專利名稱：：通過三維相互作用從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過三維相互作用從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法及其免疫測(cè)定試劑盒。
背景技術(shù)：
：通常已知組成蛋白質(zhì)的多肽的多聚化是蛋白質(zhì)功能所需要的。然而，在一些蛋白質(zhì)中多聚體形式常常引起疾病或紊亂。尤其是，蛋白質(zhì)在正常狀態(tài)下作為單體存在而在異常狀態(tài)(例如通過轉(zhuǎn)變形成錯(cuò)折疊形式)下變成多聚體(或聚集形式)。已經(jīng)充分確定錯(cuò)折疊并最終聚集(或積聚)的蛋白質(zhì)，即那些非功能性相關(guān)構(gòu)象的蛋白質(zhì)缺乏正常的生物活性。未能正確折疊或未能保持正確折疊引起許多不同類型的生物功能障礙，并因此引起許多不同形式的疾病(MassimoStefani,etal.,Mo/.Med81:678-699(2003);和RadfordSE,etal.,ce〃.97:291-298(1999))。許多疾病最終起因于在生命系統(tǒng)中存在具有不正確結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子(即不同于正常行使功能的生物體的蛋白質(zhì)分子)。例如，與蛋白質(zhì)異常聚集或錯(cuò)折疊有關(guān)的疾病或紊亂包括阿爾茨海默氏病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、海綿狀腦病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥、肺氣腫、肝硬化、II型糖尿病、原發(fā)性全身性淀粉樣變性、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、額顳骨癡呆(Fronto-temporaldementias)、老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病、遺傳性大腦淀粉樣血管病以及與血液透析相關(guān)的淀粉樣變性病。已深入研究了與聚集相關(guān)的疾病的早期診斷。但是，還沒有提出從其單體(正常)形式示差檢測(cè)多聚體(聚集)形式的任何方法和途徑。由于可傳染的海綿狀腦病(TSE)，人的偶發(fā)、變異、醫(yī)源性和家族性的克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、庫(kù)魯病、家族性致命性失眠和格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)綜合征，綿羊和山羊的瘙癢病，貓的海綿狀腦病，貂的海綿狀腦病，鹿、麋鹿和駝鹿的慢性萎縮病以及牛的海綿樣腦病是致命的神經(jīng)變性疾病(PmsinerS.B.A^/.爿cad"5^95:13363-13383(1998);和HopeJ.Cmr.(9;^.Z)ev.10，568-57(2000))。已強(qiáng)烈認(rèn)為異常同工型或瘙癢病型的朊病毒蛋白質(zhì)(PrpSe)是TSE的主要致病原因(CaugheyB.7>ewA所oc/zem,5W.26:235-42(2001》。正常型朊病毒蛋白質(zhì)(PrpC)包括a-螺旋和柔性無(wú)序部分并且作為單體形式存在(Zahn,R,,etal.，TVoc.7Vo"爿cat/.Sc/.USA97:145-150(2000))，其中，瘙癢病型(PrpSe)具有高度P-折疊構(gòu)象并且作為多聚體(聚集)或至少二聚體形式存在(Caughey,B.，etal.，/Ao/.C77em.273:32230-35(1998))。從a-螺旋構(gòu)象到(3-折疊構(gòu)象的構(gòu)象變化似乎是其神經(jīng)病理學(xué)疾病的主要起因。PrPc對(duì)蛋白酶敏感(PrP則)，PrPSc對(duì)蛋白酶解具有部分抗性(PrP，并易于形成高分子量聚集物(BoltonD.C.358:164-5(2001))。在后特征使其難于分析導(dǎo)致形成PrPr"或表現(xiàn)其特征的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。通過消化細(xì)胞型而僅保留瘙癢病型以ELISA檢測(cè)，蛋白酶K(PK)消化法已用于辨別PrP(瘙癢病型)的各種形式的抗性。但是，PK消化法備受質(zhì)疑。PrP構(gòu)象、濃度、組織抗體、消化時(shí)間和緩沖液可影響PK的敏感性，這顯著降低PK消化法的可靠性。因此，需要開發(fā)出具有更高可靠性且方便的從其單體形式(例如，PrPPrP的細(xì)胞型)中示差檢測(cè)多聚體形式(例如，PrpSe,PrP的瘙癢病型)的新方法。貫穿本申請(qǐng)，參考了多篇專利和出版物，且各引用包括在括號(hào)中。為了更加充分描述本發(fā)明和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)現(xiàn)狀，這些專利和出版物的全部?jī)?nèi)容在此作為參考并入本申請(qǐng)中。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的試劑盒。通過以下詳細(xì)說明和所附權(quán)利要求書及附圖，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。圖la示意性表示本發(fā)明的MDS-3D-單珠(多聚體檢測(cè)系統(tǒng)-三維畫單珠)系統(tǒng)的實(shí)施例。圖1b示意性表示本發(fā)明的MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的實(shí)施例。圖1c示意性表示本發(fā)明的具有雙標(biāo)記的MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的實(shí)施例。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明(同時(shí)法)與常規(guī)方法(分步法)檢測(cè)多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。"N，，與"Sc，，分別表示正常血漿與包含PrP&的血漿。"RLU"表示相對(duì)光單位。圖3a表示選擇適于MDS-3D-單珠系統(tǒng)的緩沖液類型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3b顯示由Prpse血漿的信號(hào)與正常血漿的信號(hào)的比表示的圖3a的結(jié)果的另一種呈現(xiàn)形式。圖4顯示使用3E7和MA1750抗體根據(jù)MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。"RFU"表示相對(duì)熒光單位。圖5表示選擇適于MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的緩沖液類型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6表示選擇適于MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的血漿濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7表示選擇適于MDS-3D-單珠系統(tǒng)的血漿濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8顯示使用T2和MA1750抗體根據(jù)MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9顯示使用不同濃度和類型的用于制備血漿樣本的去污劑通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖10表示使用不同類型的用于洗滌用血漿樣本和抗體溫育的珠的洗滌緩沖液通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖11表示根據(jù)MDS-3D-單珠系統(tǒng)在濃度為30%和100%的血漿中檢測(cè)多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖12表示根據(jù)MDS-3D-單珠系統(tǒng)在濃度為20%和25%的血漿中檢測(cè)多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖13顯示PK消化對(duì)根據(jù)MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的影響。圖14a表示使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖14b表示使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖15a和15b表示使用捕捉抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。圖15c表示使用檢測(cè)抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體朊病毒蛋白質(zhì)的分析結(jié)果。左側(cè)柱與右側(cè)柱分別對(duì)應(yīng)于(i)3E7-珠作為捕捉抗體并且T2-生物素和MAl-生物素作為檢測(cè)抗體混合物與(ii)MAl-珠作為捕捉抗體并且T2-生物素和3E7-生物素作為檢測(cè)抗體混合物。圖16顯示MDS與MDS-3D單珠系統(tǒng)的檢測(cè)能力的比較。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，提供了一種在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法，其包括以下步驟(a)通過將捕捉抗體與固相載體的表面以三維方式結(jié)合制備載體-捕捉抗體結(jié)合物，其中，該捕捉抗體能夠識(shí)別多聚體形成多肽上的表位；(b)制備檢測(cè)抗體，其中，由該檢測(cè)抗體識(shí)別的表位位于多聚體形成多肽中的一個(gè)位置而通過捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻，以阻止檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽結(jié)合；(c)使載體-捕捉抗體結(jié)合物以及^f企測(cè)抗體與生物樣本同時(shí)接觸；以及(d)檢測(cè)載體-捕捉抗體-多聚體形式-檢測(cè)抗體復(fù)合物的形成。在本發(fā)明的另一技術(shù)方案中，提供了一種在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的試劑盒，其包括(a)捕捉抗體，該捕捉抗體識(shí)別多聚體形成多肽上的表位并與固相載體的表面三維結(jié)合；和(b)檢測(cè)抗體，該檢測(cè)抗體識(shí)別存在于多聚體形成多肽中的一個(gè)位置的表位，通過捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻從而阻止檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽結(jié)合。本發(fā)明目標(biāo)在于一種通過涉及抗原-抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定而在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法。此外，本發(fā)明使用兩類抗體，捕捉抗體與檢測(cè)抗體，二者都與多聚體形成多肽竟?fàn)幗Y(jié)合。通過空間阻礙出現(xiàn)了這種竟?fàn)幍目贵w結(jié)合。具體而言，由于與多聚體形成多肽上的結(jié)合部位的竟?fàn)?，與多聚體形成多肽上的表位結(jié)合的捕捉抗體抑制檢測(cè)抗體與其多聚體形成多肽上的表位結(jié)合。本發(fā)明的特征之一是在三維接觸情況下進(jìn)行免疫測(cè)定。本發(fā)明中，確保捕捉和檢測(cè)抗體與生物樣本中的抗原具有三維接觸機(jī)會(huì)。本發(fā)明人已經(jīng)提出了一種從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的原型方法，稱為"多聚體檢測(cè)系統(tǒng)(MDS)"，并且提交了PCT專利申請(qǐng)(PCT/KR2005/004001)。鑒于實(shí)施例XV中顯示的靈敏性和鑒別能力，本發(fā)明將改進(jìn)MDS。本發(fā)明最突出的特征是使捕捉抗體和檢測(cè)抗體與生物樣本的抗原三維接觸。因此，本發(fā)明的方法命名為"MDS-3D(三維)系統(tǒng)"。本文所用術(shù)語(yǔ)"多聚體形成多肽"指一種多肽，該多肽能夠形成聚集(即多聚體)形式，特別是在構(gòu)象改變之后，引起如阿爾茨海默氏病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、海綿狀腦病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥、肺氣腫、肝硬化、II型糖尿病、原發(fā)性全身性淀粉樣變性、繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病、額顳骨癡呆、老年全身性淀粉樣變性、家族性淀粉樣多神經(jīng)病、遺傳性大腦淀粉樣血管病以及與血液透析相關(guān)的淀粉樣變性病的廣泛多種疾病。因此，術(shù)語(yǔ)"多聚體形成多肽"與術(shù)語(yǔ)"聚集體形成多肽"將可交替使用。本發(fā)明方法使用兩類抗體，即捕捉抗體和檢測(cè)抗體。本文所用術(shù)語(yǔ)"捕捉抗體"指能夠與生物樣本中的目的多聚體形成多肽結(jié)合的抗體。術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)抗體"指能夠與捕捉抗體捕獲的多聚體形成多肽結(jié)合的抗體。"抗體"指能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白蛋白質(zhì)。本文所用抗體指包括能夠結(jié)合目的表位、抗原或抗原片段的完整抗體和任何抗體片段(例如，F(xiàn)(ab，)2、Fab，、Fab、Fv)。本發(fā)明中，由捕捉抗體和檢測(cè)抗體特異性識(shí)別的表位在多聚體形成多肽中位于在要與表位結(jié)合的抗體之間引起位阻(竟?fàn)幗Y(jié)合)的位置。優(yōu)選地，由捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重疊或毗連。應(yīng)該理解，在由捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同或重疊的情況下，要與其表位結(jié)合的捕捉抗體和檢測(cè)抗體S1起位阻或者竟?fàn)幗Y(jié)合。本文所用術(shù)語(yǔ)"重疊"指捕捉抗體和檢測(cè)抗體的表位包括具有完全或部分重疊的氨基酸序列的表位。例如，T2和3E7抗體的表位分別具有牛朊病毒序列的第147-152位和第140160位氨基酸的氨基酸序歹'J。這種表位可描述成完全重疊的表位。此外，ICSM35和1E4抗體的表位分別具有牛朊病毒序列的第104-113位和第108-119位氨基酸的氨基酸序列。這種表位可描述成部分重疊的表位。至于引起位阻的毗連的表位，在多聚體形成多肽中一個(gè)表位(例如，由捕捉抗體識(shí)別的表位)可位于除另一表位(例如，由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位)之外的一位置，只要兩種抗體與毗連的表位竟?fàn)幗Y(jié)合。本發(fā)明的另一特征在于使捕捉抗體與用于制備載體-捕捉抗體結(jié)合物的固相載體的表面三維結(jié)合。例如，捕捉抗體與用于制備載體-捕捉抗體結(jié)合物的三維珠的表面結(jié)合。因此，本發(fā)明排除了捕捉抗體與板的表面的結(jié)合，因?yàn)榭紤]到這種結(jié)合是二維的。與載體三維結(jié)合的捕捉抗體使其與生物樣本中的抗原三維接觸，確保與生物樣本中的抗原更多的接觸機(jī)會(huì)。與捕捉抗體結(jié)合的固相載體可為具有三維結(jié)構(gòu)的任何物質(zhì)，優(yōu)選為提通過重力、電荷或磁力可分離的物質(zhì)。最優(yōu)選，固相載體為磁珠。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，檢測(cè)抗體具有產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記或親和物質(zhì)。該標(biāo)記包括〗旦不限于酶的(例如，^咸性磷酸酶、過氧化物酶、(3-半乳糖苦酶和(3-葡萄糖苷酶)、放射性的(例如，1125和<:14)、熒光的(例如，熒光素)、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FREET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)標(biāo)記。親和物質(zhì)包括生物素。標(biāo)記抗體的各種標(biāo)記和方法是本領(lǐng)域已知的(HarlowandLane,eds.爿w幼0(i/w爿丄a6orato^yMawwa/(1988)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.》在使用放射性標(biāo)記檢測(cè)抗體的情況下，本發(fā)明最終步驟中形成的抗原-抗體復(fù)合物可通過測(cè)量標(biāo)記的放射性而檢測(cè)。在用催化比色反應(yīng)的酶標(biāo)記檢測(cè)抗體的情況下，抗原-抗體復(fù)合物可通過使用酶的底物而檢測(cè)。例如，在用堿性磷酸酶標(biāo)記檢測(cè)抗體的情況下，溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基四偶氮藍(lán)(NBT)、萘酚-AS-BI-磷酸酯和ECF(增強(qiáng)的化學(xué)熒光)可用作顯色反應(yīng)的底物；在用辣根過氧化物酶標(biāo)記的情況下，可使用氯萘酚、氨乙基咔唑、二氨基聯(lián)苯胺、D-螢光素、光澤精(雙-N-曱基吖啶鐵硝酸鹽(bis-N-methylacridiniumnitrate))、試卣靈二曱苯醚、魯米諾、AmplexRed試劑(10-乙?；?3,7-二羥吩噁。秦)、TMB(3，3,5,5-四曱基聯(lián)苯胺)和ABTS(2,2-吖嗪-二[3-乙基苯噻唑啉磺酸酯])作為底物。在用親和物質(zhì)標(biāo)記檢測(cè)抗體的情況下，形成的抗原-抗體復(fù)合物可通過使用其與產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記連接的結(jié)合輔助物而檢測(cè)(例如，比色反應(yīng)-催化酶)。例如，在用生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體的情況下，可使用結(jié)合酶的鏈霉親和素檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。上述標(biāo)記使步驟(d)中定性和定量檢測(cè)多聚體抗原-抗體復(fù)合物可行。在檢測(cè)抗體連接標(biāo)記的情況下，通過測(cè)量標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行步驟(d)。由捕捉抗體和檢測(cè)抗體組成的優(yōu)選抗體組包括作為識(shí)別牛朊病毒序列第140~160位氨基酸表位的捕捉抗體的一種抗體和作為識(shí)別牛朊病毒序列第147-152位氨基酸表位的檢測(cè)抗體的其它抗體。另一優(yōu)選抗體組包括作為識(shí)別牛朊病毒序列第104~113位氨基酸表位的捕捉抗體的一種抗體和作為識(shí)別牛朊病毒序列第108-119位氨基酸表位的檢測(cè)抗體的其它抗體。本發(fā)明的顯著特征在于使載體-捕捉抗體結(jié)合物和^r測(cè)抗體與生物樣本以同時(shí)方式接觸。如果生物樣本開始與捕捉抗體接觸然后與檢測(cè)抗體接觸，則載體-捕捉抗體結(jié)合物與多聚體形式的多肽中的大多數(shù)捕捉抗體表位結(jié)合，從而引起檢測(cè)抗體的結(jié)合抑制。因此，在實(shí)行分步方案而非同時(shí)方案的情況下，檢測(cè)抗體結(jié)合的信號(hào)非常弱。相反，在使捕捉抗體和檢測(cè)抗體與生物樣本同時(shí)接觸的情況下，兩類抗體處于竟?fàn)幥闆r下并且其與抗原的結(jié)合取決于它們的濃度。關(guān)于載體-捕捉抗體和4企測(cè)抗體的術(shù)語(yǔ)"同時(shí)接觸"指(i)使各載體-捕捉抗體和檢測(cè)抗體與生物樣本以同時(shí)方式接觸；或(ii)使包含載體-捕捉抗體和4企測(cè)抗體的混合物與生物樣本接觸。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟(c)中與載體結(jié)合的捕捉抗體和檢測(cè)抗體以5:11:5的摩爾比、更優(yōu)選3:11:3的摩爾比、還更優(yōu)選2:11:2的摩爾比、最優(yōu)選約1:1的摩爾比(捕捉抗體與檢測(cè)抗體)使用。在根據(jù)MDS-3D雙珠系統(tǒng)進(jìn)行本發(fā)明方法的情況下，在步驟(c)中與載體結(jié)合的捕捉抗體和與載體結(jié)合的檢測(cè)抗體以5:11:5的摩爾比、更優(yōu)選3:11:3的摩爾比、最優(yōu)選約2:1的摩爾比(捕捉抗體與檢測(cè)抗體)使用。本發(fā)明使從任何多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式成為可能。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，多聚體形成多肽包括與阿爾茨海默氏病相關(guān)的AP肽和Tau蛋白、與克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和海綿狀腦病相關(guān)的朊病毒、與帕金森氏病相關(guān)的a-突觸核蛋白、與原發(fā)性全身性淀粉樣變性相關(guān)的Ig輕鏈、與繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性病相關(guān)的血清淀粉樣蛋白A、與額顳骨癡呆相關(guān)的Tau蛋白、與老年全身性淀粉樣變性相關(guān)的運(yùn)甲狀腺素蛋白、與家族性淀粉樣多神經(jīng)病相關(guān)的運(yùn)甲狀腺素蛋白、與遺傳性大腦淀粉樣血管病相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、與血液透析相關(guān)的淀粉樣變性病相關(guān)的P2-微球蛋白、與亨廷頓氏病相關(guān)的亨廷頓蛋白、與肌萎縮性側(cè)索硬化相關(guān)的超氧化物歧化酶、與絲氨酸蛋白酶抑制劑缺乏癥、肺氣胂和肝硬化相關(guān)的絲氨酸蛋白酶抑制劑以及與II型糖尿病相關(guān)的糊精。最優(yōu)選，多聚體形成多肽為引起克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病和海綿習(xí)犬腦病的朊病毒蛋白質(zhì)。本發(fā)明突出用于檢測(cè)多聚體朊病毒，即由朊病毒蛋白質(zhì)構(gòu)象改變形成的PrPSe。當(dāng)本發(fā)明方法用于朊病毒蛋白質(zhì)(PrP)時(shí)，單體形式為PrPX朊病毒的細(xì)胞或正常型)而多聚體形式為PrP&(朊病毒的瘙癢病或有傳染性型)。本發(fā)明的特征之一在于采用與在抗原分子中具有非重復(fù)序列的表位結(jié)合的抗體。除非由抗體識(shí)別的表位具有非重復(fù)序列，否則本發(fā)明不能有效從多聚體形成多肽的單體形式中檢測(cè)多聚體形式。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，由捕捉抗體特特異性識(shí)別的表位和/或由檢測(cè)抗體特異性識(shí)別的表位在多聚體形成多肽中不重復(fù)。本發(fā)明所用抗體可根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備，例如融合方法(KohlerandMilstein，c/owna/q/7wmwwo/ogy,6:511-519(1976》、重組DNA方法(USP4,816,56)或噬菌體抗體文庫(kù)(Clacksonetal,A^w，352:624-628(1991);和Marksetal,/Mo/.脂.，222:58，1-597(1991))。抗體制備的一般程序如以下文獻(xiàn)所述Harlow,E.andLane,D.，爿丄aZora/o^yAfowwa/,ColdSpringHarborPress,NewYork,1988;Zola,H.,Mowoc/owaZ/4w幼o(hù)Wes..Mawwa/0/7^c/zw々wes，CRCPress,Inc.,BocaRaton，F(xiàn)lorida,1984;以及Coligan，CW/^AT尸707UCOLS/iV/MMWO丄(9GT,Wiley/Greene,NY,1991。通過無(wú)限增殖細(xì)胞系與產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞的融合進(jìn)行用于單克隆抗體制品的雜交瘤細(xì)胞系的制備。這可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行。多克隆抗體可通過注射上述抗原至適當(dāng)動(dòng)物、收集動(dòng)物中包含抗體的抗血清和經(jīng)由任何已知親和技術(shù)分離特異抗體而制備。僅若混合的捕捉抗體或檢測(cè)抗體能分別和與檢測(cè)抗體或捕捉抗體的表位相同或重疊的表位起反應(yīng)，本發(fā)明還包括使用抗體混合物作為捕捉抗體或檢測(cè)抗體。如實(shí)施例XIII和XIV中所述，本發(fā)明使用混合的捕捉抗體或檢測(cè)抗體可從PrPe中示差檢測(cè)PrPSe。本文所用術(shù)語(yǔ)"生物樣本"是待測(cè)材料的來自生物體的樣本。生物樣本指生物源的任何細(xì)胞、組織或流體，或者能根據(jù)本發(fā)明方便評(píng)價(jià)的任何其他介質(zhì)，包括取自人的樣本、取自動(dòng)物的樣本、取自為人和動(dòng)物消耗的指定食物樣本。優(yōu)選地，待測(cè)生物樣本為體液樣本，包括血液、血清、血漿、淋巴、乳、尿、糞、目艮內(nèi)液、唾液、精液、腦提取物(例如，腦勻漿)、脊髓液(SCF)、闌尾、脾和扁桃體組織的提取物。更優(yōu)選生物樣本為腦勻漿或血漿，最優(yōu)選為血漿。在使用腦勻漿作為生物樣本的情況下，本發(fā)明方法進(jìn)一步包括用蛋白酶K(PK)或胰蛋白酶預(yù)處理生物樣本的步驟，這是有利地。在使用血液或血漿作為生物樣本的情況下，優(yōu)選生物樣本不用蛋白酶(例如，PK)預(yù)處理。蛋白酶處理導(dǎo)致本發(fā)明方法對(duì)多聚體形式、尤其是PrpSe的檢測(cè)和鑒別能力顯著下降。令人驚訝的是，本發(fā)明方法在檢測(cè)血液或血漿樣本中的PrpSc過程中完全排除了蛋白酶(例如，PK)消化的要求，如實(shí)施例X中所述。在使用血液或血漿作為生物樣本的情況下，有利的是本發(fā)明方法進(jìn)一步包括用肌氨?；騎riton系(例如，TritonX-1OO)去污劑(優(yōu)選Triton系、最優(yōu)選TritonX-100)預(yù)處理生物樣本的步驟。就生物樣本(優(yōu)選血液，最優(yōu)選血漿)的制備而言，優(yōu)選的緩沖液包括TBST(含有吐溫20的Tris-緩沖鹽水)和三(羥曱基)曱基甘氨酸(Tricine)。優(yōu)選地，步驟(c)中生物樣本(優(yōu)選血液，最優(yōu)選血漿)的濃度范圍為10v/v%~70v/v%，更優(yōu)選20v/v%~40v/v%，最優(yōu)選23v/v%~30v/v%。在本發(fā)明的還一技術(shù)方案中，提供一種在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法，其包括以下步驟(a)通過使捕捉抗體與磁珠的表面以三維方式結(jié)合制備磁珠-捕捉抗體結(jié)合物，其中，該捕捉抗體能夠識(shí)別多聚體形成多肽上的表位結(jié)合物；(b)制備檢測(cè)抗體，其中，由該檢測(cè)抗體識(shí)別的表位位于所述多聚體形成多肽中的一個(gè)位置而通過捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻，以阻止所述檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽的結(jié)合；(c)使所述磁珠-捕捉抗體結(jié)合物以及4企測(cè)抗體與生物樣本同時(shí)接觸；(d)利用步驟(c)的生成物分離^茲珠-捕捉抗體-多聚體形式-檢測(cè)抗體復(fù)合物；和(e)檢測(cè)磁珠-捕捉抗體-多聚體形式4企測(cè)抗體復(fù)合物的形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在步驟(d)與步驟(e)之間進(jìn)一步包括洗滌已分離的捕捉抗體-多聚體形式-檢測(cè)抗體復(fù)合物的步驟?？墒褂萌鏟BS(磷酸緩沖鹽溶液)、PBST(含有吐溫ZO的磷酸緩沖鹽溶液)、PBSX(含有TritonX-100的磷酸緩沖鹽溶液)、TBSX(含有TritonX-100的Tris-緩沖鹽水)和TBST(含有吐溫20的Tris-緩沖鹽水)的各種洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌步驟。最優(yōu)選，使用TBST進(jìn)行洗滌步驟。圖la示意性表示本發(fā)明的使用磁珠作為載體的實(shí)施例。將參照?qǐng)Dla更加詳細(xì)描述本發(fā)明。使磁珠上的捕捉抗體和HRP-檢測(cè)抗體與包含Prpc和PrpSe的生物樣本同時(shí)接觸，HRP-結(jié)合的檢測(cè)抗體不能與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的Prpe結(jié)合，而是僅與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的PrpSe結(jié)合。另夕卜，磁珠-捕捉抗體也不能與HRP-結(jié)合的檢測(cè)抗體-結(jié)合的Prpe結(jié)合。捕捉抗體和檢測(cè)抗體的表位在朊病毒蛋白質(zhì)中具有非重復(fù)序列。由捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重復(fù)或毗連。圖la中，表位表示成三角形。因?yàn)橛蓹z測(cè)抗體識(shí)別的表位被捕捉抗體占據(jù)，所以檢測(cè)抗體不能與具有僅一個(gè)表位的Prpe結(jié)合。然而，由于多聚體朊病毒蛋白質(zhì)，PrpSe,包括多個(gè)特定表位，所以檢測(cè)抗體可以與捕捉抗體-結(jié)合的PrpSe結(jié)合。在抗原-抗體反應(yīng)之后，向反應(yīng)生成物施加磁場(chǎng)以收集磁珠，接著洗滌收集的珠。使用HRP底物誘導(dǎo)顏色-，熒光-或顯色反應(yīng)并且測(cè)量其結(jié)果，提供定性和定量分析數(shù)據(jù)以驗(yàn)證是否形成PrpSe-抗體復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，與載體結(jié)合的捕捉抗體和檢測(cè)抗體以5:11:5的摩爾比、更優(yōu)選3:11:3的摩爾比、還更優(yōu)選2:11:2的摩爾比、最優(yōu)選約1:1的摩爾比(捕捉抗體與檢測(cè)抗體)包含在混合物形式中。該試劑盒可進(jìn)一步包括^磁板、緩沖液、顯色酶和底物。本發(fā)明的MDS-3D系統(tǒng)分為MDS-3D單珠系統(tǒng)和MDS-3D雙珠系統(tǒng)。MDS-3D單珠系統(tǒng)使用捕捉抗體-結(jié)合珠(圖la)而MDS-3D雙珠系統(tǒng)使用捕捉抗體-結(jié)合珠和檢測(cè)抗體-結(jié)合珠(圖lb和lc)。參照?qǐng)Dla已在上文中描述MDS-3D單珠系統(tǒng)。MDS-3D雙珠系統(tǒng)中，檢測(cè)抗體與固相載體的表面三維連接。與載體結(jié)合的檢測(cè)抗體與多聚體多肽以三維方式接觸。與檢測(cè)抗體結(jié)合的固相載體可為具有三維結(jié)構(gòu)的任何物質(zhì)，優(yōu)選，通過重力、電荷或^f茲力可分離的物質(zhì)。最優(yōu)選，固相載體為膠乳珠。載體可被標(biāo)記。在載體具有標(biāo)記的情況下(例如，載體為包含熒光物質(zhì)的膠乳珠)，載體產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)(指示多聚體多肽的存在)可無(wú)需標(biāo)記才企測(cè)抗體而獲得。MDS-3D雙珠系統(tǒng)進(jìn)一步分為"具有單標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)，，(圖lb)和"具有雙標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)"(圖lc)。在具有單標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)中，檢測(cè)抗體或載體具有產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。在具有雙標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)中，檢測(cè)抗體和載體都具有產(chǎn)生可#:測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。這種雙標(biāo)記策略能夠雙重4全測(cè)指示多聚體多肽存在的信號(hào)。參照?qǐng)Dlb，將更加詳細(xì)描述具有單標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)。使磁珠上的捕捉抗體和熒光(Fluor)-檢測(cè)抗體(與包含熒光物質(zhì)的膠乳珠連接的檢測(cè)抗體)與包含Prpe和PrPSe的生物樣本同時(shí)接觸，并且熒光-檢測(cè)抗體不能與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的Prpc結(jié)合，而僅能夠與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的PrPSe結(jié)合。捕捉抗體和檢測(cè)抗體的表位在朊病毒蛋白質(zhì)中具有非重復(fù)序列。由捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重疊或毗連。圖lb中，表位表示成三角形。因?yàn)橛蓹z測(cè)抗體識(shí)別的表位被捕捉抗體占據(jù)，所以檢測(cè)抗體不能與具有僅一個(gè)表位的Prpe結(jié)合。然而，由于多聚體朊病毒蛋白質(zhì)，PrPSe包括多個(gè)特定表位，所以檢測(cè)抗體可以與捕捉抗體-結(jié)合的PrPSc結(jié)合。在抗原-抗體反應(yīng)之后，向反應(yīng)生成物施加,茲場(chǎng)以收集磁i朱，接著洗滌收集的珠。進(jìn)行測(cè)量以分析熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證是否形成PrpSe-抗體復(fù)合物。參照?qǐng)Dlc將更加詳細(xì)描述具有雙標(biāo)記的MDS-3D雙珠系統(tǒng)。使磁珠上的捕捉抗體和熒光-HRP-檢測(cè)抗體(與包含熒光物質(zhì)的膠乳珠連接的HRP-結(jié)合的檢測(cè)抗體)與包含PrPe和PrPSe的生物樣本同時(shí)接觸，熒光-檢測(cè)抗體不能與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的Prpe結(jié)合，而僅能夠與磁珠-捕捉抗體-結(jié)合的PrpSe結(jié)合。捕捉抗體和檢測(cè)抗體的表位在朊病毒蛋白質(zhì)中具有非重復(fù)序列。由捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重疊或毗連。圖lc中，表位表示成三角形。因?yàn)橛蓹z測(cè)抗體識(shí)別的表位被捕捉抗體占據(jù)，所以檢測(cè)抗體不能與具有僅一個(gè)表位的Prpe結(jié)合。然而，由于多聚體朊病毒蛋白質(zhì)，PrpSc包括多個(gè)特定表位，所以檢測(cè)抗體可以與捕捉抗體-結(jié)合的PrpSe結(jié)合。在抗原-抗體反應(yīng)之后，向反應(yīng)生成物施加磁場(chǎng)以收集磁珠，接著洗滌收集的珠。進(jìn)行測(cè)量以分析熒光強(qiáng)度和HRP反應(yīng)，驗(yàn)證是否形成PrpSe-抗體復(fù)合物。以下具體實(shí)施例用來說明本發(fā)明，但是不能用來限制如所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例I:使用MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP混合2705pl羊血漿、22.5重組多聚體羊PrP(基因型ARQ，120倍稀釋)和3605(il的2.5x去污劑(包含3%TritonX-IOO，1.5%脫氧膽酸鈉和0.25°/。肌氨酰)以制備樣本。還制備包含22.5|ilPBS替代重組多聚體羊PrP的陰性對(duì)照。制備捕捉抗體-結(jié)合的磁珠，其中l(wèi)昭捕捉抗體與2.5pi磁珠結(jié)合。與磁珠結(jié)合的捕捉抗體為3E7或MA1-750單克隆抗體。針對(duì)3E7單克隆抗體的表位為Prpc第140-160位氨基S^f列(參照牛朊病毒序列)或第132~152位氨基酸序列(參照羊朊病毒序列)，發(fā)現(xiàn)其在朊病毒中是非重復(fù)序列。MA1-750抗體特異性識(shí)別PrPe上的表位，Ser-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Arg，發(fā)現(xiàn)其在朊病毒中是非重復(fù)序列。將捕捉抗體-結(jié)合的磁珠和檢測(cè)抗體與血漿樣本以同時(shí)的方式溫育。然后，確定血漿樣本中的重組多聚體羊PrP是否被本發(fā)明的MDS-單珠系統(tǒng)檢測(cè)到。使用3B8/D5-HRP或T2-HRP作為檢測(cè)抗體。如HirokoHayashi，etal.,/版5W"66(6):515(2004)中所述，T2抗體識(shí)別PrPl47~152表位(參照牛朊病毒序列)或PrPi4(M45表位(參照羊朊病毒序列)。針對(duì)3B8/D5單克隆抗體的表位是第132-152位氨基酸序列(參照羊朊病毒序列)和第140-160位氨基酸序歹'K參照牛朊病毒序列)。向血漿樣本中同時(shí)加入捕捉抗體-結(jié)合的磁珠和檢測(cè)抗體并在37。C溫育1小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物施加磁場(chǎng)以分離磁珠，接著用TBST洗滌該珠三次。進(jìn)行ECL(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>為了比較，將捕捉抗體-結(jié)合的磁珠開始與血漿樣本溫育然后與檢測(cè)抗體溫育。血漿樣本的制備如上文所述。向血漿樣本中加入捕捉抗體-結(jié)合的》茲i朱并在37。C溫育1小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物施加;茲場(chǎng)以分離》茲珠，接著用TBST洗滌該珠三次。然后將分離的珠與檢測(cè)抗體在37。C溫育1小時(shí)。向反應(yīng)混合物施加磁場(chǎng)以分離磁珠，接著用TBST洗滌該珠三次。最后，進(jìn)行ECL(增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光)檢測(cè)。如圖2中所示，在將磁珠-捕捉抗體(3E7抗體)和檢測(cè)抗體(T2-HRP)與樣本以同時(shí)的方式溫育的情況下，針對(duì)多聚體PrP的檢測(cè)信號(hào)顯示出比分步方案高得多的檢測(cè)信號(hào)，這說明同時(shí)方案極大地增強(qiáng)了多聚體朊病毒檢測(cè)的靈敏性。另外，同時(shí)方案中的多聚體朊病毒信號(hào)強(qiáng)度與正常朊病毒信號(hào)強(qiáng)度的比比分步方案中的高得多，引出本發(fā)明顯示極好的對(duì)多聚體朊病毒的鑒別能力的原因。實(shí)施例II:適于MDS-3D-單珠系統(tǒng)的緩沖液類型的確定為了確定本發(fā)明MDS-3D-單珠系統(tǒng)中適用的緩沖液類型，以1:1的重量比(0.8嗎:0.8fig，基本相當(dāng)于1:1的摩爾比)使用磁-結(jié)合的捕捉抗體(3E7-珠)和檢測(cè)抗體(T2-HRP)完成MDS-3D-單珠系統(tǒng)。血漿樣本制備如下混合120,uld-H20中的10%TritonX-IOO、580,ul緩沖液(TAPS,TBST或三(羥曱基)曱基甘氨酸,pH8.0)和300jil顯示具有PrPsc臨床征兆的羊血漿以提供總體積1ml包含1.2%TritonX-100和30%血漿的血漿樣本?；旌?|il(0.8昭)作為捕捉抗體的3E7-結(jié)合的磁珠和200|il(0.8嗎)作為檢測(cè)抗體的T2-HRP(TBST中4嗎/ml)以制備混合抗體。向1ml血漿樣本中加入200pi混合抗體并在37。C溫育1小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物施加磁場(chǎng)以分離磁珠，接著用TBST洗滌該珠三次。進(jìn)行ECL檢測(cè)(圖3a和3b)。圖3a和3b中，"N"和"Sc"分別表示正常血漿和包含PrpSe的血漿。如圖3a和3b中所示，三(羥曱基)曱基甘氨酸緩沖液對(duì)包含Prpse的血漿顯示出最強(qiáng)信號(hào)而對(duì)正常血漿顯示出最弱信號(hào)。實(shí)施例III:使用MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中多聚體PrP混合120pl10%TritonX-100、730(alTBST緩沖液(pH8.0)和150|il羊血漿以提供1ml包含1.2%TritonX-100和15%血漿的血漿樣本。混合4jil作為捕捉抗體的3E7-結(jié)合的磁珠、2pi作為檢測(cè)抗體的MAI750-結(jié)合的熒光膠乳珠和200(ilTBST緩沖液以制備混合抗體(3E7-珠:MA1750-熒光珠，2:1)。向1ml血漿樣本中加入200(il混合抗體并在37。C溫育1小時(shí)。然后，向反應(yīng)混合物施加磁場(chǎng)以分離磁珠，接著用TBST洗滌該珠三次。最后，檢測(cè)熒光信號(hào)。如圖4中所示，MDS-3D-雙珠系統(tǒng)能夠示差檢測(cè)血漿中的PrPSc。實(shí)施例IV:適于MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的緩沖液類型的確定混合4|il作為捕捉抗體的3E7-結(jié)合的磁珠和1|^1作為檢測(cè)抗體的MA1750-結(jié)合的熒光膠乳珠以制備混合抗體(3E7-珠:MAl750-熒光珠，4:1)。混合120|il10%TritonX-腦、730pl緩沖液(TBST或三(羥曱基)曱基甘氨酸，pH8.0)和150jil羊血漿以制得血漿樣本。其他程序與實(shí)施例ni相同。如圖5中所示，使用MDS-3D-雙珠系統(tǒng)，在血漿樣本中檢測(cè)Prpse，TBST顯示出比三(羥曱基)曱基甘氨酸緩沖液更高的信號(hào)和鑒別能力。此外，使用T2和MA1抗體分別作為捕捉抗體和檢測(cè)抗體制成MDS-3D-雙珠系統(tǒng)，然后進(jìn)行上述程序。如圖5中所示，使用另一抗體組合的MDS-3D-雙珠系統(tǒng)還能夠檢測(cè)血漿中的PrPSc。實(shí)施例V:適于MDS-3D-雙珠系統(tǒng)的血漿濃度的確定混合2作為捕捉抗體的3E7-結(jié)合的磁珠和1^tl作為檢測(cè)抗體的MA1750-結(jié)合的熒光膠乳珠以制備混合抗體(3E7-珠:MAl750-熒光珠，2:1)。制備濃度為30%、15%和7.5%的血漿樣本。使用三(羥曱基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩沖液。其他程序與實(shí)施例III相同。如圖6中所示，本發(fā)明的MDS-3D-雙珠系統(tǒng)能夠示差檢測(cè)濃度為30%、15%和7.5%的全部血漿樣本中的PrPSc。然而，當(dāng)降低血漿濃度時(shí)Sc/N的比降低，當(dāng)降低血漿濃度時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度增加。因此，可以理解MDS-3D-雙珠系統(tǒng)中適宜的血漿濃度為約15%。實(shí)施例VI:適于MDS-3D-單珠系統(tǒng)的血漿濃度的確定為了確定MDS-3D-單珠系統(tǒng)中適宜的血漿濃度，以1:1的比(0.8嗎:0.8i!g)使用磁-結(jié)合的捕捉抗體(3E7-珠)和檢測(cè)抗體(T2-HRP)以完成MDS-3D-單珠系統(tǒng)。制備濃度為30%、15%和7.5%的血漿樣本。使用三(羥曱基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩沖液。其他程序與實(shí)施例II相同。如圖7中所示，本發(fā)明的MDS-3D-單珠系統(tǒng)能夠示差檢測(cè)濃度為30%、15%和7.5%的全部血漿樣本中的PrPSc。當(dāng)血漿濃度降低時(shí)，針對(duì)正常血漿和PrP&血漿的Sc/N的比、信號(hào)強(qiáng)度都降低。因此，可以理解，適于MDS-3D-單珠系統(tǒng)的血漿濃度約為30%。此夕卜，以1:2的比例使用3E7-珠抗體和T2-HRP抗體并且使用三(羥甲基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩沖液制備濃度為30%和100%的血漿樣本。其他程序與實(shí)施例II相同。如圖11中所示，觀察到100%血漿濃度比30%血漿濃度產(chǎn)生低得多的信號(hào)強(qiáng)度和鑒別。另夕卜，以1:1的比例使用3E7-珠抗體和T2-HRP抗體并且使用三(羥甲基)曱基甘氨酸(pH8.0)緩沖液制備濃度為20%和25%的血漿樣本。包含20%和25%血漿樣本的反應(yīng)體積分別為300[xl和4(X)|al。其他程序與實(shí)施例II相同。如圖12中所示，觀察到25%血漿濃度比20%血漿濃度產(chǎn)生高得多的信號(hào)強(qiáng)度和鑒別。實(shí)施例VII:使用MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP以2:1或4:1的比例使用作為捕捉抗體的T2-結(jié)合的磁珠和作為檢測(cè)抗體的MA1750-結(jié)合的熒光膠乳珠以完成MDS-3D-雙珠系統(tǒng)。使用15°/。血漿樣本和TBST(pH8.0)緩沖液。其他程序與實(shí)施例III相同。如圖8中所示，發(fā)現(xiàn)T2-珠與MA1750-珠以4:1的比例的Sc/N的比和信號(hào)強(qiáng)度比以2:1的比例的高。實(shí)施例VIII:使用不同濃度和類型的去污劑通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)才全測(cè)血漿中的多聚體PrP除了去污劑條件，以與實(shí)施例II相同的方式使用不同濃度和類型的去污劑通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)顯示出具有PrPse臨床征兆的羊血漿樣本中的多聚體PrP。如圖9中所示，TritonX-100的濃度(1%,1.5%和2。/。)顯示出對(duì)多聚體PrP相似的檢測(cè)和示差結(jié)果。另夕卜，盡管結(jié)果偏差相對(duì)較高，Np-40(USBCorp.,USA)也顯示了相當(dāng)?shù)臋z測(cè)和示差結(jié)果。Np-40是一種非離子去污劑且表示[辛基苯氧基]聚乙氧基乙醇。實(shí)施例IX:使用不同類型的洗滌緩沖液通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP除了抗體重量比(3E7-珠:T2-HRP,l:2)和洗滌條件之外，以與實(shí)施例II相同的方式，使用不同類型的用于洗滌與血漿樣本和抗體溫育的珠的洗滌緩沖液通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有Prpse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。如圖IO中所示，與其他緩沖液，PBST(含有吐溫20的磷酸緩沖鹽溶液)、PBSX(含有TritonX-100的磷酸緩沖鹽溶液)和TBSX(含有TritonX-100的Tris-緩沖鹽水)相比，TBST(含有吐溫20的Tris-緩沖鹽水)洗滌緩沖液顯示出最優(yōu)異的多聚體PrP的^^r測(cè)和示差結(jié)果。實(shí)施例X:PK消化對(duì)使用MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP的影響除了抗體重量比(3E7-珠:T2-HRP，1:4)之外，以與實(shí)施例II相同的方式，進(jìn)行或沒有PK(蛋白酶K)消化，通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有Prpse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。如圖13所示，PK消化極大降低了針對(duì)血漿樣本中的PrpSe的信號(hào)強(qiáng)度。在這一點(diǎn)，可確認(rèn)，本發(fā)明的MDS-3D-單珠系統(tǒng)能夠在檢測(cè)血液或血漿樣本中的PrpSe時(shí)完全排除PK消化的需要。實(shí)施例XI:使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP以與實(shí)施例II相同的方式，使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有Prpsc的羊血漿樣本中的多聚體PrP。3E7-珠捕捉抗體與T2-HRP檢測(cè)抗體的重量比為4:1、2:1、1.33:1和1:1。如圖14a中所示，在以相同的量使用兩種抗體的情況下，本發(fā)明的MDS-3D-單珠系統(tǒng)顯示出最優(yōu)異的對(duì)血漿樣本中的PrPsc的檢測(cè)和鑒別能力。實(shí)施例XII:使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP以與實(shí)施例III相同的方式，使用不同重量比的抗體通過MDS-3D-雙珠系統(tǒng)檢測(cè)含有Prpse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。3E7-珠捕捉抗體與MA1750熒光J朱4企測(cè)抗體的重量比為4:1和2:1。如圖14b中所示，在以2:1的比例使用捕捉抗體與檢測(cè)抗體的情況下，本發(fā)明的MDS-3D-雙珠系統(tǒng)顯示出最優(yōu)異的對(duì)血漿樣本中的PrPsc的檢測(cè)和鑒別能力。實(shí)施例XIII:使用捕捉抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP以與實(shí)施例II相同的方式，使用捕捉抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有PrPse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。使用由3E7-珠與T厶珠抗體(圖Ua)或SE:珠與MAl-珠抗體(圖1化)組成的捕捉抗體混合物作為捕捉抗體。捕捉抗體混合物與檢測(cè)抗體T2-HRP的重量比為1:1。如圖15a和15b所示，捕捉抗體混合物同樣顯示出優(yōu)異的對(duì)血漿樣本中的PrPse的檢測(cè)和鑒別能力。實(shí)施例XIV:使用檢測(cè)抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)血漿中的多聚體PrP以與實(shí)施例II相同的方式，使用檢測(cè)抗體混合物通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有Prpse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。所用抗體組為(i)3E7-珠作為捕捉抗體且T2-生物素與MAl-生物素作為檢測(cè)抗體混合物以及(ii)MAl-珠作為捕捉抗體且T2-生物素和3E7-生物素作為檢測(cè)抗體混合物。如圖15c中所示，檢測(cè)抗體混合物同樣顯示出優(yōu)異的對(duì)血漿樣本中的prpse的檢測(cè)和鑒別能力。實(shí)施例XV:在相同條件下MDS與MDS-3D-單珠系統(tǒng)的檢測(cè)能力的比較_本發(fā)明人已經(jīng)提出了從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的原型方法，稱為"多聚體檢測(cè)系統(tǒng)(MDS)"，并提交了PCT專利申請(qǐng)(PCT/KR2005/004001)。為了以可靠方式比較MDS與MDS-3D單珠系統(tǒng)的PrP"檢測(cè)和鑒別能力，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，按照各程序檢測(cè)含有Prpse的羊血漿樣本中的多聚體PrP。分別使用3E7和T7抗體作為捕捉抗體和檢測(cè)抗體。如圖16中所示，明顯看出，與MDS相比，本發(fā)明的MDS-3D單珠系統(tǒng)顯示出更高的對(duì)羊血漿樣本中的PrP"的靈敏度和鑒別能力。實(shí)施例XVI:適于使用其他抗體組的MDS-3D-單珠系統(tǒng)的血漿濃度的確定除了抗體組的類型和血漿濃度之外，以與實(shí)施例II相同的方式通過MDS-3D-單珠系統(tǒng)檢測(cè)含有PrPsc的羊血漿樣本中的多聚體PrP。使用ICSM35-生物素鏈霉親和素珠作為捕捉抗體以及1E4-HRP作為檢測(cè)抗體。羊血漿的濃度為25%。ICSM35抗體(D-Gen，Inc.)識(shí)別對(duì)應(yīng)于第96105位氨基酸序列(參照羊朊病毒序列)或第104~113位氨基酸序列(參照牛朊病毒序歹'j)的表位。1E4抗體(SanquinReagents,Inc.)識(shí)別對(duì)應(yīng)于第100-111位氨基酸序歹'J(參照羊朊病毒序列)或第108~119位氨基酸序列(參照牛朊病毒序列)的表位。如圖17中所示，識(shí)別部分重疊表位的另一抗體組同樣顯示出優(yōu)異的對(duì)血漿樣本中的PrPse的靈敏性和鑒別能力。已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，可以理解，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說落入本發(fā)明實(shí)質(zhì)范圍的變形和修改是明顯的，并且本發(fā)明的范圍由所述權(quán)利要求書及其等同物確定。權(quán)利要求1、一種在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法，該方法包括以下步驟(a)通過將捕捉抗體與固相載體的表面以三維方式結(jié)合制備載體-捕捉抗體結(jié)合物，其中，所述捕捉抗體能夠識(shí)別所述多聚體形成多肽上的表位；(b)制備檢測(cè)抗體，其中，由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位位于所述多聚體形成多肽中的一個(gè)位置而通過捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻，以阻止所述檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽的結(jié)合；(c)使所述載體-捕捉抗體結(jié)合物以及檢測(cè)抗體與生物樣本同時(shí)接觸；(d)檢測(cè)載體-捕捉抗體-多聚體形式-檢測(cè)抗體復(fù)合物的形成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)抗體與所述固相載體的表面以三維方式結(jié)合。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多聚體形成多肽選自由A(3肽、P-淀粉狀蛋白、Tau蛋白、朊病毒、oc-突觸核蛋白、Ig輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、運(yùn)曱狀腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、(32-微球蛋白、亨廷頓蛋白、超氧化物歧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和糊精組成的組中。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述多聚體形成多肽為朊病毒o5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述單體形式為Prpe而所述多聚體形式為PrpSe。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，由所述捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重疊或郵匕連。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，由所述捕捉抗體識(shí)別的表位在所述多聚體形成多肽中不重復(fù)。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位在所述多聚體形成多肽中不重復(fù)。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，與所述捕捉抗體結(jié)合的固相載體為》茲珠。10、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，與所述檢測(cè)抗體結(jié)合的固相載體為膠乳珠。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述檢測(cè)抗體具有產(chǎn)生可才企測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。12、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，與所述捕捉抗體結(jié)合的標(biāo)記。13、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，通過;f企測(cè)與所述檢測(cè)抗體連接的標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行所述步驟(d)。14、根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過檢測(cè)與所述載體-捕捉抗體結(jié)合物連接的標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行所述步驟(d)。15、根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中，所述與檢測(cè)抗體連接的標(biāo)記為化學(xué)的、酶的、放射性的、熒光的、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FREET標(biāo)記。16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物樣本為腦勻漿或血液。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述生物樣本為血液。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述生物樣本為血漿。19、根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，在使用腦勻漿作為所述生物樣本時(shí)，所述方法進(jìn)一步包括用蛋白酶K或胰蛋白酶預(yù)處理所述生物樣本。20、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述步驟(c)中以2:11:2摩爾比的捕捉抗體與檢測(cè)抗體使用與載體結(jié)合的捕捉抗體和檢測(cè)抗體。21、一種用于在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的試劑盒，其包括(a)捕捉抗體，該捕捉抗體識(shí)別所述多聚體形成多肽上的表位并與固相載體的表面三維結(jié)合；以及(b)檢測(cè)抗體，該檢測(cè)抗體識(shí)別存在于所述多聚體形成多肽中的一個(gè)位置的表位，通過所述捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻從而阻止所述檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽結(jié)合。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，所述檢測(cè)抗體與固相載體的表面以三維方式結(jié)合。23、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，所述多聚體形成多肽選自由A卩肽、P-淀粉狀蛋白、Tau蛋白、朊病毒、a-突觸核蛋白、Ig輕鏈、血清淀粉樣蛋白A、運(yùn)曱狀腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、P2-微球蛋白、亨廷頓蛋白、超氧化物歧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑和糊精組成的組中。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中，所述多聚體形成多肽為朊病毒。25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中，所述單體形式為Prpe而所述多聚體形式為PrPSe。26、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，由所述捕捉抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列與由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位的氨基酸序列相同、重疊或曰比連。27、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，由所述捕捉抗體識(shí)別的表位在所述多聚體形成多肽中不重復(fù)。28、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位在所述多聚體形成多肽中不重復(fù)。29、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，與所述捕捉抗體結(jié)合的固相載體為磁珠。30、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中，與所述檢測(cè)抗體結(jié)合的固相載體為膠乳珠。31、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，所述檢測(cè)抗體具有產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記。32、根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中，與所述捕捉抗體結(jié)合的才示i己。33、根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的試劑盒，其中，所述與檢測(cè)抗體連接的標(biāo)記為化學(xué)的、酶的、放射性的、熒光的、發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的和FREET標(biāo)記。34、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為腦勻漿或血液。35、根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血液。36、根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血漿。37、根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其中，在使用腦勻漿作為所述生物樣本時(shí)，所述試劑盒進(jìn)一步包括蛋白酶K或胰蛋白酶。38、根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，以2:11:2摩爾比的所述捕捉抗體與檢測(cè)抗體的混合物形式包含與載體結(jié)合的捕捉抗體和才企測(cè)抗體。全文摘要本發(fā)明涉及在生物樣本中從多聚體形成多肽的單體形式中示差檢測(cè)多聚體形式的方法，其包括以下步驟(a)通過將捕捉抗體與固相載體的表面以三維方式結(jié)合制備載體-捕捉抗體結(jié)合物，其中，所述捕捉抗體能夠識(shí)別所述多聚體形成多肽上的表位；(b)制備檢測(cè)抗體，其中，由所述檢測(cè)抗體識(shí)別的表位位于所述多聚體形成多肽中的一個(gè)位置而通過捕捉抗體與其表位結(jié)合引起位阻，以阻止所述檢測(cè)抗體與多聚體形成多肽的結(jié)合；(c)使所述載體-捕捉抗體結(jié)合物以及檢測(cè)抗體與生物樣本同時(shí)接觸；和(d)檢測(cè)載體-捕捉抗體-多聚體形式-檢測(cè)抗體復(fù)合物的形成。文檔編號(hào)G01N33/49GK101427132SQ200780014413公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2007年4月20日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者吳炫姃,安性洙,林君澤申請(qǐng)人:人民生物公司