專利名稱：：用于減少細(xì)胞脂肪和預(yù)測(cè)用酪氨酸激酶抑制劑治療后的心臟毒性的組合物和方法用于減少細(xì)胞脂肪和預(yù)測(cè)用酪氨酸激酶抑制劑治療后的心臟毒性的組合物和方法背景心臟具有強(qiáng)大的ATP生成能力，使其在生物的一生中行使高效泵的功能。成年人的心肌利用脂肪酸(FA)和/或葡萄糖氧化作為其主要能量來(lái)源。正常情況下，成年人的心臟通過(guò)線粒體中脂肪酸的氧化獲得其絕大多數(shù)的能量。心肌細(xì)胞具有在碳水化合物糖酵解和Krebs循環(huán)(三羧酸循環(huán))之間轉(zhuǎn)換并轉(zhuǎn)換至脂肪養(yǎng)料源的能力，從而在不同的生理學(xué)和飲食條件下維持ATP以恒定速率生成。該代謝和養(yǎng)料選擇的靈活性對(duì)于正常的心功能至關(guān)重要。盡管心臟能量轉(zhuǎn)化容量和代謝通量在多個(gè)層面上受到調(diào)節(jié)，一個(gè)重要的調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生在基因表達(dá)的層面上。參與多重能量轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因的表達(dá)響應(yīng)于發(fā)育、生理學(xué)和病理生理學(xué)的信號(hào)而受到動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。參與這些關(guān)鍵能量代謝途徑的基因由核受體超家族成員特別是脂肪酸活化的過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR)和核受體輔激活因子-PPARY輔激活因子-1oc(PGC-1ot)以及雌激素受體相關(guān)蛋白ERRa，、ERRfi和ERRy和它們的激活因子PGR-1和PERC在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)生理學(xué)和病理生理學(xué)狀態(tài)心臟PPAR/PGC-1復(fù)合物的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)將在下面進(jìn)行更為詳盡的說(shuō)明。PGC-la為PPARY輔激活因子，與在棕色脂肪中適應(yīng)性生熱有關(guān)。兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白PGC-lfi和PARC已經(jīng)得到克隆并且表現(xiàn)出參與調(diào)節(jié)能量代謝途徑。PGC-1a的組織特異性且誘導(dǎo)型表達(dá)提示其參與細(xì)胞能量生成代謝過(guò)程(包括線粒體的生物發(fā)生和氧化、肝糖原異生以及骨骼肌葡萄糖攝取)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。PGC-loc在強(qiáng)氧化作用的組織(例如心臟、骨骼肌、棕色脂肪和肝臟)中選擇性地表達(dá)。心臟中PGC-la的表達(dá)在出生時(shí)急劇增加。這與從葡萄糖代謝到脂肪氧化的圍產(chǎn)期轉(zhuǎn)換相吻合。還已經(jīng)知道PGC-loc的活性和表達(dá)水平受冷暴露、禁食以及鍛煉(已知促進(jìn)氧化代謝的刺激)的誘導(dǎo)。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中pgc-1的被迫表達(dá)誘導(dǎo)參與多重線粒體能量轉(zhuǎn)換/能量產(chǎn)生途徑的核與線粒體基因的表達(dá)，增加細(xì)胞線粒體數(shù)量并且刺激偶聯(lián)的呼吸作用。與這些刺激相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(包括p38MAP激酶、IJ-腎上腺素能/cAMP、一氧化氮、AMP激酶和Ca2-鉤調(diào)蛋白激酶)通過(guò)增加PGC-1ot表達(dá)或通過(guò)其反式激活功能激活PGC-1oc和其下游耙基因。這些代謝和結(jié)構(gòu)的改變可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病和心臟的舒張功能障礙。有趣的是，線粒體增殖是可逆的并且心肌病可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的減少得到補(bǔ)救。這表明除了通過(guò)PPAR作用為細(xì)胞脂肪酸代謝的激活因子，PGC-loc與線粒體生物發(fā)生相關(guān)。因此，PGC-loc表現(xiàn)出作用為氧化能量代謝的主要調(diào)節(jié)因子并響應(yīng)細(xì)胞能量狀況的變化。新出現(xiàn)證據(jù)表明孤兒核受體的雌激素相關(guān)受體(ERR)家族作用為心臟和骨骼肌能量代謝的PGC-1-活化調(diào)節(jié)因子。ERR家族有三個(gè)成員ERRot、ERRB、和ERRy。在主要依賴于線粒體氧化代謝以生成ATP的成年組織(例如心臟和慢收縮骨骼肌)中ERRot和ERRy的表達(dá)升高。出生后在心臟中ERRoc的表達(dá)急劇增加，伴隨參與細(xì)胞脂肪酸攝入和線粒體氧化的酶的全面上調(diào)。近來(lái)已將ERRot和ERRy確定為輔激活因子PGC-1家族的新配偶體。這種在ERR同種型和PGC-1oc之間功能上的關(guān)聯(lián)激發(fā)了對(duì)ERR在能量代謝中作用的興趣。ERRot基因的缺失揭示了ERRoc在脂質(zhì)代謝的組成型調(diào)節(jié)中的組織特異性作用。在ERRcc丄小鼠中白色脂肪質(zhì)量的減少與脂肪細(xì)胞大小和脂質(zhì)合成速率的減少一致。相反地，ERRot很可能在心臟中的脂質(zhì)分解代謝中起作用，與其和PGC-loc的功能相互作用相一致。不表現(xiàn)出明顯的心臟表型的error八小鼠顯示出心臟pgc-1oc和erry表達(dá)的代償性增加。這些結(jié)果表明ERR同種型促成心臟中脂肪酸代謝基因的組成型表達(dá)。然而基因表達(dá)改變引起的代謝上的影響尚未為人所知。正使用過(guò)量表達(dá)errot的心肌細(xì)胞中的基因表達(dá)分析鑒定心臟ERRoc耙基因。ERRa激活了參與能量生成途徑包括細(xì)胞脂肪酸攝取(LPL、CD36/FAT、H-FABP、FACS-1)、B-氧化(MCAD、VLCAD、LCHAD)以及線粒體電子傳遞/氧化磷酸化(細(xì)胞色素c、c0xiv、COXVIII、NADH泛醌脫氬酶、黃素蛋白-泛醌氧化還原酶、ATP合酶IJ)的基因。ERRoc也增加心肌細(xì)胞中棕櫚酸的氧化速率。ERRoc對(duì)fi-氧化酶基因的活化涉及PPARoc信號(hào)傳導(dǎo)途徑。ERRa直接激活PPARa基因表達(dá)，并且在來(lái)自于PPARa_/—小鼠的細(xì)胞中ERRa介導(dǎo)的對(duì)MCAD和M-CPTI的調(diào)節(jié)被消除。目前還已知道ERRoc參與PGC-lct調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生。已知其通過(guò)調(diào)節(jié)&/^2基因(編碼NRF-2復(fù)合物的一個(gè)亞基并且直接在轉(zhuǎn)錄水平上激活參與線粒體氧化代謝的基因)介導(dǎo)PGC-la活化NRF途徑。ERRa和其輔激活因子PGC-la激活MCAD、細(xì)胞色素c和ATP合酶B基因啟動(dòng)子。綜合起來(lái)這些結(jié)果將ERRoc確定為通過(guò)參與PGC-1調(diào)節(jié)路徑對(duì)心臟氧化能量代謝的調(diào)節(jié)因子。然而，在心臟中ERR的精確生物學(xué)作用尚未確定。核受體ERRy(雌激素相關(guān)受體y)在心臟、骨骼肌、腎臟和腦以及發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中輔激活因子PGC-1a和PGC-1P的表達(dá)有力地增強(qiáng)了由ERRy引起的轉(zhuǎn)錄激活。孤兒受體的組成型活化功能2(AF-2)對(duì)于協(xié)同增強(qiáng)至關(guān)重要。功能性受體截短分析已經(jīng)用于鑒定額外的氨基末端活化功能，這對(duì)于ERRy2同種型和pgc-1ot是特異性的。體外實(shí)驗(yàn)表明erry與這兩種輔激活因子均有直接相互作用。這些發(fā)現(xiàn)與PGC-la和PGC-ie作為對(duì)ERRy的組織特異性輔激活因子的不同調(diào)節(jié)功能的假設(shè)相吻合。不過(guò)需要更多的研究進(jìn)一步定義這些功能。在轉(zhuǎn)基因小鼠中pgc-1的心臟特異性過(guò)表達(dá)導(dǎo)致心肌細(xì)胞中線粒體失控增殖，致使肌節(jié)結(jié)構(gòu)喪失和擴(kuò)張性心肌病。因此，PGC-l是在對(duì)能量需求的響應(yīng)中控制心臟線粒體數(shù)量和功能的重要調(diào)節(jié)分子。即使不是所有的，大多數(shù)這些調(diào)節(jié)途徑涉及信號(hào)傳導(dǎo)途徑7中中間體的磷酸化。對(duì)磷酸化的抑制，例如通過(guò)多種不同的激酶抑制劑的作用，影響這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致脂肪酸代謝的改變，其可引起器官毒性，包括心臟毒性。許多新的抗癌藥物為激酶抑制劑并且伴有毒性。因此，需要方法以鑒定藥物是否伴有毒性作用，以及該毒性作用是否可能在患者體內(nèi)發(fā)生。還需要方法在維持其對(duì)抗磷酸化的受體靼的效力同時(shí)避免這些抑制劑的毒性作用。概述公開(kāi)了診斷毒性特別是心臟毒性是否可能在選擇用多種藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑或者erbB抑制劑)進(jìn)行治療的患者中發(fā)生的方法。此外還公開(kāi)了評(píng)估一種候選藥物是否可能具有毒性或者心臟毒性作用的方法。在一種方法中，可分析脂質(zhì)例如甘油三酯和膽固醇以確定是否存在脂肪酸氧化紊亂。在另一種方法中，可測(cè)定負(fù)責(zé)所觀察到的脂肪酸氧化的酶(例如MCAD)。關(guān)于脂質(zhì)水平，認(rèn)為在正常細(xì)胞中AMP活化的蛋白激酶的活化可導(dǎo)致脂質(zhì)水平的特征性減少，以及糖酵解的和較短碳鏈中間產(chǎn)物(例如C2至C6碳中間產(chǎn)物)的相應(yīng)增加。對(duì)于本公開(kāi)內(nèi)容的目的而言，可將與正常細(xì)胞中的特征性脂質(zhì)減少的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著偏差視為脂肪酸氧化紊亂。類似地，對(duì)于本公開(kāi)內(nèi)容的目的而言，對(duì)于參與這些代謝途徑的酶，這些酶的活性或水平的量相對(duì)于正常細(xì)胞的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著改變(通過(guò)Western、Northern、PCR或者其它技術(shù)測(cè)量)可視為脂肪酸氧化紊亂。脂肪酸氧化紊亂的診斷可用于預(yù)測(cè)增加的毒性風(fēng)險(xiǎn)并且可能作為藥物使用的禁忌指示?；蛘?，如果一種藥物用在患有脂肪酸氧化紊亂的患者身上，可使用所述方法指示密切關(guān)注患者心臟功能的必要性。或者可以通過(guò)諸如正電子發(fā)射體層攝影術(shù)的已知方法測(cè)量葡萄糖攝取。對(duì)于施用酪氨酸激酶抑制劑藥物時(shí)葡萄糖攝取不減少或不減少至與正常非癌細(xì)胞相同程度的情況下，則該藥物治療可能對(duì)于非癌細(xì)胞有毒。或者，在暴露于酪氨酸激酶抑制劑時(shí)，如果ATP水平的減少超過(guò)在正常非癌細(xì)胞中，則預(yù)示該酪氨酸激酶抑制劑有毒。另一種用于預(yù)測(cè)選擇用藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑，特別是erbB抑制劑)治療的患者是否具有心臟毒性的方法是評(píng)估患者體內(nèi)TNFct的水平(無(wú)論在腫瘤或血液或在二者中)。TNFoc的水平可以用于預(yù)測(cè)患者是否可能由于藥物(特別是赫賽汀)治療導(dǎo)致具有與心臟毒性相關(guān)的不良事件。此外還公開(kāi)了施用激活A(yù)MP活化的蛋白激酶(AMPK)的藥物(例如某些酪氨酸激酶抑制劑)以為了美容原因或體重減輕而減少患者的脂質(zhì)和脂肪的方法。該方法基于驚人的發(fā)現(xiàn)-AMP活化的蛋白激酶的激活因子導(dǎo)致細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)換，從而將脂質(zhì)氧化為較少碳的中間產(chǎn)物。該代謝轉(zhuǎn)換導(dǎo)致受處理細(xì)胞脂質(zhì)含量的驚人減少。以足以激活A(yù)MP活化的蛋白激酶的量施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子可用于使細(xì)胞去掉一部分其脂質(zhì)含量。已知有許多向細(xì)胞施用此類化合物的方法并可以使用。可使用局部或者全身施用?？赏ㄟ^(guò)注射、通過(guò)皮膚貼劑或軟骨或洗液進(jìn)行局部施用。此外還公開(kāi)一種方法用于將AMP活化的蛋白激酶的激活因子施用于患者，或者將其包含在一種介質(zhì)中與器官溫育，使用的量足以^f呆護(hù)器官例如心肌和/或腦細(xì)胞免于急性窘迫(acutedistress)，所述急性窘迫通常會(huì)由創(chuàng)傷諸如缺血、細(xì)胞因子釋放、葡萄糖剝奪和在診斷出這類情況的細(xì)胞和器官中導(dǎo)致代謝壓力的類似事件引起。還可以使用雙激酶抑制劑，特別是導(dǎo)致AMP活化的蛋白激酶活性增加的酪氨酸激酶抑制劑。優(yōu)選地如詳述中進(jìn)一步所說(shuō)明的，這類激酶抑制劑對(duì)于其靶將是特異性的。已知并且可使用許多施用方法。例如該藥物可包含在溶液中以對(duì)器官進(jìn)行灌注或可進(jìn)行全身施用。此外還公開(kāi)一種方法用于保存器官用來(lái)移植。該方法涉及制備含有AMPK激活因子的保存溶液并且使器官與該保存溶液接觸。該保存溶液可以是任何添加足夠量AMPK激活因子以提供對(duì)器官的改進(jìn)保護(hù)的已知保存溶液。在此描述了另外的特點(diǎn)和長(zhǎng)處，并將由以下詳述和附圖清楚地說(shuō)明。附圖簡(jiǎn)述圖1為在Au565細(xì)胞中受赫賽汀處理調(diào)節(jié)的基因列表。圖2為用NDF或赫賽汀處理并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的Au-565細(xì)胞的照片。圖3為用GW-2974處理并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的Au-565細(xì)胞的照片。圖4為在不同條件下生長(zhǎng)并且進(jìn)行脂質(zhì)染色的原代人心肌細(xì)胞的照片。圖5為顯示在不同條件下檢測(cè)脂質(zhì)呈陽(yáng)性人心肌細(xì)胞的百分比的條形圖。圖6為MDA-MB-468細(xì)胞用GW-2974處理并通過(guò)Fl雨o-4檢測(cè)胞內(nèi)Ca的照片。圖7A為顯示某些酪氨酸激酶抑制劑對(duì)于p-eEF2和p-AMPKa表達(dá)的影響的Western印跡照片。圖7B為顯示不同化合物存在下Au565細(xì)胞中的p-eEF2表達(dá)的染色細(xì)胞照片。圖8為經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)不同激酶抑制劑處理的心肌細(xì)胞中ERRa和MCAD的照片。圖9為顯示用不同類型erbB抑制劑和TNFa組合處理的HMC的生長(zhǎng)抑制的條形圖。圖10為用TNFa、GW2974或者赫賽汀(或者組合)處理后探觀'JNF-kB的HMC的Western印跡。詳述—方面，本公開(kāi)是基于發(fā)現(xiàn)藥物(例如酪氨酸激酶抑制劑，如赫賽汀和拉帕替尼(lapatinib，Tykerb))影響與脂質(zhì)代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)并且強(qiáng)烈影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的量。用本發(fā)明的激酶抑制行處理，通過(guò)增加或減少所述細(xì)胞氧化脂肪酸的能力而影響脂肪酸代謝。當(dāng)培養(yǎng)生長(zhǎng)的正常脂肪細(xì)胞暴露于例如GW2974、GW572016的激酶抑制劑時(shí)，所述細(xì)胞中儲(chǔ)存的脂質(zhì)迅速消失。該觀察結(jié)果也在心臟細(xì)胞中觀察到?？墒褂糜图tO脂質(zhì)染色進(jìn)行該類研究。因此，用拉帕替尼(tykerb)和其它Herl/Her2酪氨酸激酶抑制劑處理致使該類細(xì)胞丟失脂肪，這與降低的脂質(zhì)合成速率和/或增加的脂質(zhì)氧化速率相吻合。用其它藥物(例如赫賽汀)，NDF脂質(zhì)含量表現(xiàn)出增加。還已經(jīng)知道許多激酶抑制劑可用作化療劑。在一些患者中這些藥物產(chǎn)生心臟毒性。本公開(kāi)基于可以將脂肪酸代謝的缺陷與心臟毒性相聯(lián)系的驚人發(fā)現(xiàn)。因此，在脂肪酸代謝方面具有特定功能障礙或者血液中TNFoc水平高、并且經(jīng)受激酶抑制劑治療的患者，用例如erbB酪氨酸激酶抑制劑的激酶抑制劑治療后，更有可能遭受心臟功能失常例如心肌病。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織或血清中具有高水平的TNFot或其下游存活因子NF-kB的患者通常對(duì)赫賽汀有更好的反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)引出了新方法的開(kāi)發(fā)，用于預(yù)測(cè)患者在用影響某些細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的藥物(包括激酶抑制劑，單獨(dú)或與其它活性劑聯(lián)合使用)治療時(shí)是否將遭受心臟毒性。公開(kāi)一種方法用于分析患者的脂質(zhì)包括甘油三酯及膽固醇和/或脂質(zhì)代謝酶例如尤其是MCAD。這類分析的結(jié)果可用于預(yù)測(cè)何時(shí)可能由激酶抑制劑治療引起心臟毒性并且提供對(duì)經(jīng)受藥物(例如激酶抑制劑，包括赫賽汀、GW572016或者其它erbB抑制劑)治療的患者應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)其心臟功能的早期指示。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5-'AMP-活化的蛋白激酶(已顯示它在其它組織中使乙酰輔酶A羧化酶磷酸化并且失活)的活性在缺血末期顯著增加，并且在再灌注的過(guò)程中保持升高。在缺血過(guò)程中5，-AMP的累積導(dǎo)致AMP活化的蛋白激酶的活化，在再灌注過(guò)程中AMP活化的蛋白激酶使乙酰輔酶A羧化酶磷酸化并且失活。隨后的丙二酰輔酶A水平的降低可導(dǎo)致在缺血心臟的再灌注過(guò)程中脂肪酸氧化速率的增加。對(duì)于心臟毒性，已知有多種脂肪酸氧化紊亂并且在下面表1中列出。如果在患者中檢測(cè)出這樣一種紊亂，可以提供激酶抑制劑可對(duì)心臟有毒的指示。表I酰基輔酶A脫氫酶缺陷酰基輔酶A脫氫酶，短鏈(SCAD)酰基輔酶A脫氫酶，中鏈(MCAD)?；o酶A脫氬酶，長(zhǎng)鏈(LCAD)?；o酶A脫氫酶，極長(zhǎng)鏈(VLCAD)2—烯酰輔酶A水合酶缺陷L-3-羥酰輔酶A脫氫酶缺陷L-3-羥酰輔酶A脫氫酶，短鏈(SCHAD)三官能蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈FA(LCHAD)ot亞基(HADHA)P亞基(HADHB)3-酮脂酰輔酶A硫解酶缺陷3-酮脂酰輔酶A硫解酶，中鏈(MCKAT)三官能蛋白質(zhì)oc-曱基?；o酶A消旋酶(AMACR)缺陷肉堿-酰基肉堿移位酶缺陷3p212，4-二烯酰輔酶A還原酶缺陷8q21電子傳遞黃素蛋白(ETF)缺陷15q23魚(yú)鱗癬狀紅皮病(NCIE2):CGI58基因；3p21三官能蛋白質(zhì)缺陷亞基A和B酪氨酸血癥1°肉堿代謝紊亂脂肪酸和肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)途徑脂肪酸氧化途徑脂質(zhì)紊亂線粒體生化異常過(guò)氧化物酶體紊亂這類紊亂可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測(cè)。例如，在某些紊亂中可將脂肪酸飼喂給個(gè)體并且追蹤其代謝?；蛘?，例如，可以測(cè)定酶水平，如通過(guò)Western印跡，或者對(duì)某些基因產(chǎn)物可以分析mRNA水平。任何可檢測(cè)到的減少表明存在脂肪酸氧化紊亂，并且用酪氨酸激酶抑制劑治療可能對(duì)正常細(xì)胞和器官有毒。在一種方法中，可對(duì)作為用激酶抑制劑治療候選人的患者進(jìn)行這些疾病的篩選以確定他們是否有可能遭受心肌細(xì)胞毒性。例如可對(duì)培養(yǎng)生長(zhǎng)的心肌細(xì)胞中的生物大分子進(jìn)行測(cè)定以確定施用候選藥物如何影響這些大分子的水平。在一種方法中，可將人心肌細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)并且可在候選藥物存在的情況下對(duì)磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這可以通過(guò)檢測(cè)磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的Western印跡法進(jìn)行測(cè)定。并非對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，相信在應(yīng)激條件(例如缺氧、缺血、葡萄糖剝奪和饑餓)下，細(xì)胞內(nèi)AMP:ATP比例的增加變構(gòu)激活A(yù)MP活化的蛋白激酶(AMPK)，這是一種意圖保持細(xì)胞能量平衡的反應(yīng)。最初發(fā)現(xiàn)AMP活化的蛋白激酶抑制乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶，HMGR)的制備物。AMPK的活化被認(rèn)為起始了一系列下游磷酸化事件，使細(xì)胞從活躍的ATP消耗(例如脂肪酸、膽固醇和蛋白質(zhì)的生物合成)轉(zhuǎn)換為ATP生成(例如脂肪酸和葡萄糖氧化)。應(yīng)激誘導(dǎo)的AMPK活化被認(rèn)為是在一個(gè)或多個(gè)上游AMPK激酶(AMPKK)對(duì)其a亞基上172位的蘇氨酸的磷酸化之后發(fā)生，所述上游AMPK激酶包括鉀調(diào)蛋白依賴性激酶激酶P(CAMKKP)(—種鈣激活的蛋白激酶)和LKB1(由Peutz-Jegher綜合征肺瘤抑制基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸激酶)。相信在骨骼肌和心臟中AMPK的活化導(dǎo)致對(duì)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)的磷酸化和抑制，認(rèn)為這13進(jìn)而又減少了丙二酰輔酶A(其自身為肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶l(CPTl)的抑制劑)的水平。認(rèn)為CPT1的去抑制導(dǎo)致了伴隨的脂肪酸p-氧化的增加，這被認(rèn)為引起了線粒體生成ATP增加。應(yīng)激誘導(dǎo)的AMPK活化還被認(rèn)為通過(guò)抑制mTOR并且直接調(diào)節(jié)eEF2(已知與心臟保護(hù)相關(guān)的翻譯延伸因子)來(lái)抑制蛋白質(zhì)合成。重要的是，線粒體功能的改變被認(rèn)為可引起由伊馬替尼(imatinib)所致的心肌細(xì)胞死亡。另外，通過(guò)AMPK介導(dǎo)的TSC2磷酸化對(duì)帽依賴性翻譯的抑制被認(rèn)為在響應(yīng)ATP耗盡的細(xì)胞存活中極其重要。AMPK活化后增加的ATP生物合成而非消耗，可能還保護(hù)心肌細(xì)胞免于缺血性損傷。已發(fā)現(xiàn)可激活A(yù)MPK及其下游底物的分子例如GW2974(—種強(qiáng)有效的小分子HER2/EGFR酪氨酸激酶抑制劑，具有類似于拉帕替尼的活性鐠)，刺激脂肪酸氧化，這進(jìn)而又增加在表達(dá)HER2的人心肌細(xì)胞中ATP的生成，形成對(duì)由TNFa(—種在心衰中檢測(cè)到的已知細(xì)胞因子)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)。相反地，不活化AMPK的分子例如曲妥珠單抗(trastuzumab)導(dǎo)致響應(yīng)TNFa的增加的心肌細(xì)胞死亡。對(duì)于AMPK和隨之的能量生成的特異性HER2-靶向療法的效果可以預(yù)測(cè)心肌病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，并且提供一種新的HER2-引導(dǎo)的治療策略，以保護(hù)心肌在急性缺血損傷之后免于TNFa或其它促細(xì)胞凋亡刺激物的殺傷效應(yīng)。另外，酪氨酸激酶抑制劑可用于減少細(xì)胞中的脂肪，特別是其它方面正?；驘o(wú)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性介導(dǎo)的疾病的細(xì)胞。對(duì)于這個(gè)目標(biāo)，哺乳動(dòng)物或組織的至少一部分可用激酶抑制劑處理，從而減少細(xì)胞中脂類的量?？墒褂萌魏魏线m的激酶抑制劑。確定合適的抑制劑的方法是為人所熟知的。例如，脂肪細(xì)胞的樣品可在存在和缺乏激酶抑制劑的條件下生長(zhǎng)，并且以已知方法用油紅0染色以確定該激酶抑制劑是否導(dǎo)致儲(chǔ)存脂肪的減少。導(dǎo)致可觀察到的脂肪儲(chǔ)存減少的激酶抑制劑適合于本發(fā)明。適合于本發(fā)明的例示性激酶抑制劑包括erbB抑制劑，特別包括GW2974、GW572016等。下面的表II顯示了用GW2974處理所獲得的脂類含量的減少。Au565在本領(lǐng)域已知的正常條件下生長(zhǎng)，并用GW2974(25nM)處理兩天。收集細(xì)胞、清洗并在水中超聲波處理(200jiL水中2，000，000個(gè)細(xì)胞)。將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)離心下來(lái)并且通過(guò)對(duì)胞內(nèi)代謝物的MS/MS檢測(cè)?；鈮A(線粒體脂肪酸氧化的副產(chǎn)物)。表II?；鈮A(pmol蛋白)C18:lC16C2對(duì)照(細(xì)胞沉淀)8.564.09148.54GW2974(細(xì)胞沉淀)4.10.83258.88在一種方法中，細(xì)胞可用合適的激酶抑制劑處理以減少脂肪儲(chǔ)量。該方法可包括以下步驟用足量合適的酪氨酸激酶抑制劑接觸細(xì)胞以使細(xì)胞除去其自身中一定量并且優(yōu)選大部分或更優(yōu)選幾乎所有其過(guò)剩儲(chǔ)存脂類。所述細(xì)胞可處于體外細(xì)胞培養(yǎng)中或位于個(gè)體中。當(dāng)用于無(wú)疾病或無(wú)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性相關(guān)疾病的細(xì)胞時(shí)，本方法特別有效。還公開(kāi)將激酶抑制劑(例如酪氨酸激酶抑制劑或者雙重酪氨酸激酶抑制劑)施用于患者的方法，例如在心臟再灌注期間或心臟病發(fā)作期間，以抵消脂肪酸氧化效應(yīng)并且保護(hù)心肌和/或腦細(xì)胞。該處理可用于保護(hù)心臟細(xì)胞、腦細(xì)胞和來(lái)源于其它組織和器官的細(xì)胞，免于由缺血、細(xì)胞因子釋放、葡萄糖剝奪或其它在代謝上脅迫這類細(xì)胞的病癥所造成的急性窘迫。優(yōu)選所述激酶抑制劑是特異性的，在于它們導(dǎo)致代謝活性轉(zhuǎn)換并且不影響無(wú)關(guān)的靶。各種不同的激酶抑制劑的特異性可通過(guò)Fa6/a/等，Asmallmolecule-kinaseinteractionmapforclinicalkinaseinhibitors,NatureBiotechnology23，p.329(通過(guò)參考文獻(xiàn)引用并入)描述的方法進(jìn)行測(cè)定。相信代謝活性的轉(zhuǎn)換是通過(guò)AMP活化的蛋白激酶活性的增加帶來(lái)的?？蓪⒒钚詣┙?jīng)口施用、通過(guò)注射或通過(guò)皮膚貼劑、軟骨或洗劑局部施用給個(gè)體，或者可不經(jīng)腸道施用，只要其以足夠的量到達(dá)目標(biāo)靶細(xì)胞以發(fā)揮其減少脂類的效用。例如優(yōu)選在儲(chǔ)存脂質(zhì)的組織例如脂肪組織局部施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子以使脂質(zhì)含量減少。可將其全身施用給需要治療代謝性應(yīng)激、心臟病發(fā)作、缺血等的患者o可將AMP活化的蛋白激酶的激活因子以鹽類或溶劑化物或者游離化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行施用，然而，優(yōu)選以藥物制劑形式施用該抑制劑。制劑除活性劑外可包含一種或多種藥用栽體、稀釋劑或賦形劑。藥物制劑可以單位劑量形式呈現(xiàn)，包含預(yù)先確定量的活性成分/每單位劑量。如此一個(gè)單位可根據(jù)施用途徑和患者的年齡、體重和狀態(tài)包含例如0.5mg至1g,優(yōu)選70mg至700mg，更優(yōu)選5mg至100mg的活性劑。例如在小鼠中，饑餓期間可施用100mg/kg的GW2974以保護(hù)心臟。藥物制劑可適合以任何適宜途徑施用，例如經(jīng)口(包括口含或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口含、舌下或透皮)、陰道或非腸道(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。這樣的制劑可通過(guò)制藥領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如通過(guò)將活性成分與載體或賦形劑相結(jié)合。適用于口服的藥物制劑可以采取的形式為膠囊或片劑；粉劑或顆粒；在水性或非水性液體中的溶液或懸液；可食用的泡沫或攪拌糊(whip);或水包油液體乳劑或者油包水液體乳劑以及在脂質(zhì)體中。用于透皮施用的藥物制劑可呈現(xiàn)為不連續(xù)貼劑，旨在與受治者的皮膚保持長(zhǎng)時(shí)間的緊密接觸?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法以離子滲入療法從貼劑中遞送活性成分。用于局部施用的藥物制劑可配制為軟骨、乳霜、懸液劑、洗劑、粉劑、溶液劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑或油劑。對(duì)于外部組織的治療，制劑可以局部用的軟骨或乳霜形式16應(yīng)用。當(dāng)配制為軟骨時(shí)，活性劑可以和石蠟質(zhì)或者可與水混溶的軟骨基質(zhì)一起使用。或者，活性劑還可以與水包油乳霜基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制在乳霜中。優(yōu)選地這類軟骨可使活性劑滲透入皮膚并與靶細(xì)胞和組織接觸，特別在脂肪蓄積的組織和器官中對(duì)于脂肪進(jìn)行改善。適于在口中局部施用的藥物制劑包括糖錠、錠劑和漱口水。通過(guò)吸入施用的藥物制劑包括精細(xì)顆粒塵劑或霧劑，可通過(guò)多種類型已計(jì)量劑量的加壓氣霧劑、噴霧器或吹入器的方式產(chǎn)生。用于陰道施用的藥物制劑可呈現(xiàn)為子宮托、棉塞條、乳骨、凝膠、糊劑、泡沫或者噴霧制劑。非腸道施用的藥物制劑可以包括水性和非水性的無(wú)菌注射溶液，其可進(jìn)一步包括例如生育酚的抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標(biāo)受治者血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無(wú)菌懸液劑，其可包括助懸劑和增稠劑。制劑可呈現(xiàn)于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可在冷凍干燥(凍干)條件下保存，只需要在使用前即刻加入無(wú)菌的液體載體例如注射用水。臨時(shí)注射溶液和懸液可從無(wú)菌粉劑、顆粒和片劑制備。優(yōu)選的單位劑量制劑為含有活性成分的每日劑量或亞劑量，或者適當(dāng)?shù)牟糠至?。?yīng)當(dāng)了解的是除了上述特別提到的成分外，制劑還可包括關(guān)系到所討論制劑類型的本領(lǐng)域常規(guī)的其它試劑，例如適合于口服的制劑可包括調(diào)味劑。需要用本發(fā)明的化合物、鹽或溶劑化物進(jìn)行治療的動(dòng)物通常為哺乳動(dòng)物，例如人類。本發(fā)明的活性劑、鹽或溶劑化物的治療有效量將取決于多種因素，包括例如動(dòng)物的年齡和體重、需要治療的情況的嚴(yán)重度、制劑的性質(zhì)和施用途徑，并且最終在于主治醫(yī)生或獸醫(yī)的判斷力。不過(guò)本發(fā)明化合物對(duì)于毒性治療的有效量通常在受試者(哺乳動(dòng)物)每天每公斤體重0.1至500mg的范圍內(nèi)，更通常在每天1-200mg/kg體重范圍內(nèi)。因此對(duì)于一個(gè)70公斤的成年哺乳動(dòng)物，每天的實(shí)際用量通常為70至700fflg，并且該量可以每天單劑量給予或以每天任何數(shù)目的亞劑量給予以使總?cè)談┝肯嗤?。本發(fā)明的鹽或溶劑化物的有效量可以作為化合物本身的有效量的比例確定。本發(fā)明的化合物及其鹽和溶劑化物可單獨(dú)或與其它治療劑聯(lián)合使用。從而根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合療法包括施用至少一種本發(fā)明的AMP活化的蛋白激酶的激活因子或其藥用鹽或溶劑化物，以及至少一種其它藥學(xué)活性劑，例如癌癥治療劑。組合的活性劑可以一起或者分別施用，并且當(dāng)分別施用時(shí)可同時(shí)或以任何順序序貫施用。本發(fā)明的激酶抑制劑和其它藥學(xué)活性劑的量以及相關(guān)的給藥時(shí)機(jī)為達(dá)到期望的聯(lián)合治療效果目的進(jìn)行選擇。實(shí)施例1以下實(shí)施例展示了在Au565細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物中受到赫賽汀處理影響的基因的鑒定。Au565細(xì)胞在正常條件下生長(zhǎng)并且用赫賽汀處理或不做處理。將細(xì)胞沉淀，用液氮快速冷凍并且使用標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行微陣列分析。從由細(xì)胞沉淀物分離的RNA制備Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA。表III顯示參與脂質(zhì)代謝的基因。受到上調(diào)或下調(diào)的參與其它途徑的基因也顯示于圖1中。表III通過(guò)微陣列分析不使用或使用赫賽汀處理的Au565細(xì)胞代謝基因的改變<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本實(shí)施例證明在用一種小分子酪氨酸激酶抑制劑GW2974處理時(shí)脂肪細(xì)胞失去脂質(zhì)。圖2顯示用一種ErbB刺激性配體NDF或單克隆抗體赫賽汀處理的Au565細(xì)胞，二者均導(dǎo)致脂質(zhì)的生成。這通過(guò)相對(duì)細(xì)胞背景復(fù)染(蘇木精)用油紅進(jìn)行脂質(zhì)染色來(lái)顯示(脂質(zhì)由紅色點(diǎn)表示)。圖3顯示脂質(zhì)在未處理的Au565細(xì)胞中存在，但在用EGFR和ErbB2的雙重抑制劑GW2974處理的細(xì)胞中減少。圖4顯示用GW2974、赫賽汀或NDF處理的心肌細(xì)胞。用赫賽汀和NDF處理的細(xì)胞中脂質(zhì)增加(與未處理細(xì)胞相比)，但在用GW2974處理的細(xì)胞中不減少。圖5顯示在對(duì)照細(xì)胞、赫賽汀和GW2974處理的細(xì)胞中對(duì)脂質(zhì)的定量測(cè)量。用GW2974處理細(xì)胞導(dǎo)致了胞內(nèi)鈣的重新分布(圖6)。這可以在MDA-MB-468乳癌細(xì)胞中看到，其中釣通過(guò)Fluoro-4以熒光進(jìn)行檢測(cè)。這種鉤的重新分布導(dǎo)致AMPK的活化和磷酸化。被活化的AMPK通過(guò)對(duì)翻譯因子eEF-2的磷酸化(其使eEF-2失活并抑制蛋白質(zhì)合成，為TKI的已知效果)抑制翻譯(圖7)。圖7A顯示Au565細(xì)胞使用一種刺激性配體(EGF)或GW2974處理并且對(duì)p-eEF-2進(jìn)行探測(cè)的western印跡。p-eEF-2在GW2974處理后引人注目地增加。圖7B顯示p-eEF-2表達(dá)(通過(guò)IHC)。C225和赫賽汀不使p-eEF-2增加，然而例如易瑞沙、GW2974和雷帕霉素的TKI增加p-eEF-2。ERRot在心臟細(xì)胞的脂質(zhì)代謝中起作用，并且MCAD為分解脂質(zhì)和脂肪酸的酶。MCAD的突變?yōu)槌Ｒ?jiàn)的遺傳病，特別是在北歐家系中。圖8顯示在赫賽汀處理的細(xì)胞中，ERRcx的水平輕微減少。MCAD在經(jīng)赫賽汀處理的細(xì)胞中表達(dá)，但在GW2974處理的細(xì)胞中完全缺失。實(shí)施例3以下實(shí)施例展示了用GW2974處理的細(xì)胞的mRNA表達(dá)鐠中的變化。Au565細(xì)胞在正常條件下生長(zhǎng)并且不用或用GW2974(25pM)進(jìn)行處理。將細(xì)胞沉淀，用液氮快速冷凍并且進(jìn)行微陣列分析。使用Agilent總RNA分離試劑盒分離得到RNA。使用Agilent低RNA輸入熒光線性擴(kuò)增試劑盒制備Cy3和Cy5標(biāo)記的cRNA。將經(jīng)標(biāo)記的cRNA與G4110A人1A(V2)微陣列(由代表涵蓋18K個(gè)清楚表征的、全長(zhǎng)的人類基因的60聚體寡核苷酸構(gòu)成)雜交。表IV以表格形式提供了結(jié)果。表IV表IVA-離子通道基因名稱描迷與對(duì)照相比GW2974變化FLJ12476含有IQ鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)5.0xCAMK4鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV，一種參與Ca(2+)-調(diào)節(jié)的基因表達(dá)(包括CREBBP依賴性基因表達(dá))的蛋白激酶4.5xAVIL與絨毛蛋白l(人VIL1)具有高相似性的蛋白質(zhì)，為一4.2x23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表IVB-心臟調(diào)節(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表IVC-脂肪酸和氨基酸代謝<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>應(yīng)當(dāng)了解，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，對(duì)本文所描述的目前優(yōu)選的實(shí)施方案的多種變化和修改是顯而易見(jiàn)的。此類變化和修改可在不偏離本主題內(nèi)容的精神和范圍以及不減少其預(yù)期優(yōu)勢(shì)下進(jìn)行。因此旨在將此類變化和修改包含在所附權(quán)利要求中。權(quán)利要求1.一種預(yù)測(cè)響應(yīng)使用酪氨酸激酶抑制劑處理的毒性的方法，包括鑒定待用酪氨酸激酶抑制劑處理的靶細(xì)胞群，確定在所述細(xì)胞中是否存在脂肪酸氧化紊亂，由此在所述細(xì)胞中脂肪酸氧化紊亂的存在預(yù)測(cè)使用酪氨酸激酶抑制劑處理細(xì)胞可能有毒。2.權(quán)利要求l的方法，用于預(yù)測(cè)心臟毒性，其中與在酪氨酸激酶抑制劑存在下無(wú)脂肪酸氧化紊亂的細(xì)胞的葡萄糖吸收相比，通過(guò)對(duì)在酪氨酸激酶抑制劑存在下的葡萄糖吸收的正電子發(fā)射體層攝影術(shù)，確定脂肪酸氧化紊亂。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制劑為erbB抑制劑。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述激酶抑制劑為赫賽汀。5.權(quán)利要求1的方法，其中脂肪酸氧化紊亂通過(guò)測(cè)量與經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑處理無(wú)脂肪酸氧化紊亂的細(xì)胞中脂質(zhì)含量的減少相比經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑處理的細(xì)胞脂質(zhì)含量的減少而確定。6.權(quán)利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊亂通過(guò)測(cè)量與無(wú)脂肪酸氧化紊亂的細(xì)胞相比所述細(xì)胞中降低量的脂肪酸氧化代謝途徑中至少一種酶的活性而確定。7.權(quán)利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊亂通過(guò)測(cè)量與無(wú)脂肪酸氧化紊亂的細(xì)胞相比所述細(xì)胞中減少量的編碼脂肪酸氧化代謝途徑中至少一種酶的mRNA而確定。8.權(quán)利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊亂通過(guò)測(cè)量經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑處理正常細(xì)胞后所述細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝途徑中至少一種酶的量而確定。9.權(quán)利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊亂通過(guò)測(cè)量經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑處理正常細(xì)胞后ATP量的減少而確定。10.權(quán)利要求1的方法，其中生物大分子為磷酸化的AMP活化的激酶。11.權(quán)利要求l的方法，其中生物大分子為細(xì)胞因子。12.權(quán)利要求1的方法，其中生物大分子為TNFa。13.權(quán)利要求1的方法，其中生物大分子為pNFkB。14.權(quán)利要求l的方法，其中分析患者體內(nèi)生物大分子的方法包括從患者組織獲得提取物并且在微陣列分析器上分析該提取物。15.減少細(xì)胞中的細(xì)胞脂肪的方法，包括將細(xì)胞與足量的AMPK激活因子接觸以導(dǎo)致細(xì)胞中脂肪的實(shí)質(zhì)性減少。16.權(quán)利要求15的減少脂肪的方法，其中AMPK激活因子為酪氨酸激酶抑制劑。17.權(quán)利要求15的減少脂肪的方法，其中AMPK激活因子為ErbB酪氨酸激酶抑制劑。18.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法，其中將AMPK激活因子非腸道施用。19.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法局部施用。20.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法通過(guò)注射局部施用。21.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法通過(guò)皮膚貼劑局部施用。22.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法通過(guò)軟骨局部施用。23.權(quán)利要求15的減少細(xì)胞脂肪的方法以洗劑或通過(guò)注射局部施用或者以全身治療施用。24.治療患有缺血發(fā)作的患者的方法，包括大致在缺血期間或再灌注期間對(duì)患者施用一定量的AMPK激活因子。25.治療患者以保護(hù)心臟或腦細(xì)胞的方法，包括診斷會(huì)誘導(dǎo)對(duì)性窘迫的一定量的AMPK激活因子。26.權(quán)利要求25的方法，其中會(huì)誘導(dǎo)代謝性應(yīng)激的情況選自缺其中將AMPK激活因子其中將AMPK激活因子其中將AMPK激活因子其中將AMPK激活因子其中將AMPK激活因子血、細(xì)胞因子釋放和葡萄糖剝奪。27.保存用于移植的器官的方法，包括制備包含AMPK激活因子的保存溶液并且將所述器官與該保存溶液接觸。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了確定器官毒性特別是心臟毒性是否將在選擇用各種激酶抑制劑如酪氨酸激酶抑制劑更特別是erbB抑制劑如赫賽汀治療的患者中發(fā)生的方法。此外，還公開(kāi)了確定潛在藥物是否可能產(chǎn)生心臟毒性效應(yīng)的方法。所述方法涉及分析脂質(zhì)水平或者脂肪酸氧化酶、pAMP活化的蛋白激酶的表達(dá)、葡萄糖攝取，以確定是否存在脂肪酸氧化紊亂。鑒定脂肪酸氧化紊亂可用作為毒性特別是心臟毒性的預(yù)測(cè)物，和用作為如果施用諸如酪氨酸激酶抑制劑的藥物應(yīng)小心監(jiān)測(cè)器官功能的指示。還公開(kāi)了保護(hù)器官免于代謝性應(yīng)激和處理細(xì)胞如脂肪細(xì)胞以減少其脂質(zhì)含量的方法。文檔編號(hào)G01N33/53GK101438155SQ200780013697公開(kāi)日2009年5月20日申請(qǐng)日期2007年2月27日優(yōu)先權(quán)日2006年2月27日發(fā)明者S·S·巴克斯申請(qǐng)人:靶向分子診斷有限責(zé)任公司