專利名稱：：測量人巨蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及測量人巨蛋白(megalin)的方法。更詳細地說，本發(fā)明涉及檢測人巨蛋白的方法，其包括對觀測到巨蛋白表達的細胞、組織和器官中的局部而特異地表達的巨蛋白，以快速而簡單的方式進行定量檢測，從而能夠直接和早期診斷細胞、組織和器官受影響的程度，并且通過治療改善病狀和預(yù)后并防止其惡化。本發(fā)明可用于診斷其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病，如腎病或肺病。背景材料1.巨蛋白的克隆1982年，作為對Heymann腎炎(其為實驗?zāi)ば阅I病的模型)病因抗原的研究結(jié)果，Kerjaschki,D.和Farquhar,M.G.鑒定了一種細胞膜蛋白質(zhì)-gp330(KerjaschkiD.，F(xiàn)arquharM.G.，1982，Proc.Natl.Acad,Sci.U.S.A.，79,5557-5561)。1994年，Saito,A.等測定了大鼠gp330的完整一級結(jié)構(gòu)，并將其命名為巨蛋白，因為它是脊推動物中已克隆的最大細胞膜蛋白質(zhì)(SaitoA.等，，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91，9725-9729)。2.巨蛋白表達4立點巨蛋白也被稱為糖蛋白330(gp330)或低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白2(LRP-2)。它是分子量約600kDa的糖蛋白，在腎近端小管上皮細胞中表達，也在其它組織和細胞如II型肺泡細胞、精巢、子宮內(nèi)膜、胎盤、或內(nèi)耳上皮、腎上皮、生殖卵黃腺和神經(jīng)外胚層(參見ChristensenE.I.，Willnow,T.E.，1999;J.Am.Soc.Nephrol.10，2224-2236;JuhlinC.，KlareskogL.等,1990,J.Biol.Chem.265,8275-8279;和ZhengG,McCluskeyR.T.等,1994，J.Histochem.Cytochem.42,531-542)。在腎臟，巨蛋白作為內(nèi)吞受體，與排尿前近端腎小管的內(nèi)吞和蛋白質(zhì)重吸收等相關(guān)聯(lián)。重吸收的蛋白質(zhì)等隨后被溶酶體降解(參見MausbachA.B.，ChristensenE.I.,1992,HandbookofPhysiology:RenalPhysiology,Windhager,editor,NewYork,OxfordUniversityPress,42-207)。3.巨蛋白的核苷,列巨蛋白是一種糖蛋白，其表達最常見于哺乳動物腎近端小管上皮細胞膜上。其cDNA編碼序列與Korenberg,J.R.等(1994)公開的基因登錄號U04441的人巨蛋白cDNA序列或Hjaeln,G.等(1996)公開的基因登錄號U33837的人巨蛋白cDNA序列(參見KorenbergJ.R.等，1994,Genomics22,88-93;和HjalmG.等，1996,Eur.J.Biochem.239，132-137)有核苷酸同一性。此外，Saito等(1994)已公開了與人巨蛋白具有同源性的大鼠巨蛋白，其基因登錄號L34049的cDNA序列也已被公開(參見SaitoA.等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,9725-9729)。4.巨蛋白的氨基臥^f列和蛋白結(jié)構(gòu)巨蛋白是一種巨大的細胞膜蛋白，由4,655個氨基酸(就人巨蛋白而言)或4,660個氨基酸(就大鼠而言)組成。由氨基酸序列推算的分子量為約520kDa,含有糖^隨時可能高達約600kDa(參見SaitoA.等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91，9725-9729)。巨蛋白屬于LDL受體基因家族，其巨大的胞外區(qū)有4個功能域，胞外區(qū)通過單一跨膜區(qū)與小的胞內(nèi)區(qū)相連。巨蛋白主要存在于腎小球的披網(wǎng)格蛋白小窩(大鼠)，或近端小管的上皮管腔膜(luminalmembrane)(腎小球上皮細胞的管腔膜和基底膜)、II型肺泡細胞、附睪腺、曱狀腺、甲狀旁腺、卵黃嚢膜、內(nèi)耳、小腸或脈絡(luò)膜，因此，它與細胞攝入不同配體及其代謝相關(guān)(參見FarquharM.G.等，1995,J.Am.Soc.Nephrol,6,35-47;和ChristensenE.I.等，2002,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3,256-266)。巨蛋白敲除小鼠會發(fā)生低分子量蛋白尿、骨代謝紊亂、呼吸衰竭、腦畸形和其他疾病(參見WillnowT.E.等,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,8460-8464)。在線蟲(秀麗隱桿線蟲(C.e/eg"m))中也存在巨蛋白同源物，其生物學重要性也已4皮暗示(參見YochemJ.等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90，4572-4576)。5.作為腎炎起因的巨蛋白的重要性巨蛋白為實驗?zāi)ば阅I病(Heymann腎炎)的主要致病抗原，是一種上皮清道夫受體，其生物學和病理學作用已被闡明。用動物模型來闡明人膜性腎病發(fā)展的機制已有很長時間，大鼠Heymann腎炎就是膜性腎病的一種模型。與其它任何模型相比，對Heymann腎炎的分析取得了更大進步。SaitoA.等公開了對Heymann腎炎的病理學表位和配體結(jié)合域的分析結(jié)果，他們還展示了巨蛋白的主要抗原區(qū)和巨蛋白上對結(jié)合配體有主要貢獻的功能域(參見KerjaschkiD.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89,11179-11183;SaitoA.,FarquharM.G.等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93，8601-8605;YamazakiH.,FarquharM.G.等,1998,J.Am.Soc.Nephrol.9,1638-1644;和OrlandoR.A"FarquharM.G.等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,2368-2373)。6.巨蛋白的各種配體在體內(nèi)，巨蛋白在近端小管上皮細胞的管腔側(cè)表達最豐富。在人類腎臟，在近端小管上皮細胞以外的部位(包括在腎小球)未觀察到巨蛋白的表達。巨蛋白通過內(nèi)吞作用將由腎小球過濾的各種配體(例如低分子量蛋白或藥物)攝入細胞中，并將他們運輸?shù)饺苊阁w，之后它們通過再循環(huán)重新呈現(xiàn)在細胞表面(參見FarquharM.G.等，1995，J,Am.Soc.Nephrol.6,35-47;和ChristensenE.L等，2002,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3,256-266)。此外，巨蛋白與從管腔面向基底膜側(cè)的轉(zhuǎn)胞吞作用有關(guān)。巨蛋白還與結(jié)合蛋白(如維生素A、維生素B12和維生素D)的攝入和代謝有關(guān)(參見ChristensenE.I.等2002，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3,256-266)。Christensen和Willnow證實巨蛋白介導(dǎo)三種維生素載體蛋白-維生素D結(jié)合蛋白(DBP)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)和鈷胺傳遞蛋白(TC)以及與此相關(guān)的維生素即(OH)維生素25D3、維生素A0見黃醇)和維生素B,2的重吸收(參見ChristensenE.I"WillnowT.E.，1999,J.Am.Soc.Nephrol.10,2224-2236)。SaitoA.等證實，瘦蛋白(其由脂肪細胞分泌，在肥胖患者的血液中水平增加)作為巨蛋白的配體^皮近端小管上皮細胞攝入并代謝(參見SaitoA.,GejyoF.等，2004,Endocrinology.145,3935-3940)。脂肪細胞(也就是積累的內(nèi)臟脂肪)可導(dǎo)致復(fù)合性病理病癥，即代謝綜合癥。瘦蛋白為由脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，在代謝綜合癥患者的血液中水平增加。有研究認為，腎臟是血液中瘦蛋白最有可能積累的器官，而且瘦蛋白展現(xiàn)了腎病的作用(參見TarziR.M.LordG.M.等，2004,Am.J.Pathol.164，385-390)。還在近端小管和收集管之間的區(qū)域(位于巨蛋白發(fā)揮功能的區(qū)域的下游)發(fā)現(xiàn)了所謂的瘦蛋白受體。術(shù)語"代謝綜合癥，，被定義為內(nèi)臟肥胖、血壓升高、高脂血癥、糖耐量低減和其他癥狀的疾病并發(fā)癥，其主要的危險因素是胰島素抵抗。該病癥非常有可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化癥和蛋白尿癥的發(fā)生，并可能導(dǎo)致有腎小球及腎小管肥大的組織學特征的腎病發(fā)生。當這種狀況結(jié)合明顯的糖尿病時，就會進一步出現(xiàn)高血糖特征，表現(xiàn)出糖尿病性腎病，這種病狀還可能會進一步變得嚴重。n型糖尿病基本上是在代謝綜合癥之前或同時發(fā)生。因此，腎病的特征可以包含與代謝綜合癥相關(guān)的腎病。SaitoA.等用源自大鼠卵黃嚢上皮的細胞(L2細胞，巨蛋白在其中有高水平表達)進行了一項實驗，發(fā)現(xiàn)抗巨蛋白抗體可以顯著抑制L2細胞對125I標記的AGE(漸進性糖化終產(chǎn)物)(來自葡萄糖)的攝入。因此，他們證明了，巨蛋白與該攝入途徑關(guān)聯(lián)(參見SaitoA.GejyoF.等,2003，J.Am.Soc.Nephrol.14,1123-1131)。作為糖尿病性腎病發(fā)生的機9制，漸進性糖化終產(chǎn)物(AGE)通過美拉德反應(yīng)與糖化和修飾型蛋白質(zhì)的相關(guān)性已經(jīng)有報道。血液中低分子量的AGE由腎小球過濾，被近端小管上皮細胞重吸收和代謝。如果腎病的進一步發(fā)展，則更高分子量的AGE也被腎小球過濾，在近端小管上皮細胞中積累，而施加超量的代謝負荷。進一步，SaitoA.等還表明，除了葡萄糖之外，巨蛋白還與細胞對由曱基乙二醛、甘油醛、乙醇趁衍生的AGE的攝入有關(guān)。此外，代謝綜合癥往往伴隨肝病，如脂肪肝。在肝臟中大量存在的肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)被釋放到健康人的血液中。在肝病時，更多的L-FABP被釋放，血液中含量增加。SaitoA.等也表明，血液中的L-FABP被腎小球迅速過濾，并借助巨蛋白被近端小管上皮細胞重吸收(參見TakedaT"GejyoF"SaitoA.等，2005,Lab.Invest.85，522-531)。7.與巨蛋白相互作用的功能性蛋白為了闡明巨蛋白在細胞中的運輸機制，研究了與巨蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的銜接分子，已鑒定出各種蛋白，如Dab2、ANKRA、MAGI-1、GAIP、GIPC、Ga3、MegBP和ARH(參見OleinikovA.V.等，2000,Biochem.J.347,613-621;RaderK.，F(xiàn)arquharM.G.等，2000，J.Am.Soc.Nephrol.11,2167-2178;PatrieK,M.,MargolisB.等,2001,J.Am.Soc.Nephrol.12，667-677;LouX.,FarquharM.G.等，2002,J.Am.Soc.Nephrol.13,918-927;PetersenH.H.,WillnowT.E.，2003,J.Cell.Sci.116,453-461;和TakedaT.,FarquharM.G.等,2003，Mol.Biol.Cell.14,4984—4996)。通過這些分子，巨蛋白與內(nèi)吞或轉(zhuǎn)胞吞關(guān)聯(lián)，也和與此相關(guān)的信號傳遞關(guān)聯(lián)。此外，在近端小管上皮細胞中，巨蛋白的功能還與一種細胞膜受體即cubilin相結(jié)合，以進一步參與細胞對各種配體的攝入(參見SaitoA.等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,9725-9729)。例如，cubilin是直接結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白、內(nèi)源性維生素B,2等的受體，而巨蛋白間接參與了對它們的內(nèi)吞作用。此外，已知在近端小管上皮細胞中巨蛋白與Na+-H"交換轉(zhuǎn)運蛋白同種型310(Natl^exchangerisoform3，NHE3)相互作用(參見BiemesderferD.等，1999，J.Biol.Chem.274，17518-17524)。NHE3是在Na+的重吸收中起重要作用的一種反向轉(zhuǎn)運蛋白，NHE3還影響一種巨蛋白對配體的攝入(參見HryciwD.H.等,2004，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.31，372-379)。巨蛋白還可能涉及NHE3的失活和代謝。在糖尿病性腎病或代謝綜合癥相關(guān)性腎病的早期，腎小球濾過變?yōu)檫^量。推導(dǎo)其首要原因是近端小管上皮對Na+重吸收增強(參見VallonV.等2003,J.Am.Soc.Nephrol.14,530-537)，NHE3在這種情況下發(fā)揮了關(guān)4建作用，NHE3被巨蛋白失活和代謝被認為與此有關(guān)(參見HryciwD.H.等，2004，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.31，372-379)。8.巨蛋白尿排泄和巨蛋白配體尿排泄的相關(guān)性Leheste等揭示，巨蛋白敲除小鼠和近端小管功能減弱的范可尼(Fanconi)綜合癥患者將經(jīng)歷尿中蛋白質(zhì)和視黃醇的排泄增加(參見LehesteJ.等，1999，Am.J.Pathol.155,1361-1370)。此外，MoestrupS.K.等表明，范可尼綜合癥患者尿中排出的巨蛋白量顯箸低于健康個體的排出量。這導(dǎo)致巨蛋白功能和在近端小管中表達的削弱，從而增加排泄在尿中的含視黃醇結(jié)合蛋白的腎小球濾過蛋白的量(參見AnthonyG.W.,MoestrupS.K.等，2002,J.Am.Soc.Nephrol.13,125-133)。9.通過使用尿毒癥模型和器官再生模型的實驗發(fā)現(xiàn)巨蛋白功能的重要性如上所述，巨蛋白參與將各種低分子量蛋白質(zhì)攝入近端小管上皮細胞并且參與其代謝。當病理病癥發(fā)展為腎衰竭時，代謝機制被擾亂，低分子蛋白質(zhì)因此在血液和組織作為尿毒癥蛋白積累。其代表性例子是卩2-微球蛋白(p2-m),它可能導(dǎo)致長期透析患者的透析相關(guān)性淀粉狀蛋白病(參見GejyoF"SchmidK,等，1985,Biochem.Biophys.Res.Commun.129,701-706)。上述AGE由于其在腎衰竭或透析患者的血中積累，也被認為是動脈粥樣硬化或器官衰竭的病因，并且AGE被認為是一種類型的尿毒癥蛋白(參見HenleT.,MiyataT.，2003,Adv,Ren.ReplaceTher.10,321_331)。此外，瘦蛋白在透析患者的血中積聚，因此被認為與營養(yǎng)不良或免疫妥協(xié)有關(guān)。TabataY.和GejyoF.等公開了利用巨蛋白功能的尿毒癥蛋白代謝沖莫式的效果和有效性(參見SaitoA.:TabataY.,GejyoF.等，2003,J.Am.Soc.Nephrol.14,2025-2032和WO02/091955)。即，巨蛋白表達細胞在體內(nèi)被移植作為支架蛋白，從外周血管(新生血管)滲漏的低分子量蛋白在巨蛋白的幫助下被攝入細胞以進行代謝。用于移植的巨蛋白表達細胞(即卵黃嚢上皮來源的L2細胞)在巨蛋白幫助下攝入和代謝卩2-m(參見SaitoA.,TabataY"GejyoF.等，2003，J.Am.Soc.Nephrol.14，2025-2032)。將皮下移植了L2細胞的棵鼠的兩個腎臟摘除，誘導(dǎo)腎衰竭病癥，測定移植組織塊和器官中經(jīng)腹腔注射的^I標記p2-m的細胞4聶入。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其它器官比辟支，移植了L2細胞的細胞塊更顯著地攝入125I標記的(32-m;并且發(fā)現(xiàn)，與無L2細胞移植的對照組比較，在L2細胞移植組中125I標記(32-m的清除有顯著加強(參見SaitoA"TabataY"GejyoF.等，2003,J.Am.Soc.Nephrol.14,2025-2032)。10.巨蛋白的蛋白水解和尿排泄近年來，已經(jīng)提出了巨蛋白在Notch樣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中被蛋白水解的可能性(參見ZouZ.，BiemesderferD.等"2004,J.Biol.Chem.279,34302-34310;和GrigorenkoA.P.等，2004,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,14955-14960)。這還包括一個兩步切割系統(tǒng)由金屬蛋白酶介導(dǎo)的外結(jié)構(gòu)域的脫落和y-分泌酶介導(dǎo)的膜內(nèi)蛋白水解。此外，已知巨蛋白在II型肺泡細胞中表達。因此，巨蛋白與器官(如腎臟)代謝的相關(guān)性已被廣泛地研究。然而，器官(包括腎臟)的疾病和巨蛋白間的相關(guān)性尚未被闡明，巨蛋白迄今為止，作為檢測巨蛋白的方法，業(yè)已知曉使用多克隆抗體的組織染色法或免疫印跡法，其中該多克隆抗體通過對免疫動物(如兔子)免疫而獲得。但是，該技術(shù)涉及到細胞或借助電泳分離的蛋白的染色，這需要非常復(fù)雜的程序，并需要長時間來固定組織、準備組織切片、電泳并轉(zhuǎn)移到膜上。因此，它難以定量巨蛋白。從診斷組織或器官的功能紊亂(尤其就腎病而言)程度的角度看，沒有以特異性且簡單的方式來診斷腎小管衰竭的有效方法。目前，已使用了許多診斷方法，檢測尿液或血液中的白蛋白、肌肝、(32-微球蛋白、L-FABP等作為腎病的診斷標志。但是，這些診斷標志并非源自腎組織，它們僅僅緣于在腎臟腎小球濾過和腎臟腎小管重吸收過程中的所有現(xiàn)象和功能。也就是說，即使使用這種標志，也難以鑒別腎臟的腎小球衰竭與腎小管衰竭。此外，這種標志是一種來自腎臟以外的器官的間接標志。因此，對疾病早期診斷的有效性差。這同樣適用于KL-6(急性炎癥的標志物)，KL-6是現(xiàn)有的肺病(特別是炎癥)診斷標志。本發(fā)明的公開內(nèi)容本發(fā)明提供了測量人巨蛋白的方法，與傳統(tǒng)技術(shù)比較，這種方法可以在較短的時間以較筒單方法完成，而且還可以定量人巨蛋白。本方法還使得能夠在早期以定點方式診斷功能疾病，這種方法對細胞、組織或器官是特異性的。特別是，本發(fā)明提供了一種測定尿中巨蛋白水平以一企測腎病的方法。如上所述，已有許多關(guān)于人巨蛋白的報道，并已提示其與器官(如腎或肺)代謝的相關(guān)性。然而，目前還不了解在器官功能受損時巨蛋白表達變化的方式和巨蛋白流行性改變的方式。本發(fā)明人在用快速方式高靈敏度測定人巨蛋白的方面進行了大量研究。他們因此發(fā)現(xiàn)了一種方法，使用能與人巨蛋白結(jié)合的配體，尤其是抗人巨蛋白抗體，可以準確測量體液樣本(如尿)中的巨蛋白。進一步，本發(fā)明人測定了器官功能受損患者體液中的人巨蛋白，發(fā)現(xiàn)人巨蛋白可能是檢測和診斷器官疾病的標志。這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。具體來說，本發(fā)明如下。使用結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體發(fā)生反應(yīng)，使樣本與能結(jié)合人巨蛋白的第二配體發(fā)生反應(yīng)，對因該樣本中的人巨蛋白與能結(jié)合人巨蛋白的配體形成復(fù)合物而被結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第二配體進行測定。按照[l]所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其包括以下兩個步驟結(jié)合于固體支持物上的能與人巨蛋白結(jié)合的第一配體與樣本之間的反應(yīng)，以及隨后的能與人巨蛋白結(jié)合的第二配體與樣本之間的反應(yīng)。按照[l]所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體與樣本之間的反應(yīng)以及能結(jié)合人巨蛋白的第二配體與樣本之間的反應(yīng)是在一個的步驟中進行。按照[1]至[3]中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體都是抗體。按照[1]至[3]中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體是特異地針對人巨蛋白的糖鏈的凝集素，而能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是抗體。按照[1]至[3]中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體是抗體，而能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是特異地針對人巨蛋白糖鏈的凝集素。按照[1]至[6]中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其14中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和/或能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是選自下列物質(zhì)維生素結(jié)合蛋白，其為鈷胺傳遞蛋白-維生素B12、維生素D結(jié)合蛋白或視黃醇結(jié)合蛋白；脂蛋白，其為載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/蔟蛋白、或載脂蛋白H;激素，其為曱狀旁腺激素(PTH)、胰島素、上皮生長因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或曱狀腺球蛋白，上述任一種的受體或這類激素的受體；免疫或應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白，其為免疫球蛋白輕鏈、PAP-1或卩2-微球蛋白；酶，其為PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纖溶酶原、a-淀粉酶、(3-淀粉酶、c^-微球蛋白或溶菌酶，上述任一種的抑制劑或這種酶的抑制劑；藥物或毒素，其為氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；載體蛋白，其為白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、曱狀腺素視黃質(zhì)運載蛋白(transthyretin)或L-FABP;和受體相關(guān)蛋白(RAP)，其為細胞色素c、鉤(Ca2,、漸進性糖化終產(chǎn)物(AGE)、cubilin或Na+-H+交換轉(zhuǎn)運蛋白同種型3(NHE3);或這些物質(zhì)中的結(jié)合片段。使用結(jié)合于固體支持物上的人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段以及能結(jié)合人巨蛋白的配體測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與能結(jié)合人巨蛋白的配體發(fā)生反應(yīng)，使該反應(yīng)產(chǎn)物與結(jié)合于固體支持物上的人巨蛋白反應(yīng)，對結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的配體進行測定，并根據(jù)結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的配體的減少百分率，來竟爭性定量樣本中的人巨蛋白。按照[8]所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體。使用能結(jié)合人巨蛋白的配體測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與結(jié)合于微粒上的能結(jié)合人巨蛋白的配體發(fā)生反應(yīng)以誘導(dǎo)凝集，并根據(jù)導(dǎo)致凝集的程度來測量人巨蛋白。按照[10]所述的測定人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體，凝集是免疫凝集。用[l]至[ll]中任一項的方法測定人巨蛋白以檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病的方法。按照[12]所述的檢測器官疾病的方法，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病是肺病。按照[12]所述的檢測器官疾病的方法，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病是腎病。按照[14]所述的檢測腎病的方法，其中，腎病是腎小管性疾病。按照[14]或[15]中的方法，其中，樣本是尿液。用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其包含能結(jié)合人巨蛋白的配體。按照[17]所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體。按照[18]所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。按照[18]所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。按照[20]所述的用于檢測腎病的試劑盒，其中，腎病是腎小管性疾病。用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的疾病檢測標志，其包含人巨蛋白。按照[22]所述的疾病檢測標志，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。按照[22]所述的疾病檢測標志，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。按照[24]所述的疾病檢測標志，其中，腎病是腎小管性疾病。人巨蛋白作為用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的疾病4全測標志的用途。按照[26]所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。按照[26]所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。按照[28]所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，腎病是腎小管性疾病。本發(fā)明的效果本發(fā)明的方法能夠以高靈敏度和準確性測量樣本(如尿)中的人巨蛋白。當表達巨蛋白的細胞、組織或器官的功能受損時，巨蛋白從細胞中逸出并在樣本中積累。具體說來，樣本中人巨蛋白的測量使得可以直接檢測和診斷細胞、組織或器官的功能障礙，而不是間接的^^測和診斷。因此，用本發(fā)明的方法測量樣本中人巨蛋白，使得可以在早期以高準確性檢測觀察到巨蛋白表達的器官的疾病，如腎或肺疾病。本說明書包括日本專利申請?zhí)?006-089306的說明書和/或附圖中所公開的部分或全部內(nèi)容，該專利申請是本申請的優(yōu)先權(quán)文件。附圖筒述圖1顯示人巨蛋白的基因座和一般蛋白結(jié)構(gòu)。圖2顯示使用標準人巨蛋白檢測人巨蛋白的ELISA校準曲線。圖3顯示尿中人巨蛋白的臨床結(jié)果(第1部分)。圖4顯示尿中人巨蛋白的臨床結(jié)果(第2部分)。實施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明涉及測量樣本中人巨蛋白的方法。SEQIDNO:1顯示了人巨蛋白的核苷酉踏列，SEQIDNO:2顯示了人巨蛋白的氨基酸序列。在本發(fā)明中，使用結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體來測量人巨蛋白。用于常規(guī)免疫分析的任何固體支持物都可以使用。例如，塑料微量滴定板的孔或磁性微粒可能優(yōu)選被使用。能結(jié)合人巨蛋白的配體的一個例子是抗人巨蛋白抗體，單克隆抗體或多克隆抗體均可使用。此外，特異針對人巨蛋白糖鏈的凝集素可用作能結(jié)合人巨蛋白的配體。凝集素的例子包括但不僅限于伴刀豆球蛋白A、麥胚凝集素(WGA)、蓖麻(Ricinuscommunis)凝集素(RCA)和小扁豆凝集素(LCA)。另外，能結(jié)合人巨蛋白的配體的例子包括選自下列的物質(zhì)維生素結(jié)合蛋白，如鈷胺傳遞蛋白-維生素B^、維生素D結(jié)合蛋白或^1黃醇結(jié)合蛋白；脂蛋白，如載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/蔟蛋白、或載脂蛋白H;激素，如甲狀旁腺激素(PTH)、胰島素、上皮生長因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或曱狀腺球蛋白，上述任一種的受體或這類激素的受體；免疫或應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白，如免疫球蛋白輕鏈、PAP-1或(32-微球蛋白；酶，如PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纖溶酶原、a-淀粉酶、(3-淀粉酶、ar微球蛋白或溶菌酶，上述任一種的抑制劑或這類酶的抑制劑；藥物或毒素，如氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；載體蛋白，如白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、曱狀腺素視黃質(zhì)運載蛋白或L-FABP;和受體相關(guān)蛋白(RAP)，如細胞色素c、4丐(Ca")、漸進性糖化終產(chǎn)物(AGE)、cubilin或Na+"H+交換轉(zhuǎn)運蛋白同種型3(NHE3)]或這些物質(zhì)的結(jié)合片段。用于此處的術(shù)語"結(jié)合片段"是指上述物質(zhì)中包含結(jié)合人巨蛋白的4立點的片4爻。能結(jié)合人巨蛋白的配體，如抗人巨蛋白抗體，可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)結(jié)合到固體支持物上。當將配體結(jié)合到微量滴定板孔上時，將約3-10|ig/ml(優(yōu)選約5fig/ml)的能結(jié)合人巨蛋白的配體(如抗體)施加到固體支持物，然后使生成物在4°C靜置過夜(優(yōu)選12小時或更長時間)。當固定全長抗體時，根據(jù)理論確定出上述提到的固體支持物的推薦密度。根據(jù)下述公式確定密度Q=(2/V3)'(MW/N)'(2r)-2'109(ng/cm2)Q:分子量密度(ng/cm2)MW:分子量(道爾頓Da)N:阿伏伽德羅數(shù)=6'1023(mole")r:分子的斯托克斯半徑-(R'T2o)/(6'7i'Ti2(rD2Q'N)(cm)R:氣體常數(shù)-8.3.107(g■cm2■sec-2.。K".mole")T20:室溫(20。C)=293。Kti20:在20。C時水的粘度=l'l(r2(g.cm".sec-1)D20:在20。C時分子參考物對水的差分系數(shù)(cm^sec")在借助物理吸附進行固定時這種值是適用的。當固定能結(jié)合人巨蛋白的配體時，確定相應(yīng)固體支持物的理論密度，該密度受上述變異系數(shù)(如各自的分子量)影響。所以，密度隨各個固體支持分子的類型、固相的構(gòu)造或其它條件而變化。因此，密度并不限于上述的值。此外，當通過共價結(jié)合附著于固體支持物上時，在本發(fā)明中使用該密度。在這種情況下，存在于吸附表面并用于共價結(jié)合的官能團數(shù)目也被納入考慮。固體支持物的密度并沒有限制。基于常規(guī)技術(shù)，在結(jié)合后，用牛血清白蛋白(以下簡稱為"BSA")或酪蛋白進行封閉，目的是封閉蛋白質(zhì)的非特異性吸附位點。當固體支持物是磁珠時，用與微量滴定板同樣的方法處理固體支持物。使結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的配體(如抗人巨蛋白抗體)與樣本反應(yīng)，樣本中的人巨蛋白通過配體-受體結(jié)合反應(yīng)，如抗原抗體反應(yīng)，借助于結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的配體而結(jié)合于固體支持物。具體地講，形成結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體(如抗人巨蛋白抗體)和人巨蛋白的復(fù)合物。任何樣本均可使用，只要它含有人巨蛋白。樣本的實例包括尿、肺泡洗液、血液、血清、血漿和呼出空氣的凝結(jié)物。該抗原抗體反應(yīng)可在4。C至45。C進行，更優(yōu)選在20。C至40°C、進一步優(yōu)選在25°C至38。C進行。反應(yīng)的持續(xù)時間是大約10分鐘至18小時，更優(yōu)選10分鐘至1小時，進一步優(yōu)選30分鐘到1小時。在洗滌后，使能結(jié)合人巨蛋白的第二配體與結(jié)合于固體支持物的樣本中的人巨蛋白反應(yīng)。具體地講，形成結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體(如抗人巨蛋白抗體)、人巨蛋白和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體的復(fù)合物。作為能結(jié)合人巨蛋白的第二配體，可以使用與用作能結(jié)合人巨蛋白的第一配體相同的物質(zhì)，如抗人巨蛋白抗體。但是，當能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體都是抗人巨蛋白的單克隆抗體時，被第一抗人巨蛋白抗體識別和結(jié)合的表位需要與被第二抗人巨蛋白抗體識別和結(jié)合的表位不同。第一抗人巨蛋白抗體和第二抗人巨蛋白抗體的組合可以是下列任意組合單克隆抗體和單克隆抗體、單克隆抗體和多克隆抗體、多克隆抗體和單克隆抗體以及多抗體和多克隆抗體。反應(yīng)可在4。C至45。C進行，更優(yōu)選在20。C至40。C、進一步優(yōu)選在25。C至38°C進行。反應(yīng)的持續(xù)時間是大約10分鐘至18小時，更優(yōu)選10分鐘至1小時，進一步優(yōu)選30分鐘到1小時。于是，能結(jié)合人巨蛋白的第二配體，借助于人巨蛋白和能結(jié)合人巨蛋白的第一配體而被結(jié)合于固體支持物。經(jīng)過洗滌后，測量結(jié)合于固體支持物上的能與人巨蛋白結(jié)合的第二配體(如第二抗人巨蛋白抗體)。這可以借助在免疫分析領(lǐng)域普遍采用的各種各樣技術(shù)來進行。例如，將能結(jié)合人巨蛋白的第二配體標記上酶、熒光、生物素或放射性標記，以制備酶標記物質(zhì)。通過分析這類標記，可以測量能與結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白結(jié)合的第二配體。特別優(yōu)選用酶或熒光來標記。酶的例子包括過氧化物酶、堿性磷酸酶、p-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶；熒光的例子是異硫氰酸熒光素(FITC),雖然標記并不僅限于此。標記的檢測可以如下進行使相應(yīng)底物與酶標記的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，然后測量所產(chǎn)生的染料、熒光、發(fā)射等。當能與人巨蛋白結(jié)合的第二配體未被標記時，使帶標記的第三抗體與能結(jié)合人巨蛋白的第二配體發(fā)生反應(yīng)，可以基于這種標記來測量第三抗體。于是，也可以測量能結(jié)合人巨蛋白的第二配體。固體支持物或用于標記的抗人巨蛋白抗體可以是對人巨蛋白有特異性的免疫球蛋白片段(如Fab或F(ab，)2)，或以表達為重組子的重組抗體(如scFv、dsFv、雙倍體或微型抗體(minibody))。在本發(fā)明中，術(shù)語"抗體，，還指對人巨蛋白有特異性的片段。制備這類片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。上述方法包含以下兩個步驟結(jié)合于固體支持物上的能與人巨蛋白結(jié)合的第一配體(如抗人巨蛋白抗體)與樣本之間的反應(yīng)，隨后是在洗滌后能與人巨蛋白結(jié)合的第二配體與樣本之間的反應(yīng)?？商娲兀部梢圆捎冒瑔我徊襟E的方法，其中結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體(如抗人巨蛋白抗體)與樣本之間的反應(yīng)，和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體與樣本之間的反應(yīng)同時進行。本發(fā)明還包括用人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段和能結(jié)合人巨蛋白的配體來測量樣本中人巨蛋白的方法，其中所述人巨蛋白或人巨蛋白部分片段被結(jié)合于固體支持物上，該方法包括使樣本與能結(jié)合人巨蛋白的配體反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)物與結(jié)合于固體支持物上的人巨蛋白反應(yīng)，測量能與被結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白結(jié)合的配體，根據(jù)能與被結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白結(jié)合的配體百分率的減少，竟爭性定量樣本中的人巨蛋白。此方法需要將人巨蛋白結(jié)合到固體支持物，這種結(jié)合可按照將物質(zhì)結(jié)合到固體支持物的方法進行。此外，對人巨蛋白的部分片段并沒有限制，可以使用能結(jié)合人巨蛋白的配體所結(jié)合的人巨蛋白部分片段。作為人巨蛋白的部分片段，SEQIDNO:2所示的人巨蛋白氨基酸序列的部分序列可以通過化學合成或基因工程來制備?？梢允褂蒙鲜瞿芙Y(jié)合人巨蛋白的配體，特別優(yōu)選抗人巨蛋白抗體。在竟爭性方法中，結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白或人巨蛋白部分片段和能結(jié)合人巨蛋白的配體的用量是重要的。竟爭性方法是已知的才支術(shù)，可以基于已知技術(shù)可以適當?shù)卮_定該量。進一步，本發(fā)明包含用能結(jié)合人巨蛋白的配體來測量人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本同能與結(jié)合于微粒上的人巨蛋白結(jié)合的配體發(fā)生反應(yīng)以誘導(dǎo)凝集，基于所導(dǎo)致的凝集程度測量人巨蛋白。用于本方法的微粒的例子包括直徑為0.05-lOpm的微粒，優(yōu)選21直徑為0.1-0.4pm的乳膠微粒、直徑在0.5-10|am的明膠微粒和動物紅細胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法如物理吸附或共價結(jié)合，將抗體結(jié)合到微粒上，。在此方法中，如在黑色載玻片上將結(jié)合有抗人巨蛋白抗體的微粒與樣本混合，觀察由于凝聚而產(chǎn)生的微粒沉淀。于是，可檢測樣本中的人類巨蛋白。此外，可測量凝集的吸收以定量人巨蛋白。此外，也可以通過脈沖免疫測定法來檢測人巨蛋白。本發(fā)明的測量人巨蛋白的方法使得不僅可以測量完整的人巨蛋白，還可以測量人巨蛋白的片段。通過測量樣本中的人巨蛋白，可評估從中獲取樣本的受試者在表達人巨蛋白的細胞、組織、器官中是否患有疾病。具體地講，可檢測或診斷器官疾病等。任何細胞、組織或器官都可以是靶標，只要其中觀察到巨蛋白表達。優(yōu)選肺和腎，更優(yōu)選腎臟。就腎病而言，可特別檢測腎炎或腎小管性疾病。另外，糖尿病性腎病也能夠得到充分檢測。此外，這些細胞、組織或器官也可用于檢測代謝綜合癥或代謝綜合癥相關(guān)性腎病。在上述患有細胞、組織或器官功能障礙的受試者中，人巨蛋白從細胞泄露，樣本中人巨蛋白量增加。當體外測量取自受試者的樣本中的人巨蛋白，而且與取自健康個體的人巨蛋白濃度比較，樣本中人巨蛋白的濃度顯著增強時，該受試者可以被診斷為患有細胞、組織或器官功能障礙。如上所述，尿、肺泡洗液、血液、血清、血漿、呼出的空氣冷凝等均可用作樣本。在欲檢測肺病時，特別優(yōu)選使用肺泡洗液。在欲檢測腎臟病時，優(yōu)選使用尿液。此外，測量從受試者取得的樣本中的人巨蛋白，使得可以評估患有細胞、組織或器官功能障礙如腎病的危險性。當體外測量取自受試者的樣本中的人巨蛋白，而且與取自健康個體的人巨蛋白濃度比較，樣本中人巨蛋白的濃度顯著增強時，該受試者可被評估為很可能患有22有細胞、組織或器官功能障礙。也就是說，測量樣本中人巨蛋白使得能夠篩選很有可能患病的受試者，如將出現(xiàn)腎病的患者，并提供適當?shù)闹委?。進一步，定期測量從受試者獲得的樣本中人巨蛋白和監(jiān)測人巨蛋白濃度，使得可以控制器官功能。人巨蛋白可用作標志，用于檢測或診斷其中觀測有人巨蛋白表達的細胞、組織或器官的功能障礙。本發(fā)明包括人巨蛋白的應(yīng)用，用作用于檢測功能障礙、即其中觀測有巨蛋白表達的器官的疾病的標志。本發(fā)明還進一步包括疾病檢測/診斷標志，用于檢測和診斷功能紊亂，即其中觀測有巨蛋白表達的細胞、組織或器官的疾病。此外，當檢測或診斷功能紊亂、即其中觀測有巨蛋白表達的細胞、組織或器官的疾病時，也可以通過測量人巨蛋白的片段以及完整的人巨蛋白。實施例以下將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明，盡管本發(fā)明并不限于這些實施例。應(yīng)該指出的是，實施例中使用的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，自EngvallE.和PerlmannP.在1971年首次報道后，迄今為止已有許多研究人員報道。這種技術(shù)的使用已有堅實的基礎(chǔ)(EngvallE,Perlma皿P.,1971,Immimochemistry,8,871-874)。以下將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明，盡管本發(fā)明并不限于這些實施例。借助酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測尿中的人巨蛋白(l)制備小鼠抗人巨蛋白單克隆抗體用50fig帶佐劑的人巨蛋白經(jīng)腹腔免疫小鼠幾次，確認了血清效價升高。在加強注射(靜脈免疫)后3天，取出脾臟并獲得脾細胞。在聚乙二醇3500存在下，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合(10:1)以制備雜交瘤細胞。將產(chǎn)生的細胞在C02存在下于37。C培養(yǎng)1周，監(jiān)測在培養(yǎng)液上清中是否存在抗人巨蛋白抗體。通過限制稀釋法對其中觀察有抗體產(chǎn)生的陽性孔內(nèi)的細胞進行稀釋，將產(chǎn)物培養(yǎng)2周，以同樣的方式檢查培養(yǎng)液上清中是否存在抗人巨蛋白抗體。此后，通過限制稀釋法對其中觀察到有抗體產(chǎn)生的陽性孔內(nèi)的細胞進行稀釋，并以同樣的方式培養(yǎng)產(chǎn)物。在這一階段，將其中有抗人巨蛋白抗體產(chǎn)生的細胞在燒瓶中培養(yǎng)，將其中的部分懸浮在含10。/。二甲基亞砜(DMSO)(5x106細胞/ml)的胎牛血清(FCS),將產(chǎn)物儲存在液氮中。隨后，用孔內(nèi)的上清檢查培養(yǎng)液上清內(nèi)產(chǎn)生的抗人巨蛋白抗體的反應(yīng)性。將人巨蛋白溶解于140mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀、10mM磷酸氫二鈉和1.8mM磷酸二氫鉀(pH值7.3;以下簡稱"PBA,pH7.3")。向塑料微量滴定板(Nunc-ImmunoTMModuleF8MaxisorpSurfaceplate，NalgeNuncInternational)的孔內(nèi)，每孔加入100|^1人巨蛋白的PBS溶液(pH7.3);然后，將人巨蛋白以3pmol/孔的濃度固定在微量滴定板上，于4。C固定12小時。之后，通過傾析去除已經(jīng)加入孔內(nèi)的人巨蛋白的PBS溶液(pH7.3)，將145mM氯化鈉、3.6mM磷酸氫二鈉、1.4mM磷酸二氬鉀和0.05%(v./v.)吐溫20(以下簡稱為"PBS-T，，)加入微量滴定板的孔內(nèi)(200jul/孔)，通過傾析去除PBS-T，洗去孔內(nèi)超量吸附的人巨蛋白。該洗滌程序總共進行兩次。隨后，加入含145mM氯化鈉、7.2mM磷酸氫二鈉、2.8mM磷酸二氫鉀、1%(wt./v.)BSA和5%(wt./v.)乳糖(以下簡稱為"抗原結(jié)合化板的封閉溶液)，200pl/孔，將已結(jié)合有人巨蛋白的微量滴定板孔內(nèi)壁于4。C封閉12個小時。此后，將所得物儲存在4°C。為了檢查培養(yǎng)上清內(nèi)抗體的反應(yīng)性，可使用封閉處理后已結(jié)合有人巨蛋白的微量滴定板。向固定有人巨蛋白的微量滴定板孔內(nèi)加入lOOiul/孔的雜交瘤細胞培養(yǎng)液上清，將微量滴定板在37。C加熱1個小時。此后，通過傾析去除已加入孔內(nèi)的培養(yǎng)液上清，將PBS-T以200(il/孔加入微量滴定板的孔內(nèi)，通過傾析去除PBS-T,并洗滌孔的內(nèi)壁。該洗滌程序總共進行三次。此后，將過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DAKO)以100jal/孔加入孔內(nèi)(2000倍稀釋，0.55pg/ml),將產(chǎn)物在37。C加熱1小時。用145mM氯化鈉、3.6mM磷酸氫二鈉、1.4mM磷酸二氬鉀、0.05%(v./v.)吐溫20和0.5%(wt./v.)BSA的溶液(以下簡稱為"酶標記抗體的稀釋液")稀釋酶標記抗體。此后，通過傾析去除已加入孔內(nèi)的酶標記抗體，一夸PBS-T以200|11/孔加入微量滴定板的孔內(nèi)，通過傾析去除PBS-T,并且洗滌孔的內(nèi)壁。該洗滌程序總共進行三次。此后，將3，3，,5，5，-四曱基聯(lián)苯胺(以下簡稱"TMB")溶液(TMB—步法底物系統(tǒng)DAKO)加入孔內(nèi)(100(il/孔)，作為過氧化物酶反應(yīng)的底物溶液，使產(chǎn)物在25。C靜置30分鐘。緊接著，將313mM的H2S04溶液(以下簡稱為"反應(yīng)終止液")以100jil/孔加入到孔內(nèi)的反應(yīng)底物溶液中，以終止孔內(nèi)的酶反應(yīng)。此后，測量各孔的吸光度，用450nm的吸光度減去630nm的吸光度，得到的值被指定為反應(yīng)性評價指標(JosephyP.D.，MasonR.P.等，1982,J.Biol.Chem.257,3669-3675)。自BosE.S.等在1981年首次報道后，迄今為止，已有許多有關(guān)基于TMB的比色法的報導(dǎo)，該技術(shù)的使用有堅實的基礎(chǔ)(BosE.S.等，1981,J.Immunoassay,2,187-204)。結(jié)果，篩選出了對固定化人巨蛋白表現(xiàn)出強反應(yīng)活性的抗人巨.蛋白抗體的單克隆雜交瘤細胞，用小鼠免疫球蛋白分類試劑盒(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.),在培養(yǎng)液上清中檢查了有關(guān)來自100|ul貯存培養(yǎng)液上清溶液的每一個克隆的免疫球蛋白類別和亞類?；谒鼋Y(jié)果，從所得的單克隆細胞庫中篩選出IgG類克隆，然后按如下所述程序進行腹水制備。隨后，在25毫升燒瓶中培養(yǎng)這些細胞，然后在75毫升燒瓶中培養(yǎng)。將這些細胞腹腔注射到經(jīng)姥鮫烷處理的小鼠，并抽取腹水樣本。(2)純化小鼠抗人巨蛋白單克隆(IgG)抗體將獲得的腹水(10毫升)按1:1.5體積比與混濁血清處理試劑[FRIGEN(注冊商標)II:KyowaPureChemicalCo.,Ltd.]混合，振蕩和攪拌生成物1-2分鐘以使腹水脫脂。將腹水以3000rpm(1930xg)離心IO分鐘，分級分離出澄清腹水的離心上清液(IOml)。將該腹水離心上清(IOml)在冰浴中用硫酸銨分級分離(終濃度50%飽和硫酸銨)1小時，用PBS懸浮并溶解沉淀的免疫球蛋白部分。此^fe酸銨分級分離過程共進行兩次，以從腹水中獲得免疫球蛋白組分粗制品。將所得的免疫球蛋白組分粗制品(IOml)與等量的20mM磷酸鈉[pH7.0;以下簡稱"20mMNaPB(pH7.0)，，]混合，然后用G蛋白柱(HiTrapProteinGHP,5ml;AmershamBioSciences)進行親和純化。將樣本吸附在G蛋白柱后，用20mMNaPB(pH7.0,50ml)沖洗該G蛋白柱，樣本中除IgG以外的雜質(zhì)被洗去。然后，親和吸附在G蛋白柱的IgG抗體用0.1M鹽酸甘氨酸(pH2.7)洗脫，洗脫后即刻從柱中流出的洗脫部分用IM三(羥曱基)氨基曱烷鹽酸鹽(pH9.0)中和并回收(以下"三(羥曱基)氨基曱烷，，縮寫為"Tris，，)。中和后，在4。C用以500倍于親和純化產(chǎn)物的量的PBS透析該親和純化產(chǎn)物6小時，此透析過程共進行兩次。透析用的透析膜是透析用纖維素管(ViskaseCompanies)。所得的IgG洗脫部分被稱為純化的抗人巨蛋白單克隆抗體，并儲存于4°C，再進行如下所述的程序。通過將上述G蛋白柱以恒定流速1ml/min連接到BioLogicLPSystem(BioRadLaboratories),進4亍純化過牙呈。(3)制備固定有抗人巨蛋白單克隆抗體的微量滴定板用PBS(pH7.3)溶解純化抗人巨蛋白單克隆抗體，使其終濃度為5嗎/ml。向塑料微量滴定板(Nunc-I腿unoTMModuleF8MaxisorpTMSurfaceplate，NalgeNuncInternational)的孑L內(nèi)，力口入抗人巨蛋白單克隆抗體的PBS溶液(pH7.3)，每孔100|11，并使抗人巨蛋白單克隆抗體在微量滴定板上于4。C固定12小時。之后，通過傾析去除孔內(nèi)的抗人巨蛋白單克隆抗體的PBS溶液(pH7.3),將PBS-T加入微量滴定板的孔內(nèi)(200pl/孔)，通過傾析去除PBS-T,洗去孔內(nèi)超量吸附的抗人巨蛋白單克隆抗體。該洗滌程序總共進行兩次。然后，加入86mM氯化鈉、100mMTris、0.5%(wt./v.)BSA和0.05%(v./v.)吐溫20(以下簡稱為"抗體固定化板的封閉溶液")，200^1/孔，將已固定有抗人巨蛋白單克隆抗體的微量滴定板孔內(nèi)壁于4'C封閉12個小時。然后，將生成物儲存于4。C。(4)制備過氧化物酶標記的抗人巨蛋白單克隆抗體將辣根過氧化物酶(以下簡稱為"HRP")(源自辣根的過氧化物酶，VI型，Sigma)以4mg/ml溶解于純水，向500|alHRP溶液(2mg)加入100|Lil的100mM偏過碘酸鈉溶液，在室溫攪拌混合物20分鐘。用體積量500倍于該HPR溶液的1mM醋酸鈉;容液(pH4.0)(以下稱為"1mM醋酸緩沖液")透析此生成物，4。C透析6小時，該程序進行兩次。透析用的透析膜是透析用纖維素管(ViskaseCompanies)。隨后，將抗人巨蛋白單克隆抗體溶解于2.4mM碳酸鈉和7.6mM碳酸氫鈉的溶液(pH9.6)(以下簡稱為"lOmM碳酸緩沖液")，濃度為8mg/ml。向500|ulHRP溶液(2mg)加入1/3體積的120mM碳酸鈉和380mM碳酸氫鈉的溶液(pH9.6)(以下簡稱為"0.5M碳酸緩沖液")，再加入500pl上述抗人巨蛋白單克隆抗體(4mg),此生成物在室溫下攪動2小時。此后，加入50jil硼氫化鈉溶液(4mg/ml),此生成物在室溫下攪動2小。在冰浴中將此生成物用硫酸銨分級分離(終濃度50%飽和硫酸銨)1小時，沉淀部分懸浮和-容解在1ml的100mMTris、145mM氯化鈉和1%(v./v.)BSA溶液(pH7.6)(以下被稱為"標記抗體的懸浮液")中。該硫酸銨分級分離處理共進行兩次，將2.8mM磷酸二氫鉀、7.2mM磷酸氫二鈉、145mM氯化鈉、l%(wt./v.)BSA、0.02%(v./v.)苯酚和40%(wt./v.)D-山梨醇溶液(以下被稱為"標記抗體儲存液")，按標記抗體溶液的3/4體積，加入到標記抗體溶液(以下被稱作"標記抗體儲存液")中。獲得HRP標記的抗人巨蛋白單克隆抗體。自從Nakane,P.K.和Kawaoi,A.在1974年首次報導(dǎo)后，已有許多關(guān)于HRP標記方法的報導(dǎo)。因此，該技術(shù)的使用有堅實基礎(chǔ)(Nakane,P.K.,Kawaoi，A.，1974,J.27Histochem.Cytochem.22,1084)。(5)測量尿中的人巨蛋白使用上述固定有抗人巨蛋白單克隆抗體的微量滴定板和HRP標記的抗人巨蛋白單克隆抗體來測量尿液中的人巨蛋白。首先，將90pl腎小球濾過液與10(il2MTris和0.2M乙二胺-N,N,N，,N，-四乙酸溶液(以下"乙二胺-N,N，N，,N，-四乙酸，，縮寫為EDTA，pH為8.0)混合，將100|il所得溶液加入到固定有抗人巨蛋白單克隆抗體的微量滴定板的孔中。使生成物在37。C靜置1小時，通過傾析去除孔中已加入的尿樣溶液，向微量滴定板的孔中加入PBS-T(200ml/孔)，通過傾析去除PBS-T，然后洗滌。洗滌過程進行三次。此后，加入HRP標記的抗人巨蛋白單克隆抗體溶液(用稀釋標記抗體溶液將上述儲存液稀釋10000倍)，100jil/孔。使生成物在37。C靜置1小時，通過傾析去除孔中已加入的HRP標記抗體溶液，向微量滴定板的孔中加入PBS-T(200pl/孔)，通過傾析去除PBS-T，然后洗滌。洗滌過程進行三次。隨后，將100^1/孔的TMB溶液(TMB—步法底物系統(tǒng)；DAKO)加入孔中作為過氧化物酶反應(yīng)的底物溶液，讓生成物在25。C靜置30分鐘。緊接著，將反應(yīng)終止液加入到孔內(nèi)的底物溶液中，100jal/孔，以終止孔內(nèi)的酶反應(yīng)。此后，測量孔內(nèi)的吸光度，450nm的吸光度減去630nm的吸光度得到的值被指定作為評價尿中人巨蛋白測量值的指標。作為校準曲線的參考樣本，在使用抗人巨蛋白單克隆抗體制劑時，使用人巨蛋白作為免疫抗原，分析結(jié)果示于表1和圖2。尿液中人巨蛋白的實際臨床測量結(jié)果示于表2、圖3和圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康個體相比，腎病患者和將患腎病的患者排出到尿液中的人巨蛋白量顯著增高(圖3和4)。有關(guān)排出到尿液中的巨蛋白量的肌酐清除試驗也得到類似結(jié)果。這表明，尿排泄時間的濃度將無關(guān)緊要(圖3和4)。本發(fā)明提供了測量人巨蛋白的方法，與傳統(tǒng)的技術(shù)比較，這種方法可以在較短的時間以較筒單方法完成，而且還可以定量人巨蛋白。進一步，本發(fā)明使得能夠在早期以定點方式診斷細胞、組織或器官特有的功能性疾病的方法。上述臨床結(jié)果明顯支持本發(fā)明的這種特征。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表2項目尿肌酐尿巨蛋白測量方法酶法比色法ELISA樣本背景樣本號[u-Cre]O.D.(450應(yīng))-O.D.(630nm)[巨蛋白]肌酐清除(mg/dl)(nM)(nmol巨蛋白/gCre)糖尿病D陽l117.960.2410.5130.435D-268.160.1100.1680.246D-3102.530.1020.1460.142腎病N-l178.522.4726.3983.584N-233.550.459l細3.243N-341.240.1610.3020.732N陽478.290.1100.1680.215N-536.970.1290.2180.590代謝綜合癥M-l302.320,1690.3230.107M-259.560.0860.1040.175健康個體H墨l44.110.0610.0380扁H-292.720.0820.0940.101H-3.134.720.0560.0250.019H-4123.590.0630.0440.036H-5104.310.0520.0150.014H-696.640.0500.0090扁此文中引用的所有出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容在此引作參考。30權(quán)利要求1.使用結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體以及能結(jié)合人巨蛋白的第二配體來測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體發(fā)生反應(yīng)，使樣本與能結(jié)合人巨蛋白的第二配體發(fā)生反應(yīng)，對因該樣本中人巨蛋白與能結(jié)合人巨蛋白的配體形成復(fù)合物而被結(jié)合于固體支持物的、能結(jié)合人巨蛋白的第二配體進行測定。2.權(quán)利要求1所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其包括以下兩個步驟結(jié)合于固體支持物上的能與人巨蛋白結(jié)合的第一配體與樣本之間的反應(yīng)，和隨后的能與人巨蛋白結(jié)合的第二配體與樣本之間的反應(yīng)。3.權(quán)利要求1所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，結(jié)合于固體支持物上的能結(jié)合人巨蛋白的第一配體與樣本之間的反應(yīng)，和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體與樣本之間的反應(yīng)，是在單一的步驟中進行的。4.權(quán)利要求1至3中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和能結(jié)合人巨蛋白的第二配體都是抗體。5.權(quán)利要求1至3中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體是特異地針對人巨蛋白糖鏈的凝集素，而能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是抗體。6.權(quán)利要求1至3中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體是抗體，而能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是特異地針對人巨蛋白糖鏈的凝集素。7.權(quán)利要求1至6中任一項所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的第一配體和/或能結(jié)合人巨蛋白的第二配體是選自下列物質(zhì)維生素結(jié)合蛋白，其為鈷胺傳遞蛋白-維生素B12、維生素D結(jié)合蛋白或視黃醇結(jié)合蛋白；脂蛋白，其為有載脂蛋白B、載脂蛋白E、載脂蛋白J/簇蛋白、或載脂蛋白H;激素，其為甲狀旁腺激素(PTH)、胰島素、上皮生長因子(EGF)、催乳素、瘦蛋白或曱狀腺球蛋白，上述任一種的受體或這類激素的受體；免疫或應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白，其為免疫球蛋白輕鏈、PAP-1或(32-微球蛋白；酶，其為PAI-I、PAI-I-尿激酶、PAI-I-tPA、尿激酶原、脂蛋白脂肪酶、纖溶酶原、a-淀粉酶、(3-淀粉酶，(Xr微球蛋白或溶菌酶，上述任一種的抑制劑或這類酶的抑制劑；藥物或毒素，其為氨基糖苷類、多粘菌素B、抑肽酶或天花粉蛋白；載體蛋白，其為白蛋白、乳鐵蛋白、血紅蛋白、氣味結(jié)合蛋白、甲狀腺素視黃質(zhì)運載蛋白或L-FABP;和受體相關(guān)蛋白(RAP),其為細胞色素c、釣(Ca,、漸進性糖化終產(chǎn)物(AGE)、cubilin或Na、ir交換轉(zhuǎn)運蛋白同種型3(NHE3);或這些物質(zhì)中的結(jié)合片段。8.使用結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白或人巨蛋白的部分片段以及能結(jié)合人巨蛋白的配體來測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與能結(jié)合人巨蛋白的配體發(fā)生反應(yīng)，讓反應(yīng)產(chǎn)物與結(jié)合于固體支持物的人巨蛋白發(fā)生反應(yīng)，對結(jié)合于固體支持物的能與人巨蛋白結(jié)合的配體進行測定，并根據(jù)結(jié)合于固體支持物的能結(jié)合人巨蛋白的配體的減少百分率來竟爭性定量樣本中的人巨蛋白。9.權(quán)利要求8所述的測定樣本中人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體。10.使用能結(jié)合人巨蛋白的配體測定樣本中人巨蛋白的方法，該方法包括使樣本與結(jié)合于微粒上能結(jié)合人巨蛋白的配體發(fā)生反應(yīng)以誘導(dǎo)凝集，并根據(jù)導(dǎo)致凝集的程度來測量人巨蛋白。11.權(quán)利要求IO所述的測定人巨蛋白的方法，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體，凝集是免疫凝集。12.通過權(quán)利要求1至11中任一方法測定人巨蛋白以4企測其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病的方法。13.權(quán)利要求12所述的檢測器官疾病的方法，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病是肺病。14.權(quán)利要求12所述的檢測器官疾病的方法，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官的疾病是腎病。15.權(quán)利要求14所述的檢測腎臟疾病的方法，其中，腎病是腎小管性疾病。16.權(quán)利要求14或[15]所迷的方法，其中，樣本是尿液。17.用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其包含能結(jié)合人巨蛋白的配體。18.權(quán)利要求17所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，能結(jié)合人巨蛋白的配體是抗人巨蛋白抗體。19.權(quán)利要求18所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。20.權(quán)利要求18所述的用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的試劑盒，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。21.權(quán)利要求20所述的用于檢測腎病的試劑盒，其中，腎病是腎小管性疾病。22.用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的疾病檢測標志，其包含人巨蛋白。23.權(quán)利要求22中的疾病檢測標志，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。24.權(quán)利要求22中的疾病檢測標志，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。25.權(quán)利要求24中的疾病檢測標志，其中，腎病是腎小管性疾病。26.人巨蛋白的用途，用作用于檢測其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病的疾病檢測標志。27.權(quán)利要求26所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是肺病。28.權(quán)利要求26所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，其中觀測到有巨蛋白表達的器官疾病是腎病。29.權(quán)利要求28所述的人巨蛋白作為疾病檢測標志的用途，其中，腎病是腎小管性疾病。全文摘要本發(fā)明提供了測量人巨蛋白的方法，與傳統(tǒng)方法比較，這種方法可以在較短的時間較簡單地完成，而且還可以定量人巨蛋白。本發(fā)明還提供了直接在疾病部位早期診斷細胞、組織或器官特異性功能疾病的方法。本發(fā)明還公開了通過測定人巨蛋白而檢測特征性地觀測到巨蛋白表達的器官疾病的方法。文檔編號G01N33/53GK101454670SQ20078001948公開日2009年6月10日申請日期2007年3月28日優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日發(fā)明者三浦州平,小笠原真也,齋藤亮彥,竹田徹朗申請人:國立大學法人新澙大學;電化生研株式會社