專利名稱：：用于檢測細胞及其它分析物的裝置和方法用于檢測細胞及其它分析物的裝置和方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2006年3月15日提交的美國臨時申請No.60/782,470的權(quán)益，這里通過引用結(jié)合進來。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及醫(yī)療器械、醫(yī)學診斷和細胞計數(shù)領域。在全球40,400,000感染HIV的人中，35,000,000以上生活在資源局限性顯著的發(fā)展中國家，他們中的許多迫切需要診斷、監(jiān)測和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療。在管理HIV感染的對象時，對特定白細胞群體CD4+T淋巴細胞的計數(shù)被證實為重要的生物學指標。在成人中，每微升血液中CD4+T細胞的絕對數(shù)量具有關(guān)鍵的預斷和治療意義，并用于HIV分期和治療決策中。常規(guī)的CD4計數(shù)監(jiān)測——每年兩到四次——被推薦用于所有的感染階段。臨床上，低于200個細胞m1/1的CD4計數(shù)用以確診AIDS,并且在大多數(shù)情況下，被用作啟動抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(ART)和預防機會感染的標記物。較高的CD4計數(shù)閾值，即350和500個細胞m1/1被廣泛用作增加監(jiān)測強度的標記物，并在一些情況下用以啟動ART。然而，可以負擔得起的和合適的用以確定CD4計數(shù)的實驗室監(jiān)測工具在資源有限的情況下進入量很少，盡管國際社會在不斷努力擴大ART在這些地區(qū)的可獲得性。目前，CD4+T細胞計數(shù)的黃金標準是采用單克隆抗體和商用多用途流式細胞計數(shù)儀或單用途CD4計數(shù)流式細胞計數(shù)儀對淋巴細胞亞群的流式細胞計數(shù)法。盡管這些儀器通量高而準確，但其成本和對操作和維護的技術(shù)需要限制了其普及并大大制約了HIV治療項目在世界范圍內(nèi)的資源局限地區(qū)實施。小型的儀器如GuavaEasyCD4提供了有限的改進而并沒有被廣泛地采用。非細胞熒光光度法，包括ELISA和膠珠式測定法，被認為是CD4十T淋巴細胞定量的實用替代方式，因為這些方法比流式細胞計數(shù)需要較少的設備并試劑成本低。然而，它們的通量低得多，勞動集約性更大并且準確度較低，沒有廣泛使用或被世界衛(wèi)生組織指南所推薦。5此外，對CD4計數(shù)后端方面的改進——諸如設備小型化——并沒有解決資源局限情況下的最大問題，即樣品制備。在診斷測定的任何步驟中對靜脈穿刺采集血液、裂解紅細胞、離心樣品或使用移液管的需要在這些情況下成為極大的問題。因此，仍然需要一種診斷和監(jiān)測CD4細胞種群的低成本方法。發(fā)明概述本發(fā)明重點提供了一種用于從樣品中分離目的細胞的方法，其通過將所述樣品引入含有對目的細胞具有特異性的結(jié)合部分的微流動裝置，使得樣品中的目的細胞與所述結(jié)合部分結(jié)合，并向所述微流動裝置施加剪切應力以使目的細胞保持結(jié)合而非目的細胞不結(jié)合。在該實施方式中，4吏目的細胞結(jié)合于所述結(jié)合部分的步驟和施加剪切應力的步驟可以同時進行。本發(fā)明還重點提供了一種用于從樣品中分離目的細胞的方法，其通過將所述樣品引入含有對第一目的細胞具有特異性的第一結(jié)合部分的微流動裝置，其中所述第一結(jié)合部分置于第一腔室中。所述方法包括使得樣品中的第一目的細胞與所述第一結(jié)合部分結(jié)合，向所述微流動裝置施加第一剪切應力以使第一目的細胞保持結(jié)合而其它細胞不結(jié)合，并使剩余樣品流入含有針對第二目的細胞的結(jié)合部分的所述微流動裝置第二腔室中。該方法進一步包括使得樣品中的第二目的細胞與所述第二結(jié)合部分結(jié)合，并向所述第二腔室施加笫二剪切應力以使第二目的細胞保持結(jié)合而非目的細胞不結(jié)合。在該實施方式中，第一剪切應力和第二剪切應力可以相同或不同。而且在該實施方式中，所述第一結(jié)合部分和第二結(jié)合部分可以相同或不同。如上所述，所述應力可以在結(jié)合發(fā)生的同時施力口。本發(fā)明還重點提供了用于分離目的細胞的試劑盒。該試劑盒包括裝置，其包含具有對目的細胞具有特異性的結(jié)合部分的腔室，和用于產(chǎn)生剪切應力以使所述目的細胞優(yōu)先于非目的細胞結(jié)合的泵。該試劑盒還可以包括對目的細胞具有特異性的標記試劑。任選地，該試劑盒還可以包括用于AIDS診斷的i兌明書。另一方面中，本發(fā)明重點提供了確定在裝置上分離目的細胞的剪切應力的方法。該方法包括將含有目的細胞的樣品引入微流動裝置的腔室中，所述腔室含有對目的細胞具有特異性的結(jié)合部分，使得樣品中的目的細胞與所述結(jié)合部分結(jié)合，并向所述微流動裝置施加剪切應力。在該方法中，所述剪切應力沿腔室長度變化，并確定目的細胞優(yōu)先于其它細胞結(jié)合所述結(jié)合部分的剪切應力。在該方面中，剪切應力可以在結(jié)合發(fā)生的同時施加。在任何前述的方面中，所述結(jié)合部分可以選自抗體、抗體片段、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核普酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。同樣在任何前述方面中，所述樣品可以為血液樣品，所述結(jié)合部分可以結(jié)合CD66、CD14、CD4、CD8、EpCAM、E選擇蛋白、或P選擇蛋白，所述目的細胞可以選自嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、循環(huán)腫瘤細胞、HIV感染的CD8淋巴細胞、循環(huán)內(nèi)皮細胞和血小板。在優(yōu)選的實施方式中，目的細胞為CD4+淋巴細胞。在該實施方式中，所述樣品可以來自具有AIDS發(fā)展風險的患者。本發(fā)明的方法還可以包括分析目的細胞的至少一種性質(zhì)(如生物學性質(zhì))(例如mRNA表達、蛋白質(zhì)表達、DNA定量、DNA序列、和染色體異常)；目的細胞(例如CD4+淋巴細胞)計數(shù)，例如，以診斷諸如AIDS的疾病狀態(tài)。盡管是以細胞的形式進行的描述，但本發(fā)明的方法、裝置和試劑盒也可用于其它的分析物，如本文中所述。在優(yōu)選的實施方式中，目的細胞比在無剪切應力時能夠與結(jié)合部分結(jié)合的其它細胞優(yōu)先發(fā)生結(jié)合。"患者，，是指活的多細胞有機體。術(shù)語"患者"意在包括人、鼠、狗、貓、牛、羊、馬、非人類靈長目和魚。"結(jié)合部分"是指特異性地結(jié)合于分析物(例如細胞)的分子。結(jié)合部分包括例如，抗體、適配體、受體、配體、抗原、生物素/抗生物素蛋白、金屬離子、螯合劑、核酸、MHC肽單體、四聚體、五聚體或其它寡聚體。"細胞表面標記物"是指暴露在細胞外環(huán)境中的結(jié)合細胞的分子。所述細胞表面標記物可以是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或上述三者的一些組合。術(shù)語"細胞表面標記物"包括天然存在的分子、由于某疾病狀況而異常存在的分子、或者與所述細胞表面相連的分子。"裂解"是指細胞膜破壞。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"裂解"意在包括完全破壞細胞膜("完全裂解")，部分破壞細胞膜("部分裂解")，以及細胞膜的滲透。"結(jié)合部分"是指細胞與其結(jié)合的化學物種。結(jié)合部分可以是偶聯(lián)到表面或構(gòu)成表面的物質(zhì)上的化合物。結(jié)合部分的實例包括抗體、抗體片段(例如Fc片段)、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核苦酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。"滲透"是指破壞細胞膜使得特定胞內(nèi)成分能夠脫離細胞，而其它成分保留在細胞內(nèi)。術(shù)語"腔室"意在包括微流動通道的任何指定部分，例如，橫截面積大于、小于或等于進出所述腔室的通道的部分。通過以下說明、附圖和權(quán)利要求，其它的特點和優(yōu)點將更加顯而易見。附圖簡要說明圖1A是表示CD4計數(shù)裝置操作步驟的圖表。圖1B是細胞計數(shù)裝置的照片。具有一個入口和一個出口的微加工型PDMS裝置被結(jié)合在載玻片上以形成封閉腔室。圖1C是Hele-Shaw裝置的幾何形狀圖。該Hele-Shaw裝置提供了沿其中線線性變化的剪切力。圖1D是1B的細胞計數(shù)裝置的圖表。該裝置具有10pL的容積用于樣品體積計量。圖2A是在Hele-Shaw腔室中捕獲的一系列細胞的顯微圖像，其位點對應于0.4dyncm-2(左)，1.7dyncm-2(中)，和5dyncm-2(右)的剪切應力。所述圖像通過將相襯圖像和對應的焚光圖像重疊形成。圖2B是在如上所述的剪切應力條件下染色CD4(箭頭)和CD14后一系列捕獲細胞顯微圖像。淋巴細胞(CD4+CD14-)和單核細胞(CD4+CD14+)在0.5dyncm-2的剪切應力^f皮捕獲，而純淋巴細胞在兩個專支高的剪切應力凈皮捕獲(Bar:100mm)。圖2C是表示CD4+T細胞(實心圓)、單核細胞(空心圓)和其它細胞(實心三角)響應于剪切力的粘著性圖表。觀察到單核細胞和淋巴細胞響應于剪切力的區(qū)別捕獲性能。l到3dyncm々的剪切應力窗口對CD4+T細胞的粘著來說是最佳的，而在高于0.7dyncm々單核細胞的粘著性顯著下降(小圖)。其它細胞的粘著性在整個被測剪切應力范圍最小。每個數(shù)據(jù)點在跨不同剪切應力范圍的3個裝置中重復；誤差條表示每次實中測量的標準偏差。圖2D是表示表面捕獲細胞的組成作為剪切應力函數(shù)的圖表。當剪切應力高于0.7dyncm-2時，95%的表面捕獲細胞為CD4+T細胞(實心圓)。當剪切應力降到低于0.7dyncm^時，這些細胞的純度迅速下降到低于50%。每個數(shù)據(jù)點在跨不同剪切應力范圍的3個裝置中重復；誤差條表示每次實驗中測量的標準偏差。圖3A是表示在CD4+T細胞分離之前流式細胞計數(shù)分析血液樣品的圖表。CD4+T細胞(CD3+CD4+)占所有淋巴細胞的29.67%。圖3B是表示CD4+T細胞在所述裝置中捕獲之后，相同血液樣品的流式細胞計數(shù)分析的圖表。在裝置捕獲之后樣品流中的目標細胞組成下降到所有淋巴細胞群的2.13%。將十微升的全血在1.7dyncm々的剪切應力注入該線形裝置中。細胞在門控淋巴細胞群中獲得，所述象限提供有同種型匹配的對照。圖3C是表示捕獲細胞百分比產(chǎn)量作為剪切應力函數(shù)的圖表，其通過流式細胞計數(shù)分析計算得到。利用1到3dyncm々范圍的剪切應力，接近95%的目的細胞可以從全血中分離。在該范圍以外產(chǎn)量迅速降^氐到小于85%。每個數(shù)據(jù)點在至少3個裝置中重復。誤差條表示每次實驗中測量的標準偏差。圖4是表示在兩種剪切應力下采用線性細胞捕獲腔室的捕獲細胞密度作為距入口距離的函數(shù)的圖表。在1.7dyncnT2(實心圓，產(chǎn)量接近95%),捕獲細胞密度在樣品入口附近達到最大值。相比之下，在7dyncm々(空心圓，產(chǎn)量75%),沿所述裝置的細胞分布相當均勻。所述試驗采用10(iL來自健康對象的全血實施。每個數(shù)據(jù)點在至少3個裝置中重復。誤差條表示每次實驗中測量的標準偏差。圖5是表示微流動芯片上計數(shù)的細胞作為采用來自13個HIV+成年對象的全血通過流式細胞計數(shù)儀計數(shù)的CD4+T細胞數(shù)的函數(shù)。在800個細胞mL—1(n=ll)以下絕對CD4計數(shù)的實-驗數(shù)據(jù)的線性回歸表明兩種測量(虛線)之間具有很好的相關(guān)度。所述虛線表示兩者之間的理想相關(guān)度1:1。圖6A是表示表面4乾獲的CD4+T細胞的純/復作為絕^j"CD4-計數(shù)的函數(shù)的圖表。純度高于60%并且對于絕對CD4計數(shù)大于200個細胞pi/1來說相當一致。圖6B是表示線性裝置內(nèi)CD4+T細胞產(chǎn)量作為絕對CD4計數(shù)的函數(shù)。觀察到對于絕對CD4計數(shù)多達800個細胞p1/1而言具有相當一致的產(chǎn)量。繪制的虛線作為視覺指導。圖7A是具有多個平行腔室用于細胞分離的微流動裝置示意圖。圖7B和7C是與注射泵相連的裝置實例照片。圖7D是利用壓力驅(qū)動流從全血中自動化分離細胞的微流動站照片。圖8是具有兩個串聯(lián)的細胞捕獲腔室的微流動細胞分離裝置的照片。第一個腔室(上部)捕獲并去除雜質(zhì)細胞，提高第二腔室內(nèi)捕獲的細胞純度。圖9是捕獲的用Wright-Giemsa染色處理過的CD66b+粒細胞照片。沒有觀察到明顯的血小板雜質(zhì)。圖IO是表示從利用微流動腔室分離的嗜中性粒細胞中分離的RNA的典型電泳圖。從100|nL血液中分離出的嗜中性粒細胞中分離出總量為33ng的總RNA。RNA質(zhì)量非常好，表明了細胞捕獲與RNA提取技術(shù)的相容性。圖11是表示pMHC五聚體分子與微流動通道偶聯(lián)的示意圖。圖12是表示加載有A2-SL9抗原性肽的pMHC五聚體示意圖，由具有該抗原受體的CD8+T細胞所特異性識別，而非特異性CD8+T細胞(以及所有其它的細胞種群)將不與所述生物素化五聚體結(jié)合。圖13A和13B是表示利用涂布有加載有A2-SL9抗原性肽的pMHC五聚體的PDMS微流動裝置捕獲的以下物質(zhì)的純克隆種群的圖片(A)A2-SL9CD8+T細胞和(B)A2-IV9CD8+T細胞。圖14A-14C是全血中捕獲的細胞的照片。圖14D是表示觀察到圖14A-C中所示細胞的通道示意圖。圖14E是表示剪切應力作為距離的函數(shù)圖表，其來自用以測試實驗可變性的協(xié)調(diào)試驗的結(jié)果。利用相同的樣品在相同條件下進行兩次實驗。圖14F是表示附著細胞作為剪切應力的函數(shù)圖表，其中對比了全血和裂解RBC血液的捕獲效率。發(fā)明詳細說明總體來說，本發(fā)明重點提供了用于分離分析物(例如細胞)的方法、裝置和試劑盒。將含有目的分析物的樣品引入含有與該目的分析物相結(jié)合的部分的微流動裝置中。施加剪切應力，其大得足以防止非目的分析物的結(jié)合且小得足以使得目的分析物結(jié)合。一旦結(jié)合，就可以對目的分析物進行分析(例如計數(shù))。本發(fā)明還重點提供了用于確定分離目的分析物的剪切應力的方法。本發(fā)明的一個示例性實施方式中提供了在微流動模式下采用細胞親和層析的全血CD4十T淋巴細胞計數(shù)測定。所述裝置用用于親和選擇目的細胞的特異性抗體進行功能化。施加到微流動通道中的可控剪切應力允許從小體積樣品中相對于單核細胞和其它的白血細胞特異地和有效地選擇CD4+T細胞，所述小體積樣品和指尖采血相容。為了進行CD4計數(shù)，將IO^iL未處理的全血以控制流速注入微流動通道中，利用光學顯微鏡確定CD4+T細胞計數(shù)作為所有捕獲細胞數(shù)量?？倻y定時間少于IO分鐘。利用該方法準確計數(shù)CD4的一個關(guān)鍵因子在于細胞捕獲的特異性。為了達到該目的，我們采用具有固定抗體的細胞親和層析法，其進一步用BSA阻斷以減少非特異性結(jié)合(Amiji和Park.J.Biomater.Sci.Polym.Ed.4:217(1993))。由于CD4同樣在單核細胞上表達，我們使用剪切應力作為二次選擇步驟來排除單核細胞。我們發(fā)現(xiàn)CD4十T淋巴細胞和單核細胞對官能化裝置表面上的剪切應力反應不同，在1-3dyncirT2的窗口中淋巴細胞結(jié)合優(yōu)先發(fā)生，相比之下，單核細胞在較低的剪切應力發(fā)生最佳結(jié)合。在該窗口內(nèi)(1-3dyncm-2)的選擇性結(jié)合可能出于兩個原因。第一，與淋巴細胞相比，單核細胞表達表面CD4要低大約一個數(shù)量級，這減少了抗體-抗原相互作用的機會，特別是在動態(tài)流動的條件之下(Lee等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:5215(1999))。第二，單核細胞的大尺寸增加了作用在單個細胞上的剪切力(其與細胞直徑的平方大致成比例)，導致結(jié)合效力降低。這兩個因素使得淋巴細胞相對于單核細胞有不同的結(jié)合性質(zhì)?？煽氐募羟袘σ脖憩F(xiàn)出對有效的細胞捕獲很關(guān)鍵。捕獲效率通過延長的通道幾何形狀得到進一步提高，這增加了目標細胞與活性表面積之間的相互作用時間。在最佳、淋巴細胞結(jié)合窗口內(nèi)(l-3dyncm-2),施加在直徑10nm的細胞上的剪切力為~8-25pN。該數(shù)量級與單個抗體-抗原對的結(jié)合力大約相同(Harada等,Langmuir16:708(2000)和Hinterdorfer等,Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.93:3477(1996))。當剪切力大于該水平時，觀察到細胞粘著性降低了多達兩個數(shù)量級。該觀察結(jié)果意味著當目標細胞與所述表面相接觸時，通過形成單個抗體-抗原相互作用啟動了細胞-基板的連接(Tissot等，Biophys.J.61:204(1992)),而膜抗原的高密度將有利于這種相互作用的機率。有些令人驚訝的是，當剪切力降到低于ldyncn^時，粘著細胞的數(shù)量也有所下降。這種下降發(fā)生在用全血進行試驗時，而用裂解血時則不會(數(shù)據(jù)未示出)。我們相信，在低剪切應力范圍紅細胞對目標細胞結(jié)合的減少起著重要的作用。紅細胞已知在高于特定流速時引起毛細管內(nèi)白細胞流動邊集(margination)。(Goldsmith和Spain.Microvasc.Res.27:204(1984)以及Shevkoplyas等，Anal.Chem.77:933(2005))在我們的裝置中，邊集類似于將白細胞推到腔室的底面和頂面。在低流速下，邊集效應不占優(yōu)勢，全血中的紅細胞可占據(jù)大部分的官能表面并防止抗體-抗原相互作用。在裂解血中，細胞之間的相互作用大大降低，白細胞沉淀主要是通過沉降作用驅(qū)動，這在減少的流量下不會減少。在用來自健康供體的血液優(yōu)化了該單通道裝置之后(95%+的純度和90%+的產(chǎn)量)，用來自HIV感染對象的全血來測試其性能。我們發(fā)現(xiàn)，采用來自這些對象的樣品時裝置性能有略微的下降，這可能是出于多個原因。干擾HIV感染患者血清中可溶因子，如可溶CD4，(Peakman等，J.InfectDis.165:799(1992))可能損害了捕獲細胞的產(chǎn)量。其它可溶因子，包括細胞因子、趨化因子和免疫復合物(Trial等，J.Clin.Invest.95:1690(1995))可能影響血細胞的行為(Polo等,AIDS.13:447(1999),Vonsydow等，AidsRes.Hum.Retrov.7:375(1991),以及Clerici等，J.Clin.Invest.91:759(1993))。白細胞表面粘附分子也可能在HIV疾病進程中被改變，(Trial等，J.Clin.Invest.95:1690(1995)和Trial等,J.Immunol.173:2190(2004))這可能導致了我們的裝置中升高的非特異性結(jié)合。HIV感染對象中CD4+T細胞表面的改變，例如CD4受體的下調(diào)(Anderson等,J.Virol.67:4923(1993))和gpl20結(jié)合(Thali等,J.Virol.66:5516(1992))可能也會減少受體-抗體的相互作用并減少產(chǎn)量。因此，當來自HIV感染對象的樣品在所述線性腔室裝置中測試時，看到純度和產(chǎn)量都有所下降并不令人驚訝。盡管如此，從通過微芯片和通過流式細胞計數(shù)儀在200到800個細胞每mL的相關(guān)臨床范圍內(nèi)獲得的CD4計數(shù)中，觀察到線性相關(guān)的關(guān)系(Sato等，Adv.DrugDeliv.Rev.55:379(2003))。因此，所述微流動裝置可用于資源有限情況下的臨床決策和疾病監(jiān)測。純度和產(chǎn)量的進一步優(yōu)化應導致甚至更高的精度水平。用于CD4計數(shù)的微流動裝置應用相對于常規(guī)的流式細胞計數(shù)設備具有減少樣品體積、降低試劑使用、低制造成本、和便攜性的優(yōu)點。其采用直接體積方法并起著單平臺的功能。而且，測定中無需象單平臺流式細胞計數(shù)法和其它提議方法那樣添加試劑。與勞動密集型膠珠式測定和以前記載的微型化流式細胞設計(flowcelldesign)相比(Rodriguez等，PLoSMed.2:663(2005)),本發(fā)明的這種微流動CD4計數(shù)裝置直接解決了在大多數(shù)資源貧乏情況下面臨的樣品制備的問題。不需要樣品制備過程，例如裂解紅細胞、移液、或與抗體試劑混合，因此該裝置可用作自包含系統(tǒng)。在基于顯微計數(shù)的過程中，無須從CD4+T淋巴細胞中區(qū)分出單核細胞。基于在可控剪切應力下操作的微流動細胞親和性色譜法，我們證明了一種簡單、快速和廉價的CD4+T細胞計數(shù)裝置。據(jù)我們所知，這是CD4計數(shù)可以用指尖釆血的全血樣品進行的首個裝置，既不需要樣品處理也無須添加試劑。最小化的處理步驟、快速的操作、簡單的裝置以及高通量檢測潛能使得該方式成為在資源有限情況下管理HIV患者的有希望的候選方法。我們還注意到，CD4計數(shù)只是這種類型裝置的一種應用。利用與細胞親和色譜法相結(jié)合的剪切應力來高效分離特定細胞的證明可以應用到多種需要特定和有效分離細胞的應用中。此外，本發(fā)明的應用不僅限于細胞，也可應用于任何能夠與結(jié)合部分結(jié)合并可經(jīng)受適當剪切力的分析物。這類分析物包括顆粒，例如磁性的、陶資的、或塑料的，病毒，以及分子復合物，例如細胞器和脂蛋白復合物。I.分離分析物的方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明重點提供了用于分離細胞和其它分析物的方法和裝置。本發(fā)明的裝置是具有至少一個腔室的微流動裝置，所述腔室可以是微流動通道指定部分的一部分或整個通道。該腔室包含對目標分析物具有特異性的結(jié)合部分。通常，所述結(jié)合部分被置于所述通道壁上，但通道中也可以包括其它的結(jié)構(gòu)，例如柱子，以增加表面積。將含有目的分析物的樣品在剪切應力下施加，所述剪切應力優(yōu)選足夠低以使得目的分析物可以結(jié)合，但足夠高以防止非目的分析物結(jié)合，如上對CD4+細胞中所述。在一種實施方式中，所述腔室涂布有與目的細胞群體的細胞表面標記物相結(jié)合的結(jié)合部分。通過施加適當?shù)募羟袘Γ景l(fā)明的方法使得以特定濃度表達這些細胞表面標記物的細胞選擇性地分離。所施加的剪切應力優(yōu)選大到足以防止含有濃度低于目的細胞群體的所述細胞表面標記物的非目的細胞的結(jié)合以及其它的非特異性結(jié)合相互作用。本發(fā)明的方法使得樣品中例如50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的目的分析物如細胞被分離，同時滯留例如，少于20%、10%、5%、或1%的非目的分析物。此外，盡管結(jié)合的分析物被描述成"目的"而不結(jié)合的分析物被描述成"非目的"，但任一種或兩種類型的分析物在特定實驗中都可以是實際的目標。例如，本發(fā)明的方法可用于分離與所述裝置結(jié)合或者流過所述裝置的分析物。至少可以運用兩個變量來控制施加到所述通道上的剪切應力腔室的才黃截面積以及施加到腔室上的流體壓力。也可以運用其它的因素來控制使得目的分析物結(jié)合并防止非目的分析物結(jié)合所需的剪切應力的大小，例如，所采用的結(jié)合部分以及通道中結(jié)合部分的密度。所述腔室可包括多種類型的結(jié)合部分(例如1、2、3、4、5或更多)。多種結(jié)合部分可以與相同或不同的分析物結(jié)合，并且可以位于相同或不同的腔室中。例如，針對存在于目的細胞上的多種細胞表面標記物的結(jié)合部分可以設置在一個腔室中。在另一種實施方式中，本發(fā)明重點提供了串聯(lián)設置的腔室(例如2、3、4、5個或更多個腔室)。在該實施方式中，每個腔室分離一種或多種類型的細胞，其可以是或者不是目的細胞。當多個腔室串聯(lián)設置時，施加到每個腔室上的剪切應力可以不同(通過例如改變腔室的橫截面積來實現(xiàn))或者所述剪切應力可以相同。同樣，當多個腔室串聯(lián)設置時，每個腔室可以含有與不同細胞表面標記物或者相同細胞表面標記物結(jié)合的結(jié)合部分。當在不同腔室中采用相同的結(jié)合部分時，所述方法可用于連續(xù)地分離具有逐漸減少量的與結(jié)合部分結(jié)合的物質(zhì)的分析物。所述方法還可以用于并聯(lián)分離各種類型的分析物，例如通過使同一樣品的等分試樣通過多個單獨的裝置或包含多個并聯(lián)腔室的一個裝置。不同的樣品也可以并耳關(guān)測定。用于本發(fā)明方法中的裝置可以僅僅是連接有結(jié)合部分并能夠支持流體以所需剪切應力流動的微流動通道。所述裝置的幾何形狀將根據(jù)測試而定。裝置可以或者可以不包括允許光學或可視觀察所述腔室的區(qū)域。能夠產(chǎn)生所需剪切應力的流體泵也是本領域已知的。泵的實例包括注射泵、蠕動泵、真空泵。用于將泵偶聯(lián)到裝置上的方法是本領域已知的。所述裝置可以構(gòu)造成用于在任何給定腔室中提供基本上恒定的剪切應力或者在給定腔室中提供可變的剪切應力。示例性的裝置在本文中有所描述。本發(fā)明的裝置可以利用本領域已知的技術(shù)制造。所采用的制造技術(shù)將依賴于用來制作所述裝置的材料。制造技術(shù)的實例包括模制、光刻、電成型、和機械加工。示例材料包括玻璃、聚合物(例如聚苯乙烯、硅氧烷類如聚二甲基硅氧烷、環(huán)氧樹脂和尿烷)、硅和其它半導體、以及金屬。結(jié)合部分可以利用本領域已知的方法連接到腔室上。所采用的方法將依賴于所述結(jié)合部分和用來構(gòu)建所述裝置的材料。連接方法的實例包括到所述表面的非特異性吸附結(jié)合部分或者與所述結(jié)合部分連接或化學結(jié)合的化合物，例如通過自組裝單層或硅烷化學處理。本發(fā)明的裝置可以與流體、泵、和/或檢測器結(jié)合。裝置還可以結(jié)合試劑，例如裂解劑、標記試劑，以及使用說明書，例如針對疾病診斷的說明書。II.目標分析物表1提供了示例性的細胞群體，適用于本發(fā)明的方法和裝置的細胞表面標記物，以及從血樣中特異性地分離指定細胞的相應剪切應力。表l從全血中分離的血細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*來自健康供體的血液#來自患有m-iv期癌癥患者的血液適用于本發(fā)明方法和裝置的其它示例性細胞表面標記物列于表2中。細胞類型還包括疾病特異性T細胞，或者是CD4+或者是CD8+,其可以利用MHC肽單體、四聚體或五聚體作為結(jié)合部分來分離。適用載那:確定。除了表2中所列的細胞之外，、本發(fā)明也適用于;列二，分離人和動物的病原體(例如原生生物、細菌、和真菌)、胎兒細胞(例如有核紅細胞、羊膜細胞、和胚胎滋養(yǎng)層)、干細胞(胚胎或成人)、鐮刀形紅細月包、以及白細月包。表2細胞表面標記物<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>為了確定分離含目的細胞表面標記物的細胞的最佳剪切應力，可以將細胞樣品應用到基于Usami等人推導的方程(Murthy等，Langmuir.20:11649(2004)和Usami等，Ann.Biomed.Eng.21:77(1993))而設計的Hele-Shaw腔室中(例如列于圖1C中的裝置)。該裝置的腔室形狀使得沿著腔室軸向的剪切應力沿腔室長度方向線性下降。Hele-Shaw裝置可用于確定細胞連接到微流動裝置上的動力學，因為在不改變?nèi)肟诹魉俚那闆r下在各流動腔室中可以得到多個剪切速率。通過識別沿Hele-Shaw腔室軸向上目的細胞結(jié)合的最窄部位，利用上面所引用的方程可以計算出相應的剪切速率。III.結(jié)合部分適用于本發(fā)明裝置和方法的結(jié)合部分包括抗體、抗體片段(例如Fc片段)、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核苷酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。IV.使用方法除了從樣品中分離各種分析物的方法，本發(fā)明還提供了可以將所分離的分析物用于提供其它信息的方法。特別地，利用本發(fā)明方法和裝置所分離的細胞可以進一步利用本發(fā)明的其它方法來測定。在一種實施方式中，利用本發(fā)明方法和裝置分離的細胞進行了計數(shù)。細胞可以通過本領域已知的任何方法計數(shù)，包括光學，例如視覺觀察，自動計數(shù)，基于顯微鏡的4企測，以及FACS和電子計數(shù)，例如Coulter計數(shù)儀。利用本發(fā)明方法和裝置分離的細胞或者其它分析物的計數(shù)可用于診斷疾病、檢測疾病進展、以及監(jiān)測或確定治療效力。細胞或其它分析物的計數(shù)也可以用于非醫(yī)療應用中，例如，用于確定環(huán)境樣品(例如水、空氣和土壤)、藥物、食品或化妝品中的污染物的含量、存在或種類。許多疾病的特征在于含有特定細胞表面標記物(例如參見表2)的細胞異常水平。感染特定病原體的細胞也通常會表達獨特的細胞表面標記物，獨特的細胞表面標記物的組合，或者異常水平地表達細胞表面標i己物。在另一種實施方式中，利用本發(fā)明方法和裝置分離的細胞可以進行裂解，并且可以測量所述細胞或其部分的一種或多種性質(zhì)。可以在分離的細胞中測量的生物學性質(zhì)實例包括mRNA表達、蛋白質(zhì)表達和DNA定量。此外，通過本發(fā)明方法分離的細胞DNA可以進行測序，或者利用標準技術(shù)例如FISH或PCR可以識別特定的序列特征(例如多態(tài)性和染色體異常)。細胞和其它分析物的化學成分也可以在分離之后測定。V.實施例實施例1:CD4+T淋巴細胞的分離材料3-巰基丙基三曱氧基硅烷購自Gelest(Morrisville,PA)。乙醇(200標準強度)、載玻片(35x60mm，no.l),血細胞計數(shù)器和顯微載玻片取景器購自FisherScientific(FairLawn,NJ)。為了制造腔室，SU畫8光刻膠和顯影劑購自MicroChem(Newton,MA);珪氧烷彈性體和固化劑購自DowCorning(Midland,MI)。磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)購自Mediatech(Herndon，VA)。凍干牛血清白蛋白(BSA)購自AldrichChemicalCo.(Milwaukee,WI)。偶聯(lián)劑GMBS(N-，馬來酰亞胺丁酰氧基琥珀酰亞胺酯)和NeutrAvidin購自PierceBiotechnology(Rockford,IL)。生物素化鼠抗人抗CD4(13b8.2克隆)購自BeckmanCoulter(Somerset,NJ)。生物素化鼠抗人抗CD36(SMO克隆)購自Ancell(Bayport,MN)。AlexaFluorl488綴合鼠抗人CD4抗體(AF488抗CD4,289-14120克隆)、AlexaFluorl647-綴合鼠抗人CD3抗體(AF647抗CD3,289-13801克隆)以及4，-6-二脒基-2-苯基。引咮(DAPI)購自MolecularProbes(Eugene,OR)。藻紅蛋白(PE)綴合的鼠抗人CD14單克隆抗體(PE-抗CD14,M5E2克隆)購自BDBioscience(SanDiego，CA)。低聚甲醛購自ElectronMicroscopySciences(Hatfield,PA)。腔室設計與制造該工作中釆用了兩種類型的微流動裝置。第一種是基于Usami等人推導的方程(Murthy等，Langmuir.20:11649(2004)和Usami等，Ann.Biomed.Eng.21:77(1993))而設計的Hele-Shaw腔室(圖1C)。該腔室形狀使得沿著腔室軸向的剪切應力沿腔室長度方向線性下降。所制造的流動腔室高度為43±1nm,入口寬度和總長度分別為5mm和50mm。該Hele-Shaw裝置可用于研究采用健康供體血液時淋巴細胞連接到微型裝置的動力學，因為在不改變?nèi)肟诹魉俚那闆r下每個流動腔室中可以獲得多個剪切速率。第二種類型的裝置是直流通道(圖Id),其提供了沿通道長度方向的恒定剪切應力并具有2cn^的印記。所述通道的寬度、長度和高度分別為4mm、51mm和50±l|iim。所述直通道裝置用于實際細胞捕獲和計數(shù)試驗，其采用由Hele-Shaw試驗數(shù)據(jù)確定的工作剪切應力。所述裝置在PDMS中制造并永久粘合以利用標準清潔室技術(shù)來清潔載玻片。(Murthy等，Langmuir.20:11649(2004)和Usami等，Ann.Biomed.Eng.21:77(1993))。表面改性利用前面所述的方法對新制成的裝置進行改性。(Murthy等，Langmuir,20:11649(2004)和Usami等，Ann.Biomed.Eng.21:77(1993))。簡而言之，將所述腔室用乙醇中4%(v/v)的3-巰基丙基三曱氧基^s圭烷在室溫下預處理30分鐘，然后用乙醇中0.01mmolmL(Sato等，Adv.DrugDeliv.Rev.55:379(2003))的GMBS在室溫下溫育所述腔室15分鐘。之后，通過將所述腔室表面用10mgml"NeutrAvidin在PBS中的溶液在4。C溫育至少1小時來將NeutrAvidin固定到GMBS上。最后，10mgmL"(同前)在PBS中的生物素化抗CD4溶液在室溫下注入反應15分鐘，其中所述PBS含有l(wèi)%(w/v)BSA和0.09%(w/v)疊氮化鈉。在每個步驟之后，用乙醇或者PBS沖洗所述表面，根據(jù)前一步驟中所使用的溶劑而定，以沖掉未反應的分子。研究對象和血液制備/人Boston的MassachusettsGeneralHospital(MGH)征集HIV陰性的健康對象和感染HIV的對象。給所有對象提供書面通知同意書。在肝素或EDTA真空采血管(BectonDickinson)中通過靜脈穿刺采集5mL外周血樣品。所有樣品都在采血當天用于所述微流動裝置。通過如前面所述的標準臨床實驗操作步驟來對HIV感染對象進行CD4計數(shù)的平行測量。(Rodriguez等，PLosMed2:663(2005))。簡而言之，在醫(yī)院的臨床試馬全室中采用BectonDickinsonFACSCalibur上的標準4色流式細胞計數(shù)儀，并采用MultiTEST試劑和TruCOUNT膠珠處理患者樣品，利用MultiSET軟件分析以獲得CD4計數(shù)。孩i流體流動試馬全在用于開發(fā)所述微型裝置原型的試驗中，利用注射泵(HarvardApparatusPHD2000,Holliston,MA)將來自健康供體的300pi未處理全血以所需的剪切速率(5-40^1min—1)引入Hele-Shaw腔室中。選擇全血體積以使所述表面上的細胞粘附達到假穩(wěn)態(tài)，其中如同根據(jù)檢測粘附在所述表面上的細胞數(shù)量和由所述裝置出口收集的血樣所確定的那樣觀察不到明顯的捕獲細胞增加。在樣品輸送之后立即將含1%BSA(w/v)和ImM的EDTA的PBS以40mm"的速度流過所述腔室5min,以沖洗掉未結(jié)合的細胞。然后將細胞通過用1%的低聚曱醛溫育然后用含AF647-抗CD3/AF488-抗CD4/PE-抗CD14的抗體混合物溫育15min的方式固定在所述表面上。在用含1%(w/v)BSA和lmMEDTA的PBS沖洗去未結(jié)合的抗體之后，通過將取景器放在腔室下面并利用倒置顯微鏡(NikonEclipseTE2000,Nikon,Japan)在沿裝置軸的選擇位點處計數(shù)細胞，計數(shù)粘附細胞的數(shù)量。通過用針對CD14的抗體染色識別單核細胞，通過003+/。04+/。014-染色來識別CD4+T細胞的抗體，通過用DAPI染色或在相襯顯微鏡下直接觀察來測定粘附性有核細胞的總數(shù)量。每個位點進4于三次測量，對應于其附近三個1平方mm,并取平均值。利用熒光素、羅丹明和Cy5激發(fā)/發(fā)射過濾器以106放大率獲得圖像。之后通過用在PBS中的300nMDAPI在室溫下溫育表面連接的細胞5分鐘并用PBS沖洗來進行DAPI染色。手工或者利用ImageJ軟件(http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)對細胞進行計數(shù)。為了避免捕獲抗體和標記抗體之間的竟爭型結(jié)合，選擇CD4抗體來結(jié)合不同的表位。在用以測試CD4細胞計數(shù)裝置的試驗中，使10(til來自健康供體或HIV感染對象的全血以所需流速(1-20plmin-1)流到線形腔室中。在以20plmin"的流速沖洗之后，粘附到所述表面上的細胞被染色并采用與上面對Hele-Shaw裝置中所述的步驟類似的步驟進行計數(shù)。從裝置出口收集流過的樣品和沖洗緩沖液，裝到Eppendorf管中并離心以濃縮細胞用于流式細胞計數(shù)。流式細胞計數(shù)分析為了確定裝置從全血中去除目標細胞的效率，收集通過線性腔室裝置前后的樣品等份試樣并利用標準流式細胞計數(shù)儀分析以定量CD4+T細月包的百分含量。在FACSCalibur(BecktonDickinsonImmunocytometrySystem(BDIS),SanJose,CA)儀器上采用BDCellQuestPro軟件進行流式細胞計數(shù)測量。通過在流過所述微流動裝置制前后收集的樣品中CD3+CD4+T細胞的百分含量來估算所迷裝置的捕獲效率或產(chǎn)量。統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析用來自HIV陰性健康對象的血液進行試驗，在每種條件下在至少3個不同裝置中重復。圖2、3和4中所示的數(shù)據(jù)表示對這些裝置平均化的細胞計數(shù)或流式細胞計數(shù)測量，每個誤差條表示平均值的標準誤差。結(jié)果從全血中利用親和性分離化學法分離CD4+細胞的簡單裝置開發(fā)利用裝置的簡單性和準確性作為我們的關(guān)鍵目標，我們在我們的設計標準中確定了兩個關(guān)4建的因素在無標記微流動裝置中CD4+T細胞捕獲的特異性(純度)和效率(產(chǎn)量)。我們首先測試了抗CD4固定的、BSA阻斷的表面在捕獲具有CD4的細胞方面的特異性。圖2A表示了來自健康HIV陰性對象并粘附在抗CD4官能化表面上的全血的細胞的代表性重疊相襯圖像和抗CD4染色的熒光圖像。如圖所示，幾乎所有的捕獲細胞(密度~50-500個細胞mm-2)對于表面CD4抗原而言都是陽性染色。缺少特異性細胞捕獲抗體的對照裝置對全血表現(xiàn)出低1-2兩個數(shù)量級的細胞連接性(密度，5個細胞mm—2)。因此，看上去表面官能化方案能成功地從未標記全血樣品中專一性捕獲具有CD4的細胞。來自全血的單核細胞對CD4+T淋巴細胞的粘附性在循環(huán)細胞中，CD4分子存在于淋巴細胞和單核細胞上，其不能僅僅通過固定的抗CD4區(qū)分開。這可以在圖2B中觀察到，其中一些具有CD4的細胞(染成綠色)也由單核細胞標記物CD14染色。因此，為了單獨計數(shù)CD4+T細胞，必須采用二次選擇機制來排除單核細胞結(jié)合。為此我們使用剪切應力，這是考慮了單核細胞相對于CD4+T細胞具有較低的CD4表達水平，以及其尺寸的差異。為了研究剪切應力對單核細胞和淋巴細胞粘附性的影響，我們采用抗體官能化的Hele-Shaw裝置(圖1C),它可以在一次試驗中分析細胞在剪切應力范圍內(nèi)的粘附性。(Murthy等,Langmuir.20:11649(2004)和Usami等,Ann.Biomed.Eng.21:77(1993))。圖2C比較了0.15到5dyncm^的剪切應力范圍內(nèi)的單核細胞(空心圓)和CD4+淋巴細胞(實心圓)的粘附性圖表。CD4+淋巴細胞的最大粘附性出現(xiàn)在1到3dyncm^的剪切應力窗口中。在該區(qū)域內(nèi)，每平方毫米面積大概粘附了500個細胞。在該剪切應力窗口外CD4+T細胞的粘附性迅速下降。與淋巴細胞在抗CD4表面上的粘附性相比，單核細胞具有不同的剪切應力依賴性(圖2C中的小圖)。當剪切應力從0.3增加到0.7dyncnT2,單核細胞粘附性從大約40個細胞mm-2下降到大約5個細胞mm-2,而當剪切應力高于0.7dyncm-2時貝'H呆持孑氐于5個細月包mrn—2。我們還繪制了粘附到抗CD4表面的其它細胞的數(shù)量圖(粘附細胞總數(shù)減單核細胞和CD4+T細胞)(圖2C中實心三角)。在整個測試的剪切應力范圍內(nèi)，非特異性細胞數(shù)量保持在恒定的低水平上(<5個細胞mm-2)。當繪制裝置表面上的細胞組成圖時(圖2D),我們觀察到當剪切應力高于0.7dyncm時，表面捕獲的CD4+T淋巴細胞的純度高于95%(Chovan和Guttman.TrendsBiotechnol.20:116(2002))。在剪切應力低于0.7dyncm^時純度下降，這主要是由于在低剪切力條件下單核細胞的粘附性；在高于4dyncm々時純度也稍微有所下降。因此，剪切應力是一種區(qū)分CD4+T淋巴細胞和單核細胞的特異性粘附的強大工具。細胞計數(shù)裝置的研發(fā)和確定捕獲效率在開始的試驗中，我們證實了利用單克隆抗體官能化的表面在不同剪切應力下實施的對。04+T細胞高選擇性捕獲。接著，我們設計了在固定的剪切應力下用于有效分離CD4+T淋巴細胞的直型通道裝置，所述固定的剪切應力在針對純的CD4+T細胞捕獲而不摻雜單核細胞而最優(yōu)化的剪切應力范圍內(nèi)(圖ID)。該簡單裝置具有10pL的內(nèi)部容積，其用作樣品體積的計量機構(gòu)。該10jliL的體積可以方便地輸送從研究對象獲得的小體積樣品，并且樣品大小足以統(tǒng)計有效細胞計數(shù)。延長的腔室設計增加了血液與官能性表面的相互作用時間。我們在0.2-7dyncnT2的剪切應力范圍下將10全血注入所述線性裝置中，在流過所述腔室前后收集樣品，并通過流式細胞計數(shù)法分析它們以研究該裝置內(nèi)的捕獲效率。來自在1.7dyncm々的剪切應力流過所述裝置前后的血樣的淋巴細胞窗口的代表性象限分析數(shù)據(jù)如圖3A和3B中所示。在該代表性試驗中，CD4+T淋巴細胞(CD3+CD4+)占所有進入了所述微流動通道中的全部淋巴細胞的29.7%(圖3A);在選擇性捕獲之后，該分數(shù)下降到流出所述裝置的淋巴細胞的2.1%(圖3B),表明該剪切應力滯留了多于90%的目標CD4+T細胞在所述裝置內(nèi)。在不同的剪切應力下進行類似的試驗以研究所述線性裝置中剪切應力對CD4+T細胞捕獲效率(或產(chǎn)量)的影響(圖3C)。我們觀察到在所述線性腔室中1-3dyncm々的剪切應力窗口對CD4+T細胞捕獲是最佳的，與利用Hele-Shaw腔室獲得的結(jié)果相當(圖2C)。在該剪切應力窗口內(nèi)，分離了接近95%的CD4+T淋巴細胞，純度高于95%。在窗口之外，捕獲效率迅速下降到70-80%,并且純度也隨之下降(圖3C)。當我們估算在所述最佳窗口內(nèi)外的兩種剪切應力下操作時裝置中的細胞分布時，我們觀察到有助于解釋它們獨特捕獲效率機制的區(qū)別點(圖4)。在1.7dyncm^的剪切力，獲得95%的目標細胞，在離裝置入口10mm內(nèi)觀察到大約200個粘附細胞mm々的狹窄細胞密度峰值；在離入口更大的距離處該密度迅速下降到低于20個細胞111111-2。相比之下，在7dyncm-2的效率較低的剪切力下，整個腔室長度范圍內(nèi)表面捕獲細胞保持相對恒定的低密度。因此，簡單的抗CD4官能化裝置中的受控剪切流動促進了有效和特異性的CD4+T細胞捕獲。利用優(yōu)化的簡單微流動裝置對來自HIV感染對象的進行CD4計數(shù)在使用來自健康供體的血液確定了該裝置的最佳條件后，我們接著使用來自HIV+成人對象的樣品測試了該裝置。將十微升血樣以5min^的速度在兩分鐘內(nèi)引入，這對應于1.7dyncm々的剪切應力。接著，將緩沖液以20jiLminJ引入，這對應于7dyncm—2的剪切應力，以去除單核細胞和非特異性細胞。然后從粘附細胞的總數(shù)量來確定CD4計數(shù)，在相襯顯微鏡下手工計數(shù)，總測定時間在IO分鐘以內(nèi)。我們將來自我們的微型裝置的這些CD4計數(shù)與通過流式細胞計數(shù)并行處理的樣品所獲得的結(jié)果(圖5)進行了比較。對于通過流式細胞計數(shù)的CD4計數(shù)范圍在26到1428個細胞iiL"的13個成人研究對象，我們的結(jié)果表明在CD4計數(shù)分別多達800個細胞jxL"(n=ll,R2=0.93)時兩種方法之間具有密切的相關(guān)性。在CD4計數(shù)高于800個細胞pL—1時，所述微型裝置的細胞計數(shù)明顯低于通過流式細胞計數(shù)獲得的結(jié)果，這可能反映了腔室內(nèi)細胞結(jié)合的飽和度。為了證實這些發(fā)現(xiàn)，我們采用來自HIV感染對象的全血評估了所述線性裝置中CD4+T細胞的純度和產(chǎn)量(圖6A和B)。通過CD4+T細胞(CD3+CD4+)與捕獲細胞總數(shù)量(DAPI+)之比來計算純度(或捕獲特異性)；產(chǎn)量(或捕獲效率)定義為捕獲的CD4+T細胞與捕獲CD4+T細胞加上流動過程中損失的細胞的總和之比。在13個研究對象中，觀察到CD4計數(shù)直至800個細胞iiL"時具有一致的產(chǎn)量(>75%);在具有更高的絕對CD4計數(shù)患者中產(chǎn)量開始下降。CD4計數(shù)高于200個細胞jliL"時純度在60-90%范圍內(nèi)。當絕對CD4計數(shù)低于200個細胞jiL"以下時，觀察到較弱的捕獲特異性(20-50%)。不過，對于200個細胞jiL—2左右的CD4計數(shù)觀察到清晰截止，這用于臨床區(qū)分有關(guān)的CD4計數(shù)閾值。我們還觀察到>90%的非目的細胞為單核細胞(數(shù)據(jù)未示出)，其在HIV感染的情況下中可能比來自未感染血液的單核細胞更多地粘附到抗CD4官能化表面上。實施例2:捕獲腔室的設置使用平面的微流動腔室(圖7)來從全血中分離各種目標細胞(表1)。特異性細胞捕獲的原理是將特異性抗體、裝置內(nèi)良好受控的剪切應力條件、和有效的表面鈍化以防止不需要的細胞非特異性結(jié)合進行組合。在優(yōu)化之后，細胞捕獲的純度可以高達99%,捕獲產(chǎn)量高達80%。一種在不利情況下提高純度的方法依賴于使用串聯(lián)的分離腔室(圖8),其中第一腔室去除掉如若不去除會污染第二腔室中目的樣品的細胞。所捕獲的細胞可以利用標準顯微鏡成像(圖9)、計數(shù)、提取RNA和蛋白質(zhì)(圖10)以用于進一步的分析。實施例3:HIV特異性CD8T細胞分離我們開發(fā)了涂布有pMHCI類五聚體的PDMS微流動裝置用以捕獲疾病特異性的CD8+T細胞(圖11)。在我們的試驗中，我們使用了軟光刻技術(shù)和SU-8制造技術(shù)在PDMS模內(nèi)形成微通道。然后在其不可逆密封到一起之前將所述PDMS模和二氧化硅基板暴露于氧等離子處理下。然后用無水乙醇中的3-巰基三曱氧基硅烷處理PDMS和二氧化硅表面上的羥基，從而形成疏醇末端基團。在用無水乙醇洗去未反應的硅烷溶液之后，用無水乙醇中的異雙官能交聯(lián)劑GMBS沖洗所述PDMS裝置，在此過程中硅烷上的硫醇基與GMBS的馬來酰亞胺區(qū)域特異并共價地反應。這留下了GMBS的琥珀酰亞胺殘基可供蛋白質(zhì)連接，并且在用lxPBS(pH7.4)沖洗掉未反應的GMBS之后，將NeutrAvidin溶液(PBS中)引入通道，使得GMBS琥珀酰亞胺基與NeutrAvidin的末端氨基相結(jié)合。在用lxPBS(pH7.4)沖洗掉未反應的NeutrAvidin之后，將生物素化的加載有A2-SL9抗原性肽(顯性HIVgag表位)的pMHCI類五聚體引入所述裝置中。然后用lxPBS(pH7.4)(具有1%的BSA(w/v))沖洗所述裝置以便沖掉未反應的pMHC五聚體并最小化與通道表面的非特異性細胞相互作用(圖12)。在將所述裝置適當?shù)卦O置成用于細胞捕獲試驗后，我們培養(yǎng)兩個克隆的CD8+T細胞系---個特異性地針對HIVA2-SL9(SLYNTVATL)肽，另一個特異性地針對不相關(guān)的A2-IV9(ILKEPVHGV)肽。在MHCI類分子環(huán)境下識別這些肽的T細胞存在于大多數(shù)感染了HIV的個體中。我們將500,000個A2-SL9CD8+T細胞(125微升，濃度為4X106個細胞/ml)以2pl/min的流速引入用A2-SL9加載的pMHC五聚體官能化處理的PDMS微流動裝置中。作為陰性對照，將特異性識別A2-IV9的T細胞引入具有相同規(guī)格的相同裝置中。用lxPBS沖洗所述裝置以去除通道表面上未連接的細胞，然后用1%的PFA溶液固定并在成^象前用DAPI溶液熒光染色(圖13)。我們觀察到具有A2-SL9CD8+T細胞的裝置中有高度的特異性捕獲，而引入了A2-IV9特異性CD8+T細胞的裝置中觀察到低水平的非特異性T細胞捕獲。特異性T細胞的結(jié)合很有效，這由通道中缺乏單層細胞覆蓋來證實。這套試^r證明了疾病特異性的T細胞可以利用pMHC復合物作為捕獲劑來在微流動通道中分離。這些裝置可應用于疾病診斷，或者用于需要識別疾病特異性T細胞的研究中，例如監(jiān)測疫苗效價。實施例4:利用抗EpCAM抗體捕獲胂瘤細胞剪切應力在細胞捕獲中起著重要作用。最佳剪切應力應當施加以4吏得能夠以足夠高的流速捕獲最大數(shù)量的癌細胞。為了找出最佳流速，我們利用沿腔室具有可變寬度和恒定高度的平坦微流動腔室研究了剪切應力對細胞捕獲的影響。圖14中所示的這些腔室的幾何形狀使得剪切應力沿著腔室長度方向線性改變(圖14E),從而可以研究給定流速下寬范圍的剪切應力。將培養(yǎng)的肺癌細胞加入PBS溶液中，然后以恒定的流速通過用EpCAMAb官能化的Hele-Shaw腔室。隨著剪切應力沿著通道降低，粘附到所述表面上的細胞密度增加(圖14A-14C)。剪切應力對通過EpCAM抗體-抗原結(jié)合的細胞粘附性的影響繪制于圖14F中，其表明8dyn/cm2是最佳的剪切速率，導致捕獲200個細胞/mm2的官能化的4翁獲表面。其它實施方式上述說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請這里均引入作為參考。所述本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的各種修飾和改變方式對于本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并沒有背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明是結(jié)合特定實施方式進行描述的。但應當明白本發(fā)明如所要求的那樣不應不適當?shù)叵拗朴谶@些特定的實施方式。的確，所描述的對本領域技術(shù)人員顯而易見的實施本發(fā)明的方式的各種變形都打算包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。其它實施方式在權(quán)利要求中。權(quán)利要求1.一種用于從樣品中分離目的細胞的方法，包括(a)將所述樣品引入含有對所述目的細胞具有特異性的結(jié)合部分的微流動裝置；(b)使得所述樣品中的目的細胞與所述結(jié)合部分結(jié)合；以及(c)向所述微流動裝置施加剪切應力以使目的細胞保持結(jié)合而非目的細胞不結(jié)合。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合部分選自以下組抗體、抗體片段、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核苷酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述樣品是血樣。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述目的細胞選自以下組嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、循環(huán)胂瘤細胞、HIV感染的CD8淋巴細月包、循環(huán)內(nèi)皮細胞和血小板。5.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述結(jié)合部分結(jié)合CD66、CD14、CD4、CD8、EpCAM、E選擇蛋白、或P選擇蛋白。6.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述目的細胞為CD4+淋巴細胞，所述結(jié)合部分是抗CD4抗體。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述樣品來自具有AIDS發(fā)展風險的患者。8.權(quán)利要求l所述的方法，進一步包括(d)分析所述目的細胞的至少一種生物學性質(zhì)。9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述生物學性質(zhì)選自以下組mRNA表達、蛋白質(zhì)表達、DNA定量、DNA定序、和染色體異常。10.權(quán)利要求l所述的方法，進一步包括(d)計數(shù)所述目的細胞。11.權(quán)利要求6所述的方法，進一步包括(d)計數(shù)所述CD4+淋巴細月包。12.權(quán)利要求ll所述的方法，利用所述計數(shù)來診斷疾病狀態(tài)。13.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述步驟(b)和步驟(c)同時進行。14.一種用于從樣品中分離目的細胞的方法，包括(a)將所述樣品引入含有對第一目的細胞具有特異性的第一結(jié)合部分的微流動裝置，其中所述第一結(jié)合部分置于第一腔室中；(b)使得所述樣品中的所述第一目的細胞與所述第一結(jié)合部分結(jié)合；(c)向所述微流動裝置施加第一剪切應力以使所述第一目的細胞保持結(jié)合而其它細胞不結(jié)合；(d)使剩余樣品流入所述微流動裝置的第二腔室中，其中所述第二腔室含有針對第二目的細胞的結(jié)合部分；(e)使得所述樣品中的所述第二目的細胞與所述第二結(jié)合部分結(jié)合；以及(f)向所述第二腔室施加第二剪切應力以使所述第二目的細胞保持結(jié)合而非目的細胞不結(jié)合。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一結(jié)合部分選自以下組抗體、抗體片段、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核苦酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第二結(jié)合部分選自以下組抗體、抗體片段、寡肽或多肽、核酸、細胞受體、配體、適配體、MHC肽單體或寡聚體、生物素、抗生物素蛋白、寡核苷酸、配位復合物、合成聚合物以及碳水化合物。17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第一剪切應力和所述第二剪切應力不同。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一結(jié)合部分和所述第二結(jié)合部分相同。19.一種用于分離目的細胞的試劑盒，包括腔室；以及(b)用于產(chǎn)生剪切應力的泵，以使所述目的細胞優(yōu)先于非目的細胞結(jié)合。20.權(quán)利要求19的試劑盒，進一步包括對所述目的細胞具有特異性的標記試劑。21.權(quán)利要求19的試劑盒，進一步包括用于AIDS診斷的說明書。22.用于確定施加在裝置上的用于分離目的細胞的剪切應力的方法，所述方法包括(a)將含有所述目的細胞的樣品引入到微流動裝置的腔室中，所述腔室含有對所述目的細胞具有特異性的結(jié)合部分；(b)使得所述樣品中的目的細胞可以結(jié)合到所述結(jié)合部分；(c)向所述微流動裝置施加剪切應力，其中所述剪切應力沿著所述腔室的長度變化；和(d)確定如下剪切應力在所述剪切應力處，所述目的細胞和其它細胞相比優(yōu)先結(jié)合到所述結(jié)合部分上。全文摘要本發(fā)明重點提供了用于分離分析物(例如細胞)方法、裝置和試劑盒。將含有目的分析物的樣品引入含有與所述目的分析物結(jié)合的部分的微流動裝置中。施加剪切應力，其大到足以防止非目的分析物結(jié)合并小到足以使得目的分析物結(jié)合。一旦結(jié)合，就可以對目的分析物進行分析(例如計數(shù))。本發(fā)明還重點提供了用于確定用于分離目的分析物的剪切應力的方法。文檔編號G01N15/06GK101443660SQ200780017396公開日2009年5月27日申請日期2007年3月15日優(yōu)先權(quán)日2006年3月15日發(fā)明者D·艾里米亞,M·托納,U·德米爾奇,W·羅德里格斯,X·程申請人:綜合醫(yī)院公司