專利名稱：用于測(cè)量流體中微觀對(duì)象的光致發(fā)光、吸收以及衍射的設(shè)備和方法
用于測(cè)量流體中微觀對(duì)象的光致發(fā)光、吸收以及衍射的設(shè)備和方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于對(duì)測(cè)量容器中存在的流體的光致發(fā)光進(jìn)行測(cè)量的設(shè)備 和方法的一般領(lǐng)域。這種設(shè)備和方法特別用于對(duì)流體，例如生物流體中的 微觀對(duì)象(或粒子)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
更準(zhǔn)確地說(shuō)，本發(fā)明涉及基于使用部分相干光源(例如發(fā)光二極管
(LED))作為激發(fā)流體中存在的分子(例如熒光分子)的手段的設(shè)備。
由光致發(fā)光引起的光發(fā)射是一種基本上各向同性的輻射現(xiàn)象，其在由
光能已經(jīng)在先激發(fā)的易激分子返回其基態(tài)時(shí)產(chǎn)生，所述激發(fā)在該分子的特
定波長(zhǎng)處發(fā)生。由于光致發(fā)光引起的光發(fā)射總是在低于激發(fā)頻率的頻率處
發(fā)生。通常遠(yuǎn)離入射光的激發(fā)軸，并且經(jīng)由僅將感興趣的譜帶通過(guò)檢測(cè)器
的彩色濾波器來(lái)執(zhí)行測(cè)量。
本發(fā)明特別涉及能夠檢測(cè)到非常微弱的光致發(fā)光信號(hào)的開(kāi)發(fā)中的光學(xué)
和光電裝置，諸如那些用于標(biāo)記生物分子(例如蛋白質(zhì)或核酸)的光學(xué)和光電裝置。
在動(dòng)物生物學(xué)中，測(cè)量光致發(fā)光信號(hào)對(duì)于從業(yè)者來(lái)說(shuō)尤其有利于作出 診斷，特別是細(xì)胞學(xué)診斷，在細(xì)胞學(xué)診斷中，能夠檢測(cè)并對(duì)稀有的細(xì)胞系， 如造血千細(xì)胞或者在血液或其它生物流體中出現(xiàn)的其它元素進(jìn)行計(jì)數(shù)是非 常有用的。
生物元素的光致發(fā)光測(cè)量，不論該光電發(fā)射是自然的還是由分子探針 誘發(fā)的，都在流式細(xì)胞儀和自動(dòng)細(xì)胞儀領(lǐng)域，尤其是對(duì)于血液細(xì)胞學(xué)有著 廣泛的應(yīng)用。
所使用的分子探針可以是對(duì)于特定類(lèi)型的分子各具有固有親和力的活 休染料或者超活體染料，諸如插入核酸的染料。它們也可以是以下類(lèi)型的 免疫學(xué)探針(immunological probe):即包括單獨(dú)的或者串聯(lián)(in tandem) 的抗體和移植于其上的染料分子(通常是熒光染料)，或者有時(shí)候是納米晶 體?？贵w將可具體結(jié)合到己知作為抗原或抗原決定簇(antigenic determinant)的分子或分子部分上，并且隨后可通過(guò)測(cè)量光致發(fā)光進(jìn)行計(jì)數(shù)。
通過(guò)實(shí)施免疫學(xué)探針進(jìn)行標(biāo)記的方法廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)鑒別，特別是
借助于流式細(xì)胞儀技術(shù)。
為了獲得這種測(cè)量所要求的靈敏度級(jí)別，激發(fā)光源必須能夠傳輸足夠
的能量以使得在己標(biāo)記的生物元素通過(guò)激發(fā)光束時(shí)，能夠以足夠的靈敏度
檢測(cè)到每個(gè)已標(biāo)記的生物元素。
為了獲得這種能力，大多數(shù)利用這些熒光技術(shù)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或機(jī)器
使用基于氣態(tài)、固態(tài)或其它源的激光型光源，或者半導(dǎo)體源，如激光二極
管或其它激光派生物，例如二極管-泵浦固體(DPSS)源。
激光型源具有非常好的空間相干性和高的功率，但是激光束的高斯結(jié) 構(gòu)影響測(cè)量點(diǎn)處的光場(chǎng)的均勻性。為了獲得測(cè)量點(diǎn)處均勻性大于0.5%的場(chǎng)， 必須利用復(fù)雜且因此昂貴的光學(xué)系統(tǒng)。
所以，利用激光源將帶來(lái)花費(fèi)這一主要缺陷，并且尤其是對(duì)于使用染 料或多帶的紫外線(UV)激發(fā)束設(shè)備來(lái)說(shuō)，成本更是難以承受，這意味著這 種設(shè)備的應(yīng)用將僅限于較難的生物學(xué)分析領(lǐng)域中非常特殊的情況。
激光二極管比較廉價(jià)，并且它們具有能夠提供高功率密度以及高空間 相干性的優(yōu)點(diǎn)，但是可用波長(zhǎng)與LED能夠提供的波長(zhǎng)相比更加受限。
關(guān)于該主題，例如從文獻(xiàn)WO 00/57161中已知在流式細(xì)胞儀中使用具 有低空間相干性的這種源，如LED。
圖1示出一般性地使用具有低空間相干性的源，如弧光燈或LED，的 設(shè)備。這種設(shè)備可以用于針對(duì)中央注入有用于分析的流體(例如，生物流體) 的測(cè)量容器CM中的光致發(fā)光進(jìn)行測(cè)量。所建議的光學(xué)系統(tǒng)通常認(rèn)為是落 射熒光(epifluorescence)模式設(shè)置。該設(shè)備包括用于產(chǎn)生激發(fā)光束的光源 S，以及用于拾取由光致發(fā)光所發(fā)射的光束的元件(例如，光檢測(cè)器PD)，。
術(shù)語(yǔ)"激發(fā)光束"或"光"或"輻射"用于表示來(lái)自照亮待分析的流 體的光源的光。
術(shù)語(yǔ)"發(fā)射光束"或"光"或"輻射"用于表示激發(fā)光束和待分析的 流體中存在的微觀對(duì)象之間的非彈性作用所產(chǎn)生的光，如由熒光或光致發(fā) 光所發(fā)射的光。
在這種落射熒光設(shè)備中，光源S所產(chǎn)生的激發(fā)光束以及光檢測(cè)器PD所拾取的發(fā)射光束在同一軸上，沿著"系統(tǒng)"軸X傳播，因此，可以使用同 一光學(xué)系統(tǒng)來(lái)發(fā)射和接收光。
該設(shè)備具有用于將激發(fā)和發(fā)射光束分隔開(kāi)的二色性板(dichroicplate)DC。
優(yōu)選地，該設(shè)備還具有兩個(gè)濾波器F1和F2，分別用于針對(duì)來(lái)自光源S 的朝向測(cè)量容器CM發(fā)射的光以及由源S發(fā)射的激發(fā)光與測(cè)量容器CM中 存在的流體中的微觀對(duì)象之間的非彈性作用所產(chǎn)生的熒光(可能是各種波長(zhǎng) 的)進(jìn)行濾波。
光學(xué)單元Ll和L3使得激發(fā)和發(fā)射光束在通過(guò)濾波器Fl和F2以及二 色性板DC時(shí)成為平行光束。具有較大的數(shù)值孔徑的透鏡或光學(xué)單元L2使 得激發(fā)光朿能夠聚焦在以測(cè)量容器CM的測(cè)量點(diǎn)M為中心的小體積 (volume)上。
來(lái)自流體中的微觀對(duì)象并通過(guò)由激發(fā)光束照亮的點(diǎn)M的熒光由透鏡L2 聚焦為平行光束，通過(guò)板DC,由濾波器F2濾波，并在由透鏡L3聚焦之后 由光檢測(cè)器PD接收。
通常，相對(duì)于所使用的熒光所選擇的中心波長(zhǎng)的激發(fā)光束的功率較弱。 這相應(yīng)地降低了現(xiàn)有技術(shù)設(shè)備的鑒別能力，因此它們的應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。 它們只能夠檢測(cè)到例如，與大量表位(epitope)或者在熒光中呈現(xiàn)高等級(jí) 效率的標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的高熒光性的信號(hào)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于測(cè)量光致發(fā)光以及用于測(cè) 量吸收和/或衍射的精確、靈敏、廉價(jià)的設(shè)備以減少現(xiàn)有技術(shù)設(shè)備的缺陷， 所述設(shè)備包括至少兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)包括呈現(xiàn)低空間相干性并 沿著"系統(tǒng)"軸向所述測(cè)量容器傳輸激發(fā)光束的光源，以及用于拾取(獲取) 集中在所述系統(tǒng)軸上的光致發(fā)光的發(fā)射光束的拾取元件(或獲取元件)，所述 光學(xué)系統(tǒng)同時(shí)操作并且定位為使得它們的軸圍繞所述測(cè)量容器彼此之間形 成非180°的非零鈍角，所述光致發(fā)光的測(cè)量通過(guò)將從所述拾取元件同時(shí)拾 取的發(fā)射光束所獲取的數(shù)據(jù)耦合在一起而得出。根據(jù)本發(fā)明，所述光學(xué)系
統(tǒng)還以如下方式定位即在第一光學(xué)系統(tǒng)的源的激發(fā)光束與第二光學(xué)系統(tǒng)的拾取元件所拾取的發(fā)射光束之間存在至少一個(gè)部分重疊光束，并且所述
設(shè)備還配備有至少一個(gè)"消光(extinction)"拾取元件，其位于至少一個(gè)源 的附近并用于拾取部分重疊光束中的激發(fā)波長(zhǎng)的光，吸收和/或衍射的測(cè)量 山所述消光拾取元件拾取的光中所獲取的數(shù)據(jù)得出。
本發(fā)明特別建議增加光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)目，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)使用低空間相干 性的光源，并且將接收到的發(fā)射光束耦合在一起。對(duì)于n個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，這 使得測(cè)量點(diǎn)處的激發(fā)功率能夠比使用單個(gè)系統(tǒng)時(shí)大n倍，并且使得接收到 的光致發(fā)光發(fā)射的功率比從單個(gè)系統(tǒng)接收到的大nM咅，因?yàn)槠涫窃趎個(gè)光 學(xué)系統(tǒng)上同時(shí)接收的。光致發(fā)光發(fā)射輻射的各向同性特性確保在將落射熒 光屮使用的光學(xué)系統(tǒng)增加n個(gè)時(shí)，設(shè)備的檢測(cè)靈敏度基本上增加112倍。從 而，可使用呈現(xiàn)低相干性的光源而沒(méi)有任何有害的靈敏度損失。
此外，假設(shè)通過(guò)來(lái)自同時(shí)操作的兩個(gè)系統(tǒng)的兩個(gè)激發(fā)光束激發(fā)測(cè)量體 積，并且熒光所發(fā)射的光是各向同性的，則熒光發(fā)射光束由兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng) 的兩個(gè)拾取元件同時(shí)收集。由于兩個(gè)系統(tǒng)都是落射熒光設(shè)置的，即發(fā)射和 接收發(fā)生在利用同一光學(xué)系統(tǒng)的公共的軸上，并且由于兩個(gè)系統(tǒng)設(shè)置為兩 者之間具有嚴(yán)格的鈍角，所以由每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)接收的熒光發(fā)射光束相對(duì)于 來(lái)自其它光學(xué)系統(tǒng)的激發(fā)光束存在角度偏移。
隨后所接收的熒光發(fā)射光束由于直接的光照明而幾乎未受到干擾，并 且由于使用了兩個(gè)激發(fā)光束而不是如現(xiàn)有技術(shù)設(shè)備中那樣僅使用單個(gè)激發(fā) 光束，所以熒光發(fā)射光束的強(qiáng)度也是二倍。
此外，由于兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)在測(cè)量容器周?chē)舜酥g形成鈍角，重疊光 朿的重疊程度很小，其存在也保證了最大功率到達(dá)該容器，同時(shí)產(chǎn)生最小 量的干擾光。
本發(fā)明建議使用適于拾取來(lái)自重疊光束的光的消光拾取元件，該光呈 現(xiàn)出代表通過(guò)重疊光束的微觀對(duì)象的吸收和/或衍射的強(qiáng)度變化。使用適當(dāng)
的拾取元件能夠量化該吸收。
在本發(fā)明的-個(gè)實(shí)施例中，該設(shè)備具有奇數(shù)個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，其定位為使
得它們的軸圍繞所述測(cè)量容器彼此之間成對(duì)地形成非180°的非零鈍角。 根據(jù)具體特征，所述光學(xué)系統(tǒng)定位為使得它們的軸圍繞測(cè)量容器形成
相等的角。優(yōu)選地，光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)目等于三。那么該設(shè)備包括位于所述測(cè)量容器 周闈的三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，它們的軸圍繞所述測(cè)量容器彼此之間形成相等的角。
該具體特征用于限制測(cè)量容器周?chē)目臻g大小，同時(shí)使得每個(gè)拾取元 件從測(cè)量容器CM接收到的每個(gè)熒光發(fā)射光束的強(qiáng)度與使用單個(gè)光學(xué)系統(tǒng) 的激發(fā)相比，提高三倍。
此外，光學(xué)系統(tǒng)在測(cè)量容器周?chē)?20°處的位置以及需要具有重疊光束 嬰求所使用的激發(fā)和發(fā)射光束具有大的數(shù)值孔徑。這提供了相應(yīng)地增大用 于激發(fā)容器中的熒光的功率的優(yōu)點(diǎn)。
此外，通過(guò)使用這種大數(shù)值孔徑的光源，可獲得非常均勻的光場(chǎng)。因 此，使用二個(gè)光學(xué)系統(tǒng)提供了積極的協(xié)作效果。
另外，使用三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)提供了一種在光學(xué)系統(tǒng)之間的角度、可用的 光功率、重疊、光場(chǎng)均勻性、成本以及靈敏度方面的優(yōu)選的配置。
然而，應(yīng)該觀察到，三光學(xué)系統(tǒng)配置的許多優(yōu)點(diǎn)與重疊光束以及消光 拾取元件的存在與否無(wú)關(guān)。此外，這種配置能夠完美地實(shí)現(xiàn)使用具有低空 間相干性的光源來(lái)測(cè)量熒光而不用測(cè)量消光，而與重疊光束的存在與否無(wú) 關(guān)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施中，發(fā)射光束拾取元件連接到公共的光檢測(cè)器或一 組公共的光檢測(cè)器。
這種實(shí)施使得能夠?qū)⑹叭≡瑫r(shí)接收到的熒光信號(hào)直接在公共的光 檢測(cè)器內(nèi)相加。然后，由于是使用單個(gè)光檢測(cè)器獲取的數(shù)據(jù)，所以該數(shù)據(jù) 被直接耦合。這種特征用于執(zhí)行光信號(hào)的光學(xué)相加。光檢測(cè)器通常對(duì)單個(gè) 波長(zhǎng)敏感。因此，在僅預(yù)料到一個(gè)光致發(fā)光波長(zhǎng)時(shí)使用單個(gè)光檢測(cè)器將更 適合，其中單個(gè)光致發(fā)光波長(zhǎng)通常對(duì)應(yīng)于單個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)。
相反，針對(duì)拾取元件使用一組光檢測(cè)器能夠檢測(cè)到多個(gè)光致發(fā)光波長(zhǎng)。 因此，當(dāng)預(yù)料到多個(gè)光致發(fā)光波長(zhǎng)時(shí)這更加合適，其中多個(gè)光致發(fā)光波長(zhǎng) 通常對(duì)應(yīng)于多個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)。例如，這對(duì)應(yīng)于三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)不一定都發(fā)射 相同波長(zhǎng)的光的配置。
在兩種配置中，光檢測(cè)器執(zhí)行光信號(hào)的光學(xué)相加。
優(yōu)選地，光檢測(cè)器連接到數(shù)據(jù)處理器裝置，其中所述數(shù)據(jù)處理器裝置 適于由所述光檢測(cè)器接收的數(shù)據(jù)得出所述光致發(fā)光的測(cè)量。在實(shí)施例中，消光拾取元件連接到光檢測(cè)器，光檢測(cè)器本身連接到數(shù) 據(jù)處理器裝置，所述數(shù)據(jù)處理器裝置適于由所述光檢測(cè)器接收的數(shù)據(jù)得出 吸收和/或衍射的測(cè)量。
根據(jù)本發(fā)明的具體特征，發(fā)射光束拾取元件和/或消光拾取元件是圓形 或矩形截面的光纖。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體特征，光源包括具有低空間相干性的LED， K耦合到用于使得激發(fā)光束均勻的光學(xué)元件。
優(yōu)選地，所述光學(xué)元件是光導(dǎo)管(light conductor),例如，光纖。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述測(cè)量容器在光學(xué)系統(tǒng)放置的平面上是多面 體截面的，所述多面體的面垂直于光學(xué)系統(tǒng)的軸。
當(dāng)使用以規(guī)則角度圍繞容器放置的三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)時(shí)，容器呈現(xiàn)等邊三 角形形式的截面。
在另一實(shí)施例中，測(cè)量容器是圓柱形的。
優(yōu)選地，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)包括像差校正裝置，用于校正由于測(cè)量容器的 幾何形狀而在各個(gè)光束中引入的像差。
在本發(fā)明的特別有利的應(yīng)用中，所述流體是生物流體。
在該應(yīng)用中，本發(fā)明的設(shè)備可以用于檢測(cè)已經(jīng)標(biāo)記了熒光的生物元素 并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。特別是在流式細(xì)胞儀領(lǐng)域中有多種應(yīng)用，更具體地用于 外周血樣本或者骨髓或者任何其它生物流體中生物細(xì)胞的鑒別和計(jì)數(shù)。
本發(fā)明還提供了一種對(duì)測(cè)量容器中存在的流體中的光致發(fā)光、吸收和/ 或衍射進(jìn)行測(cè)量的方法，其特征在于所述測(cè)量容器中的流體同時(shí)接收來(lái)自 兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的至少兩個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)具有沿著"系統(tǒng)"軸向 所述測(cè)量容器發(fā)送所述激發(fā)光束的低空間相干性的光源，以及用于接收集 中在所述系統(tǒng)軸上并來(lái)自所述流體的光致發(fā)光的發(fā)射光束的拾取元件，所 述光學(xué)系統(tǒng)定位為使得它們的軸圍繞所述測(cè)量容器彼此之間形成非180° 的非零鈍角，所述光致發(fā)光的測(cè)量通過(guò)將從所述拾取元件同時(shí)拾取的發(fā)射 光束所獲取的數(shù)據(jù)耦合在一起而得出。根據(jù)本發(fā)明，所述光學(xué)系統(tǒng)定位為 使得在來(lái)自第一光學(xué)系統(tǒng)的源的激發(fā)光束與由至少一個(gè)第二光學(xué)系統(tǒng)的拾 取元件所拾取的發(fā)射光束之間存在部分重疊光束，并且位于至少一個(gè)源附 近的至少一個(gè)消光拾取元件拾取部分重疊光束中的至少一個(gè)激發(fā)光波長(zhǎng)，吸收和/或衍射的測(cè)量由所述消光拾取元件拾取的光中所獲取的數(shù)據(jù)得出。


本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)將從下面參考附圖所做的描述中變得顯而易 見(jiàn)，其中附圖示出了沒(méi)有限制性特征的實(shí)施例。附圖中-圖1示出現(xiàn)有技術(shù)中已知的光致發(fā)光測(cè)量設(shè)備； 圖2是示出本發(fā)明的光致發(fā)光設(shè)備的原理的視圖3示出在圖2中所示的設(shè)備的測(cè)量容器中沿著水平方向的光束的強(qiáng) 度llll線；
圖4示出在圖2中所示的設(shè)備中使用的濾波器和二色性板的光譜特性 的實(shí)例；
圖5示出噻唑(thiazol)染料以實(shí)線表示的吸收光譜和以虛線表示的熒 光中的發(fā)射光譜；
圖6所示為本發(fā)明的光致發(fā)光測(cè)量設(shè)備所分析的體積的三維視圖7是本發(fā)明的光致發(fā)光測(cè)量設(shè)備的第一實(shí)施例的透視圖8示出用于校正由于測(cè)量容器的形狀造成的像差的裝置；
圖9示出作為玻璃/空氣界面處入射角的函數(shù)的發(fā)射光束的透射系數(shù)；
圖10是用于測(cè)量多個(gè)光致發(fā)光值的本發(fā)明設(shè)備的第二實(shí)施例的透視
閣；
圖IIA、圖IIB和圖IIC示出消光拾取元件在本發(fā)明的設(shè)備中的多個(gè) 位置；
圖12A和圖12B分別示出三角形容器和透視圖中的重疊光束； 圖13是示出根據(jù)本發(fā)明的吸收和衍射測(cè)量的原理的視圖； 圖14示出在用作消光拾取元件的光纖的出口處觀察到的結(jié)果； 圖15示出染料藻紅蛋白花青5 (dye phycoerthyrine cyanine 5)以實(shí)線 表示的吸收光譜和以虛線表示的熒光中的發(fā)射光譜；以及
圖16是其上繪制有使用如圖2中所示的設(shè)備所測(cè)量的網(wǎng)狀細(xì)胞群 (population)的特性的視圖。
具體實(shí)施方式
圖2是本發(fā)明的光致發(fā)光測(cè)量設(shè)備在圓柱形測(cè)量容器CM中的圖。該 設(shè)備包括三個(gè)類(lèi)似的光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cb和Cc，每個(gè)系統(tǒng)分別以軸Xa、 Xb 和Xc為屮心。這些軸Xa、 Xb和Xc彼此之間形成不是180°的非零角。 在圖2屮所示的優(yōu)選實(shí)施例中，光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cb和Cc規(guī)則地分布在測(cè)量 容器CM周?chē)虼诉@些角相等且等于120° 。這是己知為落射熒光設(shè)置的 光學(xué)系統(tǒng)，其中同一光學(xué)系統(tǒng)既用于發(fā)射光也用于接收光。在這種設(shè)置中， 朝向測(cè)量容器發(fā)射的光的軸與從測(cè)量容器接收到的光的軸相一致。
給定了所使用的光學(xué)系統(tǒng)Ci(其中i=a、 b或c)之間的相似性，為方便起 見(jiàn)，在卜lf的描述中下標(biāo)i-a、 b或c僅在使用它們對(duì)于理解來(lái)說(shuō)是必需時(shí) 才指明。在圖中，只有示出設(shè)備原理的圖2的視圖具有所有帶下標(biāo)的標(biāo)記。
每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ci具有源Si和拾取元件CEi，源Si用于向測(cè)量容器CM 發(fā)射用實(shí)線表示的激發(fā)光束，拾取元件CEi用于拾取與沿著軸Xi的激發(fā)光 束相同的軸上的、以虛線部分表示的由熒光發(fā)射的光束。
在實(shí)施例中，以幾乎沒(méi)有空間相干性的明亮的LED作為源Si是有利的， 特別是由于其比較廉價(jià)。
己知明亮的LED構(gòu)造為集成電路，其表面上包括由于存在用于向半導(dǎo) 體結(jié)供電的電觸點(diǎn)而不均勻的區(qū)。因此所產(chǎn)生的光束是不均勻的，并且將 二極管的圖像投影到測(cè)量體積中并不能實(shí)現(xiàn)檢査情況下微觀對(duì)象之間的精 確辨別。
因此，并且尤其是在生物學(xué)分析領(lǐng)域，無(wú)法獲得使用這種普通均勻性 的激發(fā)光束給出正確結(jié)果的血液分析儀。
所以，如圖2中所示，LEDSi最好與各自的光學(xué)元件EOi耦合，該光 學(xué)元件EOi具有使激發(fā)光的場(chǎng)均勻的功能。光學(xué)元件EOi最好是光導(dǎo)管， 例如光纖，或者諸如非成像光束轉(zhuǎn)換器的特定光學(xué)元件。例如，可使用具 有階躍折射率或漸變折射率的具有圓形或矩形截面的光纖。
為了將光源Si與光學(xué)元件EOi耦合，包含二極管的集成電路的發(fā)射區(qū) 可以放置在光導(dǎo)管光學(xué)元件EOi的入口面。這種耦合是廉價(jià)且易實(shí)現(xiàn)的。 由于集成電路的溫度可以達(dá)到高于100。C的值，所以最好使用能夠耐受這種 溫度的材料，例如硅。
或者，可以通過(guò)將諸如由硅或人造紅寶石制成的玻璃微珠透鏡的特定光學(xué)系統(tǒng)插入到光導(dǎo)管EO與集成電路之間來(lái)使用由塑料材料制成的光導(dǎo)
符EO。還應(yīng)該觀察到，例如通過(guò)將集成電路放置在微珠透鏡的焦平面上， 該微珠透鏡可進(jìn)一步提高激發(fā)光場(chǎng)的均勻性。在這種情況下，光導(dǎo)管EO由 平行光束照亮，光源的每個(gè)點(diǎn)都發(fā)射耦合到光纖中的波。
離開(kāi)光導(dǎo)管EO的激發(fā)光束的發(fā)散由其數(shù)值孔徑給定，對(duì)于光纖來(lái)說(shuō)， U:是光導(dǎo)部分及其周?chē)陌矊又g的折射率差的函數(shù)。
例如，光導(dǎo)管EO可以是直徑為940微米Oim)、光學(xué)孔徑為0.22的硅 光纖。在測(cè)量容器CM中的總功率為4.5毫瓦(mW)的情況下，耦合到每個(gè) 光纖的功率為1.5 mW。光纖放置為與饋入2000毫安(mA)的(金龍 型)OSRAM商標(biāo)的LED相接觸。
在該實(shí)例中，提供給集成電路的功率可能會(huì)超過(guò)制造商指定的數(shù)據(jù)， 閃此最好提供用于冷卻該結(jié)的裝置，尤其是在連續(xù)照明模式下使用激發(fā)光 束吋。例如，在本發(fā)明的設(shè)備中可以實(shí)施由低熱阻的散熱器以及與其相鄰 的珀耳帖(Peltier)效應(yīng)元件構(gòu)成的冷卻電路。
對(duì)于等同的光度預(yù)算，當(dāng)光源在脈沖條件下使用并且脈沖由諸如消光 信號(hào)或使用庫(kù)爾特(Coulter)效應(yīng)的已知類(lèi)型的電阻抗變換器的輔助裝置 觸發(fā)吋，口J以避免進(jìn)行冷卻。
隨后沿著測(cè)量容器CM中的流體的流動(dòng)方向，在本發(fā)明的光致發(fā)光測(cè) 量設(shè)備的上游執(zhí)行消光或電測(cè)量，例如測(cè)量電阻或阻抗。在圖2中，該流 動(dòng)方向垂直于圖面。通過(guò)這種方式，當(dāng)發(fā)射光束的模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)由阻抗 咽測(cè)量觸發(fā)時(shí)，激發(fā)光束的觸發(fā)最好延遲所檢測(cè)的微觀對(duì)象從阻抗傳感器 到測(cè)量點(diǎn)M處的光學(xué)測(cè)量點(diǎn)所花費(fèi)的時(shí)間。
該吋間是己知的，因?yàn)樗怯蓛蓚€(gè)測(cè)量點(diǎn)之間的距離除以流體流的速 度v的比值所給出的，速度v由于是受控的所以該速度本身是已知的。流 體的運(yùn)動(dòng)本身由液壓系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)，其中該液壓系統(tǒng)附加于設(shè)置之上，并且包 括步進(jìn)電機(jī)或氣動(dòng)致動(dòng)器(圖中未圖示)。
在每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ci中，準(zhǔn)直器Lli使得來(lái)自光導(dǎo)管EOi的激發(fā)光束平 行。隨后激發(fā)光束最好由濾波器元件Fli濾波，該濾波器元件Fli是由待檢 測(cè)的熒光分量的吸收光譜或光譜所限定的帶通濾波器。
隨后已濾波的光束施加到二色性濾波器DCi，該二色性濾波器DCi是卨通濾波器，其能夠?qū)⒓ぐl(fā)光束朝向測(cè)量容器CM反射并將來(lái)自測(cè)量容器
CM的熒光中發(fā)射的光束沿著落射熒光設(shè)置的軸經(jīng)由濾波器F2i和傳感器元 件CEi透射到光檢測(cè)器PD。隨后光學(xué)系統(tǒng)L2i將光纖EOi的出口面成像到 測(cè)最容器CM中。
圖3示出測(cè)量容器CM中獲得的、以點(diǎn)M為中心的光場(chǎng)在水平方向上 的強(qiáng)度IL的歸一化曲線。可以在點(diǎn)M的寬度上看到良好的空間均勻性，在 該實(shí)例中，該寬度為300 pm。這具體是由于使用了大數(shù)值孔徑的激發(fā)光束
圖4示出了在對(duì)利用橙色噻唑染料或具有相同光譜特性的任何其它染 料進(jìn)行了著色的微觀對(duì)象進(jìn)行測(cè)量的應(yīng)用中，濾波器Fl和F2以及二色性 板DC的光譜特性的實(shí)例，其中特別地將增益G描繪為波長(zhǎng)的函數(shù)。在本 發(fā)明的主要應(yīng)用之一，例如，對(duì)網(wǎng)織細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)(differential counting) 中，所使用的這種染料具有圖5中以實(shí)線表示的吸收特性和以虛線表示的 熒光特性。利用本發(fā)明還可檢測(cè)具有核子或其它生物元素的細(xì)胞。如圖5 屮曲線所不，在以488納米(nm)為中心的窄帶上進(jìn)行激發(fā)，并在以530 nm 為中心、寬度為30nm的帶上測(cè)量熒光。
因此，在圖4中，濾波器Fl位于激發(fā)波長(zhǎng)為470nm、寬度為15nm的 中心，濾波器F2位于熒光發(fā)射波長(zhǎng)為540 nm、寬度為20nm的中心。濾波 器F2具有單個(gè)通道。然而，當(dāng)需要測(cè)量多個(gè)熒光時(shí)，優(yōu)選地使用多通道濾 波器。二色性濾波器DC具有非常陡的上升沿，在大約10 nm內(nèi)從最小傳 輸上升到最大傳輸。這是用于使熒光發(fā)射波長(zhǎng)通過(guò)同時(shí)反射激發(fā)波長(zhǎng)的高 通濾波器。這種濾波器可以從例如OMEGA和SEMROCK的供應(yīng)商處購(gòu)得。
此外，應(yīng)該理解，發(fā)送到測(cè)量容器CM中的光功率越大，熒光現(xiàn)象越 強(qiáng)。因此由光學(xué)單元Ll和L2構(gòu)成的光學(xué)組件的放大倍率Gr是決定該功率 的參數(shù)。
禾U用矩形截面(aXb)的光導(dǎo)管EO，投射到計(jì)數(shù)室中的圖像大小為(a/Gr) X(b/Gr)。將單個(gè)光導(dǎo)管中的光功率記為P，那么光導(dǎo)管EO的出口面處的 功率強(qiáng)度為P/(aXb)。
在該圖像中，對(duì)激發(fā)光束聚焦將產(chǎn)生等于(GifP/(aXb)的功率強(qiáng)度，即， 該功率強(qiáng)度是光導(dǎo)管EO出口面處的(Grf倍。因此，放大倍率Gr最好盡可能地大，并且光學(xué)單元L2最好具有較大 的數(shù)值孔徑。
利用圖2的設(shè)備，基于使用彼此以120。放置的三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，領(lǐng)懂體 積的每個(gè)微觀對(duì)象接收三個(gè)激發(fā)光束，從而得益于其熒光的三次激發(fā)。
考慮單個(gè)激發(fā)束的測(cè)量體積的激發(fā)，假定熒光是各向同性的，則熒光 發(fā)射光束由三個(gè)光學(xué)單元L2a、 L2b和L2c收集。在每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ci中， 發(fā)射光朿隨后透射通過(guò)二色性板DCi，并且隨后通過(guò)濾波器F2i進(jìn)行濾波。 隨后，發(fā)射光束由光學(xué)單元L3i聚焦到拾取元件CEi上。
拾取元件CEa、 CEb和CEc優(yōu)選為光導(dǎo)管，例如光纖，每個(gè)光導(dǎo)管的 -端放置在透鏡L3a、 L3b或L3c中一個(gè)透鏡的焦點(diǎn)處，另一端指向單個(gè)光 檢測(cè)器PD的敏感面，該光檢測(cè)器可以是光電倍增管、簡(jiǎn)單的光電二極管或 者雪崩效應(yīng)光電二極管。
光檢測(cè)器PD同時(shí)接收到來(lái)自三個(gè)拾取元件CEa、 CEb和CEc中每一 個(gè)的發(fā)射光束，并將三個(gè)光纖CEa、 CEb和CEc所拾取的光能相加。
由于本發(fā)明的設(shè)備提供了三個(gè)同時(shí)的激發(fā)光束，所以同樣的推導(dǎo)可以 應(yīng)用于每個(gè)激發(fā)光束。最后，與圖1中所示類(lèi)型的現(xiàn)有技術(shù)設(shè)置相比，靈 敏度的提卨達(dá)到(32)=9。
因此該組件所收集的光的量大于單獨(dú)使用每個(gè)系統(tǒng)所收集的光的量的 總和，并且對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的原理使用兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的情況，這也同樣適 用。
此外，在本發(fā)明的所有設(shè)備中，由于落射熒光設(shè)置呈現(xiàn)非180°的非零 鈍角，所以圖2的設(shè)備中的激發(fā)光束彼此之間有所偏移。這種配置避免了 激發(fā)和發(fā)射光束完全重疊，從而使得現(xiàn)場(chǎng)的背景光最小，其中該背景光構(gòu) 成丫光檢測(cè)器PD處噪聲的主要來(lái)源。
假定考慮使用正方形截面的容器，其中使用四個(gè)光學(xué)系統(tǒng)、每個(gè)光學(xué) 系統(tǒng)在測(cè)量容器一側(cè)互相面對(duì)的情況，將具有四個(gè)相對(duì)的面用于對(duì)待分析 的微觀對(duì)象進(jìn)行照明，并因此激發(fā)熒光。然而，這種配置并不理想，因?yàn)?在激發(fā)和發(fā)射光束之間會(huì)存在100%的重疊，并且直接后果是雜光(parasitic light)的水平大于本發(fā)明的設(shè)備。這種雜光造成了DC分量Ib和變量(j、2 qlt3的隨機(jī)光電噪聲，其中q是電子電荷，B是接收器電路的通帶。應(yīng)該觀察到，Ib越小，測(cè)量設(shè)備識(shí)別的越多。由于激發(fā)光束未重疊或僅 僅部分重疊，所以在本發(fā)明的設(shè)備中Ib將最小化。
優(yōu)選地，圖2的設(shè)備還具有空間濾波器D，例如簡(jiǎn)單針孔，將其放置
在拾取元件CE的前方。這種濾波的作用在于消除某些不想要的信號(hào)，諸如 測(cè)量容器CM壁上的雜散反射。因此這將有助于減小分量Ib，從而提高信噪比。
這種空間濾波的另一個(gè)作用在于降低M中的測(cè)量體積v，該體積由激 發(fā)光朿的交點(diǎn)限定。圖6示出了對(duì)于圓形光導(dǎo)管OE的這種測(cè)量體積v。體 積v對(duì)應(yīng)于按照?qǐng)D2中所示的原理彼此以120°放置的三個(gè)激發(fā)光束的所有交點(diǎn)。
圖7是示出本發(fā)明的第一實(shí)施例的透視圖，其中使用三角形的測(cè)量容 器CM。測(cè)量容器CM的面垂直于彼此成120°角的光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cd和Cc 的軸Xa、 Xb和Xc。
在每個(gè)系統(tǒng)Ci中，二色性板DC在激發(fā)和發(fā)射光束的交點(diǎn)處以45。角 放覽，并且其具有如圖4中所示的光譜傳輸特性。
圖7中所示的實(shí)施例適于檢測(cè)單個(gè)熒光波長(zhǎng)并對(duì)其計(jì)數(shù)，并且其根據(jù) 本發(fā)明的原理使用三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cb和Cc。該設(shè)備可以具體用于檢測(cè) 外周總血量的樣品中的網(wǎng)織細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。在該圖中，微觀對(duì)象在 光學(xué)系統(tǒng)的照明平面中的通過(guò)由穿過(guò)測(cè)量容器CM的、形成一條線的連續(xù) 珠子來(lái)表不。
在該實(shí)施例中，三個(gè)發(fā)射光束由三個(gè)拾取元件CEa、 CEb禾BCEc拾取， 該拾取元件由指向單個(gè)光檢測(cè)器PD的光導(dǎo)管構(gòu)成。每個(gè)發(fā)射光束通過(guò)使用 二色性板PC和干涉濾波器(未圖示)進(jìn)行光譜濾波，其中所述干涉濾波器優(yōu) 選位于二色性板DC與光學(xué)單元L3之間。
在'種變型中，通過(guò)位于拾取元件CEa、 CEb和CEc的三個(gè)出口與光 敏檢測(cè)器PD之間的干涉濾波器來(lái)執(zhí)行光譜濾波。
在測(cè)量容器是矩形的實(shí)施例中，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cb和Cc最好包括 用于對(duì)測(cè)量容器CM的每個(gè)面所構(gòu)成的厚的表面所引入的光學(xué)像差進(jìn)行校 正的裝置。因此，光學(xué)單元L2最好需要校正首先與光束的大的數(shù)值孔徑相 關(guān)聯(lián)、其次與通過(guò)厚的表面相關(guān)聯(lián)的幾何像差，其中該孔徑可大于0.6，該厚的表面具體是測(cè)量容器CM的表面，以及通過(guò)直到到達(dá)測(cè)量點(diǎn)M的流體
的厚度。
已知稱作幾何像差的各種類(lèi)型的像差是造成測(cè)量點(diǎn)M處功率密度降^氐 的原因。在這些情況下，球差是需要校正的主要像差。由于測(cè)量容器CM 的形狀是不變的，所以可以實(shí)施本領(lǐng)域技術(shù)人員已知應(yīng)用中的各種解決方
案來(lái)校止球差。
圖8示出了包括一組具有適當(dāng)曲率和折射率的透鏡的校正的一個(gè)實(shí)例，
it:屮兩個(gè)連續(xù)透鏡之間的間距也是可以變化的尺寸參數(shù)。 .
在圖8屮，該校正是針對(duì)等邊三角形的測(cè)量容器CM進(jìn)行的。其包括 三個(gè)平面的組合，例如，由2.5mm的玻璃壁以及1.5mm的二氧化硅組成。
因此，在圖7中所示的實(shí)例中，光學(xué)單元L1是一個(gè)消色差雙合透鏡， 其能夠使488 nm處的色差最小，光學(xué)單元L2由一組四個(gè)包含接觸雙合透 鏡(touching doublet)的透鏡構(gòu)成，該接觸光合透鏡包括圖8的表面。最后， 光學(xué)單元L3是平凸透鏡。
應(yīng)該觀察到，非球面透鏡也可用于校正類(lèi)似的像差或其它類(lèi)型的像差。
所述的透鏡對(duì)由經(jīng)過(guò)由容器的玻璃壁和水的厚度所構(gòu)成的厚的表面所 引入的幾何像差和色差進(jìn)行校正，其中水在測(cè)量容器CM的壁和通過(guò)點(diǎn)M 的微觀對(duì)象，例如細(xì)胞之間延伸。
隨后激發(fā)光束通過(guò)空氣/玻璃第一界面，緊接著通過(guò)玻璃/水第二界面， 其將光量減小了等于需要考慮的界面處的菲涅耳(Fresnel)透射的因子。
多電介質(zhì)處理可以用于將需要考慮的界面處的光的反射最小化。圖9 小出了作為材料-空氣界面上的入射角的函數(shù)的發(fā)射光束的透射系數(shù)，其作 為波長(zhǎng)488 mn處的折射率為n=1.46的材料的入射角的函數(shù)。
可以看出，全內(nèi)反射現(xiàn)象限制了發(fā)射光束的數(shù)值孔徑。如果測(cè)量容器 的透明壁的折射率記為n，則反射角將幾何角限定為值e，使得sine-l/n。 岡此可以看出，使用圓柱形或球形的測(cè)量容器，如圖2中所圖示的，可以 限制由測(cè)量容器CM的幾何形狀引入的像差。
還應(yīng)該觀察到，可以通過(guò)不僅校正幾何像差，而且校正與激發(fā)光譜帶 寬相關(guān)聯(lián)的色差來(lái)最優(yōu)化由光學(xué)單元Ll和L2構(gòu)成的光學(xué)組件。
此外，由光學(xué)單元L2和L3構(gòu)成的光學(xué)組件可以通過(guò)校正如下的色差來(lái)設(shè)優(yōu)化，其中該色差首先與熒光集中于朝向更長(zhǎng)波長(zhǎng)偏移的波長(zhǎng)的事實(shí) 相關(guān)，其次與該熒光的檢測(cè)發(fā)生在有限寬度的光譜帶上的事實(shí)相關(guān)。
因此，例如通過(guò)將三個(gè)基本波長(zhǎng)0.460 pm(藍(lán)色)、0.500 pm(綠色)禾口 0.600 ^uii(紅色)在軸上和場(chǎng)邊計(jì)算的像差限制為小于士20 pm來(lái)最優(yōu)化激發(fā) fl I發(fā)射光束的光學(xué)特性是有用的。
在圖7的設(shè)備中，熒光發(fā)射光束由三個(gè)拾取元件CEa、 CEb和CEc收 柒，這三個(gè)光學(xué)拾取元件是一起構(gòu)成耦合到光電檢測(cè)器PD的單個(gè)光束的光 3行，其巾該光電檢測(cè)器PD可以是光電倍增管或是雪崩光電二極管。
光檢測(cè)器PD將從三個(gè)光纖拾取的光能相加。隨后基于本領(lǐng)域技術(shù)人員
的知識(shí)對(duì)熒光進(jìn)行計(jì)算，特別是在預(yù)先校準(zhǔn)該設(shè)備之后。從而，得到測(cè)量 休積v中產(chǎn)生的熒光的測(cè)量。
圖IO是適于對(duì)測(cè)量容器CM中的流體中的多個(gè)熒光波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量的本 發(fā)明的設(shè)備的第二實(shí)施例的透視圖。
測(cè)量容器CM中存在的微觀對(duì)象再次由來(lái)自三個(gè)系統(tǒng)Ca、 Cb和Cc的 源Si的三個(gè)激發(fā)光朿來(lái)照亮，該激發(fā)光束通過(guò)可選的光學(xué)光譜濾波器(未圖 小-)和二色性分離器板DC進(jìn)行濾波。在每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ci中，二色性板DCi 將來(lái)自Si的光向測(cè)量容器CM反射，L2i將所述光會(huì)聚到測(cè)量容器CM中。 相反的，—色性板DCi透射來(lái)自被照亮的微觀對(duì)象的更長(zhǎng)波長(zhǎng)以使得其朝 向拾取元件CEa、 CEb和CEc傳播，這些元件優(yōu)選地是諸如光纖的光導(dǎo)管。
這二個(gè)拾取元件CEa、 CEb和CEc依次組合在例如由衍射光柵DG和 n個(gè)光檢測(cè)器PD1至PDn構(gòu)成的公共的光譜儀檢測(cè)器單元上。所述n個(gè)光 檢測(cè)器相對(duì)于光柵DG進(jìn)行空間定位，使得它們中的每個(gè)能夠拾取并測(cè)量 波K:的帶，每個(gè)帶對(duì)應(yīng)于通過(guò)容器CM的生物元素所發(fā)射的熒光的目標(biāo)波 長(zhǎng)中的一個(gè)。這些光檢測(cè)器PD1至PDn可以是選自例如排列成行或帶的光 電二極管、可選的雪崩效應(yīng)光電二極管、例如形成為矩陣或行的光電倍增 管、電荷耦合器件(CCD)型的多個(gè)光學(xué)傳感器的檢測(cè)器。
隨后對(duì)于多個(gè)不同的波長(zhǎng)帶獲得不同的熒光強(qiáng)度。不同波長(zhǎng)處熒光的 存在是由于所檢測(cè)的對(duì)象之間的差異或者由于存在用于發(fā)射的多個(gè)波長(zhǎng)， 所述多個(gè)增大了多個(gè)不同波長(zhǎng)處的熒光。
這種特定光譜檢測(cè)組件的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它能夠適用于不同波長(zhǎng)的熒光，并且該設(shè)備可以容易地用于檢測(cè)具有不同特性的對(duì)象而不用修改該設(shè) 各。此外，每個(gè)光檢測(cè)器的位置對(duì)目標(biāo)波長(zhǎng)和檢測(cè)帶的寬度都有影響。
在--個(gè)變型中，這三個(gè)拾取元件CEa、 CEb和CEc組合在例如由隔離 器板，二色性板所構(gòu)成的單個(gè)檢測(cè)組件上，其中所述二色性板共享多個(gè)光 檢測(cè)器PD1至PDn之間的光束。
在進(jìn)行測(cè)量之前，發(fā)射光束可以利用適用于所使用的熒光的干涉濾波 器進(jìn)行濾波。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，至少一個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，例如圖2中的Ca，包 括所謂的"消光"拾取元件DT，其放置為接近所討論的系統(tǒng)Ca的源，該 實(shí)例屮為Sa。該消光拾取元件DT用于拾取與源Sa的波長(zhǎng)具有相同特性的 光。該光由二色性板DC從容器CM反射到源Sa。消光拾取元件DT耦合 到光檢測(cè)器PDT。
圖11示出了消光拾取元件DTa接近源Sa的一些可能的位置，這是通 過(guò)選擇能夠保證源Sa所產(chǎn)生的光束均勻的光學(xué)元件EOa來(lái)確定的。
這種消光拾取元件DT用于觀察激發(fā)和發(fā)射光束，也稱為重疊光束，的父點(diǎn)。
從幾何上來(lái)說(shuō)，這些交點(diǎn)基于光學(xué)單元L2i的光瞳對(duì)應(yīng)于并指向測(cè)量室 CM的中心的六個(gè)錐體的交點(diǎn)這些重疊光束或體積FC如圖12中所示。 如果透鏡L2的數(shù)值孔徑足夠大時(shí)，存在這些情況。
圖12A是測(cè)量容器CM的水平截面，其上標(biāo)記有三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)Ca、 Cb 和Cc的軸Xa、 Xb和Xc。由系統(tǒng)Ca接收的、分別與光學(xué)系統(tǒng)Cb和Cc 的激發(fā)光束的激發(fā)相對(duì)應(yīng)的重疊光束標(biāo)記為FCK和FCca。該標(biāo)記方法也用 于系統(tǒng)Cb和Cc所接收的其它重疊光束。
圖12B給出了這些相同的重疊光束的三維視圖。
這種重疊光束的存在有利于對(duì)測(cè)量容器中存在的微觀對(duì)象所產(chǎn)生的吸 收和衍射進(jìn)行測(cè)量。消光拾取元件DT用于拾取這些光束的光。
在圖11A中，光學(xué)元件EOa的截面是矩形，并且內(nèi)接在正方形內(nèi)，其 'l'該正方形的頂部部分用于放置多個(gè)用于接收表示吸收的信號(hào)的消光拾取 元件DTa'和用于接收表示衍射的消光拾取元件DTa〃。使用放置在源Sa的 任一側(cè)上的兩個(gè)矩形消光拾取元件DTa'可以拾取來(lái)自重疊光束的光，因?yàn)楣鈻c的幾何形狀使得它們可以位于激發(fā)光束的任一側(cè)上。使用中間的消光
拾取元件DTa〃用于拾取任何衍射光。在該實(shí)例中，應(yīng)該觀察到，其它光學(xué) 元件EOb和EOc的截面優(yōu)選也是是正方形的。
圖IIB和圖llC示出單個(gè)圓形截面的拾取元件DTa相對(duì)于由光學(xué)元件 EOa的截面表示的源Sa的另外兩個(gè)位置。
圖13圖示了在如圖7中所示的光致發(fā)光測(cè)量設(shè)備中進(jìn)行吸收和/或衍射 測(cè);il:的^理。為了說(shuō)明目的，假定測(cè)量容器CM由來(lái)自光學(xué)系統(tǒng)Cb和Cc 的兩個(gè)激發(fā)光朿照亮。
來(lái)自源Sb和Sc的激發(fā)光束的孔徑使得重疊光束FCba和FCCa與系統(tǒng) Ca的發(fā)射光束一起存在。
山系統(tǒng)Ca(未圖示)拾取的熒光波長(zhǎng)的發(fā)射光束通過(guò)板DCa而不發(fā)生偏 轉(zhuǎn)，而從源Sb和Sc接收到的構(gòu)成重疊光束的光由二色性板DCa偏轉(zhuǎn)。在 閣13中，只顯示了與源Sb和Sc具有相同波長(zhǎng)的重疊光束FCK和FCca。 它們來(lái)自測(cè)量容器CM并經(jīng)由二色性板DCa朝向消光拾取元件DTa行進(jìn)。 消光拾取元件DTa最好是圓形截面的光纖。
實(shí)際上，存在兩種與源Sb和Sc具有相同波長(zhǎng)的光束到達(dá)消光拾取元 件DTa:形成重疊光束FCba或FCCa—部分的那些，以及未形成重疊光束
FCba或FCCa—部分的那些。
不屬于任何重疊光束FCa的那些光束只包括已經(jīng)在測(cè)量容器CM中衍
射并表示測(cè)量容器CM內(nèi)的衍射的光線RD。因此光線RD不屬于重疊光束
i''Cbjn FCX所界定的扇形角，除非微觀對(duì)象已經(jīng)對(duì)測(cè)量容器CM中的激發(fā)
光進(jìn)行了衍射。
屬于FCa的那些光束，例如源Sa的FCca包括來(lái)自源Sb、 Sc或者甚至 是Sa(如果其在工作的話)中的一個(gè)的衍射光線，并且包括來(lái)自源Sc的重疊 光束經(jīng)過(guò)測(cè)量容器CM而未偏轉(zhuǎn)或吸收之后的光線。
因此，重疊光束的光線既部分表現(xiàn)出衍射也表現(xiàn)出吸收，因?yàn)橛捎谖?收微觀對(duì)象所引起的消光在由重疊光束所限定的扇形角中是可見(jiàn)的。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一在于有可能看到并利用重疊光束FC以及在重疊光 束FC界定的扇形角中衍射的光線RD。
根據(jù)本發(fā)明特別具有優(yōu)勢(shì)的特征，光纖，優(yōu)選地是圓形截面的光纖，川于實(shí)施為消光拾取元件DTa，當(dāng)只有一個(gè)這樣的元件時(shí)。這種光纖的光 學(xué)特性用于利用進(jìn)入光纖的光線的不同進(jìn)入角，該光線形成重疊光束FCba 或FCCa的一部分或未形成其一部分。如圖13中所示，重疊光束FCh和FCca 的光線以相對(duì)于光纖的軸的一角度進(jìn)入光纖，其中該角度大于重疊光束所 界定的扇形角中的衍射光線RD的角度。該角度特性在整個(gè)光纖上均存在， l到為重疊光束的光線沿著光纖彎曲但是仍保持接近階躍折射率線或折射率 梯度線，而其它以相對(duì)于光纖的軸來(lái)說(shuō)較小的角度進(jìn)入的衍射光線可以分 布在光纖的整個(gè)截面上。
因此，如圖14的光纖截面中所示，通過(guò)將光纖DTa的出口發(fā)射到多元 件光檢測(cè)器PDT上，其中每個(gè)元件與光纖DTa的截面的特定部分有關(guān)，可 以看出光纖DTa的輪廓CNT是連續(xù)明亮的，并且在微觀對(duì)象通過(guò)時(shí)發(fā)生消 光，該消光是由于對(duì)象的吸收造成的。隨后在輪廓CNT上觀察到的光表示 吸收并且部分表示衍射，其中在重疊光束的扇形角中衍射不會(huì)為零。
還可以看出，光纖DTa的中心CTR只有在微觀對(duì)象通過(guò)時(shí)才變得明亮， 發(fā)明由所述對(duì)象衍射的光。假設(shè)衍射是各向同性的，可以通過(guò)將光檢測(cè)器 PDT連接到處理器裝置以減小在光纖的輪廓中觀察到的光的強(qiáng)度，以便獲 得對(duì)于吸收的值。
在使用例如圖IIA的配置的多個(gè)消光拾取元件時(shí)，拾取元件DTa'所傳 輸?shù)墓獾拇嬖诤蛷?qiáng)度決定了與吸收有關(guān)的測(cè)量，并且拾取DTa"所傳輸?shù)墓?的存在和強(qiáng)度決定了與衍射有關(guān)的測(cè)量。
這種對(duì)重疊光束的使用對(duì)于區(qū)分與其吸收和/或衍射特性有關(guān)的生物細(xì) 胞來(lái)說(shuō)非常有利。特別是，這種消光測(cè)量可以用于細(xì)胞學(xué)目的，在細(xì)胞學(xué) 中它們可以被解釋為形態(tài)學(xué)或化學(xué)信息。
為了對(duì)衍射各向同性實(shí)現(xiàn)更好的控制，最好使用化學(xué)試劑使細(xì)胞盡可 能地成球形。
本發(fā)明的設(shè)備的上述實(shí)例使得當(dāng)通過(guò)測(cè)量容器CM的每個(gè)微觀對(duì)象， 例如生物對(duì)象，接收到三個(gè)具有相同波長(zhǎng)的光束并且使用落射熒光設(shè)置來(lái) 測(cè)量熒光發(fā)射的光時(shí)，能夠從敏感性細(xì)胞中測(cè)量到光的發(fā)射，所述三個(gè)落 射熒光組合在用于需要考慮每個(gè)熒光波長(zhǎng)的單個(gè)光檢測(cè)器上。
接下來(lái)描述通過(guò)執(zhí)行本發(fā)明的光致發(fā)光測(cè)量來(lái)區(qū)分生物元素并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，所述生物元素具體而言是利用抗體或其它熒光化合物標(biāo)記 的元素。
如上所述，生物元素的分類(lèi)鑒別和計(jì)數(shù)一般在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行。為 此，血液樣本與待鑒別的生物元素專用的抗體一起培養(yǎng)。這些抗體與標(biāo)記 物(通常是熒光)結(jié)合在一起。通常選擇熒光來(lái)特定地鑒別每個(gè)抗體，因此測(cè) 「ft熒光對(duì)應(yīng)于鑒別其所結(jié)合的抗體。因此，可通過(guò)測(cè)量相應(yīng)數(shù)目的不同波 長(zhǎng)來(lái)鑒別多個(gè)不同抗體。
在圖10中所示的設(shè)備中，可測(cè)量多個(gè)不同波長(zhǎng)。因此可至少測(cè)量與波
長(zhǎng)數(shù)目相同的特定標(biāo)記物或抗體。
這些原理可以用于大量應(yīng)用中。接下來(lái)描述適用于任意流式細(xì)胞儀標(biāo) 記的一般性原理。
如上所述，圖5的光譜對(duì)應(yīng)于噻唑橙色。其還可以應(yīng)用于普遍與抗體 打i ^使川的異硫氰酸熒光素(FITC)染料。
圖15涉及另一種染料，藻紅蛋白花青5串聯(lián)，其也普遍用于流式細(xì)胞 儀中。這兩種染料可以用于在所述設(shè)備中鑒別至少兩張不同的抗體。
為了利用如圖7或圖IO中所示的設(shè)備來(lái)分析生物元素，應(yīng)該執(zhí)行下面
的步驟
將全血的一部分，例如50立方毫米(mm3)，與專用于目標(biāo)生物元素 的組合抗體混合；
將該溶液避光培養(yǎng)充足的時(shí)間，例如20分鐘，該時(shí)間能夠使生物元 素完全標(biāo)記并用于將細(xì)胞間質(zhì)染色；
■將所得到的生物元素的溶液以如下方式注入測(cè)量容器CM:即生物元 素一個(gè)接一個(gè)連續(xù)地通過(guò)容器CM的中心M，以便與照亮所述區(qū)域的光相 互作用。優(yōu)選地，將容器CM設(shè)置為可使用專利FR 2 653 885中所述的阻 抗測(cè)量方法，依次對(duì)通過(guò)其中的所有元素的體積進(jìn)行測(cè)量；以及
對(duì)通過(guò)容器CM的每個(gè)生物元素進(jìn)行連續(xù)測(cè)量，以通過(guò)阻抗測(cè)量確定 其體積，并測(cè)量其熒光。
根據(jù)所使用的設(shè)備和所使用的標(biāo)記物，可以以單個(gè)波長(zhǎng)或多個(gè)波長(zhǎng)來(lái) 執(zhí)行測(cè)量。
已經(jīng)執(zhí)行上述步驟來(lái)使用圖7的設(shè)備區(qū)分了網(wǎng)織細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行了計(jì)數(shù)。網(wǎng)織細(xì)胞是紅血球或紅細(xì)胞的早期狀態(tài)。它們的特征在于由RNA構(gòu)成
的網(wǎng)織組織的胞漿內(nèi)存在。這些痕量物(trace)是所排出的核子在骨髓內(nèi) 從冇核紅細(xì)胞階段到網(wǎng)織細(xì)胞階段的殘余。在這種排出之后大約24小時(shí)， 網(wǎng)織細(xì)胞從骨髓進(jìn)入血液。在外周血液中，它們的存在不超過(guò)48小時(shí)，核 糖體降解，以將網(wǎng)織細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成熟的有核紅細(xì)胞。
紅血球的平均生命周期是120天，因此正常的再生率為0.83%。通常接 受的正常平均百分比在0.5%至1」1.5%的范圍內(nèi)，這些值在小于3周的嬰兒中 較卨(在2%到6%的范圍內(nèi))。因此，對(duì)網(wǎng)織細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)可提供與有 核紅細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的指示，從而構(gòu)成特別用于以下方面的參數(shù)監(jiān)控化療 之后的骨髓恢復(fù)、監(jiān)控重組細(xì)胞紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)(rHuEpo)的治療、貧血 的研究預(yù)算、或者尋找代償性出血或溶血。
"']測(cè)量網(wǎng)織細(xì)胞的熒光時(shí)，具體如專利FR 2 759 166中所述的，使用 》冇噻唑橙色的試劑來(lái)執(zhí)行稀釋全血樣本的步驟。
將熒光和體積測(cè)量的結(jié)果進(jìn)行重構(gòu)并優(yōu)選進(jìn)行排列以提供需要考慮的 牛物元素的絕對(duì)和分類(lèi)計(jì)數(shù)。
然后可以基于細(xì)胞內(nèi)RNA的熒光來(lái)提取紅血球的數(shù)目和網(wǎng)織細(xì)胞的數(shù) 1〗和百分?jǐn)?shù)。
還可以基于與其熒光相關(guān)的元素的分布來(lái)計(jì)算未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù) (1RF)。大多數(shù)熒光元素被認(rèn)為是最年輕的。
圖16繪制出使用本發(fā)明獲得的結(jié)果網(wǎng)織細(xì)胞的群體分布在圖上作為 通過(guò)阻抗測(cè)量所測(cè)量的細(xì)胞體積VC(以]Lm^為單位)的函數(shù)并將其沿橫坐標(biāo) 繪制，以及在縱坐標(biāo)上繪制的以皮瓦(pW)為單位的熒光信號(hào)的強(qiáng)度IF。
在本發(fā)明的原理下，各種變型和實(shí)施對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而 M見(jiàn)的。
盡管上面以具有三個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的特別有利的配置描述了本發(fā)明，但是 幾可以利用各種數(shù)目的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，從數(shù)目二開(kāi)始并且成對(duì)偏移的角 度不為零且不同于180。。尤其是，利用本發(fā)明的這種特性，可以利用如上 所述以及所要求保護(hù)的重疊光束。除了所測(cè)量的熒光特性，這種特性對(duì)區(qū) 分不同的微觀對(duì)象也是非常有用的。
當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)目超過(guò)三時(shí)，發(fā)現(xiàn)至少兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)必須成非鈍角，然而本發(fā)明要求至少一對(duì)光學(xué)系統(tǒng)彼此成鈍角，與其它光學(xué)系統(tǒng)無(wú)關(guān)。為 f觀察重疊光束并因此根據(jù)本發(fā)明執(zhí)行吸收和/或衍射測(cè)量，這種特性尤其必須。
在某些特定應(yīng)用中，還可以設(shè)想改變?cè)碨a、 Sb和Sc的波長(zhǎng)。因此， "J以利用具有兩個(gè)或更多波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光束，或者利用不同波長(zhǎng)的激發(fā) 光朵，來(lái)照亮通過(guò)測(cè)量容器CM的微觀對(duì)象，并單獨(dú)測(cè)量所產(chǎn)生的落射熒光。
還可以設(shè)想將拾取元件CEa、 CEb和CEc分隔幵以使得它們能夠成對(duì) 組合或者每個(gè)單獨(dú)連接到匹配的光檢測(cè)器。此外，還可以在本發(fā)明的設(shè)備 屮使用各種其它的光檢測(cè)裝置。
權(quán)利要求
1、一種用于對(duì)測(cè)量容器(CM)中存在的流體中的光致發(fā)光、吸收和/或衍射進(jìn)行測(cè)量的設(shè)備，所述設(shè)備包括至少兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)(Ci，i＝a，b，c)，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)包括光源(Si)以及拾取元件(CEi)，所述光源(Si)呈現(xiàn)低空間相干性并沿著“系統(tǒng)”軸(Xi)向所述測(cè)量容器(CM)傳輸激發(fā)光束，所述拾取元件(CEi)用于拾取集中在所述系統(tǒng)軸(Xi)上的光致發(fā)光的發(fā)射光束，所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)同時(shí)操作并且定位為使得它們的軸(Xi)圍繞所述測(cè)量容器(CM)彼此之間形成非180°的非零鈍角，所述光致發(fā)光的測(cè)量通過(guò)將從所述拾取元件(CEi)同時(shí)拾取的發(fā)射光束所獲取的數(shù)據(jù)耦合在一起而得出，所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)還以使得在第一光學(xué)系統(tǒng)(Cb)的源(Sb)的激發(fā)光束與第二光學(xué)系統(tǒng)(Ca)的拾取元件(CEa)所拾取的發(fā)射光束之間存在至少一個(gè)部分重疊光束(FCba)的方式定位，并且所述設(shè)備還配備有至少一個(gè)消光拾取元件(DTa)，其位于至少一個(gè)源(Sa)附近并用于拾取所述部分重疊光束(FCba)中的激發(fā)波長(zhǎng)的光，吸收和/或衍射的測(cè)量是從通過(guò)從所述消光拾取元件(DTa)拾取的光中所獲取的數(shù)據(jù)得出。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其特征在于，其具有奇數(shù)個(gè)光學(xué)系統(tǒng) (Ci)，所述奇數(shù)個(gè)光學(xué)系統(tǒng)定位為使得它們的軸(Xi)圍繞所述測(cè)量容器(CM) 彼此之間成對(duì)地形成非180°的非零鈍角。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的設(shè)備，其特征在于，所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)定位 為使得它們的軸(Xi)圍繞所述測(cè)量容器(CM)彼此之間形成相等的角。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的設(shè)備，其特征在于，其具有定位于所述 測(cè)量容器(CM)周?chē)娜齻€(gè)光學(xué)系統(tǒng)(Ci)，它們的軸(Xi)圍繞所述測(cè)量容器 (CM)彼此之間形成相等的角。
5、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述發(fā)射光束拾 取元件(CEi)連接到公共的光檢測(cè)器(PD)或一組公共的光檢測(cè)器(PDl ， PDn)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的設(shè)備，其特征在于，所述光檢測(cè)器(PD)連接 到數(shù)據(jù)處理器裝置，其中所述數(shù)據(jù)處理器裝置適于從所述光檢測(cè)器(PD)接 收的數(shù)據(jù)得出所述光致發(fā)光的測(cè)量。
7、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述消光拾取元 件(DTa)連接到光檢測(cè)器(PDT)，所述光檢測(cè)器(PDT)連接到數(shù)據(jù)處理器裝 賞，所述數(shù)據(jù)處理器裝置適于從所述光檢測(cè)器(PDT)接收的數(shù)據(jù)得出吸收和 /或衍射的測(cè)量。
8、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述發(fā)射光束拾 取元件(CEi)和/或消光光束拾取元件(DT)是具有圓形或矩形截面的光纖。
9、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述光源(Si)包 括耦合到用于使激發(fā)光束均勻的光學(xué)元件(EOi)的具有低空間相干性的 LED。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其特征在于，所述光學(xué)元件(EOi)是光導(dǎo)管。
11 、根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述測(cè)量容器(CM) .在放置所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)的平面上是多面體截面的，所述多面體的面垂直于 所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)的軸。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的設(shè)備，其特征在于，所述測(cè) 量容器(CM)是圓柱形的。
13、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)(Ci) 包括像差校正裝置，所述像差校正裝置用于校正由所述測(cè)量容器(CM)的幾 何形狀在各個(gè)光束中引入的像差。
14、 根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的設(shè)備，其特征在于，所述流體是生物流體。
15、 一種對(duì)測(cè)量容器中存在的流體中的光致發(fā)光、吸收和/或衍射進(jìn)行 測(cè)量的方法，其中所述測(cè)量容器中的所述流體同時(shí)接收來(lái)自兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng) 的至少兩個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光學(xué)系統(tǒng)具有低空間相干性的光源以及拾取元 件，所述光源沿著"系統(tǒng)"軸向所述測(cè)量容器發(fā)送所述激發(fā)光束，所述拾 取元件用于接收集中在所述系統(tǒng)軸上并來(lái)自所述流體的光致發(fā)光的發(fā)射光 束，所述光學(xué)系統(tǒng)定位為使得它們的軸圍繞所述測(cè)量容器彼此之間形成非 180°的非零鈍角，所述光致發(fā)光的測(cè)量通過(guò)將從所述拾取元件同時(shí)拾取的 發(fā)射光束所獲取的數(shù)據(jù)耦合在一起而得出，在所述方法中，所述光學(xué)系統(tǒng) 以使得在來(lái)自第一光學(xué)系統(tǒng)的源的激發(fā)光束與由至少一個(gè)第二光學(xué)系統(tǒng)的 拾取元件拾取的發(fā)射光束之間存在部分重疊光束的方式定位，并且位于至 少一個(gè)源附近的至少一個(gè)消光拾取元件拾取部分重疊光束中的至少一個(gè)激 發(fā)光波長(zhǎng)，并且吸收和/或衍射的測(cè)量從通過(guò)從所述消光拾取元件拾取的光'l:'所獲取的數(shù)據(jù)得出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)量測(cè)量容器(CM)中存在的流體中的光致發(fā)光的設(shè)備和方法。根據(jù)本發(fā)明，測(cè)量容器(CM)中的流體同時(shí)接收來(lái)自兩個(gè)光學(xué)系統(tǒng)(Ci)的至少兩個(gè)激發(fā)光束。所述光學(xué)系統(tǒng)(Ci)定位為使得它們的軸(Xi)圍繞測(cè)量容器(CM)彼此之間形成非180°的非零鈍角。根據(jù)本發(fā)明，光致發(fā)光的測(cè)量通過(guò)將從拾取元件(CEi)同時(shí)拾取的發(fā)射光束所獲取的數(shù)據(jù)耦合在一起而得出。光學(xué)系統(tǒng)(Ci)還定位為使得在來(lái)自第一光學(xué)系統(tǒng)(Cb)的源(Sb)的激發(fā)光束與第二光學(xué)系統(tǒng)(Ca)的拾取元件(CEa)所拾取的發(fā)射光束之間存在至少一個(gè)部分重疊光束(FCb_a)。該設(shè)備還配備有至少一個(gè)消光拾取元件(DTa)，其位于至少一個(gè)源(Sa)的附近并用于拾取部分重疊光束(FCb_a)中的激發(fā)波長(zhǎng)的光，吸收和/或衍射的測(cè)量由消光拾取元件(DTa)拾取的所述光中所獲取的數(shù)據(jù)得出。
文檔編號(hào)G01N15/14GK101421605SQ200780012813
公開(kāi)日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月6日
發(fā)明者B·梅謝, D·勒菲弗, J-P·吉內(nèi)斯, P·尼林 申請(qǐng)人:赫拉巴Abx公司