專利名稱：異檸檬酸測定試劑盒及異檸檬酸的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定異 檸檬酸濃度的方法，屬于食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
異檸檬酸isodtricacid是檸檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在 于生物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子 類中特別多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)成分。 檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸 檬酸脫氫酶(EC1丄1.41; EC1丄1.42)的作用下變成oc-酮戊二酸，在 異檸檬酸裂合酶(isocitmte lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀 酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GBT16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁 及其飲料中D-異檸檬酸的測定方法一紫外分光光度法。該方法適用于 判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、 桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫氫酶 isocitrate dehydrogenase有兩禾中類型以 NAD 為輔酶的酶 (EC1. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶的酶.(EC1. 1. 1. 42),兩者 催化同一反應(yīng)。
異檸檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02+NAP(P)H + H+在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP 作用，生成NADH或NADPH的含量，相當(dāng)于D-異檸檬酸鹽的量。在 波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶雙倍擴(kuò)增法
(Enzymatic Doubling Method)、 酶比色 去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量/連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以 測定異檸檬酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的 異檸檬酸測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、 準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法原理如下
D-異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+
酮戊二酸+還原型輔酶
二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸羧化酶
腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用異擰檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1丄1.41; EC 1.1.1.42)酶(偶)聯(lián)丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase; EC 1.2丄59)酶促反應(yīng)速率比色法/終點(diǎn)法。異擰檬酸 脫氫酶酶解異檸檬酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸羧 化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，二次將輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，使靈敏度提高 二倍，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度， 通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算異檸檬酸的濃度 大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明異檸檬酸測 定試劑盒較為理想
緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
異擰檬酸脫氫酶10000U/L
丙酮酸羧化酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶12000U/L
腺苷三磷酸6 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
甘油醛-3-磷酸20 mmol/L
本發(fā)明的異檸檬酸測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛 -3-磷酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺 苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。 輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
丙酮酸羧化酶 12000 U/L
甘油酸-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
腺苷三磷酸 6 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L 甘油醛-3-磷酸 20mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；
使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始
吸光度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延 遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異 檸檬酸的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷三磷酸 丙酮酸
甘油醛-3-磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 16 mmol/L 20 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
異擰檬酸脫氫酶
丙酮酸羧化酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬 酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上 升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異 檸檬酸的濃度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
腺苷三磷酸 丙酮酸
甘油醛-3-磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸羧化酶 甘油酸-3-磷酸脫氫酶 試劑3
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 16 mmol/L 20 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定異檸檬酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C， 反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右， 檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異 檸檬酸的濃度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的測定方法均能 達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一 一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化 分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《 0.0025;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效 (R》0.99)線形范圍可達(dá)10.0 mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相 對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV) 《2.2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.0884 ± 0.044 AA/mmol/L——本發(fā)明 靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶雙倍擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法原理如下D-異檸檬酸+輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> 二氧化碳+ 酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酮酸 <u>丙酮酸羧化酶</u>腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 <u>甘油醛-3-磷酸脫氫酶</u> 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L異擰檬酸脫氫酶IOOO-——簡OO U/L丙酮酸羧化酶1000-——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶1000-——80000 U/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L丙酮酸1—50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好， 在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試 劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成雙劑 試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、 甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、 丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、 丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油 醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、 甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑l、試劑 2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫 酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶雙倍擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的異檸檬酸測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464285SQ200710191438
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司