專利名稱：一種裂解肽的c端肽鍵的方法和確定肽的c端氨基酸序列的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及裂解肽的c端的肽鍵的方法和確定肽的c端氨基酸序列的 方法。
相關技術
關于獲自天然來源的肽或蛋白(在下文籠統(tǒng)地稱為肽)的氨基酸序列 的信息對于研究生物學特征和功能是不可缺少的。目前，基于相應的基因
信息，即編碼這些肽的基因組基因或由mRNA制備的cDNA的堿基序列， 將肽和蛋白的氨基酸序列確定為推導的氨基酸序列。或者，通過直接分析 肽的序列的方式確定蛋白質的這些氨基酸序列。在這些情形中，仍舊需要 肽的部分氨基酸序列的信息來鑒定編碼肽的基因組基因或由mRNA制備 的cDNA。
通常，認為對于對肽的部分氨基酸序列的了解，肽的N端氨基酸序列 和C端氨基酸序列是有用的。例如，在從由大量mRNA制備的cDNA文 庫中選擇要獲得的編碼肽的cDNA的過程中，如果其N端氨基酸序列和C 端氨基酸序列已經確定，那么基于在兩端的氨基酸序列制備核酸探針，和 使用所述探針選擇要獲得的cDNA是可能的。此外，通過使用基于兩端的 氨基酸序列制備的寡核苷酸引物進行的PCR方法選擇性地擴增要獲得的 cDNA是可能的。
作為分析肽的N端氨基酸序列的方法，使用了確定通過Edman降解法 順序降解N端氨基酸而獲得的氨基酸衍生物的方法。
在另一個方面，作為分析肽的C端氨基酸序列的方法，提議了鑒定C 端氨基酸的方法，其中通過化學反應將C端氨基酸順序降解，并且基于在 起始肽和截短的肽之間的分子量的差異確定被降解的C端氨基酸(非專利 相關文獻l-3)。
非專利相關文獻1公開了通過化學反應順序降解C端氨基酸的方法。 所述方法是增加肽的C端氨基酸的選擇性水解的方法，其中將干燥的肽加
熱到卯。C ，并且使其與產自高濃度的五氟丙酸(CF3CF2COOH)水溶液或高 濃度的七氟丁酸(CF3CF2CF2COOH)水溶液的蒸汽反應。
非專利相關文獻2和3公開了使用五氟丙酸酐((CF3CF2CO)20)的乙腈 溶液或七氟丁酸酐((CF3CF2CF2CO)20)的乙腈溶液取代高濃度的全氟鏈 垸酸水溶液來選擇性降解C端氨基酸的方法。所述文獻指出將干燥的肽與 產生自上述溶液的蒸汽在-18'C下反應，并且使所述系統(tǒng)避開進入由所述溶 液蒸發(fā)產生的水分子，由此防止了副反應的發(fā)生。
己經報道了這些降解C端氨基酸的常規(guī)方法，其通過在下述反應式(I) 中指出的脫水反應和在下述反應式(II)指出的反應進行。S卩，根據反應式(I) ，曾經形成具有噁唑酮環(huán)的結構，作為來自C端氨基酸的反應中間體。接 下來，通過使全氟鏈烷酸與所述噁唑酮環(huán)作用來獲得C端氨基酸的選擇性 降解反應。
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(II)
根據在所述非專利相關文獻中公開的方法，除了選擇性降解目標C端 氨基酸序列之外，還發(fā)生了在N端的肽的絲氨酸殘基 (-NH-CH(CH20H)-CO-)的裂解，在N端的蘇氨酸殘基的裂解和在C端的天 冬氨酸殘基的裂解。因此，存在僅選擇性降解C端氨基酸序列的問題。此 外，由于N，O-?；D移反應，其是非意欲的裂解的引發(fā)物，在絲氨酸殘基 ot位置的氨基酸和(M立置的羥基之間，在蘇氨酸殘基a位置的氨基酸和(3羥基 (卩-OH基團)之間，C端氨基酸序列的順序降解反應可能在所述轉移反應位 點被抑制。
考慮到這些情況，專利文獻l公開了在溫和條件下，使用鏈烷酸酐如 乙酸酐和甲酰胺順序降解肽的方法。然而，在該反應下，存在低靈敏性的 問題。
專利文獻1
WO 2005/07844非專利相關文獻1Tsugita，A.等，Eur. J.Biochem(歐洲生物化學雜 志).,第206巻，第691 696頁，199非專利相關文獻2Tsugita,A.等，Chem.Lett.(化學通訊)，第235-238 頁，199非專利相關文獻3Takamoto,K.等，Eur. J. Biochem.(歐洲生物化學 雜志)，第228巻，第362-372頁，1995
發(fā)明公開內容 本發(fā)明待解決的問題
考慮到這些問題實施了本發(fā)明。即，證實了通過常規(guī)順序降解方法， 新的裂解反應在確定C端氨基酸序列中提供了低靈敏性，并且本發(fā)明基于 這樣的知識和性質。本發(fā)明在沒有減少靈敏性，并且防止副反應的情況下，提供了裂解肽的C端的肽鍵的方法和確定肽的C端氨基酸序列的方法。
解決問題的方式
根據本發(fā)明裂解肽的C端的肽鍵的方法的特征如下
裂解肽的C端的肽鍵的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基；
和
使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸殘基被順序刪除。
根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下 確定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基； 使所述肽與鏈垸酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸殘基被順序刪除；
測量所述缺失了C端的肽的分子量；和 基于所述分子量確定所述肽。
此外，根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下 確定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基； 使所述肽與鏈垸酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C
端的氨基酸殘基被順序刪除；
使所述肽與位點特異性的裂解劑反應，以獲得來自所述缺失了C端的
肽的刪除C端的肽來源的肽片段；
測量所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量；和 基于所述分子量確定所述肽.
根據本發(fā)明確定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如
下
確定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使由基底支持的肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的 谷氨酸殘基；
使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸殘基被順序刪除；
將所述基底浸入包含位點特異性裂解劑的溶液中，以獲得來自所述缺
失了C端的肽的缺失了C端的肽來源的肽片段；
測量所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量；和 基于所述分子量確定所述肽。
發(fā)明效果
根據本發(fā)明，通過順序降解在C端的肽鍵而裂解在N端的肽的谷氨酸殘 基被谷氨酸殘基的特異性酯化所抑制，由此特異性和有效地降解C端氨基 酸殘基。此外，容易地確定在順序降解中獲得的缺失了C端的肽的排布和 來自所述缺失了C端的肽的肽的排布。
附圖簡述
圖l是顯示大豆胰蛋白酶抑制劑的氨基酸序列和用胰蛋白酶消化的消
化片段的推導的序列的圖。
圖2是胰蛋白酶抑制劑的48-63殘基的肽片段的質量分析光譜。 圖3是胰蛋白酶抑制劑的112-119殘基的肽片段的質量分析光譜。 圖4是胰蛋白酶抑制劑的66 -76殘基的肽片段的質量分析光譜。 圖5是胰蛋白酶抑制劑的31-38殘基的肽片段的質量分析光譜。 圖6是顯示酯化反應對根據本發(fā)明的分析方法的影響的質量分析光譜
，其中(A)對應于沒有進行酯化反應的結果和(B)對應于進行酯化反應的結果。
圖7是顯示酯化反應對根據本發(fā)明的分析方法的影響的質量分析光譜。
圖8是胰蛋白酶抑制劑的在49-63殘基的肽片段的質量分析光譜。
實施本發(fā)明的最佳方式
<介紹-新的裂解反應和順序降解模式> 關于本發(fā)明，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在溫和條件下使用鏈烷酸酐如乙酸酐和甲
酰胺進行肽的順序裂解反應過程中，在N端的谷氨酸殘基發(fā)生未知的但特 異性的裂解反應。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種裂解模式絕對是新的。將在下 面指出這些知識。
圖6 (a)是洗脫混合物的MALDI-TOF-MS光譜，其中將進行SDS-PAGE 后包含大豆胰蛋白酶抑制劑的凝膠在6(TC浸入包含乙酸酐和甲酰胺的溶 液中達1小時，并且用胰蛋白酶消化所述凝膠，以從凝膠中獲得洗脫的混 合物。如在圖6(a沖所顯示，在胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制劑的情況中， 除了對應于在第48位殘基包含天冬氨酸殘基的48-63殘基的序列的峰，所 述序列在理論上被認為是在順序裂解處理后，由胰蛋白酶消化裂解的，另 一個峰在約1673.69發(fā)現(xiàn)?；谄浞肿恿客茰y該峰是對應于在胰蛋白酶抑 制劑的第49位殘基包含谷氨酸殘基的肽片段的峰，即在49-63殘基的肽片 段(序列號26)。然而，即使將該峰與對應于48-63殘基的肽片段的峰相比 較，發(fā)現(xiàn)對于鑒定在1673.69的峰中包含谷氨酸殘基，該峰的分子量少約 18。因此，將用于確定該峰起源的該片段的MS/MS分析的結果顯示在圖 8中。如在圖8中所清楚地顯示，在N端包含氨基酸殘基的片段中在比理 論分子量少18的質量位置發(fā)現(xiàn)峰，而在C端(y3-yll)包含精氨酸(用一個 字母R表示)的片段的組中發(fā)現(xiàn)理論質量的峰。
如通過這些結果所總結，發(fā)現(xiàn)下列
(1) 在使用鏈烷酸酑和甲酰胺進行的肽的常規(guī)順序裂解中發(fā)生在谷氨 酸殘基的N端的特異性裂解反應；和
(2) 在該裂解反應中獲得的片段是具有比預期的氨基酸殘基的分子量 少18的分子量的片段。
這些結果強烈地指出，在上述順序裂解中獲得的肽片段中，在N端包 含谷氨酸殘基的肽片段被脫水。此外，強烈暗示所述谷氨酸殘基被轉變?yōu)?焦谷氨酸殘基，其是由谷氨酸殘基脫水產生的分子家族。該裂解反應和裂 解模式絕對是新的，在常規(guī)的順序裂解反應中沒有被發(fā)現(xiàn)?；谏鲜鲋R， 本發(fā)明在沒有減少靈敏性并且有效地防止了副反應的條件下，提供裂解在 肽的C端的肽鍵的方法和確定肽的C端氨基酸序列的方法。
應該注意的是，在由順序裂解反應產生的肽片段中，其中水合了包含 谷氨酸殘基的肽片段的肽片段被稱為水合體，并且肽片段的水合體在附圖 中以具有縮寫"pyr"開頭的名稱表示。
<根據本發(fā)明裂解在肽的c端的肽鍵方法的一個方面>
根據本發(fā)明裂解在肽的C端的肽鍵的方法，其特征在于 裂解肽的C端肽鍵的方法，其包括下列步驟
使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基;
和
使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸殘基被順序刪除。其后，將所述步驟分別稱為酯化步驟和裂解 步驟。
(酯化步驟)
酯化步驟可以在溶液或基底中進行。當在支持肽的基底中進行酯化步 驟時，所述基底不受限制，只要其是可以保留(hold)肽的組合物。例如， 所述基底包括聚丙烯酰胺凝膠。所述基底當然可以是用于常規(guī)SDS-PAGE 以在第一維的方向進行電泳，和用于二維電泳的任何基底。
醇不受限制，只要其是具有能夠與氨基酸殘基進行酯化反應的醇式羥 基的化合物。例如，所述醇可以是具有l(wèi)-5個碳原子的醇。醇的實例包括 低級醇如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。尤其更優(yōu)選甲醇。此外，醇的 除了羥基之外的其它原子不受限制，是具有各種質量的任何原子，只要其 它的原子不抑制氨基酸殘基與醇的酯化反應。
任何肽可以用作本發(fā)明中的肽。所述肽可以包含分子內/分子間結合如 S_S結合，具有任何配位金屬，根據氧化還原狀況改變側鏈，并且可以是 用磷酸酯，糖鏈和其它進行翻譯后修飾的肽。此外，當在基底中進行所述 步驟時，所述肽不受限制，只要其可以保留在基底中。
所述全鹵化羧酸可以是任何包含鹵素原子如氟、氯和溴的羧酸。所述 全鹵化羧酸可以具有低級碳鏈。全卣化羧酸的實例包括三氯乙酸、三氟乙 酸、五氟丙酸和七氟丁酸。尤其地，根據向基底的滲透性，優(yōu)選三氟乙酸。
在本發(fā)明中，包含所述醇的全鹵化羧酸的溶液可以包含能夠將所述醇 和全鹵化羧酸保持在液體狀態(tài)的溶劑。例如，用于全鹵化羧酸溶液的溶劑 包括水和醇。g卩，包含所述醇的全鹵化羧酸的溶液可以是水溶液和醇溶液。
可以適當地調節(jié)進行酯化步驟的溫度，時間，濃度和pH。
反應溫度不受限制，只要所述肽沒有從基底洗脫，并且可以將液相保
持在液體狀態(tài)。例如，所述溫度優(yōu)選地在4-4(TC范圍內，更優(yōu)選地在20-30 。C范圍內，并且尤其優(yōu)選地在室溫-25。C的范圍內。在低于0。C的情形中， 酯化的速度會變慢，而在超過4(TC的情形中，將發(fā)生副反應如肽與全鹵化 羧酸的裂解反應。
反應時間可以根據反應溫度適當地改變。所述時間根據溫度可以是約 6小時。在少于120分鐘的情形中，谷氨酸殘基與全卣化羧酸的酯化反應 將進行得不充分。在超過2天的情形中，因為樣品的氧化和洗脫，背景會 變高，由此降低信號的質量。
用于酯化步驟的包含醇的全鹵化羧酸的溶液的每種組成的濃度不受 限制。溶液中醇濃度優(yōu)選地在5-30 ^ ％范圍內，全鹵化羧酸在溶液中的 濃度優(yōu)選地在10-40 v/v。/。范圍內。在醇濃度少于1 v/v。/。的情形中，提供給 谷氨酸的醇通過與酸的反應被消耗，由此使醇不足，而在超過60v/v。/。的 情形中，凝膠脫水并且收縮，由此阻止反應的進展。在全鹵化羧酸濃度少 于lv/v。/4青形中，酸通過與醇的酯化反應被消耗，由此使催化不足，并且 超過60 v/V/。的情形中，因為發(fā)生了不必要的脫水而導致不利的作用。當 使用甲醇作為醇，三氟乙酸作為全鹵化羧酸時，在包含醇的全鹵化羧酸的 溶液中水、甲醇與三氟乙酸的比率優(yōu)選在100 600: 150 350:300 700范圍 內，更優(yōu)選地在100:50:100 500:250:500范圍內。
當將被保留在基底中的肽酯化時，通過在隨后將基底有意用醇脫水和 收縮來以增加反應的產率后，將凝膠浸入全鹵化羧酸的醇溶液中以通過使 用由全鹵化羧酸與醇的反應產生的水來溶脹基底，從而提高所述試劑向肽 的遞送是可能的。例如，當將甲醇用作醇，而將TFA用作全鹵化羧酸時， 用甲醇進行脫水和收縮的基底可以被用在以250:500的甲醇和TFA比率包 含甲醇和TFA的溶液中，由此在室溫在溫和條件下數小時獲得溶脹的凝 膠，并進行谷氨酸的特異性酯化反應。
在酯化步驟中，由基底支持的肽的谷氨酸殘基的羧基將主要被轉變成 對應于用在上述反應中的醇的酯化的衍生物(例如在甲醇的情形中，甲基 羧基)。
(裂解步驟)
在裂解步驟中，使用鏈烷酸酑順序地裂解肽的肽鍵。通過使所述待裂 解的肽與鏈烷酸酐反應來將C端的肽的肽鍵順序地裂解，以獲得缺失了 C 端的肽，其中在C端的氨基酸殘基被順序刪除。用在裂解步驟中的鏈烷酸 酐包括取代的或未取代的鏈垸酸酐，但是不包括全氟鏈烷酸和其酐。同時， 當使用取代的鏈垸酸酐時，優(yōu)選使用被除了鹵素之外的任何原子取代的鏈
烷酸酐?？梢詫⒕哂屑s2-6個碳原子的鏈烷酸的對稱酸酑用作鏈烷酸酐來 進行肽的c端羧基的活化。通過選擇所述方面，可以在增加到反應溫度的 情況中，確保適合的反應性。此外，可以優(yōu)選地使用具有約2-4個碳原子 的鏈烷酸的對稱酸酐。通過選擇所述方面，可以減少空間位阻。此外，可 以將具有約2-6個碳原子的直鏈鏈烷酸的對稱酸酐用作酸酐。此外，可以 優(yōu)選使用具有約2-4個碳原子的直鏈鏈垸酸的對稱酸酐。通過選擇所述方 面，可以減少空間位阻。具體而言，可以使用具有2個原子的直鏈鏈烷酸 的對稱酸酐，即乙酸酐。
此外，為了嘗試活化在C端的羧基并且適當地排列以形成5-噁唑酮 環(huán)，優(yōu)選可以將較少發(fā)生空間位阻的化合物用作鏈垸酸酐。在該方面，優(yōu) 選使用乙酸酐。
應該注意，因為鏈烷酸酐將隨著反應的進程而被消耗，因此需要將超 過量的鏈烷酸酐首先溶解在用于溶脹基底的非酸堿偶極溶劑中以抑制濃 度的減少。鏈烷酸酐在反應溶液中的濃度可以在1體積％到30體積°/。的范 圍內，優(yōu)選在10體積％到20體積％范圍內。此外，反應溫度可以大于或 等于5(TC，或優(yōu)選大于或等于6(TC。通過選擇所述方面，可以有效地進 行順序裂解。此外，反應溫度可以少于或等于IO(TC，或優(yōu)選地少于或等 于8(TC。通過選擇所述方面，順序裂解可以穩(wěn)定進行。此外，其可以在使 用乙酸酐的情形中反應約4-110小時。在所述情形中，可以將反應條件設 定在50。C進行110小時，在6(TC進行50-60小時，在8(TC進行24小時或 在10(TC進行4小時。可以將反應條件設定為溫和條件，以及降低反應溫 度，由此進一步減少副反應的發(fā)生。
另一方面，在裂解步驟中，可以將鏈烷酸酐溶解在非酸堿偶極溶劑如 甲酰胺中。作為非酸堿偶極溶劑，使用這樣的溶劑，當溫度在約50-90'C 時其能夠滲透到基底中并且能夠將基底保持在溶脹狀態(tài)。此外，使用這樣
的有機溶劑，其具有相對較小的分子大小并且優(yōu)于與基底物質的親合性。 此外，非酸堿偶極溶劑可以是這樣的溶劑，其在如上提及的式(I)中所指出 的相容性異構化過程中顯示能夠維持烯醇體比率的高偶極性，并且優(yōu)于反 應副產物的鏈垸酸酐溶質和鏈烷酸。此外,非酸堿偶極溶劑優(yōu)選地在反應溫 度較少揮發(fā)和蒸發(fā)。
裂解步驟可以在去除了氧的干燥氣氛中進行。用于產生這樣的氣氛的 方法包括，例如這樣的方法，其中將進行反應的系統(tǒng)保持在氣密狀態(tài)，阻 止水分和氧氣從系統(tǒng)外部進入，在惰性氣氛如干燥氮氣和氬氣下進行用于 反應的任何液體的引入和排出。此外，可以使用具有抗氧化作用的還原的
sulfanil基團(-SH)的化合物如DTT避免氧合作用。通過去除氧，防止甲硫 氨酸殘基的硫的氧化，由此提高在測量步驟中測定分子量的精確度。
可以將反應促進劑用在裂解步驟中。促進劑包括包含氮原子的堿性芳 香環(huán)化合物，并且可以是吡啶堿或其衍生物。吡啶堿作用為質子受體。因 此，其可以快速去除將被去除的質子，伴隨氨基的酰化作用。具體而言， 吡啶堿包括，例如吡啶，甲基吡啶(甲基吡啶)，盧錫啶(二甲基吡啶)，可力 丁(三甲基吡啶)，乙基甲基吡啶和二乙基吡啶(四甲基吡啶)。包含氮原子的 堿性芳香環(huán)化合物包括縮合的環(huán)氮雜芳烴。包含氮原子的雙環(huán)堿性芳香環(huán) 化合物如喹啉，異喹啉和吲哚或可以將所述化合物的衍生物用作包含氮原 子的堿性芳香環(huán)化合物。此外，作為包含氮原子的堿性芳香環(huán)化合物，包 含氮原子的三環(huán)堿性芳香環(huán)化合物或所述化合物的衍生物如氮雜蒽和菲 啶，包括苯并喹啉，苯并異喹啉和aciydine。
在使用吡啶作為反應促進劑的情況中，所述濃度在1 v/v%-40 v/V/。范 圍內，優(yōu)選地在10 v/v%-30 v/v。/。范圍內，由此確保增加在C端的順序裂 解的速度。此外，當將基底浸入該溶液中時，可以在室溫將基底浸入20 分鐘，進行三次。接著，可以通過使用非酸堿極性溶劑從基底去除過量的 催化劑和水分，來達到用酸酐進行順序裂解反應。
應該注意在裂解步驟中的反應可以通過用如水，非酸堿偶極溶劑和非 酸堿極性溶劑稀釋并且去除滲透在基底中的反應劑鏈烷酸酐，并且降低反 應系統(tǒng)的溫度，來終止裂解步驟中的反應。在所述情形中，可以使用不溶 解基底物質并且對鏈垸酸酐和非酸堿偶極溶劑具有親和性的非酸堿極性
溶劑。在使用聚丙烯酰胺凝膠的情形中，非酸堿極性溶劑包括具有少于或 等于4個碳原子的腈如乙腈，和具有少于或等于4個碳原子的酮如丙酮。 接著，如上提及，將通過使肽與鏈烷酸酐反應形成的5-噁唑酮環(huán)水解， 以形成具有羧基端的化合物。該水解反應不受限制，只要其是任何公知的 方法，并且包含氮原子的堿性芳香環(huán)化合物或叔胺可以被用作催化劑?？?以將顯示對非酸堿極性溶劑的高溶解性的包含氮原子的單環(huán)芳香環(huán)化合 物用作包含氮原子的堿性芳香環(huán)化合物。具體而言，優(yōu)選吡啶或吡啶堿和 其他。此外，作為叔胺，使用顯示與吡啶堿的堿性一樣相對較弱堿性的化
合物。具體而言，優(yōu)選DMAE(二甲基胺乙醇((CH3)2N-CH2CH20H)作為 叔胺。在將吡啶用作包含氮原子的堿性芳香環(huán)化合物的情況中，含量可以 在水溶液的總體積的5體積％到15體積％范圍內，具體地10體積％。此 外，在使用DMAE的情形中，含量可以在水溶液總體積的1體積％到20 體積％范圍內，具體地10體積％。此外，水解反應可以在超過或等于50 。C進行。在氣密反應容器中進行反應的情形中，所述溫度可以少于或等于 100。C。
此外，水解反應可以與用鏈烷酸酐形成5-噁唑酮環(huán)的反應一起進行。 在所述情形中，加入包含有機堿的水溶液，同時減少在C端的肽鍵的順序 裂解反應的反應溫度以終止反應。通過選擇所述方面，將發(fā)生鏈烷酸酐的 失活和從基底中的洗脫。隨后，在C端的肽鍵的順序裂解反應被終止，并 且反應試劑將被失活和去除。接著，進行反應產物的水解處理，并且最終， 再次用非酸堿極性溶劑進行脫水處理。通過選擇所述方面，將發(fā)生對應于 鏈烷酸酐的鏈烷酸和非酸堿偶極溶劑以及包含有機堿的水溶液的去除，并 且發(fā)生再次脫水。隨后，可以容易地進行這樣的處理，其與在處理中間包 括用非酸堿極性溶劑進行的洗滌和去除步驟的處理并無實質上的不同。
通過根據本發(fā)明裂解在肽的C端的肽鍵的方法，在酯化步驟中進行特 異性的酯化反應，以獲得對應于在酯化步驟中的醇(例如甲醇)的酯化衍生 物(例如，包含甲基的化合物)。接下來，在裂解步驟中順序裂解在C端的 肽的肽鍵。因為谷氨酸殘基被酯化，在C端的順序裂解反應特異性地進行， 而沒有裂解在谷氨酸殘基的N端的鍵。因此，本發(fā)明可以用于各種應用， 包括質量分析以保持反應產物的定量能力，而沒有降低靈敏性，這是因為
順序裂解反應在這樣的狀態(tài)中進行，即所述肽被支持在基底中，而沒有將 待裂解的肽從基底中洗脫出。
4艮據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法的一個方面> 根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法，其特征如下
確定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基； 使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸殘基被順序刪除；
測量所述缺失了C端的肽的分子量；和
基于所述分子量確定(grasp)所述肽。所述方面還包括測量缺失了 C 端的肽的分子量和基于分子量以及上述酯化步驟和裂解步驟而確定所述 肽的步驟。將這些步驟分別稱為測量步驟和確定步驟。在該方面，可以以 如上提及的方式，以及如下提及的方式進行酯化步驟和裂解步驟。該方面 可以應用于具有不同分子量的任何肽，只要所述肽被支持在基底中。該方 面可以優(yōu)選地用在確定具有相對低分子量的肽如待確定的C端氨基酸序 列的情形中。肽可以具有少于5000的分子量。此外，在該方面中，如下提 及的使用位點特異性裂解劑的消化步驟可以在裂解步驟和測量步驟之間 進行。
(測量步驟)
測量步驟是測量肽如缺失了 C端的肽的分子量的步驟?？梢詫⒏鞣N測 量分子量的工具用在進行該步驟中。所述工具包括質量分析裝置。例如， 可以將離子阱質譜儀，四極質譜儀，扇形磁場型質譜儀，飛行時間質譜儀 和傅里葉變換質譜計用作質量分析裝置。此外，電離方法包括電霧化電離 法(ESI法)，基質輔助的激光解吸附/電離(MALDI)方法和快原子轟擊電離 (FAB條。
其中，例如優(yōu)選使用MALDI-TOF-MS。通過使用MALDI-TOF-MS， 可以在電離過程中減少組成肽片段的氨基酸殘基的原子團(atomic family)
的部分的缺乏。此外，可以優(yōu)選地進行測量相對高分子量的肽片段。此外，
甚至在將待測量的肽在基底中進行電泳，在所述基底中進行上述處理，和 接著收集并提供進行測量的情形中，可以測量相應的陰離子和陽離子二
者。因此，可以用MALDI-TOF-MS進一步滿足分析的高可再現(xiàn)性。
在將MALDI-TOF-MS用于測量步驟的情形中，可以在 MALDI-TOF-MS的電離中分別測量將質子(H+)加到肽片段上的陽離子類 別和將質子從肽片段上去除的陰離子類別。
應該注意在測量步驟中被提供進行質量分析的肽片段的長度可以最 多在30-50氨基酸殘基范圍內，和20-30個氨基酸殘基。隨后，可以確實 地將肽片段進行電離，并且可以以高精確度進行測量。肽的分子量可以在 不超過4000的范圍內，優(yōu)選地在不超過3000的范圍內。隨后，在基于分 子量的不同鑒定相應的氨基酸如天冬酰胺殘基(Asn)和天冬氨酸殘基 (Asp)，以及谷氨酰胺殘基(Gln)和谷氨酸殘基(Glu)時，可以以高精確度區(qū) 分化學式重量具有1的差異的氨基酸殘基。
(確定步驟)
所述確定步驟是基于分子量確定肽如在測量步驟中獲得的缺失了 C 端的肽和原始肽的步驟。該步驟可以這樣進行，比較在獲自如上提及的順 序裂解的具有不同長度的缺失了 C端的肽的分子量和原始肽的分子量之 間的差異，從而確定原始肽的C端氨基酸序列。
在根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法中，將在C端氨基酸序 列中特異性進行順序裂解，因為在N端的谷氨酸殘基的裂解反應受到抑 制。獲得的缺失了 C端的肽是這樣的肽，其通過順序裂解逐步在C端刪除 氨基酸殘基，而沒有非特異性地裂解在C端之外的組成肽的氨基酸殘基。 因此，C端氨基酸序列可以基于在缺失了 C端的肽和原始肽之間的分子量 差異而確定，而不用考慮其他的可能性。
<根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法的其他方面> 根據本發(fā)明確定肽的C端氨基酸序列的方法的其他方面，其特征如下: 確定被基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使被基底支持的肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的
谷氨酸殘基；
使所述肽與鏈垸酸酐反應以獲得缺失了 c端的肽，其中所述肽在c
端的氨基酸殘基被順序刪除；
將所述基底浸入包含位點特異性裂解劑的溶液中，以獲得來自所述缺 失了 C端的肽的缺失了 C端的肽來源的肽片段；
測量所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量；和
基于所述分子量確定所述肽。該方面還包括在裂解步驟和測量步驟之 間的消化步驟，以及上述的酯化步驟，裂解步驟，測量步驟和確定步驟。 該方面優(yōu)選地用在確定具有相對較高分子量的肽的C端氨基酸序列的情 形中。所述分子量可以是例如在5 kDa-300 kDa的范圍內?？梢砸匀缟咸?及的方式，和在下面提及的方式進行在這個方面中的酯化步驟，裂解步驟， 測量步驟和鑒定步驟。
(酯化步驟)
被支持在基底的肽的酯化步驟是與如上提及的包含醇的全鹵化羧酸 反應的方法。此外，可以將獲得基底溶脹和試劑滲透的方法用作酯化步驟， 其中所述方法包括使全鹵化羧酸的醇溶液與用醇脫水和收縮的基底反應， 從而利用由全鹵化羧酸與醇的反應產生的水的步驟。通過所述方法，獲得 更快速的酯化反應是可能的。
(消化步驟)
消化步驟是將支持肽的基底浸入包含位點特異性裂解劑如蛋白水解 酶的溶液中的步驟。所述步驟提供各種肽片段。其關于包含一系列反應產 物的混合物選擇性地在預定氨基酸殘基的結合位點裂解(perform)肽鏈， 在所包含一系列述反應產物的混合物中在進行了上述裂解在肽的C端的 肽鍵的方法后，預定數量的氨基酸殘基被從原始肽的C端刪去。在該情形 中，可以使用位點特異性的蛋白酶如胰蛋白酶進行相對高分子量肽鏈的酶 促消化。用在消化步驟中的位點特異性的裂解劑可以除了胰蛋白酶之外， 可以是具有位點特異性的其他蛋白酶，如在C端裂解谷氨酸殘基的V8蛋 白酶。此外，可以使用特異性裂解C端的甲硫氨酸的酰胺鍵合的任何化學 試劑，如CNBr。
消化步驟在肽被支持在基底中的狀態(tài)中進行。當肽或肽片段成為不能
被支持在基底的較短長度時，所述肽和/或肽片段被洗脫到用在消化步驟中 的液相。在消化步驟中獲得的肽片段的混合物至少包含來自原始肽的在C 端的肽片段和來自一系列反應產物的在C端的肽片段，在所述反應產物中 預定量的在C端的氨基酸殘基被刪除。
(測量步驟:i
在該方面獲得的肽除了原始肽和缺失了 C端的肽之外，還包含來自原
始肽的肽片段，來自缺失了 C端的肽的肽片段和在N端側的肽片段。因
此，通過選擇能夠精確確定在來自原始肽的峰和來自一系列反應產物的在
c端的肽片段的峰中觀察到的每個分子量的方法，在以高精確度區(qū)別來自
原始肽的在C端的肽片段和一系列反應產物的峰與來自在N端的多個肽 片段的其他峰之后，通用性可以得到進一步的提高。
在本文，如果在消化步驟中使用胰蛋白酶，組成在C端的肽片段的氨 基酸殘基不包含精氨酸殘基，因為該步驟在消化步驟之后進行。在另一方 面，在消化步驟中獲得的其他肽片段將包含具有胍基的精氨酸殘基，所述 胍基具有豐富的質子可接受性。隨后，穩(wěn)定來自這些成分的陽離子。像這 樣，在測量步驟中，可以根據用在消化步驟中使用的位點特異性裂解劑裂 解肽的方式適當地選擇測量條件。
隨后，在質量分析中，與來自陽離子類別和陰離子類別的結果比較時， 在C端的肽片段和其他肽片段之間的相對強度不同于彼此。通過利用該現(xiàn) 象，來自在C端的肽片段的系列的峰可以在一些峰的類型中進行區(qū)分和鑒 定，如通過MALDI-TOF-MS裝置測量。
來自在C端包含精氨酸殘基的肽片段的峰強度在陽離子類別的質量 分析光譜中相對較高。在另一方面，不包含精氨酸殘基的在C端的肽片段 包含羧基，所述羧基具有在C端給質子的能力。隨后，來自在C端的肽片
段的峰強度在陰離子類別的質量分析光譜中相對較高，如通過 MALDI-TOF-MS裝置所測量。像這樣，可以通過利用比較MALDI-TOF-MS
中的陽離子類別的質量分析光譜和陰離子類別的質量分析光譜時出現(xiàn)的 相對強度的不同，來區(qū)分來自通常在C端側包含精氨酸殘基的肽片段的 峰。此外，可以容易鑒定原始肽鏈的峰和來自通過在C端氨基酸殘基的順 序裂解反應中獲得的C端肽片段的系列的峰。
<其他的步驟>
用于裂解在肽的c端的肽鍵的上述方法和根據本發(fā)明確定肽的c端氨
基酸序列的方法除了上述步驟之外，還可以包括各種預處理和后處理。 (基底的脫水)
基底可以用非酸堿極性溶劑脫水，所述非酸堿極性溶劑不溶解任何組 成基底的成分如凝膠樣物質，并具有與水的親合性。通過使用該方法，即 使在脫水處理結束后，可以將待分析的肽作為分離的斑點或條帶保持在基 底中。在聚丙烯酰胺作為基底時，可以將具有少于或等于4個碳原子的腈
如與水具有較大親合性的乙腈(CH3CN)，具有少于或等于4個碳原子的酮
如丙酮用作進行脫水的非酸堿極性溶劑。此外，這些非酸堿極性溶劑比水 更容易蒸發(fā)。當所述非酸堿極性溶劑蒸發(fā)并且基底被干燥時，基底的大部 分體積減少并且基底將收縮。基底的浸入重復進行數次。例如，可以在室
溫將基底塊浸入三次，20分鐘。
(肽的交聯(lián))
可以在進行酯化步驟前將被支持在基底的肽進行彼此交聯(lián)。交聯(lián)劑不 受限制，只要其在其末端具有鍵合基團。所述交聯(lián)劑可以具有醛基，如甲 醛和戊二醛。隨后，將肽交聯(lián)在支持肽的基底中以形成網狀結構，由此使 基底和肽纏結并且抑制肽的洗脫。在使用戊二醛作為交聯(lián)劑的情況中，可
以通過將基底浸入具有1 pmol爾L到1000 nmol/pL的濃度的戊二醛水溶液 達30分鐘到2小時來進行肽的交聯(lián)。
(對于分子間/分子內結合和翻譯后修飾的處理)
在本發(fā)明中，可以將目標肽的分子間/分子內結合和翻譯后修飾的分子 家族進行處理，如降解和用適合的處理試劑進行裂解。例如，在分子間或 分子內具有目標S-S鍵合的肽的情形中，可以通過用還原劑還原它來裂解 S-S鍵合。此外，可以將通過還原S-S鍵合獲得的SH基團用烷化劑進行進 一步處理以阻止S-S鍵合的再形成。
(N或O原子的保護)
在本發(fā)明中，可以保護J3-羥基(P-OH基)如絲氨酸殘基和蘇氨酸殘基和 或s-氨基ONH2基)如賴氨酸殘基，以防止在上述裂解步驟和裂解反應， 隨后進行的轉移反應中的肽的順序裂解過程中的可能的N，O-酰基轉移反 應。此外，可以保護e-NH2基團從而將賴氨酸殘基對胰蛋白酶的敏感性一 致化，因為賴氨酸殘基的天然來源的二甲基和乙?；苌锊皇芤鹊鞍?酶， 一種蛋白酶的裂解。在該情形中，將賴氨酸殘基轉變?yōu)楸槐Ｗo的取代 的基團如在s-NH2基用天然來源的二甲基和乙?；苌锉Ｗo，由此很難 通過胰蛋白酶在N端側發(fā)生賴氨酸殘基的裂解。這些保護不受限制，只要 使用對于羥基和氨基熟知的保護基。例如，保護可以用O-乙酰化和N-乙 ?；M行保護。例如，可以這樣進行上述?；饔茫瑥亩够自诩尤胄?量的鏈垸酸的鏈烷酸酐的混合物中進行攪拌。在該情形中，鏈烷酸酐對應 于親電子?；瘎?。此外，由于質子供體能力，鏈烷酸增加鏈烷酸酐與氨基 和羥基的反應性，由此發(fā)生N-?；蚈-?；?。所述酰化作用可以根據在 裂解步驟中進行的反應的中斷而被終止。
(后處理)
可以在裂解步驟后進行去溶劑化。去溶劑化處理不受限制，并且可以 根據如上提及的基底的脫水進行。
在測量步驟前，可以將包含待測量的肽和/或肽片段的混合物進行去除 礦物質。隨后，待收集和干燥的肽片段沒有形成其鹽，并且形成一級肽。
此外，肽鏈在C端的氨基酸殘基的選擇性裂解反應與酰化作用同時進 行，所述?；饔猛ㄟ^在加熱的溫度下，使被保持在再溶脹的基底中的C 端的肽鏈與乙酸酐反應進行。具體而言，建議在肽的C端，通過以如式(I) 和(II)提及的反應途徑形成5-噁唑酮環(huán)來進行肽鏈的C端氨基酸的順序裂 解反應。
在進行c端氨基酸的順序裂解反應的情況中，將包含被逐漸缺失了 c
端氨基酸的一系列反應產物的混合物和通過?；饔帽Ｗo的原始肽保持 在基底中。
將本發(fā)明的每個方面如上提及進行詳細解釋。將這些方面用實例進行 解釋。本領域技術人員可以理解所述方面的一些修飾和修飾的方面落在本
發(fā)明的范圍內。實施方案
(處理實施例1)
將具有如在

圖1的上部所顯示的氨基酸序列的凍干的大豆胰蛋白酶抑
制劑(序列號l)與甲醇以10mg:l mL的比率進行混合，并在5"冷卻。將 6N的鹽酸在5。C，在攪拌下逐滴加入混合物，以將濃度調節(jié)為0.01 N。 在16小時后，再將6N鹽酸逐滴加入以調節(jié)濃度為0.01N。再過24小時 后，再將6N鹽酸逐滴加入以將濃度調節(jié)為0.01N，并再攪袢3天。將等 分部分用移液管分批移出并且在真空下干燥以除去溶劑，由此獲得干燥物 質1。應該注意，圖1的下部顯示用胰蛋白酶消化的胰蛋白酶抑制劑的推 導肽片段的N端的殘基的數量及其理論分子量。
(參考例1)
將在處理實施例1中制備的干燥物質1溶解在用于聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)的緩沖液中(50 mM的Tris-KCl (pH 6.8), 1%的2-巰基乙醇 和1% SDS)，并進行SDS-PAGE。將獲得的條帶切成1 mmxl mm的大小， 并且在37'C浸入1.25 ng/jiL的胰蛋白酶溶液達16小時以進行胰蛋白酶凝 膠中消化。隨后，用MALDI-TOF-MS分析從凝膠中洗脫進入液相的每個 肽片段。用陽離子模式和反射極模式進行測量。將獲得的結果顯示在圖 2-5。圖2-5顯示通過用胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制劑獲得的肽片段的質量 分析光譜，其中分別地，圖2對應于肽片段的48 - 63殘基(序列號21)， 圖3對應于肽片段的112 - 119殘基(序列號22),圖4對應于肽片段的66-76 殘基(序列號24)和肽片段的167 - 175殘基(序列號23)和圖5對應于肽片 段的31 - 38殘基(序列號25)。應該注意水平軸顯示質量數，垂直軸顯示 相對強度(圖2-圖7相同顯示)。
如在圖2-5中清楚顯示，對應于甲基衍生物的峰僅在每個肽片段中具 有谷氨酸殘基的肽片段中觀察到(序列號21， 23和25)，所述肽片段通過在 處理實施例1中進行的胰蛋白酶消化胰蛋白酶抑制劑獲得(在圖2中， 1777.0432;在圖4中,1225,7784;和在圖5中，829.4880)。隨后，發(fā)現(xiàn)這些
肽片段的谷氨酸殘基通過處理實施例1的處理而被甲基化。(參考例2)
將對應于序列號26的肽片段，其是獲自未進行處理實施例1中的處
理的一組肽片段，通過nano LC用反相柱進行分離，并且接著用MS/MS 分析獲得的組分。結果顯示在圖8中。在N端包含谷氨酸殘基的每個肽片 段的分子量和如在序列號26中所顯示的肽片段的理論分子量(分別對應于 圖8中的b3-bl4和序列號37-47)之間的差異是18。此外，關于整個部分 的分子量，觀察到比理論值少18的峰。在綜合如下提及的實施方案1的 結果后，發(fā)現(xiàn)在N端的谷氨酸殘基被脫水形成焦谷氨酸殘基。
(實施方案1)
將在處理實施例1中制備的干燥物質1溶解在用于聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE)的緩沖液中(50 mM的Tris-KCl (pH 6.8)， 1%的2-巰基乙醇 和1。/。SDS)，并進行SDS-PAGE。接著，將包含胰蛋白酶抑制劑的凝膠塊 切成lmm大小的立方體，并且進行如下提及的裂解步驟處理。結果顯示 在圖6中。圖6(a)顯示未進行處理實施例1的肽片段的質量分析光譜，圖 6(b)顯示進行了處理實施例1的肽片段的質量分析光譜。
在圖6(a)中，發(fā)現(xiàn)在1673.69和1805.79質量數的峰，并且所述峰分 別對應于具有如在序列號26中顯示的氨基酸序列和在序列號27中顯示的 氨基酸序列的水合衍生物。此外，在圖6(b)中，發(fā)現(xiàn)質量數在1673.97和 1806.11的峰，并且分別對應于圖6 (a)的氨基酸序列。如清楚地在圖6中 所顯示，在進行了處理實施例1中的處理的組中，如在序列號26中所顯 示的氨基酸序列的脫水衍生物的峰強度顯著減少。另一方面，在進行了處 理實施例1中處理的組中，如在序列號27中顯示的氨基酸序列的峰強度 顯著增加。在綜合圖2的結果后，發(fā)現(xiàn)在裂解步驟的處理中發(fā)生的在N端 的谷氨酸殘基的裂解被谷氨酸殘基的甲基化所特異性抑制。
(實施方案2)
將5嗎的胰蛋白酶抑制劑(序列號l)用SDS-PAGE進行電泳并且用 CBB對條帶進行染色。將染色的條帶切成lmmxlmm大小的凝膠塊，并
且將凝膠塊浸入水甲醇TFA-500:250:500OL)的水，甲醇和TFA的溶
液中，并且在室溫將其放置16小時。接著，如下提及，使凝膠塊進行裂 解步驟的處理。結果顯示在圖7中。
如與圖6(a)的結果比較所清楚顯示，在裂解步驟中在N端發(fā)生的谷氨 酸殘基的裂解反應被如在上述酯化步驟中所獲得的谷氨酸殘基的甲基化 所顯著抑制。
<裂解步驟的處理>
將其用1.25pmol/jLiL的戊二醛溶液固定。接下來，將固定的凝膠塊用 吡啶溶液處理，用乙腈脫水并且在6(TC浸入在甲酰胺溶液中的30%乙酸酐 溶液中達1小時。接著，在6(TC將凝膠塊浸入在乙醇溶液中的10%二甲基 胺溶液達2小時以進行水解反應。隨后，進行根據參考實施例l的以胰蛋 白酶消化進行的凝膠中消化，并且用MALDI-TOF-MS分析獲得的胰蛋白 酶的片段。用陽離子模式和線性模式進行測量。
(關于如在每個序列號中所指出的序列)
將在說明書，權利要求和附圖中公開的氨基酸序列以每個序列號列出 如下。
序列號1:大豆胰蛋白酶抑制劑的氨基酸序歹U(Genbank No.lAVU，下
同)
序列號2:大豆胰蛋白酶抑制劑l-30殘基的氨基酸序列。 序列號3:大豆胰蛋白酶抑制劑31-38殘基的氨基酸序列 序列號4:大豆胰蛋白酶抑制劑39-47殘基的氨基酸序列 序列號5:大豆胰蛋白酶抑制劑48-52殘基的氨基酸序列 序列號6:大豆胰蛋白酶抑制劑53-63殘基的氨基酸序列 序列號7:大豆胰蛋白酶抑制劑64-65殘基的氨基酸序列 序列號8:大豆胰蛋白酶抑制劑66-76殘基的氨基酸序列 序列號9:大豆胰蛋白酶抑制劑77-106殘基的氨基酸序列 序列號10:大豆胰蛋白酶抑制劑107-111殘基的氨基酸序列 序列號ll:大豆胰蛋白酶抑制劑112-119殘基的氨基酸序列 序列號12:大豆胰蛋白酶抑制劑120-122殘基的氨基酸序列 序列號13:大豆胰蛋白酶抑制劑123-132殘基的氨基酸序列
序列號14:大豆胰蛋白酶抑制劑133-144殘基的氨基酸序列 序列號15:大豆胰蛋白酶抑制劑145-159殘基的氨基酸序列 序列號16:大豆胰蛋白酶抑制劑在160殘基的氨基酸序列 序列號17:大豆胰蛋白酶抑制劑161-165殘基的氨基酸序列 序列號18:大豆胰蛋白酶抑制劑166-175殘基的氨基酸序列 序列號19:大豆胰蛋白酶抑制劑176-178殘基的氨基酸序列 序列號20:大豆胰蛋白酶抑制劑179-181殘基的氨基酸序列 序列號21:大豆胰蛋白酶抑制劑48-63殘基的氨基酸序列 序列號22:大豆胰蛋白酶抑制劑112-119殘基的氨基酸序列 序列號23:大豆胰蛋白酶抑制劑166-175殘基的氨基酸序列 序列號24:大豆胰蛋白酶抑制劑66-76殘基的氨基酸序列 序列號25:大豆胰蛋白酶抑制劑31-38殘基的氨基酸序列 序列號26:大豆胰蛋白酶抑制劑49-63殘基的氨基酸序列 序列號27:大豆胰蛋白酶抑制劑48-63殘基的氨基酸序列 序列號28:大豆胰蛋白酶抑制劑61-63殘基的氨基酸序列 序列號29:大豆胰蛋白酶抑制劑60-63殘基的氨基酸序列 序列號30:大豆胰蛋白酶抑制劑59-63殘基的氨基酸序列 序列號31:大豆胰蛋白酶抑制劑58-63殘基的氨基酸序列 序列號32:大豆胰蛋白酶抑制劑57-63殘基的氨基酸序列 序列號33:大豆胰蛋白酶抑制劑56-63殘基的氨基酸序列 序列號34:大豆胰蛋白酶抑制劑55-63殘基的氨基酸序列 序列號35:大豆胰蛋白酶抑制劑54-63殘基的氨基酸序列 序列號36:大豆胰蛋白酶抑制劑53-63殘基的氨基酸序列 序列號37:大豆胰蛋白酶抑制劑49-51殘基的氨基酸序列 序列號38:大豆胰蛋白酶抑制劑49-52殘基的氨基酸序列 序列號39:大豆胰蛋白酶抑制劑49-53殘基的氨基酸序列 序列號40:大豆胰蛋白酶抑制劑49-54殘基的氨基酸序列 序列號41:大豆胰蛋白酶抑制劑49-55殘基的氨基酸序列 序列號42:大豆胰蛋白酶抑制劑49-56殘基的氨基酸序列 序列號43:大豆胰蛋白酶抑制劑49-57殘基的氨基酸序列
序列號44:大豆胰蛋白酶抑制劑49-58殘基的氨基酸序列 序列號45:大豆胰蛋白酶抑制劑49-59殘基的氨基酸序列 序列號46:大豆胰蛋白酶抑制劑49-60殘基的氨基酸序列 序列號47:大豆胰蛋白酶抑制劑49-62殘基的氨基酸序列
本發(fā)明用本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案進行解釋。顯而易見的是，盡管本 發(fā)明參考具體的實施方案進行了解釋，可以在不背離本發(fā)明由權利要求所 限定的精神和范圍的前提下進行對這些實施方案的各種修飾和改進。艮口， 本發(fā)明不應該被解釋為受限于詳細的具體實施方案和附圖。
權利要求
1. 一種裂解肽的C端的肽鍵的方法，所述方法包括下列步驟:使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基；和使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C端的氨基酸殘基被順序地刪除。
2. 根據權利要求l所述的方法，其中使所述肽與包含醇的全鹵化羧酸 溶液反應的所述步驟是操作(performing)被基底支持的所述肽的步驟。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述基底是聚丙烯酰胺凝膠。
4. 根據權利要求1到3任一項所述的方法，其中所述包含醇的全鹵化羧 酸溶液是選自由水溶液和醇溶液組成的組的溶液。
5. 根據權利要求1到4任一項所述的方法，其中所述醇具有l(wèi)-5個碳原子。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述醇是甲醇。
7. 根據權利要求1到6任一項所述的方法，其中所述全鹵化羧酸選自由 三氯乙酸，三氟乙酸，五氟丙酸和七氟丁酸組成的組。
8. 根據權利要求7的方法，其中所述全鹵化羧酸是三氟乙酸。
9. 根據權利要求1到8任一項所述的方法，其中所述全鹵化羧酸溶液具 有100-600: 150-350: 300-700的體積比的水甲醇TFA。
10. —種確定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基； 使所述肽與鏈垸酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C端的氨基酸殘基被順序地刪除；測量所述缺失了C端的肽的分子量;和 基于所述分子量確定所述肽。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述基于所述分子量確定所述 肽的所述步驟是基于所述肽的分子量和所述缺失了C端的肽的分子量之間 的差異確定所述肽的C端氨基酸序列的步驟。
12. —種確定肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列步驟 使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的谷氨酸殘基；使所述肽與鏈烷酸酐反應以獲得缺失了c端的肽，其中所述肽在c端的氨基酸殘基被順序地刪除；使所述肽與位點特異性的裂解劑反應，以獲得來自所述缺失了C端的 肽的缺失了C端的肽來源的肽片段；測量所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量；和基于所述分子量確定所述肽。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述位點特異性的裂解劑是選 自由胰蛋白酶，V8蛋白酶和CNBr組成的組的試劑。
14. 一種確定由基底支持的肽的C端氨基酸序列的方法，其包括下列 步驟使由基底支持的肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化所述肽的 谷氨酸殘基；使所述肽與鏈烷酸酐反應，以獲得缺失了C端的肽，其中所述肽在C 端的氨基酸殘基被順序地刪除；將所述基底浸入包含位點特異性裂解劑的溶液中，以獲得來自所述缺 失了C端的肽的缺失了C端的肽來源的肽片段；測量所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量；和基于所述分子量確定所述肽。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述基于所述分子量確定所述 肽的所述步驟是基于所述缺失了C端的肽來源的肽片段的分子量和對應于 來自于所述肽的所述肽片段的肽片段的分子量之間的差異來確定所述肽 的C端氨基酸序列的步驟。
16. 根據權利要求14或15所述的方法，其中所述包含醇的全鹵化羧酸 的溶液具有150-350: 300-700的體積比的甲醇TFA。
17. 根據權利要求14到16任一項所述的方法，其中所述位點特異性裂 解劑是選自由胰蛋白酶，V8蛋白酶和CNBr組成的組的試劑。
18. 根據權利要求14到17任一項所述的方法，其中所述基底是聚丙烯 酰胺凝膠。
全文摘要
公開了下列裂解肽的C端的肽鍵的方法，其中所述方法在靈敏性降低上有所改善并且產生很少的副作用；和確定肽的C端氨基酸序列的方法。裂解肽的C端的肽鍵的方法包括下列步驟使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化肽中的谷氨酸殘基；和使肽與無水鏈烷酸反應從而產生C端缺失的肽，其中在肽中的C端氨基酸殘基被逐一刪除。確定肽的C端氨基酸序列的方法包括下列步驟使肽與包含醇的全鹵化羧酸溶液反應，以酯化肽中谷氨酸殘基；使肽與無水鏈烷酸反應，從而產生C端缺失的肽，其中在肽中的C端氨基酸殘基被逐一刪除；確定C端缺失的肽的分子量；并且基于所述分子量確定肽。
文檔編號G01N33/68GK101379402SQ20078000494
公開日2009年3月4日 申請日期2007年2月8日 優(yōu)先權日2006年2月8日
發(fā)明者上條憲一, 宮崎賢司, 次田晧 申請人:日本電氣株式會社