專利名稱：氨(離子)診斷/測定試劑盒及氨(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離 子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴(kuò)散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用 最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴(kuò)散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler 反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造 成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴(kuò)散 法更準(zhǔn)確，CV為8X 13X;離子選擇電極法是利用NH3擴(kuò)散到電極表面，引 起電極的PH發(fā)生變化進(jìn)行測定，該方法的CV為3.5X 4.8X，回收率高。結(jié) 合具體實(shí)際，應(yīng)以酶法測定為實(shí)用。
檢索中國專利，僅査出87105593.7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯， 卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙 酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨(離子) 濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的氨(離子)診斷/測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn) 行氨(離子)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。本發(fā)明氨(離子)濃度測定方法原理如下-
氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+蔗糖蔗糖磷酸化酶果糖+葡萄糖-l-磷酸 果糖+還原型輔酶甘露醇脫氫酶甘露醇+輔酶
這種方法應(yīng)用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)聯(lián) 蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases; EC 2.4.1.7)、甘露醇脫氫酶 (Mannitol dehydrogenase; EC 1.1.1.138; EC 1.1.1.138)酶促反應(yīng)終點(diǎn)比色法。 谷氨酰胺合成酶酶解氨(離子)反應(yīng)產(chǎn)生磷酸根，再通過(偶)聯(lián)合蔗糖磷酸 化酶、甘露醇脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸 光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(離子) 的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨(離子)診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
蔗糖磷酸化酶 8000 U/L
甘露醇脫氫酶 10000 U/L
谷氨酸 10mmol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L
蔗糖 5 mmol/L
本發(fā)明的氨(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露 醇脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶。 還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶、谷氨酸、腺
苷三磷酸、蔗糖在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶。 還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨(離子)濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一
本實(shí)施例的氨(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
蔗糖磷酸化酶謂0 U/L
甘露醇脫氫酶10000 U/L
谷氨酸10 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
蔗糖5 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。實(shí)施例二
本實(shí)施例的氨(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L10 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶蔗糖磷酸化酶
500 mmol/L6000 U/L8000 U/L
甘露醇脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小
實(shí)施例三
本實(shí)施例的氨(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸
試劑2
穩(wěn)定劑
蔗糖磷酸化酶
甘露醇脫氫酶
試劑3
穩(wěn)定劑
谷氨酰胺合成酶
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L10 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
500 mmol/L
8000 U/L
10000U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
500 mmol/L
6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定氨(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間0分鐘，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0014;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)2mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過土 5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.66 ± 0.2AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(離子)濃度測定方法，其方法原理如下氨離子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+蔗糖 <u>蔗糖磷酸化酶</u> 果糖+葡萄糖-1-磷酸果糖+還原型輔酶 <u>甘露醇脫氫酶</u> 甘露醇+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L谷氨酰胺合成酶畫O-——訓(xùn)00 U/L蔗糖磷酸化酶1000———80000 U/L甘露醇脫氫酶1000-——80000 U/L谷氨酸l一50 mmol/L腺苷三磷酸l一50 mmol/L蔗糖1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組成。還原型輔酶、 谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗 糖在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 谷氨酰胺合成酶組成。還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露 醇脫氫酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖在試劑l、試劑2或試劑3中的位置 可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、蔗糖、谷氨酰胺合成酶、蔗糖磷酸化酶、甘露醇脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464348SQ20071019214
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司