專利名稱：一種色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于色譜峰純度的檢驗(yàn)方法，特別屬于一種中藥色譜指紋圖譜峰純 度的檢驗(yàn)方法，尤其屬于用自身正交投影法進(jìn)行中藥色譜指紋圖譜峰純度檢驗(yàn) 的方法。
背景技術(shù)：
準(zhǔn)確識(shí)別色譜峰的純度是色譜的定性和定量分析的前提。由于中藥的化學(xué) 成分多為次生代謝產(chǎn)物，彼此間的化學(xué)結(jié)構(gòu)差別很小、理化性質(zhì)近似，其色譜 峰在色譜指紋圖譜上不可避免有重疊，準(zhǔn)確判別色譜峰純度更顯重要。鑒別色 譜指紋圖譜色譜峰的純度、確認(rèn)色譜峰，不僅增加指紋圖譜的信息量，而且有 助于對(duì)中藥的深入研究。色譜峰純度的定性可歸結(jié)為儀器方法和化學(xué)計(jì)量學(xué)方 法，其中后一方法又是前一方法的基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法有①巻積-奇異值漸進(jìn)圖法(沈衛(wèi)陽，MM.巻積一奇異值漸進(jìn)圖法在色譜峰純度鑒別中
的應(yīng)用，計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2002, 19(3): 283-284.);②二維巻積法(沈衛(wèi)陽， 胡育筑.二維巻積及其在色譜峰純度鑒定中的應(yīng)用.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué) 報(bào)，2003, 23 (3):388-390.);③導(dǎo)數(shù)色譜法(吉寧，高國(guó)強(qiáng)，陳玉奠.導(dǎo)數(shù)色譜 法鑒定高效液相色譜峰純度.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1 991,22(5): 295-298.); ④主成分分析法(Prtnclpal component annlysis，簡(jiǎn)稱PCA)(黃芳，康繼宏，郁 建，等.色譜峰純度的定性方法.色譜，1995,13(1): 33-37.);⑤漸進(jìn)因子分析法 (Evolving factor analysis, 簡(jiǎn)稱EFA) ( Lorber A. Error propagation and figures of merit for quantification by solving matrix equations. Anal Chem， 1988， 58,1167-1168.)。
3以上方法均沒能充分利用聯(lián)用色譜儀器在色譜分離過程中所記錄的各流出 組分的波譜信息。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種只需對(duì)色譜峰進(jìn)行自身的正交投影 分析即可驗(yàn)證峰自身的純度并使之程序化，無需其它對(duì)照品或參考物質(zhì)的色譜 峰純度檢驗(yàn)方法。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案為 一種色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法，包括含DAD檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，存儲(chǔ)程序的數(shù)字計(jì)算機(jī)，該存儲(chǔ)程序的數(shù)字計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下步驟a) 在圖譜的全部信息中提取待識(shí)別的色譜峰，并扣除噪音信號(hào)；b) 在扣除噪音信號(hào)的待識(shí)別色譜峰中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)窗口，移動(dòng)窗口獲取光譜數(shù) 據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，并以其建立正交投影陣，再用待識(shí)別色譜峰沿色譜方向的 每一光譜矢量對(duì)正交投影陣進(jìn)行投影、扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù)，得殘余光;並 l曰Sc) 計(jì)算待識(shí)別色譜峰與殘余光譜的夾角，判斷夾角余弦是否小于噪音信號(hào)，若夾角余弦小于噪音信號(hào)，則待識(shí)別色譜峰為純峰；若夾角余弦大于噪音信號(hào)， 則待識(shí)別色譜峰為混合峰。 所述的噪音信號(hào)為0.05。述的色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法在大決明子指紋圖譜中的應(yīng)用。 所述的色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法在溫郁金揮發(fā)油指紋圖譜中的應(yīng)用。本發(fā)明的基本原理為設(shè)X為采用聯(lián)用色譜測(cè)得的色譜指紋圖譜的# X #階二維數(shù)據(jù)矩陣，它們的行方向表征了色譜的流出信息(M個(gè)流出時(shí)間點(diǎn))，列方向表征了光譜信息(N個(gè)吸收波長(zhǎng))。用j;表示i中的待鑒別的目標(biāo)組分 色譜峰的# x "階二維數(shù)據(jù)矩陣，考慮到儀器的背景，可把矩陣z分成兩個(gè) 部分，即Ja =《+ Jc (1)J。表示來自目標(biāo)組分的主要信息，而《則表示來自儀器的背景。在目標(biāo)色譜峰前后的零濃度區(qū)內(nèi)分別各選取一點(diǎn)s (目標(biāo)色譜峰前)與e (目標(biāo)色譜峰后)，以此兩點(diǎn)的光譜矢量及和及及對(duì)照組分的光譜失量及，組成光譜矩陣 爿。」=[A,及，及] (2) w為移動(dòng)窗口大小，首先在A中自s處起至e處止移動(dòng)窗口 w獲取光 譜數(shù)據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜。標(biāo)準(zhǔn)光譜每取一個(gè)窗口，以其建立正交投影陣-# = / — (3) 其中，/為單位矩陣，,為力的廣義逆陣。用待鑒別色譜峰A的沿色譜 方向的每一光譜矢量義。,對(duì)#進(jìn)行投影運(yùn)算(扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù))jstc/= # jtc_/ (4) z。,表示Z。的第J條光譜，足/表示a,投影后的殘余光譜。為消除不等性 噪聲的影響，令投影后所得的殘余光譜a/與投影前的原始光譜a,的夾角余弦為r,，即x y = x c: <《i卜:ii i卜s ii) (5)并以A作為鑒別色譜峰純度的判據(jù)。由于#扣除了^,與」相關(guān)的光譜信息，a/保留了^與」不相關(guān)的光譜信息，所以A值越小，即投影后的殘余光譜與投影前的原始光譜a,的夾角越大，說明^/保留;^的光譜信息越少，^與j相關(guān)性越大；反之2v值大，說明A/保留^的光譜信息越多，7。,與j的光譜相關(guān)性越小。當(dāng)巧值等于0時(shí)，7。/與4完全正交，#完全扣除了^與J相關(guān)的光譜信息，完全只剩下隨機(jī)噪聲。以投影矩陣#對(duì)指紋圖譜z中的目標(biāo)色譜峰x。的每一列 光譜進(jìn)行投影，可得沿色譜方向的光譜殘差?yuàn)A角余弦曲線，若該曲線目標(biāo)色譜 峰時(shí)間范圍的A值為零或接近于零，則說明它所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)色譜峰為一與對(duì)照 組分相同的單一物質(zhì)峰，否則，目標(biāo)色譜峰為一重疊峰。由于各種物質(zhì)成分的復(fù)雜性及色譜的流出時(shí)間較長(zhǎng)，在色譜指紋圖譜的測(cè) 定中不可避免地存在著儀器的背景，因此要進(jìn)行二維數(shù)據(jù)的背景扣除，以免對(duì) 色譜峰純度產(chǎn)生誤判。本發(fā)明利用正交投影法，通過目標(biāo)色譜峰(待純度鑒別的色譜峰)的二維數(shù) 據(jù)，以移動(dòng)窗口取光譜數(shù)據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，并以其建立正交投影陣見再用目 標(biāo)色譜峰的沿色譜方向的每一光譜矢量對(duì) 行投影、運(yùn)算(扣除所取窗口處的 光譜數(shù)據(jù))得殘余光譜，再以殘余光譜與投影前的原始光譜的夾角余弦為鑒別 指標(biāo)來評(píng)價(jià)色譜峰的純度，可以方便快捷地驗(yàn)證自身峰純度，由于采用了正交 投影法，本發(fā)明不需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌肪涂芍苯优袛嗌V峰的純度，處理快速、 簡(jiǎn)便，程序化。


圖l為本發(fā)明的流程圖。圖2為大決明子生品的HPLC指紋圖譜。圖3為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的 HPLC指紋圖譜。圖4為大黃酚15的殘余光譜與原始光譜夾角余弦共有模式圖。圖5為供試品溶液1號(hào)色譜峰的殘余光譜與原始光譜夾角余弦共有模式圖。圖6為溫郁金揮發(fā)油的HPLC指紋圖譜。 圖7為吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。圖8為67號(hào)峰吉馬酮?dú)堄喙庾V與原始光譜夾角余弦模式圖 圖9為61號(hào)未知成分色譜峰的殘余光譜與原始光譜夾角余弦模式圖。 圖10為64號(hào)未知成分色譜峰的殘余光譜與原始光譜夾角余弦模式圖。 圖11為65號(hào)未知成分色譜峰的殘余光譜與原始光譜夾角余弦模式圖。 在圖l一ll中，1一16為大決明子待測(cè)純度的色譜峰，21為蘆薈大黃素，22為大黃酸，23為大黃素，24為大黃酚，25為大黃素甲醚。61—69為溫郁金揮發(fā)油待測(cè)純度的色譜峰。
具體實(shí)施方式
如圖1所示，步驟101為采用含DAD檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)物質(zhì)進(jìn)行圖 譜分析，禾U用MATLAB語言進(jìn)行處理，得到圖譜的全部信息，所述的信息包括 相應(yīng)峰的峰面積，峰高、保留時(shí)間。步驟102為在指紋圖譜的全部信息中提取待識(shí)別的色譜峰。步驟103為將在待提取識(shí)別的色譜峰中扣除噪音信號(hào)得到?jīng)]有儀器干擾的 待識(shí)別色譜峰；所述的噪音信號(hào)不大于0.05。步驟104為在扣除噪音信號(hào)的色譜峰中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)窗口，移動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)窗口建立 正投影矩陣。步驟105為將待識(shí)別色譜峰對(duì)正投影矩陣進(jìn)行投影。步驟106為將步驟105的投影結(jié)果扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù)得到殘余光譜。步驟107:計(jì)算待識(shí)別色譜峰與殘余光譜的夾角。步驟108:判斷夾角余弦是否小于噪音信號(hào)，若夾角余弦小于噪音信號(hào)，則為步驟110，待識(shí)別色譜峰為純峰；若夾角余弦大于噪音信號(hào)，則為步驟109， 待識(shí)別色譜峰不為純峰。將本發(fā)明用于鑒別決明子色譜指紋圖譜峰純度。1儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜儀(包括AgilentllOO四元泵，Agilent 1100 二極管陣列檢測(cè)器，Agilent 1100色譜化學(xué)工作站)；決明子生品藥材購(gòu)自佳木 斯市藥材公司，產(chǎn)于安徽。經(jīng)佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室劉娟教授鑒定為決明 (Casw'a o&"w'/bh'a L.)的種子，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2005版規(guī) 定。蘆薈大黃素對(duì)照品(批號(hào)766-200210)、大黃素對(duì)照品(批號(hào)756-200110)、 大黃酸對(duì)照品(批號(hào):774-200311)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)796-200204)、大黃 素甲醚對(duì)照品(批號(hào)758-2004080)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈、甲 醇為色譜純，鹽酸、磷酸及氯仿為分析純。2樣品制備2.1對(duì)照品溶液稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲 醚對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑，配制成200 ug，mL—i的蘆薈大黃素、大黃酸、 大黃素、大黃酚和大黃素甲醚五種成分的混合對(duì)照品溶液。2.2供試品溶液取決明子樣品，粉碎，過80目篩，稱取2.0g,加1.5 mol ，L—'的鹽酸溶液30mL，加熱回流1. 5 h，放冷，加氯仿25mL，回流20 min, 取出，分取氯仿層，酸水層再加氯仿25 mL,回流20 min，分取氯仿層，同上 法操作，加氯仿再回流提取二次，合并四次氯仿提取液，加水20mL振搖洗脫， 棄去水層，將氯仿液蒸干，殘?jiān)蛹状?5mL使溶解，過濾，定量轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 ym微孔濾膜過濾，即得。3色譜條件色譜柱Zorbax Eclipse XDB - C18 ( 4. 6 mm X 250 mm，5um )，保護(hù)柱: Zorbax SB - ds柱(4. 6 mm X 12. 5 mm， 5 u m );流動(dòng)相乙腈(A) - 0. 1 %磷 酸水溶液(B)作梯度洗脫，0 min， 10 % A - 90 。/。 B; 5 min， 15 % A - 85 % B; 10 min， 40 % A - 60 % B; 40 min， 70 % A - 30 % B; 41 min后IOO % A。流 速1.0mL*min—N柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，參比波長(zhǎng)550 nm;光譜 數(shù)據(jù)記錄范圍220 500 nm，波長(zhǎng)間隔2 nm;色譜記錄時(shí)間0 50 min;進(jìn)樣量 10 ii L。4目標(biāo)峰確定取決明子供試品溶液按選定色譜條件測(cè)定，記錄其色譜圖，結(jié)果見圖2。另 取取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品混合溶液同法 測(cè)定，結(jié)果見圖3。比較對(duì)照品與決明子圖譜，并利用色譜工作站峰判定功能， 初步確定圖2中的12、 15、 16號(hào)峰分別為大黃素、大黃酚、大黃素甲醚目標(biāo)峰。在供試品溶液色譜12、 15、 16號(hào)峰前后的零組分區(qū)采集色譜光譜二維數(shù)據(jù)， 以所取窗口為標(biāo)準(zhǔn)光譜，以其建立正交投影陣抓用待鑒別色譜峰的沿色譜方向 的每一光譜矢量Aj對(duì)#進(jìn)行投影運(yùn)算(扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù))，計(jì)算待 鑒別色譜峰的光譜正交投影前后光譜矢量的夾角余弦。由計(jì)算結(jié)果可知圖2中 的12、 15、 16號(hào)峰分別為大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的色譜純峰。如第15 號(hào)大黃酚的殘余光譜與原始光譜夾角余弦共有模式圖如圖4。同理，可確定其它各未知成分色譜峰的純度，如供試品溶液色譜峰1號(hào)為 未知成分峰，其殘余光譜與原始光譜夾角余弦共有模式圖如圖5，由此，可確定 1號(hào)峰為一不純峰。用本發(fā)明鑒別溫郁金揮發(fā)油色譜指紋圖譜峰純度。1儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜儀(包括Agilent1100四元泵，Agilent 1100 二極管陣列檢測(cè)器，Agilent 1100色譜化學(xué)工作站)；溫郁金購(gòu)于北京興中中藥 飲片廠，產(chǎn)地浙江，經(jīng)佳木斯大學(xué)生藥教研室史權(quán)教授鑒定，符合中國(guó)藥典(2005 版) 一部項(xiàng)下的規(guī)定。吉馬酮對(duì)照品(批號(hào)111665-200401)購(gòu)自中國(guó)藥品生物 制品檢定所。甲醇為色譜純，無水硫酸鈉、磷酸為分析純。2供試品制備2.1揮發(fā)油制備取經(jīng)粉碎過30目篩的溫郁金粗粉100g，置2000 mL圓 底燒瓶中，加8倍量的水浸泡過夜，按中國(guó)藥典(2005版) 一部附錄X D中揮 發(fā)油測(cè)定的甲法，水蒸氣蒸餾提取8h。收集揮發(fā)油部分，加入無水硫酸鈉脫水 后，密封、暗處冷藏。2.2供試液制備取溫郁金揮發(fā)油20 yL,置10mL量瓶中，加入甲醇至 刻度，搖勻。經(jīng)0.45 ym微孔濾膜過濾，制成溫郁金揮發(fā)油的供試液。取吉馬 酮對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻， 經(jīng)0.45 um微孔濾膜過濾，吸取濾液l mL置lO mL容量瓶中，加入甲醇至刻 度，配制吉馬酮對(duì)照品溶液。3色譜條件色譜柱ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6咖X250咖，5踐)，保護(hù)柱:Zorbax SB-d8柱(4.6mmX12. 5mm， 5um);流動(dòng)相甲醇(A) - 0. 2 %磷酸水溶液(B) 作梯度洗脫，0 min, 55 % A - 45 % B; 5 min， 55 % A - 45 % B; 25 min， 75 % A - 25 % B; 40 min, 75 % A - 25 % B; 50 min， 100 % A。流速1. 0 ml min _1;柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;光譜數(shù)據(jù)記錄范圍190 350 nm，波長(zhǎng)間 隔2 nm;色譜記錄時(shí)間0 50 min;進(jìn)樣體積20 u L。4目標(biāo)峰確定取溫郁金揮發(fā)油供試液按選定色譜條件測(cè)定，記錄其色譜圖，結(jié)果見圖6。 另取吉馬酮對(duì)照品同法測(cè)定，結(jié)果見圖7。經(jīng)漸進(jìn)窗口正交投影進(jìn)行色譜指紋圖 譜峰的匹配，可知圖6中第67號(hào)色譜峰為吉馬酮。5色譜峰純度鑒別在溫郁金揮發(fā)油指紋圖譜第67號(hào)色譜峰前后的零組分區(qū)采集色譜光譜二維 數(shù)據(jù)，以所取窗口為標(biāo)準(zhǔn)光譜，以其建立正交投影陣必用目標(biāo)色譜峰的沿色譜 方向的每一光譜矢量;^對(duì)#進(jìn)行投影運(yùn)算(扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù))，并 計(jì)算目標(biāo)色譜峰的光譜正交投影前后光譜矢量的夾角余弦。由計(jì)算結(jié)果可知圖6 中的67號(hào)峰為吉馬酮的色譜純峰，其殘余光譜與原始光譜夾角余弦模式圖如圖 8所示。同理，可確定其它各未知成分色譜峰的純度，如供試液色譜指紋圖譜中 的第61、 64、 65號(hào)未知成分色譜峰的殘余光譜與原始光譜夾角余弦模式圖，如 圖9、圖10、圖11所示，由此，可確定61號(hào)峰為一純峰，64、 65號(hào)色譜峰各 為一混合峰。
權(quán)利要求
1、一種色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法，包括含DAD檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果輸入存儲(chǔ)程序的數(shù)字計(jì)算機(jī)，其特征在于該存儲(chǔ)程序的數(shù)字計(jì)算機(jī)執(zhí)行如下步驟a)在圖譜的全部信息中提取待識(shí)別的色譜峰，并扣除噪音信號(hào)；b)在扣除噪音信號(hào)的待識(shí)別色譜峰中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)窗口，移動(dòng)窗口獲取光譜數(shù)據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，并以其建立正交投影陣，再用待識(shí)別色譜峰沿色譜方向的每一光譜矢量對(duì)正交投影陣進(jìn)行投影、扣除所取窗口處的光譜數(shù)據(jù)，得殘余光譜；c)計(jì)算待識(shí)別色譜峰與殘余光譜的夾角，判斷夾角余弦是否小于噪音信號(hào)，若夾角余弦小于噪音信號(hào)，則待識(shí)別色譜峰為純峰；若夾角余弦大于噪音信號(hào)，則待識(shí)別色譜峰為混合峰。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法，其特征在 于所述的噪音信號(hào)為0.05。
3、 一種權(quán)利要求l所述的色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法在大決明子指紋 圖譜中的應(yīng)用。
4、 一種權(quán)利要求1所述的色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法在溫郁金揮發(fā)油 指紋圖譜中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種色譜指紋圖譜峰純度的檢驗(yàn)方法，包括以下步驟采用含DAD檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)中藥進(jìn)行指紋圖譜處理，得到指紋圖譜的全部信息；在色譜圖中提取待識(shí)別的色譜峰；在待提取識(shí)別的色譜峰中扣除噪音信號(hào)；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)窗口；移動(dòng)窗口建立正投影矩陣；將待識(shí)別色譜峰對(duì)正投影矩陣進(jìn)行投影，得到殘余光譜；計(jì)算待識(shí)別色譜峰與殘余光譜的夾角；判斷夾角余弦是否小于噪音信號(hào)；若夾角余弦小于噪音信號(hào)，則待識(shí)別色譜峰為純峰；若夾角余弦大于噪音信號(hào)，則待識(shí)別色譜峰為混合峰。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌肪涂芍苯优袛嗌V峰的純度，處理快速、簡(jiǎn)便，程序化。
文檔編號(hào)G01N30/86GK101256175SQ20071019008
公開日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2007年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月21日
發(fā)明者鄒純才, 鄢海燕 申請(qǐng)人:皖南醫(yī)學(xué)院