專利名稱：：細菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本實用新型屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及定量PCR檢測試劑盒，具體涉及一種實時熒光定量PCR檢測細菌性感染患兒血液、腦脊液、胸水、腹水等樣本中細菌DNA的試劑盒。技術(shù)背景細菌16SrRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列。該基因具有以下兩大特點(1)多拷貝16SrRNA編碼基因以多拷貝形式存在于所有細菌染色體基因組中，每個細菌約含510個拷貝，這使得對該基因的檢測具有敏感性。(2)多信息16SrRNA編碼基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為所有細菌所共有，有"分子化石"之稱?？筛鶕?jù)保守區(qū)設計各種細菌的通用引物和通用探針，用于臨床常見細菌的通用檢測。目前，幾乎所有病原菌的16SrRNA基因測序完成。因此16SrRNA基因己成為較理想的臨床細菌感染檢測靶基因序列，逐漸成為細菌與其它病原體鑒別、分類的金標準。實時熒光定量技術(shù)的基本原理利用Taq酶的5'—3'外切酶核酸活性，在普通聚合酶鏈反應基礎上，設計熒光雙標記探針，分別標記上熒光報告基團(R)和淬滅基團(Q)。當這條探針保持完整時，R基團的熒光信號被Q基團抑制，一旦探針被切斷，抑制作用消失，R基團的熒光信號就可以被檢測到。該方法采用完全閉管檢測，省去了對PCR產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染，結(jié)果判斷由計算機完成，簡化了操作步驟，并增加了結(jié)果的可靠性。敗血癥(S印ticemia)是指病原菌及其毒素侵入血流所引起的臨床綜合癥。病程中常有炎癥介質(zhì)的激活與釋放，引起高熱、寒顫、心動過速、呼吸急促、皮疹和神志改變等一系列臨床癥狀，嚴重者可引起休克、DIC和多器官功能衰竭。即使給予適當?shù)目股刂委?，病死率仍較高。兒童特別是新生兒由于自身抵抗力差、皮膚薄嫩、出生后臍部未愈合等均易患敗血癥。兒童敗血癥如果不能早期判斷，及時、徹底地治療，可致化膿性腦膜炎發(fā)生，影響小兒智力發(fā)育，導致兒童傷殘和死亡。兒童敗血癥缺乏特異性臨床癥狀及早期可靠的實驗室指標，早期診斷十分困難。目前已有多種實驗室方法應用于兒童敗血癥的診斷中，如血培養(yǎng)、血常規(guī)、急性時相蛋白如CRP，病灶分泌物培養(yǎng)及涂片，病原菌抗原檢測如對流免疫電泳(CIE)，以及分子生物學檢測如限制性內(nèi)切酶分析(RFLP)、DNA探針等方法。熒光定量PCR法是近幾年興起的生物學技術(shù)，具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點，已廣泛用于基因表達研究、病原體檢測、SNP分析等諸多領(lǐng)域，在檢測與應用領(lǐng)域是目前的研究熱點之一。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學研究中的廣泛應用，建立快速可靠的診斷兒童敗血癥和化膿性腦膜炎等細菌性感染疾病的新方法已成為可能并被嘗試。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供細菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒，該試劑盒由PCR反應液、標準品、陽性對照品、陰性對照品、抽提裂解液、操作說明書、包裝盒體組成，盒體設有容器孔，分別放置PCR反應液、標準品、陽性對照品、陰性對照品、抽提裂解液，PCR反應液管由單管分裝，矩陣排列。其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、細菌檢測用上游引物、檢測用下游引物、熒光探針、耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)組成。抽提裂解液含有10mmol/LTri-HClpH7.65mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)。定量PCR反應液必須用0.22pm膜過濾預處理。其中上游弓l物序歹lj為5、-CAACGCGAAGAACCTTACC-3、下游弓I物序歹U為5'—ACGTCATCCCCACCTTCC—3'。熒光探針序歹!j為5'—FAM—TAAGTCCCGCAACGAGCGCAA—TAMRA—3'。標準品序列為CAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGT對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照為無菌注射用水樣品，陽性對照為大腸埃希菌滅活DNA樣品。本定量試劑保存于-20°C，盡量減少反復凍融。本品選用臨床常見菌16SrRNA基因高度保守的擴增靶區(qū)域，設計細菌通用引物和通用TaqMan熒光探針，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，實時定量檢測臨床樣本細菌DNA的應用。本實用新型試劑盒使用方法每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為1X102—lX109拷貝/ml。細菌DNA提取采集新鮮的全血1ml放置于含枸緣酸鈉抗凝集液的無菌真空采血管中，混勻取全血50ul加等量的抽提裂解液(10mmol/LTri-HClpH7.65畫1/LEDTA，0.5%SDS)置100。C煮沸10min，12000r/min離心5min，取5W上清作為PCR模板。菌液、腦脊液、胸水、腹水等樣本方法同上。擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行，總體積50ii1，其中45.On1PCR反應液，5ul檢測樣品(提取產(chǎn)物、標準品、陽性或陰性對照)。反應條件94°C5min預變性，94°C20sec、60°C60sec為一個循環(huán)，共循環(huán)40次。熒光定量結(jié)果報告①CT值(thresholdcycle,每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))等于40.0的標本為陰性，②CT值《35的標本，檢測結(jié)果為陽性，③CT值在3540之間為灰值區(qū)域，重做后大于38值為陰性。根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到各待測標本中細菌的量(拷貝數(shù)/ml)。本實用新型的有益之處是該試劑盒運用實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了對臨床常見菌通用檢測的目的。有效地解決了以往PCR方法只能用于檢測單一病原菌的問題，對常見的細菌感染進行通用檢測，提高了細菌檢測的通用性和敏感性，提高了區(qū)分細菌性和非細菌性的能力。為細菌性感染的早期病原體檢測提供依據(jù)。圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為大腸埃希菌標準品片段序列。圖3為細菌實時熒光定量PCR標準品檢測。圖4為細菌實時熒光定量PCR標準曲線。具體實施方式本實用新型結(jié)合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本實用新型范圍。實施例1參見圖1，本實用新型提供的細菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒由PCR反應液1、標準品2、陽性對照品3、陰性對照品4、抽提裂解液5、操作說明書6、包裝盒體7組成。盒體7設有容器孔，分別放置PCR反應液管1、標準品2、陽性對照品3、陰性對照品4、抽提裂解液5，PCR反應液管由單管分裝，矩陣排列。其中定量PCR反應液含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、細菌檢測用上游引物、檢測用下游引物、熒光探針、耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)組成。抽提裂解液含有10mmol/LTri-HClpH7.65mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA),0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)。實施例2細菌熒光定量PCR法檢測臨床常見分離株一、材料-臨床常見細菌分離菌株金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌均由本實驗室培養(yǎng)提供；pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、TaqDNA聚合酶、dNTP等PCR相關(guān)試劑購自美國Promega公司，測序試劑、377型測序儀、PE-5700型定量PCR儀均為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品。二、引物及探針設計與合成選擇臨床引起敗血癥和化膿性腦膜炎(化腦)的常見細菌22種菌屬50個菌株，其中革蘭陰陽性菌株各為25株(見表1)。應用MEGALIGN軟件分析其16SrRNA基因序列，尋找不同細菌種屬間的保守片段，分析生物進化樹的規(guī)律，根據(jù)引物和探針的設計原則，在這些細菌保守區(qū)域篩選通用引物和通用探針，從中選擇最佳一對組合。上游弓l物序歹lj為5、-CAACGCGAAGAACCTTACC-3、下游引物序列為5'—ACGTCATCCCCACCTTCC—3'均由上海生工公司合成。熒光探針序列為5'—FAM—TAAGTCCCGCAACGAGCGCAA—TAMRA—3'。由大連寶生物技術(shù)公司合成。表l臨床引起敗血癥和化膿性腦膜炎(化腦)的常見細菌<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>三、檢測標準品制備用上述引物擴增標準菌株大腸埃希菌，PCR產(chǎn)物為228bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后即用克隆系統(tǒng)插入pGEM-T-Easy克隆載體，抽提重組克隆質(zhì)粒，用載體引物M13R對重組的陽性克隆進行測序驗證。測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。結(jié)果經(jīng)測序，上述設計標準品完全與預期相符，其中的標準品片段序列為大腸埃希菌，參見圖2。四、臨床常見菌株梯度稀釋對照試驗從三種常見的臨床分離株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌)的培養(yǎng)基上用無菌棉簽分別刮取少量菌斑，各自放于含有2ml的無菌水的試管中，用比濁儀配成0.5滴度的液體(相當于濃度為108CFU/ml)。分別對該三種菌株依次進行10—1次、10—2次、10—3次、10—4次、10—5次方稀釋，各取10一5次、10—4次、10—"欠方稀釋液5ul熒光定量和劃平板細菌37'C隔夜培養(yǎng)，次日計數(shù)培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。表2平板菌落計數(shù)與熒光定量PCR檢測結(jié)果對照<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3細菌熒光定量PCR試劑盒檢測應用一、標本檢測選取2003年12月2005年12月，我院新生兒病房及NICU臨床疑為細菌感染(均有細菌感染的易感因素及臨床表現(xiàn))的住院新生兒(年齡ld28d，男420例，女410例，其中早產(chǎn)兒65例，其余為足月兒)830例，該830例新生兒患兒的易感因素及臨床表現(xiàn)主要有早產(chǎn)兒、黃疸、肺炎、腸炎、發(fā)熱、感染性休克等為主。選同期因非感染性疾病住院的新生兒30例標本作為對照。每例抽取靜脈血各12ml分別送檢血培養(yǎng)和細菌16SrRNA熒光定量PCR基因二、樣品檢測結(jié)果標準品檢測結(jié)果見圖3。檢測的標準曲線見圖4。830例患者血標本熒光定量PCR和血培養(yǎng)檢測結(jié)果如下表316SrRNA基因熒光定量PCR(FQ-PCR)與血培養(yǎng)細菌檢測結(jié)果對照<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>細菌16SrRNA基因熒光定量PCR檢測陽性率5.18%(43/830)，血培養(yǎng)陽性率2.41%(20/830)，前者明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義PO.Ol，且血培養(yǎng)陽性的20例標本熒光定量PCR檢測均為陽性(表3)。30例非感染性疾病患兒熒光定量PCR檢測及細菌培養(yǎng)均為陰性。若以血培養(yǎng)作為對照，細菌熒光定量PCR方法的診斷敏感性為100%，特異性為97.16%，正確診斷指數(shù)為0.972。本實用新型是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本實用新型的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種細菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒，其特征是由PCR反應液(1)、標準品(2)、陽性對照品(3)、陰性對照品(4)、抽提裂解液(5)、操作說明書(6)、包裝盒體(7)組成，包裝盒體(7)設有容器孔，分別放置PCR反應液管(1)、標準品(2)、陽性對照品(3)、陰性對照品(4)、抽提裂解液(5)，PCR反應液(1)由單管分裝，矩陣排列。專利摘要本實用新型提供的細菌實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測試劑盒由PCR反應液1、標準品2、陽性對照品3、陰性對照品4、抽提裂解液5、操作說明書6、包裝盒體7組成。盒體7設有容器孔，分別放置PCR反應液管1、標準品2、陽性對照品3、陰性對照品4、抽提裂解液5，PCR反應液管由單管分裝，矩陣排列。本實用新型提供的試劑盒設計合理，有效地解決了以往PCR方法只能用于檢測單一病原菌的問題，對常見的細菌感染進行通用檢測，提高了細菌檢測的通用性和敏感性，提高了區(qū)分細菌性和非細菌性的能力。檢測時間短快速，檢測方法特異、敏感、準確。文檔編號G01N21/00GK201107259SQ200720114159公開日2008年8月27日申請日期2007年8月31日優(yōu)先權(quán)日2007年8月31日發(fā)明者吳亦棟,尚世強,趙正言申請人:浙江大學