固相載體，增加吸附 面積，使抗原抗體得以最大程度的結(jié)合，大大提高檢測的靈敏度和精確性。
但對于以上技術(shù)的結(jié)合利用在檢測視黃醇結(jié)合蛋白4，還處于初期的研究起步階 段，本發(fā)明人對此進行了精心的研究，并完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、快速、簡便的與2型糖尿病患者胰島素 抵抗形成密切相關(guān)的RBP4蛋白作為輔助診斷和評價胰島素抵抗的新血清學(xué)指標， 選用化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)作為檢測方法，構(gòu)建可定量檢測人血清RBP4蛋白 水平的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析檢測試劑盒。本試劑盒可作為臨床輔助診斷2型糖尿 病及某些心血管疾病患者胰島素抵抗狀態(tài)的新型實驗室檢查手段。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
5一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒，其特征在于，包括試劑一特 異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫磁珠，用量為5-10ul/ul樣品，試劑二酶標記的特 異性鼠抗人RBP4抗體II，用量為l-5ul/ul樣品，試劑三化學(xué)發(fā)光底物，用量為10--15ul/ml，試劑四相應(yīng)的標準液和質(zhì)控液，標準液為梯度濃度的RBP4蛋白標準品溶 液，用量為5-10ul;質(zhì)控液分為質(zhì)控A液和質(zhì)控B液質(zhì)控A液為針對特異性鼠抗 人RBP4抗體的二抗(兔抗鼠IgG)，用量為5ul/ml;質(zhì)控B液為己知濃度的RBP4 樣品，用量為10ul。
一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒制備步驟如下
a. RBP4免疫磁珠制備選用超順磁聚合物磁性微球作為磁珠(該磁珠可以成品的方 式得到)載體，其內(nèi)部分散著平均直徑8-10納米左右的超順磁性四氧化三鐵，其表 面易于修飾上活性基團；經(jīng)活性基團修飾的磁珠通過PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 進行清洗，加入到體積比為5: 100的5%戊二醛/ PBS溶液中室溫避光振蕩反應(yīng)后 進行磁性分離，多次清洗后制得活化磁珠；取活化磁珠與特異性鼠抗人RBP4抗體I 以比例100-150ug抗體/mg磁珠在室溫下孵育，磁性分離后，加入過量的10%牛血 清白蛋白(BSA)溶液以封閉未結(jié)合抗體的游離醛基，即得到特異性鼠抗人RBP4 抗體I包被的免疫活性磁珠。
b. 酶標抗體制備根據(jù)不同標記酶的要求，將相應(yīng)量特異性鼠抗人RBP4抗體II溶于 相應(yīng)溶劑中進行預(yù)處理，標記酶溶于相應(yīng)溶劑后所形成的酶溶液，以相應(yīng)比例與上 述抗體混合均勻并反應(yīng)，所得酶標抗體產(chǎn)物經(jīng)透析或?qū)游黾兓螅?20°0凍存于甘油 中。
c. 標準液和質(zhì)控液制備準確稱量RBP4蛋白標準品，用二甲亞砜(DMSO)溶解， 用校準品稀釋液稀釋成0 160mg/L標準溶液；質(zhì)控A液準確稱量二抗(兔抗鼠IgG) lmg，以0.5ml PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 溶解后，-2(TC凍存；質(zhì)控B液為已 知濃度的RBP4樣品。
d. 化學(xué)發(fā)光底物工作液制備化學(xué)發(fā)光底物溶解在相應(yīng)(不同的化學(xué)發(fā)光底物所選 的溶劑并不相同)的溶劑中，得到系列濃度的溶液，然后作化學(xué)發(fā)光底物一發(fā)光強 度曲線，確定該發(fā)光底物的最穩(wěn)定濃度和加入反應(yīng)體系的最佳時間。以3-(2'-螺旋金 剛垸》4-甲氧基-4-(3"-鄰氧酰苯基)-1,2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)為例，以AMPPD 濃度一發(fā)光強度作一曲線，篩選出發(fā)光信號最穩(wěn)定的AMPPD濃度，并以此作為 AMPPD工作濃度。在確定的AMPPD濃度下，根據(jù)AMPPD反應(yīng)時間一發(fā)光強度的曲線，確定AMPPD加入反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)時間。 步驟a中所述的磁珠表面修飾上的活性基團為氨基。 步驟b中所述的標記酶為堿性磷酸酶或過氧化物酶。
步驟c中所述的標準液是用來繪制標準曲線的，而質(zhì)控液是用來監(jiān)測上述試劑一， 二，三的有效性。
步驟d中所述的化學(xué)發(fā)光底物為二氧雜環(huán)丁垸類化學(xué)發(fā)光劑或胺類化學(xué)發(fā)光劑等， 其中優(yōu)選二氧雜環(huán)丁垸類化學(xué)發(fā)光劑中的AMPPD。 質(zhì)控液的使用
質(zhì)控A液用法質(zhì)控A液5ul加入特異性RBP4免疫磁珠25ul，室溫孵育20min， 質(zhì)控A液中的二抗(兔抗鼠IgG)能與免疫磁珠上的鼠抗人RBP4抗體結(jié)合，再加入 酶標記的特異性鼠抗人RBP4抗體5ul，室溫孵育20min，同樣酶標記的特異性鼠抗 人RBP4抗體與質(zhì)控A液中的二抗(兔抗鼠IgG)結(jié)合后，以磁性微珠為固相載體， 在其表面形成復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入化學(xué)發(fā)光底物10ul/ml，作 用30min，通過復(fù)合物中的酶作用于化學(xué)發(fā)光底物，使其分解，反應(yīng)中釋放出的化學(xué) 能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號的有無及強度來監(jiān)測以上主要試劑(試劑 一，二，三)是否有效。
質(zhì)控B液用法質(zhì)控B液10ul (己知濃度的RBP4樣品)加入特異性RBP4免疫 磁珠50ul，室溫孵育20min，以結(jié)合質(zhì)控B液中的已知RBP4抗原，再加入酶標記 特異性鼠抗人RBP4抗體10ul，室溫孵育20min，酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與 質(zhì)控B液中的已知RBP4抗原結(jié)合后，以磁性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4 雙抗體夾心復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入化學(xué)發(fā)光底物10ul/ml，作用 30min，通過復(fù)合物中的酶作用于化學(xué)發(fā)光底物，使其分解，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能 轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號的強度獲得質(zhì)控B液中的RBP4濃度并與已 知濃度進行比較。
超順磁聚合物磁性微球是近幾年來才出現(xiàn)的一種新型磁性載體，8-10納米左右 的超順磁性四氧化三鐵的表面易于修飾上活性基團，超順磁性材料則可以使磁性微 球不象普通磁珠那樣會因剩磁而聚集成團，從而避免因聚集產(chǎn)生的非特異性誤差。
本發(fā)明的另一個目的是提供化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4的試劑盒的使 用方法，其上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒的使用方法，待測血清標本稀釋后成待檢樣品，取一定量樣品；加入特異性RBP4免疫磁珠，室溫孵育20 30min 以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入酶標記的特異性鼠抗人RBP4抗體，室溫孵 育20 30min，酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原結(jié)合后，以磁性微珠為固 相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加 入化學(xué)發(fā)光底物，作用30min，通過雙抗體夾心復(fù)合物中的酶作用于化學(xué)發(fā)光底物， 使其分解，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號強度來定 量分析血清RBP4濃度。
本發(fā)明的優(yōu)點本試劑盒設(shè)計為以化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析技術(shù)定量檢測胰島素 抵抗評價新指標一血清RBP4蛋白。例如本試劑盒所優(yōu)選的發(fā)光底物AMPPD是一種 新型的二氧雜環(huán)丁烷類化學(xué)發(fā)光劑，與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光劑相比具有發(fā)光性能穩(wěn)定， 檢測范圍大，背景干擾小，試劑存放時間長等優(yōu)點。由于本試劑盒適用于全自動儀 器分析，實驗條件標準化，人為影響因素小；試劑及標本采樣均采用無吸附材料， 相互間交叉率低；而且每個經(jīng)過質(zhì)控液質(zhì)控的試劑盒可用于多份和多次的血清檢測， 具有用量少，成本低的特點；另外本發(fā)明還具有高靈敏度，高特異性，操作檢測快 速，簡便的優(yōu)點，總之，本試劑盒是以定量檢測血清RBP4水平為目的，以最新的 微粒子化學(xué)發(fā)光磁酶免疫技術(shù)為方法，對血清RBP4水平進行精確定量檢測分析， 從而最終對于糖尿病患者機體胰島素抵抗狀態(tài)做出客觀、準確評價和診斷，因此， 其在臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。
下面通過具體實施方式
對本發(fā)明做進一步闡述，但并不意味著對本發(fā)明保護范 圍的限制。
具體實施方式
試劑盒技術(shù)指標
1. 標準曲線采用RBP4標準液七點定標，每點做5次重復(fù)測定，取均值。以縱坐
標為光強度，橫坐標為RBP4濃度，儀器自動繪出標準曲線。 標準曲線是用來說明所檢測的光信號強度和血清樣本中待測抗原RBP4濃度的 良好線性關(guān)系，此線性關(guān)系良好即說明所檢測到的光信號的強度能準確的反應(yīng)血清 樣本中待測抗原濃度。
2. 靈敏度對標準品RBP4零濃度重復(fù)測定10次，以零濃度均值士2SD確定其最低 檢測線。
3. 精密度取濃度呈梯度增加的六種血清標本，分別同批測定10次，批內(nèi)變異為
803 /。、 3.12 /。、 2.34%,均低于3%;同樣6份—ffc清，隔天 測定一次，連續(xù)測定10次，批間變異為3.03%、 3.35%、 2.97%、 3.14%、 3.21%、 3.54%, 均低于4%;符合試劑盒檢測精密度要求。
4. 準確性以回收率試驗進行測定。將已知濃度的血清樣本分成多份，分別加入不 同濃度的標準溶液，算出理論濃度值，用本試劑盒檢測以上樣本，得到測定濃度值， 用測定值/理論值，得到本試劑盒回收率。
5. 參考值確定收集并檢測300份以上正常人空腹血清樣本，確定正常參考值范圍 為25.l-32.5ug/ml。
實施例1
1.試劑盒的制備
a. RPB4免疫磁珠制備選用超順磁聚合物磁性微球作為磁珠(商品名Bruker， Biosciences Corporation制造)載體，其內(nèi)部分散著平均直徑8-10納米左右的超順磁 性四氧化三鐵；將氨基修飾活化的磁珠經(jīng)PBS緩沖液進行清洗，然后加入到5%戊 二醛/PBS溶液中室溫避光振蕩反應(yīng)后進行磁性分離，清洗多次后制備得到活化磁 珠；取活化磁珠與特異性鼠抗人RBP4抗體I以100ug抗體/mg磁珠比例在室溫下 孵育，磁性分離后，加入過量的10XBSA溶液以封閉未結(jié)合抗體的游離醛基，即得 到特異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫活性磁珠。
b. 酶標抗體制備將0.2mg特異性鼠抗人RBP4抗體II溶于1.5 mlN'N-二甲基甲酰 胺中，加入2ml 10mg/ml的堿性磷酸酶溶液，將10.8mg EDC(l-乙基-3- (二甲基丙 基)碳二亞胺鹽酸)分三次加入，每次間隔1小時，混合物不斷攪拌，4'C過夜，于 0. 01MTris緩沖液PH7. 0條件下進行透析，直至將EDC透析完全除去，加入等體積甘 油，—20'C凍存。
C.標準液制備準確稱量RBP4蛋白標準品，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用校準 品稀釋液進行系列稀釋后成0、 5、 10、 20、 40、 80、 160mg/L標準溶液。 d.化學(xué)發(fā)光底物工作液制備將劑量范圍的l-20ul AMPPD分別溶解在lml NaHC03/Na2C03緩沖液中，得到梯度濃度的AMPPD溶液。以發(fā)光底物濃度 (l-20ul/ml)—發(fā)光強度作一曲線，篩選出發(fā)光信號最穩(wěn)定的發(fā)光底物濃度10ul/ml， 并以此濃度配制發(fā)光底物工作液。在此AMPPD濃度下，根據(jù)發(fā)光底物反應(yīng)時間一 發(fā)光強度的曲線，確定發(fā)光底物加入反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)時間為30min。
并按照上述質(zhì)控液的使用方法利用質(zhì)控液對該試劑盒中試劑一、二、三的有效
9性進行檢測。 RBP4濃度的測定
將待測血清標本1 (52歲女性，有2型糖尿病病史IO余年)稀釋后成待檢樣品， 取樣品20ul，加入特異性RBP4免疫磁珠100ul，室溫孵育20min以結(jié)合樣品中的待 測RBP4抗原，再加入堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體20ul ，室溫孵育20min, 堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原的結(jié)合后，以磁性微珠為固相 載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入 10ul/ml上述的AMPPD/碳酸鹽溶液，作用30min,通過雙抗體夾心復(fù)合物中堿性磷 酸酶作用于AMPPD，使其去磷酸化分解成AMPD，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn) 定的光信號，通過檢測光信號強度達到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的測定值 為123.9ug/ml。
技術(shù)指標本試劑盒最低檢測線為0.62ng/ml;批內(nèi)變異均低于3%，批間變異 均低于5%，符合試劑盒檢測精密度要求；本試劑盒回收率為99.76% ±4.97%。 實施例2
使用與實施例1相同的試劑盒，對待測血清標本進行測定. RBP4濃度的測定
待測血清標本2 (26歲健康女性)。待測血清標本稀釋后成待檢樣品，取樣品 20ul，加入特異性RBP4免疫磁珠100ul，室溫孵育20min以結(jié)合樣品中的待測RBP4 抗原，再加入堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體20ul，室溫孵育20min，堿 性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原的結(jié)合后，以磁性微珠為固相載 體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入 10ul/ml的AMPPD/碳酸鹽溶液，作用30min,通過雙抗體夾心復(fù)合物中堿性磷酸酶 作用于發(fā)光化學(xué)底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能 轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號強度達到定量分析血清RBP4的目的。RBP4 的測定值為23.4ug/ml。
技術(shù)指標本試劑盒最低檢測線為0.62ng/ml;批內(nèi)變異均低于3%，批間變異 均低于5%,符合試劑盒檢測精密度要求；本試劑盒回收率為99.76%±4.97%; 實施例3
使用與實施例l相同的試劑盒，對待測血清標本進行測定。 RBP4濃度的測定待測血清標本3(60歲男性，超體重,有胰島素抵抗，但尚未達到2型糖尿病診斷標準)。 待測血清標本稀釋后成待檢樣品，取樣品20ul，加入特異性RBP4免疫磁珠100ul， 室溫孵育20min以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入堿性磷酸酶標記特異性鼠 抗人RBP4抗體20ul，室溫孵育20min，堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與 待測抗原的結(jié)合后，以磁性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合 物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入10ul/ml的AMPPD/碳酸鹽溶液，作用30min, 通過雙抗體夾心復(fù)合物中堿性磷酸酶作用于發(fā)光化學(xué)底物AMPPD，使其去磷酸化分 解AMPD，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號強度達到 定量分析血清RBP4的目的。RBP4的測定值為76.4ug/ml。
技術(shù)指標本試劑盒最低檢測線為0.62ng/ml;批內(nèi)變異均低于3%，批間變異均 低于5%，符合試劑盒檢測精密度要求；本試劑盒回收率為99.76%±4.97%。
實施例4
試劑盒的制備
A. RBP4免疫磁珠制備選用超順磁聚合物磁性微球作為磁珠(商品名Bruker Biosciences Corporation制造)載體，其內(nèi)部分散著平均直徑8-10納米左右的超順磁 性四氧化三鐵，該磁珠微球表面易于修飾上活性基團；將氨基修飾的活化磁珠經(jīng)PBS 緩沖液進行清洗，加入到5X戊二醛/PBS溶液中室溫避光振蕩反應(yīng)后進行磁性分 離，清洗多次后制備得到活化磁珠；取活化磁珠與特異性鼠抗人RBP4抗體I以100ug 抗體/mg磁珠比例在室溫下孵育，磁性分離后，加入過量的10。"BSA溶液以封閉 未結(jié)合抗體的游離醛基，即得到特異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫活性磁珠。 b.酶標抗體制備將0.2mg特異性鼠抗人RBP4抗體II溶于1.5 mlN'N-二甲基甲酰 胺中，加入2ml 10mg/ml的堿性磷酸酶溶液，將10.8mg EDC (1-乙基-3- (二甲基丙 基)碳二亞胺鹽酸)分三次加入，每次間隔l小時，混合物不斷攪拌，4。C過夜，于 0. 01MTris緩沖液ra7.0條件下進行透析，直至將EDC透析完全除去，加入等體積甘 油，一20。C凍存。
C.標準液制備準確稱量RBP4蛋白標準品，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用校準
品稀釋液進行系列稀釋后成0、 5、 10、 20、 40、 80、 160mg/L標準溶液。
d.化學(xué)發(fā)光底物工作液制備600ul乙醇胺，100ul 1NNaOH， 100ul 10%的NaN3，
混勻后高壓蒸汽滅菌即成。
并按照上述質(zhì)控液的使用方法利用質(zhì)控液對該試劑盒中試劑一、二、三的有效性進行檢測。
待測血清標本4 (52歲女性，有2型糖尿病病史IO余年，同待測血清標本l)稀 釋后成待檢樣品，取樣品20ul，加入特異性RBP4免疫磁珠100ul，室溫孵育20min 以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體 20ul，室溫孵育20min，堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原的結(jié)合 后，以磁性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。然后在該體系 中加入50ul的化學(xué)發(fā)光底物溶液，作用20min,通過雙抗體夾心復(fù)合物中堿性磷酸酶 作用于發(fā)光化學(xué)底物，通過檢測光信號強度達到定量分析血清RBP4的目的。RBP4 的測定值為118.6ug/m。
技術(shù)指標該劑盒最低檢測線為1.32ng/ml;批內(nèi)變異均低于5%，批間變異均 低于8%;本試劑盒回收率為93.54% ±3.71%。 實施例5
本發(fā)明的試劑盒的制備 a，RBP4免疫磁珠制備選用超順磁聚合物磁性微球作為磁珠(商品名Bruker Biosciences Corporation制造)載體，其內(nèi)部分散著平均直徑8-10納米左右的超順磁 性四氧化三鐵，該磁珠微球表面易于修飾上活性基團；將氨基修飾的活化磁珠經(jīng)經(jīng) PBS緩沖液進行清洗，加入到5%戊二醛/ PBS溶液中室溫避光振蕩反應(yīng)后進行磁性 分離，清洗多次后制備得到活化磁珠；取活化磁珠與特異性鼠抗人RBP4抗體I以 100ug抗體/mg磁珠比例在室溫下孵育，磁性分離后，加入過量的10XBSA溶液以 封閉未結(jié)合抗體的游離醛基，即得到特異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫活性磁珠。 b.過氧化物酶標抗體制備采用高碘酸氧化法進行制備。過氧化物酶8mg溶于雙蒸 水中，加入0.1mol/L過碘酸鈉0.8ml，攪拌20min，加入乙二醇0.3ml，攪拌5min， Sephadex G-25分離，分步收集后，合并棕色部分，加入抗體0.5mg，滴加碳酸鹽緩 沖液至PH9.0，室溫攪拌2小時，層析純化后，加入等體積甘油，一2(TC凍存。 C.標準液制備準確稱量RBP4蛋白標準品，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用校準 品稀釋液進行系列稀釋后成0、 5、 10、 20、 40、 80、 160mg/L標準溶液。 d.化學(xué)發(fā)光底物工作液制備1.25mmol/L魯米諾，0.136mmol/L對碘苯酚，10mmol/L Tris.HCl (PH 8.6), 0.2%乙醇，0.3mmol/LNaCl， 5mmol/L環(huán)已二胺四乙酸，4mmoI/L 的H202與4mmol/L的NaB03混合配制。
并按照上述質(zhì)控液的使用方法利用質(zhì)控液對該試劑盒中試劑一、二、三的有效
12性進行檢測。
待測血清標本5(66歲，男性，2型糖尿病病史初診患者)稀釋后成待檢樣品， 取樣品20ul，加入特異性RBP4免疫磁珠200ul，室溫孵育30min以結(jié)合樣品中的待 測RBP4抗原，再加入過氧化物酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體50ul，室溫孵育30min， 過氧化物酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原的結(jié)合后，以磁性微珠為固相載 體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。然后在該體系中加入30ul的化學(xué)發(fā)光底 物溶液，作用30min,通過雙抗體夾心復(fù)合物中過氧化物酶作用于發(fā)光化學(xué)底物，通 過檢測光信號強度定量分析血清RBP4。 RBP4的測定值165.3 ug/ml。
技術(shù)指標該劑盒最低檢測線為1.33ng/ml;批內(nèi)變異均低于5%，批間變異均 低于8%;本試劑盒回收率為90.69% ±5.27%。
實施例6
使用與實施例1相同的試劑盒，對待測血清標本進行測定. RBP4濃度的測定
待測血清標本6(66歲，男性，2型糖尿病病史初診患者，同待測血清標本5相 同)，將待測血清標本稀釋后成待檢樣品，取樣品20ul，加入特異性RBP4免疫磁 珠200ul，室溫孵育30min以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入堿性磷酸酶標記 特異性鼠抗人RBP4抗體50ul，室溫孵育30min，堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4 抗體與待測抗原的結(jié)合后，以磁性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾 心復(fù)合物。磁性分離洗滌后，在該體系中加入10ul/ml的AMPPD/碳酸鹽溶液，作用 30min,通過雙抗體夾心復(fù)合物中堿性磷酸酶作用于發(fā)光化學(xué)底物AMPPD，使其去 磷酸化分解AMPD，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號 強度達到定量分析血清RBP4的目的。RBP4的測定值為170.2ug/ml。
技術(shù)指標本試劑盒最低檢測線為0.62ng/ml;批內(nèi)變異均低于3%，批間變異 均低于5%，符合試劑盒檢測精密度要求；本試劑盒回收率為99.76% ±4.97%。 實施例7
使用與實施例1相同的試劑盒，對待測血清標本進行測定. RBP4濃度的測定
待測血清標本7(45歲，男性，體重指數(shù)正常，無糖尿病病史)，將待測血清標 本稀釋后成待檢樣品，取樣品10ul，加入特異性RBP4免疫磁珠100ul，室溫孵育20min 以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入堿性磷酸酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體50ul，室溫孵育20min，堿性磷酸酶標記特異鼠性抗人RBP4抗體與待測抗原的結(jié)合 后，以磁性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物。磁性分離洗 漆后，在該體系中加入15ul/ml的AMPPD/碳酸鹽溶液，作用30min,通過雙抗體夾 心復(fù)合物中堿性磷酸酶作用于發(fā)光化學(xué)底物AMPPD，使其去磷酸化分解AMPD，反 應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信號強度達到定量分析血清 RBP4的目的。RBP4的測定值為29.7ug/ml。
技術(shù)指標本試劑盒最低檢測線為0.62ng/ml;批內(nèi)變異均低于3%，批間變異 均低于5%，符合試劑盒檢測精密度要求；本試劑盒回收率為99.76% ±4.97%。
權(quán)利要求
1. 一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒，其特征在于，包括試劑一特異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫磁珠，用量為5-10ul/ul樣品；試劑二酶標記的特異性鼠抗人RBP4抗體II，用量為1-5ul/ul樣品；試劑三化學(xué)發(fā)光底物用量10-15ul/ml；試劑四相應(yīng)標準液和質(zhì)控液，標準液為梯度濃度的RBP4蛋白標準品溶液，用量為5-10ul，質(zhì)控液分為質(zhì)控A液和質(zhì)控B液質(zhì)控A液為針對特異性鼠抗人RBP4抗體的二抗，用量為5ul/ml；質(zhì)控B液為已知濃度的RBP4樣品，用量為10ul。
2. —種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒的制備方法，其特征在于，a. RBP4免疫磁珠制備選用超順磁聚合物磁性微球作為磁珠載體，其內(nèi)部分散著平 均直徑8-10納米左右的超順磁性四氧化三鐵，其表面易于修飾上活性基團，經(jīng)活性 基團修飾的磁珠通過PH7.4的PBS進行清洗，加入到體積比為5: 100的5%戊二醛 /PBS溶液中室溫避光振蕩反應(yīng)后進行磁性分離，多次清洗后制得活化磁珠，取活 化磁珠與特異性鼠抗人RBP4抗體I以比例100-150ug抗體/mg磁珠在室溫下孵育， 磁性分離后，加入過量的10XBSA溶液以封閉未結(jié)合抗體的游離醛基，即得到特異 性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫活性磁珠；b. 酶標抗體制備根據(jù)不同標記酶的要求，將相應(yīng)量特異性鼠抗人RBP4抗體II溶于 相應(yīng)溶劑中進行預(yù)處理，標記酶溶于相應(yīng)溶劑后所形成的酶溶液，以相應(yīng)比例與上 述抗體混合均勻并反應(yīng)，所得酶標抗體產(chǎn)物經(jīng)透析或?qū)游黾兓螅?2(TC凍存于甘油 中；c. 標準液和質(zhì)控液制備準確稱量取RBP4蛋白標準品，用DMSO溶解，用校準品 稀釋液稀釋成0 160mg/L標準溶液，質(zhì)控A液準確稱量二抗lmg，以0.5ml PH7.4的磷酸鹽緩沖液溶解后，一2(TC凍存，質(zhì)控B液為已知濃度的RBP4樣品；d. 化學(xué)發(fā)光底物工作液制備化學(xué)發(fā)光底物溶解在相應(yīng)的溶劑中，得到系列濃度的 溶液，然后作化學(xué)發(fā)光底物一發(fā)光強度曲線，確定該發(fā)光底物的最穩(wěn)定濃度和加入 反應(yīng)體系的最佳時間。
3. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒的制備，其特征在于，步驟a中所述的磁珠表面修飾 上的活性基團為氨基。
4. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒的制備，其特征在于，步驟b中所述的標記酶為堿性磷 酸酶或過氧化物酶。
5. 如權(quán)利要求2所述的試劑盒的制備，其特征在于，步驟d中所述的化學(xué)發(fā)光底物 為二氧雜環(huán)丁垸類化學(xué)發(fā)光劑或胺類化學(xué)發(fā)光劑。
6. 如權(quán)利要求2或5所述的試劑盒的制備，其特征在于，步驟d中所述的化學(xué)發(fā)光 底物為AMPPD。
7. —種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測RBP4試劑盒的使用方法，其特征在于，待測 血清標本稀釋后成待檢樣品，取一定量樣品，加入特異性RBP4免疫磁珠，室溫孵 育20 30min以結(jié)合樣品中的待測RBP4抗原，再加入酶標記特異性鼠抗人RBP4抗 體，室溫孵育20 30min，酶標記特異性鼠抗人RBP4抗體與待測抗原結(jié)合后，以磁 性微珠為固相載體，在其表面形成RBP4雙抗體夾心復(fù)合物；磁性分離洗滌后，在 該體系中加入發(fā)光化學(xué)底物，作用30min，通過雙抗體夾心復(fù)合物中的酶作用于發(fā)光 化學(xué)底物，使其分解，反應(yīng)中釋放出的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的光信號，通過檢測光信 號強度來定量分析血清RBP4濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光磁酶免疫法定量檢測人血清RBP4水平的醫(yī)用檢驗試劑盒。該試劑盒由四個試劑部分組成特異性鼠抗人RBP4抗體I包被的免疫磁珠、酶標記的特異性鼠抗人RBP4抗體II、化學(xué)發(fā)光底物、相應(yīng)的標準液和質(zhì)控液。本試劑盒使用方法為以磁珠微粒作為固相載體，在其表面結(jié)合特異性鼠抗人RBP4抗體I而成為RBP4特異性免疫活性磁珠，以酶標記的特異性鼠抗人RBP4抗體II捕獲樣本中待測抗原RBP4，并在磁珠表面形成雙抗體夾心復(fù)合物，該復(fù)合物上標記的酶能與反應(yīng)體系中相應(yīng)的發(fā)光底物反應(yīng)形成穩(wěn)定發(fā)光信號，通過檢測光信號的強度從而達到定量檢測分析RBP4的目的，具有高靈敏度，高特異性，操作簡單迅速的優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK101452001SQ20071017889
公開日2009年6月10日 申請日期2007年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日
發(fā)明者穎 王, 陳莉莉 申請人:穎 王