專利名稱：異檸檬酸測(cè)定試劑盒及異檸檬酸的濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定異檸檬酸濃度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異檸檬酸isodtricacid是檸檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC1丄1.41; EC 1丄1.42)的作用下變成oc-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GBT16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D-異檸檬酸的測(cè)定方法一紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測(cè)定。其測(cè)定原理異檸檬酸脫氫酶isocitrate dehydrogenase有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶的酶(EC1. 1.1. 42)，兩者催化同一反應(yīng)。
異檸檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在波長(zhǎng)340nm處測(cè)定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定異檸檬酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的異檸檬酸測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行異檸檬酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明異檸檬酸濃度測(cè)定方法原理如下
D-異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+
酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?
丙酮酸+輔酶八+氧丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+
乙酰輔酶八+還原型輔酶這種方法應(yīng)用異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41;EC 1.U.42)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?(pyruvate oxidase (CoAacetylating); EC 1.2.3.6)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC1.2丄51)酶促反應(yīng)速率比色法。異檸檬酸脫氫酶，作為作用酶，酶解異檸檬酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，同時(shí)也是顯色酶，將輔酶還原成為還原型輔酶；再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸脫氫酶的作用，丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?也作為作用酶，利用二氧化碳產(chǎn)生丙酮酸；丙酮酸脫氫酶又作為循環(huán)酶又是顯色酶， 一面將丙酮酸變回二氧化碳，使之不斷循環(huán)利用； 一面又將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算異檸檬酸 的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異擰檬酸測(cè)定試劑盒 較為理想
緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
異檸檬酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 丙酮酸脫氫酶 過氧化氫 乙酰輔酶A 輔酶A
本發(fā)明的異擰檬酸測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙 酰化)、丙酮酸脫氫酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、
100 mmol/L 500 mmol/L 3 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L 10 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L丙酮酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸脫氫酶、 過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脫氫酶、 過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定異檸檬酸濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的異檸檬酸測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶(CoA乙?；? 12000 U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
過氧化氫 10mmol/L 乙酰輔酶A 10mmol/L 輔酶A 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用
前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)異檸檬酸樣品與
試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2
分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的異檸檬酸測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲院一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
3 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L
過氧化氫 乙酰輔酶A100 mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L 12000U/L 12000 U/L
輔酶A 10mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
異檸檬酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶(CoA乙?；? 丙酮酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm,被測(cè)異檸檬酸樣品與
試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延
遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的異檸檬酸測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
過氧化氫 乙酰輔酶A 輔酶A
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L 10 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?
12000U/L
丙酮酸脫氫酶
12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100 mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmoI/L
異檸檬酸脫氫酶
10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定異檸檬酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng) 時(shí)間IO分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)異檸檬酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間3分鐘左 右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度 大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測(cè)定方法均能達(dá)到 本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0009; 吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線 形范圍可達(dá)10.2mmol/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過±5%;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《1.2%;試劑的靈敏度
可達(dá)0.0786 ± 0.040 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形 范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下D-異檸檬酸+輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A <u>丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?</u>丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+輔酶A+輔酶 <u>丙酮酸脫氫酶</u> 二氧化碳+乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?丙酮酸脫氫酶過氧化氫乙酰輔酶A輔酶A試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍; 此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。 在此范圍內(nèi)效果較好，在其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異擰檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰 化)、丙酮酸脫氫酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰 化)、丙酮酸脫氫酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A組成雙劑試劑； 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA 乙酰化)、丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶 (CoA乙酰化)、丙酮酸脫氫酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A在試 劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰 化)、丙酮酸脫氫酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A組成多劑試劑； 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A組 成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸 脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、 異擰檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸脫氫酶、過氧 化氫、乙酰輔酶A、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 齊U 1~4000 mmol/L或0.1°/。-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的異檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定異檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、輔酶A、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙?；?、丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101464283SQ20071019143
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司