專利名稱：：Satb2蛋白作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及癌癥診斷和預(yù)后領(lǐng)域。具體而言，它提供了一種通過(guò)鑒別作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記的SATB2蛋白來(lái)用于檢測(cè)和鑒定結(jié)腸直腸癌的新方法。
背景技術(shù)：
："加編碼富含AT的特殊序列結(jié)合蛋白2(specialAT-richsequence-bindingprotein2，SATB2)的基因是在1999年人類基因組測(cè)序的浩大工程中4皮鑒別出的(KikunoRef(1999)DNARes.6:197-205)。自此，SATB2基因被認(rèn)為主要在神經(jīng)組織中表達(dá)。SATB2是一個(gè)形成核基質(zhì)各部分的轉(zhuǎn)錄因子，并且它通過(guò)與富含AT的序列(也稱為基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs))相互作用來(lái)調(diào)控高度有序的染色質(zhì)(high-orderchromatin)結(jié)構(gòu)從而進(jìn)行組織特異性的基因表達(dá)(DickinsonLA"a/(1992)Cell70，631-45;FitzPatrickDR""(2003)Hum.Mol.Genet.12，2491-501;YasuiD，(2002)Nature419，641-5;Bode,J(2000)Crit.Rev.Eukaryot.Gene.Expr.10，73-90)。對(duì)該基因及其蛋白產(chǎn)物SATB2蛋白的研究，指出它作為轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)組織中參與基因表達(dá)的調(diào)控(DobrevaGWa/(2003)GenesDev.17:3048-3061;Britanova0"a7(2005)Eur.J.Neurosci.21:658-668)。還有記載，SATB2基因在腭發(fā)育和腭裂中起作用(FitzPatrickDR""(2003)HumanMol.Genet.12:2491-2501'，vanBuggenhoutG""(2005)Eur.J.Med.Genet.48:276-289)。Salahshor等人對(duì)一名腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因突變的患者進(jìn)行了研究(Salahshor""(2005)BMCcancer5:66)。APC患者在年輕時(shí)產(chǎn)生異常量的結(jié)腸腺瘤，如果不治療，最終將發(fā)展成結(jié)腸直腸癌?？偦虮磉_(dá)譜揭示了一組包括SATB2在內(nèi)的84個(gè)基因在腺瘤內(nèi)的表W目比在正常粘膜中有顯著改變。SATB2被發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)但未被選用于做進(jìn)一步的分8析。IntJCancer上關(guān)于結(jié)腸直腸癌表達(dá)圖鐠的新近研究同樣指出SATB2在mRM水平上的表達(dá)狀態(tài)有所改變(GroeneJWa7(2006)IntJCancer119，1829-1836)。PCT公布文本W(wǎng)O03/022126和WO2006/015742描述了關(guān)于癌細(xì)胞表達(dá)圖譜的其他相似研究。對(duì)包括SATB2的大量基因的表達(dá)進(jìn)行分析并根據(jù)總的表達(dá)模式得出結(jié)論。重要地是，上述研究并未提供關(guān)于SATB2蛋白作為特異的結(jié)腸直腸標(biāo)記的應(yīng)用或SATB2作為結(jié)腸直腸癌預(yù)后工具的應(yīng)用的暗示。疾癥癌癥是西方最常見(jiàn)的疾病和死亡原因之一。一般而言，大多數(shù)的癌癥形式的發(fā)病率是隨年齡增加的。因?yàn)槿祟惪傮w健康狀況提高所致的壽命的繼續(xù)增長(zhǎng)，患癌癥的個(gè)體會(huì)更多。盡管日益增加的知識(shí)指出環(huán)境因素(々大食、煙草、紫外線等)及遺傳因素("癌癥基因，，如p53、APC、BRCA1、XP等的種系突變)與癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間有一種聯(lián)系，但大多數(shù)常見(jiàn)類型的癌癥的病因一般來(lái)說(shuō)還不清楚。盡管癌癥本質(zhì)上是一種細(xì)胞疾病并被定義為伴有凈細(xì)胞增長(zhǎng)和有害群體行為的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群，但從細(xì)胞生物學(xué)角度來(lái)看，關(guān)于癌癥的定義都不能令人完全滿意。惡性轉(zhuǎn)化代表基于不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變的向惡性表型的轉(zhuǎn)變。盡管還沒(méi)被正式地證明，惡性轉(zhuǎn)化被認(rèn)為發(fā)生在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，由此始發(fā)隨后產(chǎn)生的腫瘤("癌癥克隆形成能力"學(xué)說(shuō))。致癌作用是指產(chǎn)生癌癥并通常被認(rèn)為包括多個(gè)最終導(dǎo)致惡性腫瘤生長(zhǎng)的事件的過(guò)程。這個(gè)多步過(guò)程包括數(shù)個(gè)速率限制步驟，如突變的增加，還可能包括外遺傳(epigenetic)事件，導(dǎo)致癌變前增殖階段后的癌癥形成。最常見(jiàn)類型的癌癥發(fā)生在體細(xì)胞，其中絕大多數(shù)起源于上皮組織(皮膚、前列腺、結(jié)腸和肺)，然后;l^ok細(xì)胞生成鐠系發(fā)生的癌癥(白血病和淋巴瘤)和從間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的癌癥(肉瘤)。逐步的變化包括決定細(xì)胞分裂、自我行為和細(xì)胞死亡的重要調(diào)控通路中的錯(cuò)誤(突變)累積。每一種變化都提供相對(duì)于周圍環(huán)境細(xì)胞的達(dá)爾文選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞群的凈生長(zhǎng)。需要強(qiáng)調(diào)的是惡性肺瘤不僅由轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞自身組成而且還包括作為支持性間質(zhì)的周圍正常細(xì)胞。這種補(bǔ)充的癌癥間質(zhì)構(gòu)成了結(jié)締組織、血9管和多種其他正常細(xì)胞，如炎性細(xì)胞，它們共同起到向轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞提供胂瘤繼續(xù)生長(zhǎng)所必需的信號(hào)的作用。對(duì)取自肺瘤的組織切片進(jìn)行顯微評(píng)價(jià)仍然是確診癌癥的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)基因組DM、轉(zhuǎn)錄基因和表達(dá)蛋白的分析在顯^:鏡檢測(cè)到的組織學(xué)特征基礎(chǔ)上又增加了重要信息。今后的診斷、預(yù)后信息和治療選擇都可能基于對(duì)形態(tài)學(xué)的整體評(píng)價(jià)和對(duì)核酸及蛋白質(zhì)的分析?，F(xiàn)在，基于人類基因組序列和生物化學(xué)通路(包括組織中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo))的不斷進(jìn)步的認(rèn)知，已經(jīng)可以揭示腫瘤形成中不同階段以及表型變化(這定義了不同的癌癥類型)的某些機(jī)制。盡管分子生物學(xué)已取得顯著進(jìn)步，癌癥診斷仍然要依靠光學(xué)顯孩i鏡。分子工具的發(fā)展對(duì)將癌癥細(xì)胞與普通細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)起到了重要的作用，而且這種重要性還在增加。除了組織切片的組織化學(xué)染色之外，最常用的方法是免疫組織化學(xué)法。免疫組織化學(xué)法使得可以使用特定的抗體來(lái)檢測(cè)組織和細(xì)胞中的蛋白表達(dá)模式。免疫組織化學(xué)法在臨床診斷上的應(yīng)用不僅可以分析組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)，還可以檢測(cè)不同細(xì)胞群中的免疫活性。這對(duì)于支持不同原發(fā)腫瘤的精確評(píng)級(jí)和分類，以及對(duì)不明起源的轉(zhuǎn)移的診斷已經(jīng)變得非常重要?，F(xiàn)在臨床實(shí)踐中，最常用的抗體包括抗細(xì)胞類型標(biāo)記(如PSA、MelanA、甲狀腺球蛋白)的抗體和識(shí)別中間絲、分化抗原蔟等和潛在惡性標(biāo)記(如Ki67、p53和HER-2)的抗體。除了免疫組織化學(xué)法，應(yīng)用原位雜交來(lái)檢測(cè)基因擴(kuò)增和應(yīng)用基因測(cè)序來(lái)分析突變是癌癥診斷學(xué)中正在發(fā)展的技術(shù)。結(jié)腸直腸癌是世界上最常見(jiàn)的人類癌癥形式之一。Parkin等人提供例4議現(xiàn)(Parkinef"(2007)CACancerJClin55，74-108)。另外，世界上結(jié)腸直腸癌的發(fā)生占全部癌癥的9.4°/。左右，而且結(jié)腸直腸癌是西方世界第二最常見(jiàn)的死亡原因。西方世界的結(jié)腸直腸癌的五年存活率約為60%,但是在東歐和印度則低至30%。癌病目前早期檢測(cè)和切除胂瘤的外科手術(shù)對(duì)良好的預(yù)后是至關(guān)重要的。癥狀取決于肺瘤在遠(yuǎn)端胃腸道中的位置，它包括腸不良應(yīng)激、腹瀉、便秘、疼痛和貧血(繼發(fā)于腫瘤出血至腸道中)。惡性腫瘤才艮據(jù)不同的分類方案可被分為幾個(gè)階段，如TNM/UICC分類法I到IV期或DukesA到C期。最輕度惡性腫瘤(DukesA和B期)可獲得合理有利的效果，而另一極端，某些轉(zhuǎn)移性高度惡性腫瘤(DukesC期)的存活率則很低。目前的診斷基于患者病史、臨床和內(nèi)窺鏡檢查(直腸鏡檢查和結(jié)腸鏡檢查)，隨后任選地進(jìn)行放射成像以確定肺瘤生長(zhǎng)的范圍。對(duì)可疑損傷處灶的活組織檢查與內(nèi)窺鏡檢查結(jié)合進(jìn)行。顯微診斷，指從可疑腫瘤收集活檢材料并置于顯微鏡下觀察。為了獲得可靠的診斷結(jié)果，再將腫瘤組織固定于福爾馬林中、進(jìn)行組織學(xué)處理和石蠟包埋。從所得的石蠟塊獲得組織切片并用組織化學(xué)方法和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色。對(duì)限定在局部區(qū)域的肺瘤，即還沒(méi)有發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤，通過(guò)外科手術(shù)將腫瘤及周圍的腸和組織完全切除。然后將外科手術(shù)標(biāo)本送去進(jìn)行粗略的病理學(xué)和顯微分析。這種分析形成了腫瘤分期的基礎(chǔ)。目前最常見(jiàn)形式的結(jié)腸直腸癌是代表腺源腫瘤的腺癌，它可高度、中度或低度分化。對(duì)原發(fā)性腫瘤，蘇木素-伊紅染色的組織切片足夠用于4艮據(jù)結(jié)腸直腸癌分類法作出正確的診斷和分類。但是，由于結(jié)腸直腸癌非常常見(jiàn)并經(jīng)常在檢出之前已經(jīng)生長(zhǎng)得很大，轉(zhuǎn)移卻不常見(jiàn)。腫瘤一般會(huì)轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，但是遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移至肝或肺的卻很少見(jiàn)。癌癥的一個(gè)常見(jiàn)的臨床問(wèn)題是患者表現(xiàn)出未知來(lái)源的轉(zhuǎn)移。如果轉(zhuǎn)移的是腺癌，可懷疑數(shù)種可能的原發(fā)性腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌。對(duì)于鑒別診斷，可以使用可識(shí)別來(lái)源細(xì)胞的固有特征的免疫組織化學(xué)標(biāo)記。目前，細(xì)胞角蛋白20(CK20)-故用于作為結(jié)腸直腸癌的特征，它是一種胃腸道腺細(xì)胞中富含的中間絲標(biāo)記。但是，幾種其他腺癌也是對(duì)CK20抗體呈陽(yáng)性的，盡管不是所有結(jié)腸直腸癌都為陽(yáng)性。另外，現(xiàn)在沒(méi)有可將低度惡性和低轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤與威脅生命的高度惡性腫瘤區(qū)分開(kāi)來(lái)的可用標(biāo)記。為了讓醫(yī)生針對(duì)正確的癌癥類型給予具體且盡可能早的治療，提供新的只針對(duì)結(jié)腸直腸癌并可以將患者按不同風(fēng)險(xiǎn)類別進(jìn)行區(qū)分的分子標(biāo)記非常重要?？傊?，目前非常需要能夠提高結(jié)腸直腸癌診斷和篩選的新方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)提供可用于受試者結(jié)腸直腸癌的診斷和/或預(yù)后的標(biāo)記來(lái)滿足上述需要。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)目的是提供可用于區(qū)分結(jié)腸直腸癌和其他類型癌癥的標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的是提供結(jié)腸直腸癌診斷、預(yù)后和/或治療的新方法。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)目的是提供一種可與結(jié)腸直腸癌診斷、預(yù)后和/或治療的方法結(jié)合使用的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供可用于結(jié)腸直腸癌診斷、預(yù)后和/或治療的新化合物。的其他目的^本發(fā)明在不同方面提供^確定結(jié)腸直腸癌狀:和預(yù)后及其治療的新方法。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了確定患有結(jié)腸直腸癌或懷疑患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動(dòng)物受試者的結(jié)腸直腸癌預(yù)后是否不良的方法，所述方法包括以下步驟a)提供取自所述受試者的一個(gè)樣品；b)對(duì)存在于所述樣品中的SATB2蛋白進(jìn)行定量以得到一個(gè)樣品值；c)將得自b)的樣品值與對(duì)照值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值低于所述對(duì)照值，d)則判斷所述受試者的結(jié)腸直腸癌預(yù)后不良。本發(fā)明的第一方面是基于以往未認(rèn)識(shí)到的事實(shí)，即取自患有結(jié)腸直腸癌或懷疑患有結(jié)腸直腸癌的受試者的樣品中SATB2蛋白的表達(dá)可作為受試者疾病狀態(tài)的指示物。更具體地，本發(fā)明第一次指出一方面的SATB2的低表達(dá)值與另一方面的更具攻擊性或高風(fēng)險(xiǎn)的形式的結(jié)腸直腸癌之間相關(guān)性?；谝許ATB2表達(dá)作為結(jié)腸直腸癌預(yù)后指示物的本發(fā)明有若干優(yōu)點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于癌癥，攻擊性形式肺瘤的早期檢測(cè)非常重要，因?yàn)樵缙诳梢灾斡?。?duì)于結(jié)腸直腸癌而言尤其如此，已有幾個(gè)大型研究表明患有早期即l期和2期(實(shí)際上是DukesA和B期)癌癥的受試者的預(yù)后，與患有晚期腫瘤的受試者相比要好很多。這種差別不是取決于治療方式，因?yàn)樗蓄愋偷慕Y(jié)腸直腸癌都會(huì)進(jìn)行完全切除。這種存活上的巨大差別而是與早期檢測(cè)、正確診斷和適當(dāng)?shù)耐饪剖中g(shù)治療明顯有關(guān)。SATB2蛋白作為標(biāo)記，其某種表達(dá)水平與某種模式的疾病進(jìn)程相關(guān)，它在例如用于轉(zhuǎn)移性的鑒別診斷方面具有巨大的潛力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟d)中不良預(yù)后的結(jié)論可能包括表明，所述受試者與其不表現(xiàn)低SATB2表達(dá)值的情況相比，具有更短的預(yù)期存活時(shí)間。或者/另外，不良預(yù)后的結(jié)論可能包括表明，與不表現(xiàn)低SATB2表達(dá)值的情況相比，具有更低的5年存活可能性。例如，結(jié)論可能為所述受試者的5年存活可能性為65%或更>[氐，例如，60。/。或更^f氐，50°/或更寸氐，40%或更〗氐或30%或更寸氐。此夕卜，對(duì)于患有或懷疑患有淋巴結(jié)陰性腫瘤的受試者，結(jié)論可能是所述受試者的5年存活可能性為73%或更低，例如，70%或更低，例如60%或更低，50%或更低，40%或更低，或者30%或更4民。對(duì)于女性受試者，結(jié)論可能為所述受試者的5年存活可能性為74%或更低，例如70°/?；蚋停?0%或更低，50°/或更低，40%或更低或30°/或更低。對(duì)于患有或懷疑患有結(jié)節(jié)陰性肺瘤的女性受試者，結(jié)論可能為所述受試者的5年存活可能性為80°/或更低，例如75%或更低，例如70%或更低，例如60%或更低，50%或更低，40%或更低或30%或更低。在SATB2的低表達(dá)與結(jié)腸直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)形式之間所識(shí)別的這種相關(guān)性也可構(gòu)成決定對(duì)受試者相對(duì)于其不表現(xiàn)低SATB2表達(dá)值的情況施行不同治療方案的基礎(chǔ)。因此，在第二方面，本發(fā)明提供了治療需要治療的受試者的結(jié)腸直腸癌的方法，包括a)提供取自該所述受試者的一個(gè)樣品；b)對(duì)存在于所述樣品中的SATB2蛋白進(jìn)行定量以得到一個(gè)樣品值；c)將得自b)的樣品值與對(duì)照值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值低于所述對(duì)照值，d)則采用適合于預(yù)后不良的結(jié)腸直腸癌的一個(gè)治療方案來(lái)治療所述受試者在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療方案選自化學(xué)療法、新輔助療法及其組合。因此，所述治療方案可以是新輔助療法。所述新輔助療法可僅由放射治療構(gòu)成或由放射治療與化學(xué)療法結(jié)合構(gòu)成。在上述本發(fā)明的方法各方面中，所述受試者可以患有或懷疑患有不同形式和/或階段的結(jié)腸直腸癌。在這些方面的某些實(shí)施方案中，要研究的結(jié)腸直腸癌是結(jié)節(jié)陰性的結(jié)腸直腸癌，即還沒(méi)有發(fā)展到結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移階段的結(jié)腸直腸癌。在其他類似的實(shí)施方案中，要研究的結(jié)腸直腸癌的特征是處于DukesA或B期。在其他實(shí)施方案中，要研究的結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸腺瘤或結(jié)腸直腸癌(carcinoma)。在這些實(shí)施方案中，確定受試者表現(xiàn)出低SATB2表達(dá)可能對(duì)疾病的未來(lái)發(fā)展預(yù)后具有重要價(jià)值，并因此形成對(duì)未來(lái)疾病處理的相關(guān)可靠決定的基礎(chǔ)。在一組患有這種相對(duì)早期階段疾病的受試者中，低SATB2表達(dá)的受試者可能有發(fā)展為更具攻擊性的疾病相對(duì)較高風(fēng)險(xiǎn)。因此，患有結(jié)節(jié)陰性結(jié)腸直腸癌或DukesA或B期結(jié)腸直腸癌的受試者中低SATB2表達(dá)可說(shuō)明這些受試者應(yīng)該得到比不表現(xiàn)低SATB2表達(dá)的受試者更密切地監(jiān)控和/或被施以與不表現(xiàn)低SATB2表達(dá)的受試者不同的治療。由于SATB2標(biāo)記提供的補(bǔ)充預(yù)后信息，本發(fā)明的方法因此提供了使這種受試者能夠在某段時(shí)間存活和/或存活更長(zhǎng)時(shí)間的更大可能性。在其他實(shí)施方案中，要研究的結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌。在其他類似的實(shí)施方案中，要研究的結(jié)腸直腸癌的特征為處于DukesC期。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述受試者是人類，如女人。如所附實(shí)施例所示，SATB2標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值在患有結(jié)節(jié)陰性結(jié)腸直腸癌的人類女性受試者組中特別顯著。SATB2蛋白表達(dá)的樣品值低于對(duì)照值的確定，本文有時(shí)將其表達(dá)為"低SATB2表達(dá)"的確定。在本發(fā)明的方法中，作為與受試者樣品值相比較的對(duì)照值可通過(guò)不同的方法確定。作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，對(duì)照值可對(duì)應(yīng)進(jìn)行所述預(yù)后或治療的受試者健康組織中的SATB2表達(dá)量。作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)照值可由取自另一個(gè)對(duì)照受試者的正常組織的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的SATB2表達(dá)量提供。作為另一個(gè)實(shí)例，對(duì)照值可由如Dukes期A或B癌癥組織的腫瘤組織的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的SATB2表達(dá)量提供。對(duì)照值可通過(guò)實(shí)施本發(fā)明上述各方面的方法獲得?？商娲?，對(duì)照值是得自對(duì)照樣品并且與所述對(duì)照樣品的SATB2表達(dá)量一致的預(yù)定值。對(duì)一個(gè)樣品中的SATB2表達(dá)定量的另一種替代方法是測(cè)定SATB2表達(dá)高于某一水平的樣品中細(xì)胞分?jǐn)?shù)。所述測(cè)定例如可按下面的實(shí)施例第4部分"分?jǐn)?shù)分值"的定義中所述進(jìn)行。本發(fā)明以上各方面的方法的實(shí)施方案中，步驟d)的結(jié)論的標(biāo)準(zhǔn)是SATB2陽(yáng)性細(xì)胞的核分?jǐn)?shù)樣品值，即"分?jǐn)?shù)分值"，它低于對(duì)照值50%,例如低于40"/。，如低于30°/,如低于25%,如低于20%,如低于15%，如低于10%,如低于5%,如低于1%。另外，不良預(yù)后的確定可對(duì)應(yīng)在樣品中基本上檢測(cè)不到SATB2陽(yáng)性細(xì)胞，即"分?jǐn)?shù)分值"基本為零。對(duì)一個(gè)樣品中的SATB2表達(dá)定量的另一種替代方法是用自動(dòng)掃描儀和圖l象處理軟件自動(dòng)測(cè)量SATB2表達(dá)的自動(dòng)分值(autoscore)。這種測(cè)定例如可按下面的實(shí)施例第5部分"自動(dòng)分值"的定義中所述進(jìn)行。本發(fā)明上面各方面的方法的實(shí)施方案中，步驟d)的結(jié)論的標(biāo)準(zhǔn)是樣品細(xì)胞中SATB2表達(dá)的樣品值，即"自動(dòng)分值"，它低于對(duì)照值70，如低于60，如低于50，如低于40，如低于30,如低于25，如低于20，如低于15,如低于10,如低于5。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，無(wú)論是作為如上的分?jǐn)?shù)分值或自動(dòng)分值或作為某種其他已知的或被適當(dāng)改變的變量的樣品值和/或?qū)φ罩档臏y(cè)定，都是在受試者的遠(yuǎn)端胃腸道即闌尾、結(jié)腸和/或直腸的腺細(xì)胞和/或結(jié)腸直腸癌細(xì)胞上進(jìn)行的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，不良預(yù)后的確定對(duì)應(yīng)于在受試者的遠(yuǎn)端胃腸道的腺細(xì)胞中沒(méi)有可檢出的SATB2表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，對(duì)術(shù)語(yǔ)"樣品值"和"對(duì)照值"做寬泛的解釋。如上所述，可通過(guò)自動(dòng)方法或通過(guò)一個(gè)基于樣品視覺(jué)或顯微鏡檢查的評(píng)分系統(tǒng)來(lái)對(duì)SATB2的表達(dá)定量以獲得這些值。但是，一個(gè)技術(shù)人員如組織病理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員，也可僅通過(guò)檢查例如已進(jìn)行SATB2表達(dá)染色的組織切片就可確定所述樣品值和對(duì)照值。因此，樣品值低于對(duì)照值的判斷可對(duì)應(yīng)于視覺(jué)或顯微鏡檢查后的判斷，即樣品組織切片比對(duì)照組織切片染色密度低和/或有更少的染色細(xì)胞。在這樣情況下，所述樣品值和對(duì)照值,皮i人為是技術(shù)人員在檢查和比較后確定的主觀值。因此，本發(fā)明不僅限于使用自動(dòng)分析。本發(fā)明的方法中用于檢測(cè)SATB2蛋白表達(dá)的具體步驟不限于任何特定方式。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，步驟b)包括bl)對(duì)所述樣品應(yīng)用一種可定量的親和配體，所述親和配體可選擇性地與待定量的SATB2蛋白相互作用，所述應(yīng)用是在允許親和配體與存在于所述樣品中的任何SATB2蛋白結(jié)合的條件下施行的。b2)除去未結(jié)合的親和配體；并且b3)對(duì)于與該樣品保持相關(guān)聯(lián)的任何親和配體進(jìn)行定量。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，所述的取自所述受試者的樣品可為體液樣品，如血液、血漿、血清、腦液、尿液、精液和滲出液樣品。在本發(fā)明的方法中，作為替代方案，所述樣品可以是糞便樣品、細(xì)胞學(xué)樣品或組織樣品，如結(jié)腸直腸組織的樣品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是在體外進(jìn)行的。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的應(yīng)用不限于對(duì)被研究的受試者體內(nèi)存在的SATB2蛋白任何具體變體定量，只要所述蛋白是被相關(guān)基因編碼并表現(xiàn)相關(guān)的表達(dá)形式即可。作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，所述SATB2蛋白的M酸序列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85%相同的序列。在某些實(shí)施方案中，上面的序列ii)與SEQIDNO:l至少90。/。相同，至少91%相同，至少92%相同，至少93%相同，至少94%相同，至少95%相同，至少96%相同，至少97%相同，至少98/。相同，或者至少99°/。相同。作為另一個(gè)非限制性的實(shí)例，所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:2;和ii)一個(gè)與SEQIDN0:2至少85%相同的序列。在某些實(shí)施方案中，上面的序列ii)與SEQIDN0:2至少90%相同，至少91°/。相同，至少92%相同，至少93°/。相同，至少94%相同，至少95%相同，至少96%相同，至少97%相同，至少98%相同，或者至少99%相同。在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方案中，SATB2蛋白是通過(guò)對(duì)樣品應(yīng)用一種可檢測(cè)和/或可定量的親和配體來(lái)檢測(cè)和/或定量的，該親和配體能夠特異性或選擇性地與SATB2蛋白相互作用。親和配體的應(yīng)用是在允許親和配體與樣品中的任何SATB2蛋白結(jié)合的條件下施行的。一旦通過(guò)本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容的教導(dǎo)了解了SATB2與結(jié)腸直腸癌之間的關(guān)系，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員就能夠選擇或制造合適的親和配體以及選擇用于檢測(cè)和/或定量的合適形式和條件。盡管如此，為了說(shuō)明，仍然在下面給出證明可用的親和配體的實(shí)例，以及用于檢測(cè)和/或定量的形式和條件的實(shí)例。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，4吏用的親和配體選自抗體及其片段和其衍生物，即基于免疫球蛋白支架的親和配體?？贵w包含任何來(lái)源的單克隆和多克隆抗體，包括鼠類抗體、人類抗體和其他抗體，以及含有不同物種的序列的嵌合抗體，如部分人源化的小鼠抗體。多克隆抗體是通過(guò)用選定抗原免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)，而具有確定的特異性的單克隆抗體可通過(guò)K6hler和Milstein開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)來(lái)生產(chǎn)(K6tilerGandMilsteinC(1976)Eur.J.Immunol.6:511-519)。抗體片段及衍生物包括Fab片段，它由完整免疫球蛋白的重鏈第一恒定區(qū)(CH1)、輕鏈恒定區(qū)(CL)、重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)組成；Fv片段，它由抗體的兩個(gè)可變區(qū)VH和VL組成(SkerraAandPliickthunA(1988)Science240:1038-1041);單鏈Fv片段(scFv),它由通過(guò)可彎曲的肽接頭連結(jié)在一起的VH和VL區(qū)組成(BirdREandWalkerBW(1991)TrendsBiotechnol.9:132-137);BenceJones二聚體(StevensFJ"a/(1991)Biochemistry30:6803-6805);駱駝(camelid)重鏈二聚體(Hamers-CastermanCa7(1993)Nature363:446-448)和單鏈可變區(qū)(CaiXandGarenA(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:6280-6285;MasatLe"/(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:893-896),以及單結(jié)構(gòu)域鏈支架如鉸口鯊的新抗原受體(MR)(DooleyHa/(2003)Mol.Immunol.40:25-33)和基于重鏈可變區(qū)的孩i抗體(minibody)(SkerraAandPliickthunA(1988)Science240:1038-1041)。多克隆和單克隆抗體以及它們的片段和衍生物，代表在需要選擇性生物分子識(shí)別的應(yīng)用中親和配體的常規(guī)選擇，例如在才艮據(jù)本發(fā)明對(duì)SATB2蛋白的檢測(cè)和/或定量中。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解，因?yàn)閷?duì)特異性結(jié)合配體的高通量生產(chǎn)和低成本生產(chǎn)系統(tǒng)的需求增加，新的生物分子多樣化技術(shù)在過(guò)去十年中已經(jīng)發(fā)M來(lái)。這使免疫球蛋白源及非免疫球蛋白源的新型親和配體得以生產(chǎn)，所述非免疫球蛋白源被證明同樣可作為結(jié)合配體用于生物分子識(shí)別應(yīng)用并可代替免疫球蛋白，或者與其一起使用。選擇親和配體所需的生物分子多樣性可通過(guò)多種可能的支架分子之一的組合工程來(lái)產(chǎn)生，然后通過(guò)合適的篩選平臺(tái)來(lái)選擇特異性和/或選擇性的親和配體。所述支架分子可以是免疫球蛋白源(BradburyARandMarksJD(2004)J.Immunol.Meths.290:29-49)、非免疫球蛋白源(NygrenPAandSkerraA(2004)J.Immunol.Meths.290:3-28)或寡核苷酸源(GoldL""(1995)Annu.Rev.Biochem.64:763—797)。許多非免疫球蛋白的蛋白支架已經(jīng)被用作新結(jié)合蛋白的開(kāi)發(fā)中的支持結(jié)構(gòu)?？捎糜谏a(chǎn)本發(fā)明中所用抗SATB2的親和配體的這類結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例為，葡萄球菌A蛋白及其結(jié)構(gòu)域和這些結(jié)構(gòu)域的衍生物，如蛋白Z(NordK""(1997)Nat.Biotechnol.15:772-777);脂質(zhì)運(yùn)栽蛋白(BesteGa/(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:1898-1903);錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(BinzHKWa7(2003)J.Mol.Biol.332:489-503);纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)(SmithGPe"/(1998)J.Mol.Biol.277:317-332;Lehti(iJ"W(2000)Proteins41:316-322);y晶體(FiedlerUandRudolphR，W001/04144);綠色熒光蛋白(GFP)(PeelleB"a/(2001)Chem.Biol.8:521—534);人類細(xì)胞毒性T、淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)(HuftonSE"a/(2000)FEBSLett.475:225-231;IrvingRA""(2001)J.Immunol.Meth.248:31-45);蛋白酶抑制劑，如Knottin蛋白(WentzelA"a/(2001)J.Bacteriol.183:7273-7284;BaggioRe"/(2002)J.Mol.Recognit.15:126-134)和庫(kù)尼茲(Kunitz)結(jié)構(gòu)域(RobertsBL""(1992)Gene121:9-15;DermisMSandLazarusRA(1994)J.Biol.Chem.269:22137-22144);PDZ結(jié)構(gòu)域(SchneiderS""(1999)Nat.Biotechnol，17:170-175);肽適體，如為充氧還蛋白(LuZWa/(1995)Biotechnology13:366-372;KlevenzB"(2002)Cell.Mol.LifeSci.59:1993-1998);葡萄球菌核酸酶(NormanTCWa/(1999)Science285:591-595);淀粉酶抑肽(McConellSJandHoessRH(1995)J.Mol.Biol.250:460-479;LiRa/(2003)ProteinEng.16:65-72);基于纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域的trinectin(KoideAe〃/(1998)J.Mol.Biol.284:1141—1151;XuLWa/(2002)Chem.Biol.9:933-942);以及鋅指結(jié)構(gòu)(BianchiEW(1995)J.Mol.Biol.247:154-160;KlugA(1999)J.Mol.Biol.293:215-218;SegalDJ""(2003)Biochemistry42:2137-2148)。18上面提到的非免疫球蛋白的蛋白支架的實(shí)例包括呈現(xiàn)出單隨機(jī)環(huán)的支架蛋白，該環(huán)用于新的結(jié)合特異性的生成；具有剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白支架，該結(jié)構(gòu)中從蛋白表面突出的側(cè)鏈?zhǔn)请S機(jī)的以生成新的結(jié)合特異性；和呈現(xiàn)出不連續(xù)的高變的環(huán)區(qū)的支架，該環(huán)區(qū)用于新結(jié)合特異性的生成。除了非免疫球蛋白的蛋白，寡核苷酸也可被用作親和配體。被稱為適體或誘辨(decoy)的單鏈核酸，折疊成界限清楚的三維結(jié)構(gòu)并以高親和性和特異性與它們的乾標(biāo)結(jié)合(EllingtonADandSzostakJW(1990)Nature346:818-822;BrodyENandGoldL(2000)J.Biotechnol.74:5-13;MayerGandJenneA(2004)BioDrugs18:351—359)。寡核香酸配體既可以是RNA也可以是DNA，并可與4艮多類別的目標(biāo)分子結(jié)合。為了從上面提到的任何支架結(jié)構(gòu)的變體庫(kù)中選擇想要的親和配體，有許多篩選平臺(tái)可用于分離特異的抗所選目標(biāo)蛋白的新型配體。篩選平臺(tái)包括但不限于:喧菌體展示(SmithGP(1985)Science228:1315-1317),核糖體展示(HanesJandPItickthunA(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4937-4942),酵母雙雜交系統(tǒng)(FieldsSandSong0(1989)Nature340:245-246)，mRNA展示(RobertsRWandSzostakJW(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12297-12302)，SELEX(指數(shù)富集式配體系統(tǒng)進(jìn)化)(TuerkCandGoldL(1990)Science249:505-510)和蛋白片段互補(bǔ)測(cè)定法(PCA)(RemyIandMichnickSW(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:5394-5399)。因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可使用如下的親和配體，它是來(lái)自任一上文所列蛋白支架的非免疫球蛋白親和配體，或者是寡核苷酸分子。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的親和配體可纟皮檢測(cè)和/或定量。這種親和配體的檢測(cè)和/或定量可以通過(guò)技術(shù)人員知道的任何在基于生物相互作用的測(cè)定中對(duì)結(jié)合試劑進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的方法完成。因此，如前一部分所述的任何親和配體，可被定量或定性地用于檢測(cè)SATB2蛋白的存在。這些"一級(jí)"親和配體自身可被各種標(biāo)記物標(biāo)記，或者通過(guò)可以檢測(cè)、目測(cè)和/或定量的被標(biāo)記的二級(jí)親和配體間接檢測(cè)。這可以使用多種標(biāo)簽的任何一個(gè)或多個(gè)并使用技術(shù)人員已知的許多技術(shù)中的任何一種或多種來(lái)完成，這其中并不需要任何過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，所述多種標(biāo)簽可與能夠與SATB2相互作用的親和配體或任何二級(jí)親和配體偶聯(lián)?？膳c一級(jí)和/或二級(jí)親和配體偶聯(lián)的標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括熒光染料或金屬(如熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、熒光胺)，發(fā)色團(tuán)染料(如視紫紅質(zhì))，化學(xué)發(fā)光化合物(如魯米那、咪唑)和生物發(fā)光蛋白(如螢光素、螢光素酶)，半抗原(如生物素)。多種其他有用的熒光劑和發(fā)色團(tuán)在StryerL(1968)Science162:526-533和BrandL和GohlkeJR(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868中有描述。親和配體也可凈皮酶(如辣根過(guò)氧物酶、堿性磷酸酯酶和p-內(nèi)酰胺酶)、放射性同位素(如3H、14C、32P、"S或1251)和顆粒(如金)標(biāo)記。不同類型的標(biāo)簽可通過(guò)不同的化學(xué)法與親和配體偶聯(lián)，如胺反應(yīng)或巰基反應(yīng)。但是，也可使用胺和巰基以外的其他反應(yīng)基團(tuán)，如醛、羧酸和谷氨酰胺。本發(fā)明的方法的各方面可通過(guò)數(shù)種已知的形式和設(shè)置中的任何形式和設(shè)置進(jìn)行使用，其非限制性的選擇將在下面討論。在一種基于組織學(xué)的設(shè)置中，一種與SATB2靶標(biāo)結(jié)合的已標(biāo)記的親和配體的檢測(cè)、定位和/或定量可包括視覺(jué)化技術(shù)如光學(xué)顯微鏡或免疫熒光顯微鏡。其他方法可能包括通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或發(fā)光法來(lái)檢測(cè)。如上所闡釋，對(duì)受試者體內(nèi)的SATB2蛋白的檢測(cè)和/或定量可通過(guò)從所述受試者采集生物樣品來(lái)完成，所述生物樣品例如采集自例如結(jié)腸直腸組織、血樣、腦液、尿液或糞便的組織樣(活組織檢查)。將親和配體用于生物樣品以對(duì)SATB2標(biāo)記蛋白檢測(cè)和/或定量。這種方法不僅可檢測(cè)SATB2蛋白，還可顯示其分布和相對(duì)表達(dá)水平。親和配體上的標(biāo)簽的視覺(jué)化方法包括但不限于熒光技術(shù)、發(fā)光技術(shù)和/或酶促技術(shù)。熒光檢測(cè)和/或定量是通過(guò)將熒光標(biāo)簽暴露在在特定波長(zhǎng)的光下，然后對(duì)發(fā)射出來(lái)的特定波長(zhǎng)的光進(jìn)行檢測(cè)和/或定量而實(shí)現(xiàn)。發(fā)光標(biāo)記的親和配體的存在可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)中發(fā)出的光來(lái)檢測(cè)和/或定量。酶促反應(yīng)的檢測(cè)是基于化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的樣品顏色變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，為了正確的檢測(cè)和/或定量，可對(duì)多種不同方法作出修改。在本發(fā)明的方法中，生物樣品可^L固定于固相支持物或載體上，如硝化纖維素或其他任何能夠固定施加于固體支持基質(zhì)本身的生物樣品中存在的任何SATB2蛋白的固體支持基質(zhì)。某些可用于本發(fā)明的熟知的固態(tài)支持材料包括玻璃、碳水化合物(如瓊脂糖凝膠(Sepharose))、尼龍、塑料、毛、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、右旋糖苷、淀粉酶、膜、樹(shù)脂、纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、氧化鋁、輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦。如果一級(jí)親和配體本身沒(méi)有被標(biāo)記，可以用本領(lǐng)域已知的各種緩沖液清洗支持基質(zhì)，然后使其與標(biāo)記的二級(jí)親和配體接觸，再用緩沖液清洗一次以除去未結(jié)合的親和配體，然后可以用常規(guī)方法檢測(cè)和/或定量選擇性的親和配體。親和配體的結(jié)合特性會(huì)隨不同的固態(tài)支持而變化，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)為每個(gè)測(cè)定確定有效的和最佳的測(cè)定條件。本發(fā)明需要的檢測(cè)和/或定量SATB2蛋白的方法是通過(guò)將親和配體連接至一種隨后可以在酶免疫測(cè)定(如EIA或ELISA)中#皮檢測(cè)和/或定量的酶上。這類技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，而且它們的實(shí)現(xiàn)對(duì)于技術(shù)人員而言不存在任何過(guò)分的困難。在這類方法中，使生物樣品與一種固體材料或一種偶聯(lián)有抗SATB2蛋白親和配體的固體材料相接觸，然后它可通過(guò)酶標(biāo)記的二級(jí)親和配體進(jìn)行檢測(cè)和/或定量。隨后，使一種合適的底物在合適的緩沖液中與酶標(biāo)簽反應(yīng)生成一種化學(xué)成分，該化學(xué)成分可用分光光度計(jì)、焚光計(jì)、發(fā)光計(jì)或視覺(jué)化方法檢測(cè)和/或定量。如上所述，一級(jí)和任何二級(jí)親和配體可用放射性同位素標(biāo)記從而能夠被檢測(cè)和/或定量。本發(fā)明中合適的放射性標(biāo)簽的非限制性實(shí)例為3H、14C、32P、"S或1251。經(jīng)標(biāo)記的親和配體的比放射性活度依賴于放射性標(biāo)簽的半衰期、同位素純度和標(biāo)簽是如何摻入親和配體中的。對(duì)親和配體的標(biāo)記優(yōu)選地4吏用熟知的才支術(shù)(WenselTGandMearesCF(1983)in:^3^/0/咖"/20//273^//2^a/zdWadf/0/咖w30t力eraj37(BurchielSWandRhodesBAeds.)Elsevier,NewYork,pp185-196)?？赏ㄟ^(guò)在體內(nèi)或體外檢測(cè)放射活性，將這種經(jīng)放射性標(biāo)記的親和配體用于顯示SATB2蛋白。放射性核掃描(如用y相機(jī))、磁共振波譜或發(fā)射斷層術(shù)可用于體外或體內(nèi)檢測(cè)，而y/P計(jì)數(shù)器、閃爍計(jì)數(shù)器和射線照相術(shù)也可在體外使用。本發(fā)明的另一方面提供了一種用于實(shí)施本發(fā)明上述各方法方面的方法的試劑盒，所述試劑盒包括a)—種能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的可定量的親和配體；和b)對(duì)所述親和配體定量所必需的試劑。本發(fā)明的試劑盒的各種成分按照上面本發(fā)明的方法方面的闡述進(jìn)行選擇和確定。因此，本發(fā)明的試劑盒包含抗SATB2親和配體，以及其他在特異和/或選擇性的親和配體與SATB2特異地和/或選擇性地結(jié)合之后幫助對(duì)所述親和配體定量的工具。例如，本發(fā)明的試劑盒可含有一種二級(jí)親和配體，所述二級(jí)親和配體用于檢測(cè)和/或定量任何由SATB2蛋白與所述能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的親和配體形成的復(fù)合物。本發(fā)明的試劑盒還可含有多種除親和配體之外的輔助物質(zhì)，以使得可容易有效地使用該試劑盒。所述輔助物質(zhì)的實(shí)例包括溶解或復(fù)原該試劑盒中凍干蛋白組分的溶劑、洗滌緩沖液、當(dāng)酶用作標(biāo)簽時(shí)用于測(cè)定酶活性的底物，以及免疫測(cè)定試劑盒中的常用物質(zhì)例如反應(yīng)終止劑。本發(fā)明的試劑盒還可有利地包含用于提供對(duì)照值的對(duì)照樣品，對(duì)照值用于與樣品值相比較。這種對(duì)照樣品可由例如一個(gè)具有預(yù)定量SATB2蛋白的組織樣品構(gòu)成，病理學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可使用所述預(yù)定量的SATB2蛋白，通過(guò)目測(cè)比較或自動(dòng)比較對(duì)照樣品與受試者樣品之間的SATB2表達(dá)水平來(lái)確定SATB2在被研究的樣品中的表達(dá)狀態(tài)。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了SATB2蛋白作為一種預(yù)后標(biāo)記的應(yīng)用。還提供了SATB2蛋白作為一種結(jié)腸直腸癌預(yù)后標(biāo)記的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面提供了SATB2蛋白或其抗原活性片段在制造用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的預(yù)后藥劑中的應(yīng)用。SATB2蛋白的抗原活性片段是足夠大的可用于產(chǎn)生親和配體(如抗體)的片段，該親和配體將與含有所述片段的SATB2蛋白相互作用。在本發(fā)明的這些應(yīng)用方面的實(shí)施方案中，作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，SATB2蛋白的^J^^列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85°/。相同的序列。在某些實(shí)施方案中，上面的序列ii)與SEQIDN0:1至少90%相同，至少91%相同，至少92°/。相同，至少93%相同，至少94%相同，至少95%相同，至少96%相同，至少97%相同，至少98%相同，或者至少99%相同。作為另一個(gè)非限制性的實(shí)例，SATB2蛋白的氨基酸序列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:2;和H)—個(gè)與SEQIDN0:2至少85%相同的序列。在某些實(shí)施方案中，上面的序列ii)與SEQIDN0:2至少90%相同，至少91。/。相同，至少92%相同，至少93。/fl相同，至少94%相同，至少95%相同，至少96%相同，至少97財(cái)目同，至少98%相同，或者至少99%相同。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的親和配體，它是一個(gè)抗體或者抗體的片段或抗體的衍生物。這樣的抗體或者其片段或衍生物，可例如通過(guò)包含用氨基酸序列含有SEQIDNO:1序列的蛋白免疫動(dòng)物的步驟的方法獲得。生成針對(duì)給定靶標(biāo)的抗體或者其衍生物或片段的方法是本領(lǐng)域已知的，且可用于本發(fā)明的這一方面。任何上面討論的SATB2蛋白(SEQIDNO:2)或其抗原活性的片段(SEQIDNO:l)的變體，當(dāng)然可用于這種產(chǎn)生抗體或者其片段或衍生物的方法中。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了才艮據(jù)本發(fā)明的親和配體作為預(yù)后藥劑的應(yīng)用。該應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是將親和配體用作結(jié)腸直腸癌預(yù)后的預(yù)后藥劑。本發(fā)明還提供了所述親和配體用于結(jié)腸直腸癌的預(yù)后的應(yīng)用。作為其相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的親和配體在制造用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的預(yù)后藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還在其另一個(gè)方面提供了一種用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的方法，所述方法包括檢測(cè)SATB2蛋白的步驟。本發(fā)明的這一方面是基于發(fā)現(xiàn)SATB2在一般情況下可以用作結(jié)腸直腸組織一一具體而言，結(jié)腸直腸癌——的蛋白標(biāo)記。如下面要詳述的，針對(duì)SATB2蛋白片段產(chǎn)生的抗體在遠(yuǎn)端胃腸道即闌尾、結(jié)腸和直腸的腺細(xì)胞和結(jié)腸直腸癌中表現(xiàn)出選擇性的強(qiáng)核免疫活性。最顯著的發(fā)現(xiàn)是在ll種結(jié)腸直腸癌中全部都為陽(yáng)性。除了結(jié)腸直腸癌，只在極少數(shù)的其他腫瘤中呈弱或中度陽(yáng)性。另外，SATB2在其他類型癌癥中相對(duì)來(lái)說(shuō)幾乎不存在，這又使針對(duì)SATB2的親和配體成為可特異地將結(jié)腸直腸癌和其他癌癥區(qū)分開(kāi)來(lái)的高度引人關(guān)注的工具。大多數(shù)結(jié)腸直腸癌是腺源的并因此被分類為腺癌。這是一種典型的癌癥類型，并且也可以源自多種其他器官。因此，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)在用于確定腫瘤轉(zhuǎn)移的類型時(shí)受到高度關(guān)注，其中所述腫瘤源自哪個(gè)器官通常是未知的。目前，可用的結(jié)腸直腸癌分子標(biāo)記會(huì)與其他腺癌交叉反應(yīng)，并因此對(duì)腫瘤的定位和轉(zhuǎn)移源的確定造成了困難。本發(fā)明特定的結(jié)腸直腸癌標(biāo)記可使醫(yī)生有效定位癌癥，提供更有效的治療并最終為患者提供更可靠的預(yù)后。本發(fā)明的另一方面包括同時(shí)用SATB2和CK20標(biāo)記來(lái)檢測(cè)癌癥樣品。如實(shí)施例的第6部分所詳述，對(duì)SATB2和CK20表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)在分辨結(jié)腸直腸癌方面的預(yù)測(cè)價(jià)值超過(guò)對(duì)每種標(biāo)記物單獨(dú)檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值。因此，本發(fā)明在此方面提供了一種診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包括檢測(cè)SATB2蛋白和檢測(cè)CK20蛋白的步驟。此外，本發(fā)明還提供了一種通過(guò)檢測(cè)SATB2蛋白和/或CK20蛋白的存在來(lái)檢測(cè)一種轉(zhuǎn)移是否源自結(jié)腸直腸癌的方法。通過(guò)綜合從CK20和SATB2獲得的信息，患者會(huì)更容易地獲得結(jié)腸直腸疾病的精確診斷。技術(shù)人員能夠?qū)Ρ疚年P(guān)于SATB2檢測(cè)的教導(dǎo)作適當(dāng)改變以4吏其適應(yīng)本發(fā)明此方面的方法，并且按照本文的描述和按照例如免疫組織化學(xué)領(lǐng)域的知識(shí)不需要過(guò)分的負(fù)擔(dān)就能進(jìn)行SATB2和CK20的同時(shí)或順序檢測(cè)和/或定量。本發(fā)明的一個(gè)引人關(guān)注的方面是預(yù)測(cè)癌癥患者的SATB2蛋白會(huì)泄漏到血漿和糞便中。作為對(duì)比，一個(gè)熟知的前列腺癌標(biāo)記PSA(也在正常前列腺中表達(dá))甚至在健康患者中也會(huì)從前列腺泄漏到血漿中。但是，許多前列腺癌患者的血漿的PSA水平有所升高，因此對(duì)于具有患前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的男性群體，檢測(cè)PSA水平的升高是一種常用的早期篩選方法。SATB2和結(jié)腸直腸癌之間被預(yù)測(cè)有同樣的聯(lián)系。因此，也可通過(guò)將人類血漿或其他體液或糞便作為本發(fā)明的樣品從而將SATB2用作篩選結(jié)腸直腸癌的工具。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，甚至可能替代目前結(jié)腸直腸癌的篩選方法例如結(jié)腸直腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查，這些檢查非常令人不適因此很多Aj^棄，盡管美國(guó)癌癥研究所建議結(jié)腸直腸癌危險(xiǎn)群體做定期檢查?；诒景l(fā)明的、將SATB2作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記蛋白的篩選方法，對(duì)患此類癌癥的患者的篩查、及早發(fā)現(xiàn)和治療都有^f艮大的好處。在本發(fā)明的背景下，"預(yù)后"是指對(duì)一種疾病及其治療的過(guò)程或結(jié)果的預(yù)測(cè)。預(yù)后也可指一種疾病的存活或瘙愈機(jī)會(huì)的確定，以及對(duì)受試者的預(yù)期存活時(shí)間的預(yù)測(cè)。預(yù)后特別地可包括確定受試者在到將來(lái)的一段時(shí)間內(nèi)存活的可能性，如三年、五年、十年或任何其他時(shí)間段。在本發(fā)明的背景下，"診斷"是指確定一種疾病或病癥的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定。診斷也指通過(guò)這個(gè)過(guò)程得到的結(jié)論。在本文中，"診斷的"是指關(guān)于或有助于確定疾病存在或性質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，"診斷"和"診斷的"也指監(jiān)控一種疾病隨時(shí)間自然發(fā)生的任何改變或者由于治療產(chǎn)生的任何改變。根據(jù)上面的定義，顯然，術(shù)語(yǔ)"預(yù)后"和"診斷"有重疊的意義，它們不互相排斥。在本發(fā)明的背景下，例如一個(gè)親和配體與其靶標(biāo)或抗原的"特異性的"或"選擇性的"相互作用是指特異性和非特異性的相互作用之間的區(qū)別或者選擇性和非選擇性的相互作用之間的區(qū)別具有意義。兩種蛋白之間的相互作用有時(shí)用離解常數(shù)來(lái)衡量。離解常數(shù)描述了兩個(gè)分子之間的結(jié)合(或親和性)強(qiáng)度。一般，抗體及其抗原之間的離解常數(shù)是10—7到10—"M。但高特異性不必需要求高親和性。已證明，對(duì)其對(duì)方具有低親和性(在摩爾范圍內(nèi))的分子已經(jīng)被證明與具有更高親和性的分子的特異性一樣。在本發(fā)明的情況下，特異性的或選擇性的相互作用是指，在天然存在的或經(jīng)加工的生物流體樣品中在存在其他蛋白的給定條件下，使得一種真體方法可用于確定一種特定蛋白即所述靶蛋白或其片段的存在和/或量的程度。換言之，特異性或選擇性是分辨各相關(guān)蛋白的能力。本說(shuō)明書中特異性和選擇性有時(shí)是可互換使用的。在本發(fā)明的背景下，"單特異性抗體"是用其自身抗原親和純化的一群多克隆抗體中的一種，通過(guò)所述親和純化可將該單特異性抗體與其他抗血清蛋白和非特異性抗體分開(kāi)。這種親和純化可產(chǎn)生與自身抗原選擇性結(jié)合的抗體。本發(fā)明中，用一種基于免疫親和的兩步法純化多克隆抗血清，獲得對(duì)目標(biāo)蛋白有選擇性的單特異性抗體。通過(guò)將固定化標(biāo)簽蛋白用作捕獲劑，在初次消耗步驟中除去針對(duì)抗原片段通用親和標(biāo)簽的抗體。在該初次消耗步驟之后，將血清加載到以所述抗原為捕獲劑的第二親和柱，以富集特異性針對(duì)所述抗原的抗體(也可參考MlssonPer(2005)Proteomics5:4327-4337)。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖l說(shuō)明了在含有另外94種不同人類蛋白(兩個(gè)重復(fù))的蛋白微芯片上，針對(duì)SATB2片段(SEQIDNO:1)所生成的抗體的特異性。圖2顯示了純化的單特異性抗體的組織蛋白質(zhì)印跡分析。^McA類細(xì)胞系RT-4(泳道l)、EF0-21(泳道2)和A-431(泳道3),以及從正常人類肝臟(泳道4)和正常人類扁桃體(泳道5)提取的總蛋白提取物。圖3A和3B顯示了(A)正常大腦皮層和海馬體以及(B)正常睪丸的細(xì)胞核中的SATB2的免疫組織化學(xué)染色。圖3C-3E顯示了來(lái)自正常受試者的(C)闌尾、(D)結(jié)腸和(E)直腸的粘膜的腺細(xì)胞中SATB2的染色。圖3F顯示了結(jié)腸粘膜的染色的高倍放大圖。圖4A顯示了所有11個(gè)測(cè)試的結(jié)腸直腸癌樣品(兩個(gè)重復(fù))中的SATB2的免疫組織化學(xué)染色。圖4B顯示了圖4A所示6個(gè)癌癥樣品的高倍放大圖。25圖5顯示了中間分化型結(jié)腸直腸腺癌的免疫組織化學(xué)染色。圖5A(左圖)顯示了有SATB2表達(dá)的切片，而圖5B(右圖)顯示了無(wú)SATB2表達(dá)的切片。顯示的兩胂瘤樣品都是兩份。圖6顯示了基于122名被診斷有結(jié)腸直腸癌的受試者的免疫組織化學(xué)染色的存活分析結(jié)果。根據(jù)SATB2水平的高低對(duì)組織芯(tissuecore)評(píng)分。實(shí)線核分?jǐn)?shù)>25%。虛線/點(diǎn)線核分?jǐn)?shù)<25%。組織取自(A)所有患者、(B)僅女性、(C)所有結(jié)節(jié)陰性患者和(D)結(jié)節(jié)陰性女性。圖7顯示了對(duì)SATB2表達(dá)和常規(guī)結(jié)腸癌標(biāo)記CEA、CK20、CDX2、p53、Ki67和細(xì)胞周期蛋白Bl(CCNB1)表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的216個(gè)癌組織的表達(dá)數(shù)據(jù)的分級(jí)聚類結(jié)果。圖8顯示了基于122個(gè)#1診斷有結(jié)腸直腸癌的受試者組織的免疫組織化學(xué)染色的CK20和SATB2表達(dá)的具體比較。根據(jù)SATB2水平的高低和CK20水平的高^(guò)f氐對(duì)組織芯評(píng)分。圖9顯示了基于17個(gè)被診斷有結(jié)腸直腸癌的受試者的結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移的免疫組織化學(xué)染色的CK20和SATB2表達(dá)的比較。才艮據(jù)SATB核分?jǐn)?shù)和CK20染色對(duì)組織芯評(píng)分。實(shí)例抗SATB2的單特異性抗體的生成和其在正常和癌癥樣品中檢測(cè)SATB2的應(yīng)歷1)抗原的生成以人類基因組序列為模板，用分子信息學(xué)工具設(shè)計(jì)了由EnsEMBLGeneIDENSG00000119042編碼的目標(biāo)蛋白的一個(gè)合適片段(LindskogMe"/(2005)Biotechniques38:723-727，EnsEMBL,www.ensembl.org)。i殳計(jì)由對(duì)應(yīng)于SATB2蛋白(SEQIDNO:2;EnsEMBL登錄號(hào)為ENSP00000260926)第377-499位氬基酸(SEQIDNO:1)的123個(gè)氬基酸組成的一個(gè)片段。以人類總RM庫(kù)組(HumanTotalRMPanelIV，BDBiosciencesClontech)為模板，用含有PlatinumTaq酶的SuperscriptOne-StepRT-PCR擴(kuò)增試劑盒(Invitrogen)分離編碼目標(biāo)蛋白的多核苷酸，該多核普酸含有長(zhǎng)SATB2基因轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO:3;EnsEMBL登錄號(hào)為ENST00000260926)的第1542-1910位核苷酸。通過(guò)PCR擴(kuò)增引物將側(cè)翼限制酶切位點(diǎn)No11和AscI引入到該片段中，使其可框內(nèi)(inframe)克隆到表達(dá)載體中(正向引物GTGTCCCAAGCTGTCTTTG，反向引物CTTGGCCCTTTTaTCTCC)。然后，下游引物凈皮生物素化以允許如前所述的固相克隆，并且產(chǎn)生的生物素化PCR產(chǎn)物被固定在DynabeadsM280Streptavidin(DynalBiotech)上(LarssonMe"/(2000)J.Biotechnol.80:143-157)。通過(guò)NotI-AscI(NewEnglandBiolabs)消化將該片段從固體支持物上釋》文出來(lái)，該片段被框內(nèi)的連入到具有雙親和標(biāo)簽的pAff8c載體(LarssonMa/，見(jiàn)上文)中，所述雙親和標(biāo)簽包括一個(gè)用于固定化金屬離子色鐠(IMAC)純化的六組氨酰標(biāo)簽和一個(gè)來(lái)自鏈球菌蛋白G的免疫增強(qiáng)白蛋白結(jié)合蛋白(ABP)(Sj6landerAa/(1997)J.Immunol.Methods201:115-123;StahlS"a/(1999)EncyclopediaofBioprocessTechnology:Fermentation,BiocatalysisandBioseparation(FleckingerMCandDrewSW，eds)JohnWileyandSonsInc.,NewYork,pp49-63)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(五co")BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen)中。按照廠商建議使用TempliPhiDNA測(cè)序擴(kuò)增試劑盒(GEHealthcare,Uppsala,Sweden),對(duì)擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA進(jìn)行染料終止循環(huán)測(cè)序以確i^克隆的序列。將1ml含有該表達(dá)載體的BL21(DE3)細(xì)胞的過(guò)夜培養(yǎng)物加入到添加有5g/l酵母提取物(MerckKGaA)和50mg/1卡那霉素(Sigma-Aldrich)的100ml30g/1的胰蛋白酶大豆肉湯(MerckKGaA)中進(jìn)行接種，所述過(guò)夜培養(yǎng)物在相同的培養(yǎng)基中。將該細(xì)胞培養(yǎng)物在l升搖瓶中于37°C，150rpm條件下培養(yǎng)，直到600nm處的光密度達(dá)到0.5-1.5。然后加入異丙基-P-D疏乳p比喊糖苦(isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside)(ApolloScientific)至終濃度為lmM以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并且在25。C和l50rpm下繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。以2400g離心來(lái)收集細(xì)胞，再用5ml裂解緩沖液(7M鹽酸胍，47mMNa2HP04，2.65mMNaH2P04，10mMTris-HCl，100mMNaCl,20mMp-巰基乙醇；pH=8.0)重新懸浮沉淀物，然后在37。C，l50rpm下培養(yǎng)2小時(shí)。在以35300g離心之后，收集含有變性和溶解的基因產(chǎn)物的上清液。通過(guò)ASPECXL4TMi(Gilson)的一個(gè)自動(dòng)蛋白純化程序(SteenJetW(2006)ProteinExpr.Purif.46:173-178)，l吏用加有1mlTalon金屬(Co"親和樹(shù)月旨(BDBiosciencesClontech)的色錯(cuò)柱對(duì)具有Hiss標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行固定化金屬離子親和色鐠(IMAC)純化。用20ml變性洗涂緩沖液(6M鹽酸胍，46.6mMNa2HP04，3.4mMNaH2P04，300mMNaCl，pH8.0-8.2)平衡樹(shù)脂。然后用最小量為31.5ml的洗滌緩沖液沖洗樹(shù)脂，再用2.5ml洗脫緩沖液(6M尿素，50mMNaH2P04，100mMNaCl，30mM乙酸，70mM乙酸鈉，pH5.0)洗脫。洗脫下來(lái)的物質(zhì)^皮分為500、700和1300jil三個(gè)級(jí)分。700jLil的級(jí)分含有抗原，該級(jí)分以及收集的500和1300pi的級(jí)分都儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS;1.9mMNaH2P04，8.1mMNa2HP04，154mMNaCl)將該抗原級(jí)分稀釋到尿素的終濃度為1M，然后用截留分子量為7500Da的Vivapore10/20ml濃縮器(VivascienceAG)進(jìn)4亍一個(gè)濃縮步驟以提高蛋白濃度。根據(jù)廠商的建議，用以一種牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品的二喹啉曱酸(bicinchoninicacid，BCA)孩吏測(cè)定方法(Pierce)，測(cè)定蛋白濃度。用一臺(tái)Bioanalyzer4義器通過(guò)用蛋白50或200測(cè)定(AgilentTechno1ogies)來(lái)分析該蛋白質(zhì)量。W絲用特異性針對(duì)所述蛋白片段的引物通過(guò)RT-PCR將對(duì)應(yīng)于STAB2基因長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO:3)的第1542-1910位核苷酸的基因片段^^A類RNA庫(kù)中成功地分離出來(lái)，所述基因片段編碼由目標(biāo)蛋白SATB2(SEQIDNO:2)的第377-499位氨基酸組成的一個(gè)肽(SEQIDNO:1)。但是，與EnsEMBL中ENSG00000119042的序列相比，該序列中有一個(gè)單核苷酸沉默突變。目標(biāo)蛋白(SEQIDNO:2)的123個(gè)M酸片段(SEQIDNO:l)被i殳計(jì)為不含跨膜區(qū)域，以保證其在大腸桿菌中有效表達(dá)；并且被設(shè)計(jì)為不含任何信號(hào)肽，因?yàn)樗鼈冊(cè)诔墒斓鞍字袝?huì)被切除。此外，所述蛋白片段被設(shè)計(jì)為由一段與其他人類蛋白低同源性的獨(dú)特序列組成，以盡可能減少所生成的親和試劑的交叉反應(yīng)；并且被設(shè)計(jì)為具有合適的大小，以允許構(gòu)象表位的形成以及細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)的有效克隆和表達(dá)。鑒定出一個(gè)編碼該正確氨基酸序列的克隆，并且，在大腸桿菌中表達(dá)后產(chǎn)生了正確大小的一個(gè)單一蛋白，隨后用固定化金屬離子色鐠純化。將洗脫出的樣品稀釋到尿素終濃度為1M之后并且濃縮樣品到1ml，測(cè)定該蛋白片段濃度為7.4mg/ml，純度分析結(jié)果為98%的純度。，、",,,fed'Iri，^^^p^/"、按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(Swedishpermitno.A84-02)用上面得到的純化的SATB2片段作為抗原來(lái)免疫家兔。用含200pg抗原的弗氏完全佐劑對(duì)家兔進(jìn)行肌內(nèi)免疫作為初次免疫，然后用含IOO網(wǎng)抗原的弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫三次，每次之間間隔為四周。用基于免疫親和的三步法純化來(lái)自該;故免疫的動(dòng)物的抗血清(AgatonC"W(2004)J.Chromatogr.A1043:33-40;NilssonP"a/(2005)Proteomics5:4327-4337)。第一步，用10xPBS將10ml總抗血清緩沖至lxPBS的終濃度(l.9mMNaH2P04，8.1mMNa2HP04，154mMNaCl)，用0,46nm孔徑的過(guò)濾器(Acrodisc,LifeScience)過(guò)濾，并將其加入到一個(gè)親和柱中，該柱中含有5ml偶合有雙親和標(biāo)簽蛋白His6-ABP(—個(gè)六組氨?；鶚?biāo)簽和一個(gè)白蛋白結(jié)合蛋白標(biāo)簽)的N-羥基琥珀酰亞胺活化的Sepharose4FastFlow填料(GEHealthcare),該標(biāo)簽蛋白His6-ABP是用pAff8c載體表達(dá)并用與上述純化抗原蛋白片段同樣的方法純化。第二步，將流過(guò)全柱的去除了抗雙親和標(biāo)簽His6-ABP的抗體以0.5ml/分鐘的流速載入lmlHi-TrapNHS活化的HP柱(GEHealthcare)中，該柱偶合有用作免疫抗原的SATB2蛋白片段(SEQIDN0:1)。按照廠商的建議，將所述His6-ABP蛋白和所述蛋白片段抗原偶合到冊(cè)S活化的基質(zhì)上。用lxPBST(lxPBS，0.1%吐溫20，pH7.25)洗去沒(méi)有結(jié)合的材料，并且用低pH的甘氨酸緩沖液(0.2M甘氨酸，1mMEGTA，pH2.5)洗脫捕獲到的抗體。洗脫的抗體級(jí)分被自動(dòng)收集，并載入到兩個(gè)串聯(lián)的5mlHiTrap脫鹽柱(GEHealthcare)中，這樣在第三步可進(jìn)行有效的緩沖液置換。第二和第三純化步驟在AKTAxpress，平臺(tái)(GEHealthcare)上進(jìn)行。用添加有終濃度分別為50%和0.02%的甘油和NaN3的PBS緩沖液洗脫該抗原選擇性(單特異性)抗體(msAb)，在-20C長(zhǎng)期儲(chǔ)存(NilssonPa/(2005)Proteomics5:4327-4337)。通it^t自身抗原及蛋白質(zhì)陣列設(shè)置中的其他94種人類蛋白片段的結(jié)合分析，對(duì)親和純化的抗體級(jí)分的特異性和選擇性進(jìn)行分析(Ni1ssonPW29a/(2005)Proteomics5:4327-4337)。將這些蛋白片段在含O.1M尿素的lxPBS(pH7.4)中稀釋至40pg/ml，并且每種取50jil轉(zhuǎn)移到一個(gè)96孑L,泉樣板的孑L中。用4宵環(huán)卩車歹'j,存、樣儀(pin—and—ringarrayer)(Affymetrix427)將這些蛋白片段點(diǎn)加并固定化在環(huán)氧樹(shù)脂載片(SuperEpoxy，TeleChem)上。用lxPBS漂洗該載片5分鐘并且封閉(SuperBlock,Pierce)其表面30分鐘。將一個(gè)粘性16孔硅酮掩罩(Schleicher&Schuell)加在玻璃上，然后加入該單特異性抗體(用lxPBST以1:2000稀釋至大約50ng/ml)并置于搖床上孵育60分鐘。使親和標(biāo)簽特異的IgY抗體與單特異性抗體共同孵育以確定每個(gè)點(diǎn)中的蛋白量。用lxPBST和lxPBS漂洗該載片兩次，每次10分鐘。二抗(偶聯(lián)有Alexa647的山羊抗-兔抗體和偶聯(lián)有Alexa555的山羊抗-雞抗體，MolecularProbes)用lxPBST以1:60000稀釋至30ng/ml，并孵育60分鐘。在進(jìn)行與首次孵育時(shí)的相同洗滌步驟之后，該載片被甩干并掃描(G2565BA陣列掃描儀，Agilent),然后用圖像分析軟件(GenePix5.1，AxonInstruments)對(duì)圖像進(jìn)行定量。結(jié)果在下面討論并示于圖1中。此外，用蛋白質(zhì)印跡法分析該親和純化的抗體的特異性和選擇性。根據(jù)廠商的建議，通過(guò)于還原條件下在預(yù)制的10-20%CriterionSDS-PAGE梯;^(Bio-RadLaboratories)上分離來(lái)自選定人類細(xì)胞系和組織的總蛋白提取物，然后電轉(zhuǎn)導(dǎo)至PVDF膜(Bio-RadLaboratories)上，來(lái)進(jìn)4亍蛋白質(zhì)印跡法。此膜在室溫下封閉(5%奶粉，lxTBST;0.1MTris-HC1,0.5MNaCl，0.5%吐溫20U小時(shí)，與用封閉緩沖液以1:500稀釋的一級(jí)親和純化抗體一起孵育，再用TBST漂洗。將偶聯(lián)HRP的二抗(豬抗兔免疫球蛋白/HRP，DakoCytomation)用封閉緩沖液以l:3000稀釋，并按照廠商的方法，用ChemidocCCD相機(jī)(Bio-RadLaboratories)和SuperSignalWestDuraExtendedDuration底物(Pierce)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。結(jié)果在下面討論并被示于圖2。b)結(jié)果已證明該多克隆抗體制劑的質(zhì)量依賴于該抗體純化的嚴(yán)格程度，并且先前已證明，針對(duì)非目標(biāo)蛋白源的表位的抗體的去除對(duì)于避免與其他蛋白的交叉反應(yīng)和背景結(jié)合而言是必需的(AgatonCWa7(2004)J.Chromatogr.A1043:33-40)。因此，進(jìn)行蛋白樣i陣列分析，確保通過(guò)去除針對(duì)該His6標(biāo)薟的抗體和針對(duì)該ABP標(biāo)簽的抗體，已生成具有高特異性的單特異性多克隆抗體。隨后在帶有固定化的抗原的一個(gè)親和柱上進(jìn)行抗原選擇性抗體的親和捕獲。為對(duì)蛋白陣列的每個(gè)點(diǎn)的蛋白定量，使用了一套聯(lián)合使用一抗和二抗的雙色染料標(biāo)記系統(tǒng)。用Alexa555熒光染料標(biāo)記的山羊抗雞的二抗來(lái)檢測(cè)在雞體內(nèi)生成的標(biāo)簽特異的IgY抗體。用Alexa647熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體檢測(cè)兔msAb與該陣列上其抗原的特異性結(jié)合。在圖1中，陣列結(jié)果以條柱顯示，對(duì)應(yīng)從陣列上每點(diǎn)檢測(cè)到的Alexa647的熒光強(qiáng)度(y軸)的量。每種蛋白片段都重復(fù)點(diǎn)樣兩份，并且圖中x軸上的每個(gè)條柱都代表一個(gè)蛋白點(diǎn)。蛋白陣列分析顯示該親和純化的抗SATB2的單特異性抗體對(duì)正確的蛋白片段具有高度選擇性，并對(duì)該陣列上分析的所有其他蛋白片段呈現(xiàn)一個(gè)4艮低的背景。蛋白質(zhì)印跡法分析的結(jié)果(圖2)顯示該抗體可在一個(gè)膀胱癌細(xì)胞系(RT-4)、一個(gè)卵巢嚢腺癌細(xì)胞系(EF0-21)以及一個(gè)表皮樣細(xì)胞系(A-431)中特異性地檢測(cè)出一條大約100kDa的條帶(1-3泳道)。另外，在肝臟和扁桃腺組織樣品中觀察到一個(gè)較弱的特異性條帶(4-5泳道)。SATB2的理論分子量為82kDa(按SATB2的氨基酸序列SEQIDNO:2計(jì)算)，考慮到該被分析的蛋白在分析條件下可能被糖基化或作其他修飾，獲得的結(jié)果與理論充分符合。3)免疫組織化學(xué)的組織分析總計(jì)用該單特異性抗體樣品分析了576個(gè)含人類組織的石蠟塊。作為供體塊(donorblock)用于制作組織微陣列(TMA)的所有組織都選自烏普薩拉大學(xué)醫(yī)院病理科的檔案，并征得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的同意。檢查相應(yīng)的組織切片以確診并在供體塊中選擇代表區(qū)域。正常組織#:定義為顯樣￡鏡下正常(無(wú)腫瘤)，其中絕大部分選自從手術(shù)切除腫瘤的附近區(qū)域采集的標(biāo)本。檢查癌癥組織以診斷和分類。所有組織用福爾馬林固定、石蠟包埋并進(jìn)行診斷切片。TMA的制作基本上如前人所述(KononenJ(1998)NatureMed.4:844-847;Kallioniemi0P"a/(2001)Hum.Mol.Genet.10:657-662)。簡(jiǎn)言之，在TMA受體塊上制造一個(gè)洞。需要來(lái)自供體塊的一個(gè)核心組織樣品并且將該樣品置于TMA受體塊中-在一個(gè)Bee.cherInstrument(ATA-27，BeecherInstruments,SunPrairie，CA，USA)的自動(dòng)組織陣列點(diǎn)樣儀中重復(fù)進(jìn)行此步驟，直到產(chǎn)生一個(gè)完整的TMA設(shè)計(jì)。TMA受體塊在42。C溫育2小時(shí)，然后切片。TMA設(shè)計(jì)的重點(diǎn)在于從大范圍的代表性正常組織中獲得樣品，以及在于包括代表性癌組織。這在以前的文獻(xiàn)KampfCW(2004)ClinProteomics1:285-300中有詳述。簡(jiǎn)言之，樣品選自48種正常組織和20種人類最常患的癌癥類型。總計(jì)制造了8種不同設(shè)計(jì)的TMA塊，每種都包含72個(gè)lmm直徑的組織芯。2個(gè)TMA代表正常組織，對(duì)應(yīng)于48種從不同個(gè)體獲得的不同的正常組織(設(shè)三個(gè)重復(fù))。剩下的6個(gè)TMA代表選自20種不同癌癥類型的癌組織。對(duì)于20種癌癥類型中的17種，采集了各不相同的12個(gè)腫瘤，并且對(duì)于剩下的3種癌癥類型，采集了各不相同的4個(gè)腫瘤，所有樣品對(duì)于同一腫瘤均設(shè)兩個(gè)重復(fù)。用懸瀑切片機(jī)(waterfallmicrotome)(Leica)將所述TMA塊切成4jiun的厚度并置于SuperFrost(RocheAppliedScience)玻片上用于免疫組織化學(xué)分析。自動(dòng)免疫組織化學(xué)分析的實(shí)現(xiàn)如前人所述(KampfCWa/(2004)Clin.Proteomicsl:285-300)。簡(jiǎn)言之，玻片在60。C孵育45分鐘，在二甲苯中脫蠟(2x15min),然后在分級(jí)乙醇中水化。為回收抗原，將玻片浸于TRS(目標(biāo)回收溶液，pH6.0,DakoCytomation)中，并在Decloakingchamber(BiocareMedical)中于125X:下煮沸4分鐘。將玻片置于Autostainer(DakoCytomation)中，并用H202(DakoCytomation)初步阻斷內(nèi)源過(guò)氧化物酶。該一抗和山羊抗兔過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的Envision⑧都在室溫下孵育30分鐘。每步之間，都用洗滌緩沖液(DakoCytomation)漂洗玻片。最后，用二#^聯(lián)苯胺(DakoCytomation)作為發(fā)色團(tuán)，并用哈里斯(Harris)蘇木精(Sigma-A1drich)進(jìn)行復(fù)染色。用Pertex(Histolab)封固玻片。用ScanScopeT2自動(dòng)切片掃描系統(tǒng)(AperioTechnologies)掃描所有免疫組織化學(xué)染色的8種不同TMA的切片。為了表示8種TMA的總含量，生成了576張數(shù)字圖像。掃描是20倍放大的。數(shù)字圖像被分離并提取成獨(dú)立標(biāo)記的圖像文件格式(TIFF)以儲(chǔ)存原始數(shù)據(jù)。為了能夠在一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的注釋系統(tǒng)中處理圖像，將各圖^^TIFF格式壓縮為JPEG格式。免疫組織化學(xué)染色的組織的所有圖像均在顯微鏡下被人工評(píng)估并被經(jīng)委員會(huì)認(rèn)證的病理學(xué)專家注釋或被專業(yè)人員注釋(然后由病理專家驗(yàn)證)。用一種對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果分類的簡(jiǎn)化方案對(duì)每種不同的正常組織以及癌組織進(jìn)行注釋。檢查每種組織的代表性和免疫反應(yīng)性。注釋包括在每種正常組織類型中的不同組織特異性的細(xì)胞類型。對(duì)每種癌癥，注釋腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)。基本注解參數(shù)包括評(píng)估i)染色強(qiáng)度，ii)染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)和iii)亞細(xì)胞定位(細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜)。按照在臨床組織病理學(xué)診斷中使用的標(biāo)準(zhǔn)主觀評(píng)估染色強(qiáng)度，并且結(jié)果作如下分類陰性-沒(méi)有免疫反應(yīng)性，弱-微弱免疫反應(yīng)性，中度=中等免疫反應(yīng)性或者強(qiáng)=明顯或強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性。染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)被分為免疫反應(yīng)活性細(xì)胞占代表性細(xì)胞群體的比例為<2%，2-25%，26-75°/或>75%?；趶?qiáng)度和免疫反應(yīng)活性細(xì)胞分?jǐn)?shù)，對(duì)每個(gè)組織樣品給出"染色分值"0=陰性，1=弱，2=中度以及3=強(qiáng)。W絲用針對(duì)該人類目標(biāo)蛋白SATB2的一個(gè)重組蛋白片段產(chǎn)生的單特異性抗體進(jìn)行組織分析的結(jié)果顯示在幾種正常組織和結(jié)腸直腸癌中(表l-4及圖3-4)有一種特殊的免疫反應(yīng)性(深灰)。表1顯示了正常人類組織中的該SATB2蛋白表達(dá)模式。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和TMA技術(shù)，篩選了代表48種不同正常組織類型的144個(gè)點(diǎn)(直徑1mm)的SATB2表達(dá)。表1示出了在不同組織中的表達(dá)水平。在遠(yuǎn)端胃腸道組織和腦中兩個(gè)區(qū)域組織中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)(染色分值為3)。在睪丸和附睪中檢測(cè)到中度(染色分值為2)表達(dá)水平。局灶淋巴細(xì)胞顯示出中度或弱(染色分值為1)表達(dá)。所有其他細(xì)胞和組織為陰性(染色分值為0)。N.R.指無(wú)代表性組織。SATB2也在某些神經(jīng)組織和睪丸中表達(dá)。33表1:正常組織中SATB2的表達(dá)模式<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>圖3A顯示了一個(gè)顯微鏡放大圖，其表示大腦皮層和海馬體的神經(jīng)元細(xì)胞核為陽(yáng)性(深灰)。周圍組織和神經(jīng)M細(xì)胞為陰性(淺灰)。睪丸組織切片顯示輸精管中為中度和大部分核陽(yáng)性(深灰)(圖3B)。在關(guān)于本發(fā)明的組織學(xué)陣列中具體發(fā)現(xiàn)了闌尾(圖3C)、結(jié)腸(圖3D)和直腸(圖3E)中的粘膜腺細(xì)胞為明顯、強(qiáng)烈的核陽(yáng)性(深灰)。注意其他細(xì)胞類型如炎性細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的陰性染色(淺灰)，也存在于粘膜中。圖3F示出了結(jié)腸粘膜的兩個(gè)高倍放大圖，顯示出所有腺細(xì)胞具有該SATB2蛋白的強(qiáng)核表達(dá)(深灰)。表2顯示了216個(gè)不同癌癥組織中SATB2的表達(dá)水平。作為代表的所有11個(gè)結(jié)腸直腸癌都顯示陽(yáng)性，并且其中8個(gè)為強(qiáng)表達(dá)。圖4A示出了表示分析的11個(gè)結(jié)腸直腸癌病例的免疫組織化學(xué)染色組織切片的低倍顯微鏡放大圖，同時(shí)4B示出了6個(gè)結(jié)腸直腸癌的代表性區(qū)域的高倍放大圖。大部分癌細(xì)胞顯示強(qiáng)核染色(深灰)，表明SATB2相對(duì)周圍含有正常細(xì)胞的陰性(淺灰)組織呈高水平表達(dá)。表2:SATB2在20種癌癥中的表達(dá)模式癌癥類型受試者編號(hào)123456789101112乳腺癌10000000000N.R.子宮頸癌100000000000結(jié)腸直腸癌33333333211N.R，子宮內(nèi)膜癌000000000000頭頸癌0000腎癌31100000000N.R.肝癌000000000000肺癌200000000000惡性類癌0000惡性膠質(zhì)瘤210000000000惡性、淋巴瘤000000000000惡性黑素瘤000000000N.N.N.R.R.R.卵巢癌100000000000胰癌00000000000N.R.前列腺癌100000000000皮膚癌000000000000胃癌220000000000睪丸癌21000000000N.R.甲狀腺癌0000尿道上皮細(xì)胞癌22000000000N.R.4)結(jié)腸直腸癌TMAa，取自122名在1999到2002年被診斷有結(jié)腸直腸癌的患者(63名女性和59名男性)的福爾馬林固定石蠟包埋的存檔組織，是從瑞典馬爾默37大學(xué)醫(yī)院病理科收集的。患者的年齡中位數(shù)為75(32-88)歲。39個(gè)腫瘤處于DukesA期，42個(gè)處于DukesB期，41個(gè)處于DukesC期。死亡曰期的信息得自地區(qū)所有患者的死因登記。倫理許可得自地方倫理委員會(huì)。所有122個(gè)結(jié)腸直腸癌病例都基于用蘇木精和曙紅染色的切片重新進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。從每個(gè)病例侵襲性癌癥的代表區(qū)域取2個(gè)1.0mm的芯樣以構(gòu)建TMA。TMA的制備和自動(dòng)免疫組織化學(xué)分析的進(jìn)行如上面第3部分所述，所用SATB2抗體的制備如上面第2部分所述。組織注釋的進(jìn)行基本上如上面第3部分所述，除了染色強(qiáng)度只劃分為陰性(無(wú)或弱免疫反應(yīng)性)或陽(yáng)性(中度或強(qiáng)反應(yīng)性)。然后計(jì)算在細(xì)胞核中表現(xiàn)陽(yáng)性染色強(qiáng)度的細(xì)胞分?jǐn)?shù)，產(chǎn)生被稱為"分?jǐn)?shù)分值"的樣品值。因此，"分?jǐn)?shù)分值"對(duì)應(yīng)樣品中根據(jù)本部分中的定義表現(xiàn)為陽(yáng)性染色強(qiáng)度的細(xì)胞百分比?；谒胁煌瑢蛹?jí)的存活趨勢(shì)，建立一個(gè)二元變量用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析，將高/陽(yáng)性的SATB2表達(dá)定義為陽(yáng)性細(xì)胞核〉25%，將低/陰性的SATB2表達(dá)定義為陽(yáng)性細(xì)胞核〈25%。然后基于該分?jǐn)?shù)分值將樣品分為兩組，劃分標(biāo)準(zhǔn)為分?jǐn)?shù)分值為25%。因此，若組織樣品(芯)中的根本沒(méi)有信號(hào)或細(xì)胞的陽(yáng)性染色強(qiáng)度<25%，則該樣品屬于"<25%"組；而若細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度〉25%,則該樣品屬于">25%"組。上述樣品分類被用于基于Kaplan-Meier估計(jì)量的總存活分析，且時(shí)序檢驗(yàn)(thelog-ranktest)也被用于比較不同層級(jí)的存活情況。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙側(cè)檢驗(yàn)，且p值〈Q.05%時(shí)被認(rèn)為具有顯著性。所有計(jì)算都是用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS12.0(SPSSInc.Illinois,USA)進(jìn)行。W絲對(duì)122個(gè)結(jié)腸直腸癌的組織微陣列分析顯示，99個(gè)腫瘤(81%)為SATB2陽(yáng)性。令人驚訝地，不能通過(guò)常規(guī)切片或組化染色來(lái)預(yù)測(cè)SATB2的低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，如圖5所示。兩個(gè)肺瘤樣品(一式兩份的切片)都被診斷為中間分化型直腸腺癌。圖5A顯示出一個(gè)SATB2強(qiáng)表達(dá)的切片；而在圖5B中，樣品無(wú)SATB2表達(dá)。存活分析的結(jié)果示于圖6，該圖表顯示了不同患者組隨時(shí)間的累計(jì)存活?；谌炕颊叩拇婊罘治鲲@示了一個(gè)趨勢(shì)(p=0.14)，即患有SATB2低表達(dá)腫瘤的患者的總存活時(shí)間(0S)更短(圖6A)。還考察了SATB2表達(dá)與臨床病理學(xué)變量性別及Dukes期之間的關(guān)系?；加蠸ATB2低表達(dá)肺瘤的女性患者(n-63)相對(duì)全部受試者其OS更短的趨勢(shì)增加(p=0.11)(圖6B)。圖6C顯示了在結(jié)節(jié)陰性(DukesA和B期)的患者(n-80)中觀察到相似的趨勢(shì)(p=0.10)。在節(jié)結(jié)陰性的女性患者(n=44)的亞群中，此趨勢(shì)很顯著(P=0.04)(圖6D)。提供存活分析數(shù)據(jù)的其他方法可以是應(yīng)用上面第3部分所述的"染色分值"。這種情況下，分值為0和1的樣品會(huì)被定義為SATB2低表達(dá)，分值為2和3的樣品會(huì)被定義為SATB2高表達(dá)。預(yù)期其結(jié)果類似于圖6所顯示。5)TMA數(shù)據(jù)的定量圖像分析為了進(jìn)行定量表達(dá)測(cè)量，4吏用AperioScanScopeCSSlideScanner(AperioTechnologies,Vista，CA，USA)系統(tǒng)來(lái)捕獲按上面第4部分所述制備的雜交的TMA玻片的數(shù)字圖像。進(jìn)行20倍放大掃描且圖像被儲(chǔ)存為多層TIFF格式。使用ImageScope(Aperio)來(lái)瀏覽這些適合分析的數(shù)字圖像。使用TMALab(Aperio)對(duì)這些圖像去排列以觀察單個(gè)組織芯。首先，使用ColorDeconvolution算法(Aperio)將每個(gè)圖像分離到三個(gè)通道，即紅、綠和藍(lán)(RGB)。這使得每種染色可被分別測(cè)量，并因此可從二l^聯(lián)笨胺鉻精(chromogene)染色中減去蘇木精復(fù)染色。然后，將許多不同的算法用于對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜的染色定量。IHCNuclear算法(Aperio)被用于定量SATB2的核染色。基于強(qiáng)度來(lái)識(shí)別核。使用一種邊界閾值法來(lái)識(shí)別核的邊界，這種方法可根據(jù)邊界像素的平均值來(lái)自動(dòng)調(diào)整閾值。從AperioTechnologies可得到所有算法的完整介紹。TMA上每個(gè)芯的偽色補(bǔ)償圖像被生成和評(píng)估以確認(rèn)每種算法的精確性。Nuclear算法的輸出值是陽(yáng)性核的一個(gè)百分比和TMA玻片上每個(gè)芯的一個(gè)核RGB強(qiáng)度值。通過(guò)用每個(gè)芯的核RGB強(qiáng)度乘以陽(yáng)性核的百分比來(lái)計(jì)算每個(gè)組織芯上SATB2表達(dá)水平的一個(gè)自動(dòng)分值(AS)。對(duì)于例如上面第4部分所述的癌癥TMA樣品和根據(jù)Kap1an_Meier方法估計(jì)的總存活進(jìn)行AS分析。時(shí)序檢驗(yàn)用于比較不同層級(jí)的存活。統(tǒng)計(jì)計(jì)算是用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS12.0(SPSSInc.Illinois,USA)進(jìn)行的。6)聚類分析為了研究已知的結(jié)腸癌標(biāo)記和SATB2之間在蛋白表達(dá)上的一致性，進(jìn)行分級(jí)聚類分析。聚類是一種評(píng)估初始挖掘步驟的數(shù)據(jù)的趁勢(shì)和結(jié)構(gòu)的合適方法。只瀏覽數(shù)據(jù)集時(shí)不明顯的分組和分類可以容易地通過(guò)非監(jiān)督式方法例如分級(jí)聚類檢測(cè)出來(lái)。在生命科學(xué)中，聚類已經(jīng)十分廣泛地用于RNA轉(zhuǎn)錄分析，如微陣列數(shù)據(jù)。第3部分所述的6種癌癥TMA被再次使用，即共計(jì)216個(gè)癌組織樣品。除了按上面第2部分制備的識(shí)別SATB2的抗體，4十對(duì)已知標(biāo)記CEA(DAK0，Glostrup,Denmark)、CK20(魔0，Glostrup，Denmark)、CDX2(Novocastra，NewcastleuponTyne，UK)、p53(DAK0，Glostrup,Denmark)、Ki67(DAKO，Glostrup,Denmark)和CyclinBl(Transductionlaboratories,Lexington,USA)的抗體也通過(guò)一種自動(dòng)免疫組織化學(xué)方法蜂皮檢測(cè)，該方法類似于第3部分中所述。如第3部分所述由病理學(xué)家注釋TMA，并對(duì)每個(gè)芯給出Q-3范圍的一個(gè)染色分值，其中3是強(qiáng)(黑)染色而0是無(wú)(白)染色。用統(tǒng)計(jì)計(jì)算語(yǔ)言R進(jìn)行聚類分析。將聚類算法用于數(shù)據(jù)矩陣的兩個(gè)維度，即組織和抗體。聚類過(guò)程總計(jì)使用了7個(gè)抗體和216個(gè)組織。8個(gè)組織由于沒(méi)有可定量表達(dá)水平的圖像而被去掉。使用自上而下的分級(jí)方法進(jìn)行群聚分析，該方法使用了基于歐幾里得距離公制的平均集聚，其中群之間的距離在每個(gè)階段都使用Lance-Williams差異更新公式根據(jù)平均連接重新計(jì)算。聚類所用算法決定了子樹(shù)(sub-tree)從而使更緊的群示于每個(gè)節(jié)點(diǎn)的左側(cè)。為了進(jìn)一步研究SATB2和CK20的異同，使用具有第4部分所述的122個(gè)癌組織芯的癌組織TMA進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。用按第2部分所述制備的SATB2抗體和獲自DAK0(Glostrup,Denmark)的CK20抗體對(duì)TMA染色。根據(jù)第4部分中定義的"分?jǐn)?shù)分值，，注釋兩個(gè)TMA,然后比較。W潛果在216個(gè)不同腫瘤中檢查SATB2與已知標(biāo)記CEA、CK20、CDX2、p53、Ki67和CyclinBl相比較作為結(jié)腸直腸癌標(biāo)記的特異性。對(duì)這7種不同蛋白的表達(dá)語(yǔ)的數(shù)據(jù)的分級(jí)聚類得出了熱圖和伴隨的樹(shù)狀圖，如圖7所示。從腫瘤的熱圖和樹(shù)狀圖清楚地看出，大部分結(jié)腸直腸癌形成一個(gè)群集,該群集基于SATB2、CK20、CDX2和CEA高表達(dá)水平以最高水平^皮分離。另外，分析顯示SATB2群集以及CK20和CDX2群集都具有比其他顯示出更一般的表達(dá)模式的被測(cè)標(biāo)記更特異的表達(dá)。在8個(gè)結(jié)腸直腸癌的群集中，也有強(qiáng)SATB2陽(yáng)性的一個(gè)宮頸腺癌和一個(gè)膽管細(xì)胞型肝癌病例。除該群集外，有三個(gè)結(jié)腸直腸癌為SATB2陰性。引人注意的是，SATB2表ii^莫式與CK20的表達(dá)沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)，因此能夠在結(jié)腸直腸癌鑒定中作為CK20的補(bǔ)充。在第4部分所描述的122個(gè)癌組織的TMA上對(duì)SATB2和CK20進(jìn)行了更詳細(xì)的分析。其中，按照分值分值〉25%的標(biāo)準(zhǔn)，單獨(dú)的CK20確認(rèn)為122個(gè)結(jié)腸直腸癌的86%(105/122),且單獨(dú)的SATB2確認(rèn)為8iy。(99/122)(圖8)。引人注意的是，結(jié)合兩種標(biāo)記的染色數(shù)據(jù)，93%(113/122)的結(jié)腸直腸癌明顯地對(duì)兩種標(biāo)記中的一種或兩種呈陽(yáng)性。只有5名患者完全缺乏CK20或SATB2的表達(dá)。這個(gè)信息在診斷癌癥時(shí)——更具體來(lái)說(shuō)在試圖鑒定轉(zhuǎn)移時(shí)_一是有價(jià)值的，因?yàn)榘┌Y的一個(gè)臨床常見(jiàn)問(wèn)題是患者出現(xiàn)來(lái)源未知的轉(zhuǎn)移。因此，通過(guò)結(jié)合得自CK20和SATB2的信息，患者可更容易地獲得結(jié)腸直腸腺癌的精確診斷。另外，還分析了SATB2和CK20在17個(gè)結(jié)腸直腸癌患者的j^巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)。按照染色分值為2或3，單獨(dú)的CK20確認(rèn)為88%(15/17)的轉(zhuǎn)移的來(lái)源。按照分?jǐn)?shù)分值〉25%,單獨(dú)的SATB2確認(rèn)為82%(14/17)的轉(zhuǎn)移的來(lái)源(圖9)。結(jié)合兩種標(biāo)記的染色數(shù)據(jù)，確認(rèn)了94%(16/17)的轉(zhuǎn)移的來(lái)源。這進(jìn)一步支持了在確定轉(zhuǎn)移是否源自結(jié)腸直腸癌時(shí)，關(guān)于SATB2和CK20表達(dá)的信息是人們希望得到的。本發(fā)明實(shí)施方案的逐項(xiàng)列表下面是本發(fā)明實(shí)施方案的非限制性逐項(xiàng)列表，目的是提供關(guān)于本發(fā)明某些方面的各個(gè)特征和組合的進(jìn)一步的信息。1.診斷結(jié)腸直腸癌的方法，包含檢測(cè)SATB2蛋白的一個(gè)步驟。2.根據(jù)第l項(xiàng)的方法，其中所述SATB2蛋白的M酸序列包括選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85%相同的序列。3.根據(jù)前述項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括選自如下的序列i)SEQIDNO:2;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:2至少85%相同的序列。4.才艮據(jù)前述項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，包括下列步驟a)提供來(lái)自懷疑患有結(jié)腸直腸癌的患者的樣品；b)對(duì)所述樣品應(yīng)用可檢測(cè)的親和配體，所述親和配體可選擇性地與待檢測(cè)的SATB2蛋白相互作用，所述應(yīng)用是在允許親和配體與存在于樣品中的任何SATB2蛋白結(jié)合的條件下施行的。c)除去未結(jié)合的親和配體；并且d)檢測(cè)與該樣品保持關(guān)聯(lián)的任何親和配體。5.才艮據(jù)第4項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種體液樣品。6.根據(jù)第5項(xiàng)的方法，其中所述體液選自下組，其構(gòu)成為血液、血漿、血清、腦液、尿液、精液和滲出液。7.根據(jù)第4項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種糞便樣品。8.根據(jù)第4項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種組織樣品。9.根據(jù)第4項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種細(xì)胞學(xué)樣品。10.根據(jù)第4-9項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)的親和配體選自抗體、其片段和其衍生物。11.根據(jù)第4-9項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)的親和配體是源自一種支架的蛋白配體，該支架選自下組，其構(gòu)成為葡萄球菌A蛋白及其結(jié)構(gòu)42域、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Y晶體、綠色熒光蛋白、人類細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、蛋白酶抑制劑、PDZ結(jié)構(gòu)域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)。12.根據(jù)第4-9項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)的親和配體是一種寡核苷酸分子。13.根據(jù)4-12項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)的親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。14.根據(jù)第4-12項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法，其中所述可檢測(cè)的親和配體是用一種能夠識(shí)別所述可檢測(cè)的親和配體的二級(jí)親和配體檢測(cè)的。15.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中所述能夠識(shí)別所述可檢測(cè)的親和配體的二級(jí)親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。16.執(zhí)行第1-15項(xiàng)的任一項(xiàng)的方法的試劑盒，所述試劑盒包括a)能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的可檢測(cè)的親和配體；和b)用于檢測(cè)親和配體存在的必需的試劑。17.根據(jù)第16項(xiàng)的試劑盒，其中所述可檢測(cè)的親和配體選自抗體、其片段和其衍生物。18.根據(jù)第16項(xiàng)的試劑盒，其中所述可檢測(cè)的親和配體是源自一種支架的蛋白配體，該支架選自下組，其構(gòu)成為葡萄球菌A蛋白及其結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Y晶體、綠色熒光蛋白、人類細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、蛋白酶抑制劑、PDZ結(jié)構(gòu)域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)。4319.根據(jù)第16項(xiàng)的試劑盒，其中所述可檢測(cè)的親和配體是一種寡核苷酸分子。20.根據(jù)第16-19項(xiàng)的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述可檢測(cè)的親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。21.根據(jù)第16-19項(xiàng)的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述用于檢測(cè)所述親和配體存在所必需的試劑包括能夠識(shí)別所述可檢測(cè)的親和配體的二級(jí)親和配體。22.才艮據(jù)第21項(xiàng)的試劑盒，其中所述所述能夠識(shí)別所述可檢測(cè)的親和配體的二級(jí)親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料或金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。23.SATB2蛋白作為一種結(jié)腸直腸癌診斷標(biāo)記的應(yīng)用。24.SATB2蛋白或其抗原活性的片段在制造用于診斷結(jié)腸直腸癌的診斷試劑中的應(yīng)用。25.根據(jù)第23和24的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述SATB2蛋白的^酸序列包括選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85°/。相同的序列。26.根據(jù)第23和24項(xiàng)的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述SATB2蛋白的氨基^列包括選自如下序列i)SEQIDNO:2;和H)—個(gè)與SEQIDNO:2至少85。/。相同的序列。27.能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的親和配體，所述親和配體是一種抗體或其片段或其衍生物。28.才艮據(jù)第27項(xiàng)的親和配體，所述親和配體可從一種包括用一種蛋白免疫動(dòng)物的步驟的方法中獲得，所述蛋白的M酸序列包含SEQIDN0:1序列。29.根據(jù)第27-28項(xiàng)的任一項(xiàng)的親和配體作為診斷試劑的應(yīng)用。30.根據(jù)第27-28項(xiàng)的任一項(xiàng)的親和配體在制造用于診斷結(jié)腸直腸癌的診斷試劑中的應(yīng)用。權(quán)利要求1確定患有或懷疑患有結(jié)腸直腸癌的哺乳動(dòng)物受試者的結(jié)腸直腸癌預(yù)后是否不良的方法，包括以下步驟a)提供一個(gè)來(lái)自該受試者的樣品；b)對(duì)存在于所述樣品中的SATB2蛋白進(jìn)行定量以得到一個(gè)樣品值；c)將得自步驟b)的樣品值與一個(gè)對(duì)照值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值低于所述對(duì)照值，d)則判斷所述受試者的結(jié)腸直腸癌預(yù)后不良。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中步驟d)中的不良預(yù)后對(duì)應(yīng)五年存活的可能性為65%或更低。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中步驟d)中的不良預(yù)后對(duì)應(yīng)五年存活的可能性為60%或更低。4.對(duì)有需要的結(jié)腸直腸癌受試者的治療方法，包括a)提供一個(gè)來(lái)自該受試者的樣品；b)對(duì)存在于所述樣品中的SATB2蛋白進(jìn)行定量，得到一個(gè)樣品值；c)將得自步驟b)的樣品值與對(duì)照值進(jìn)行比較；并且，如果所述樣品值低于所述對(duì)照值，d)則用一個(gè)適用于結(jié)腸直腸癌的預(yù)后不良的治療方案治療所述受試者。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所迷治療方案選自化學(xué)療法、新輔助療法及它們的組合。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述治療方案為新輔助療法。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述新輔助療法選自i)^5U文射療法和ii)放射療法結(jié)合化學(xué)療法。8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是結(jié)節(jié)陰性的。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌處于DukesA孰D刑o10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸腺瘤。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是結(jié)腸直腸上皮癌(colo-rectalcarcinoma)。12.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌是轉(zhuǎn)移性癌。13.根據(jù)權(quán)利要求1-7和12的任一項(xiàng)的方法，其中所述結(jié)腸直腸癌處于DukesC期。14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人類。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述受試者是女性。16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照值是一個(gè)預(yù)定值，該值與一個(gè)對(duì)照樣品中的SATB2表達(dá)量相對(duì)應(yīng)。17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照值是SATB2陽(yáng)性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)分值為50%。18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述對(duì)照值是SATB2陽(yáng)性細(xì)胞的分?jǐn)?shù)分值為25%。19.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照值是SATB2表達(dá)的自動(dòng)分值為70。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述對(duì)照值是SATB2表達(dá)的自動(dòng)分值為50。21.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種體液樣品。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述體液選自下組，其構(gòu)成為血液、血漿、血清、腦液、尿液、精液和滲出液。23.根據(jù)權(quán)利要求l-20任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種糞便樣品。24.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種組織樣品。25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述組織樣品是一種結(jié)腸直腸組織樣品。26.根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是一種細(xì)胞學(xué)樣品。27.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述SATB2蛋白的M酸序列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85°/。相同的序列。28.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述SATB2蛋白的氨基酸序列包括一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:2;和ii)一個(gè)與SEQIDN0:2至少85°/。相同的序列。29.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括bl)對(duì)所述樣品應(yīng)用一種可定量的親和配體，所述親和配體能夠選擇性地與待定量的SATB2蛋白相互作用，所述應(yīng)用是在^f吏所述親和配體能夠與存在于所述樣品中的任何SATB2蛋白結(jié)合的條件下施行的；b2)除去未結(jié)合的親和配體；并且b3)對(duì)與該樣品保持相關(guān)聯(lián)的任何親和配體進(jìn)行定量。30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述可定量的親和配體選自下組，其構(gòu)成為抗體、其片段和其衍生物。31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述可定量的親和配體是源自一種支架的蛋白配體，該支架選自下組，其構(gòu)成為葡萄球菌A蛋白及其結(jié)構(gòu)域、月旨質(zhì)運(yùn)載蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Y晶體、綠色熒光蛋白、人類細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、蛋白酶抑制劑、PDZ結(jié)構(gòu)域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)。32.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述可定量的親和配體是一種寡核苷酸分子。33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述可定量的親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。34.根據(jù)權(quán)利要求29-33的任一項(xiàng)的方法，其中所述可定量的親和配體是用一種能夠識(shí)別所述可定量的親和配體的二級(jí)親和配體檢測(cè)的。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述能夠識(shí)別所述可定量的親和配體的二級(jí)親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。36.執(zhí)行根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法的試劑盒，所述試劑盒包括a)能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的可定量的親和配體；和b)對(duì)所述親和配體進(jìn)行定量所必需的試劑。37.根據(jù)權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述可定量的親和配體選自下組，其構(gòu)成為抗體、其片段和其衍生物。38.根據(jù)權(quán)利要求36的試劑盒，其中所述可定量的親和配體是源自一種支架的蛋白配體，該支架選自下組，其構(gòu)成為葡萄球菌A蛋白及其結(jié)構(gòu)域、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Y晶體、綠色熒光蛋白、人類細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、蛋白酶抑制劑、PDZ結(jié)構(gòu)域、肽適體、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)。39.根據(jù)權(quán)利要求36的試劑盒，其中可定量的親和配體是一種寡核苷酸分子。40.根據(jù)權(quán)利要求36-39的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述可檢測(cè)的親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自焚光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。41.根據(jù)權(quán)利要求36-39的任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述用于親和配體進(jìn)行定量的必需試劑包括能夠識(shí)別所述可定量的親和配體的一種二級(jí)親和配體。42.根據(jù)權(quán)利要求41的試劑盒，其中所述能夠識(shí)別所述可定量的親和配體的二級(jí)親和配體含有一個(gè)標(biāo)簽，該標(biāo)簽選自下組，其構(gòu)成為熒光染料或金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性同位素和顆粒。43.根據(jù)權(quán)利要求36-42的任一項(xiàng)所述的試劑盒，所述試劑盒還包括用于提供對(duì)照值的一個(gè)對(duì)照樣品。44.SATB2蛋白作為一種預(yù)后標(biāo)記的應(yīng)用。45.SATB2蛋白作為一種結(jié)腸直腸癌預(yù)后標(biāo)記的應(yīng)用。46.SATB2蛋白或其抗原活性片段在制造用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的預(yù)后試劑中的應(yīng)用。47.根據(jù)權(quán)利要求44-46任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述SATB2蛋白的氨基^列包含一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:1;和ii)一個(gè)與SEQIDNO:1至少85%相同的序列。48.根據(jù)權(quán)利要求44-46任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述SATB2蛋白的氨基^列包含一個(gè)選自如下的序列i)SEQIDNO:2;和ii)一個(gè)與SEQIDN0:2至少85°/。相同的序列。49.能夠選擇性地與SATB2蛋白相互作用的親和配體，所述親和配體是一種抗體或其片段或衍生物。50.根據(jù)權(quán)利要求49的親和配體，所述親和配體可從一種包括用一種蛋白免疫動(dòng)物的步驟的方法中獲得，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQIDN0:1序列。51.才艮據(jù)權(quán)利要求49和50的任一項(xiàng)的親和配體作為預(yù)后試劑的應(yīng)用。52.根據(jù)權(quán)利要求49和50的任一項(xiàng)的親和配體用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的應(yīng)用。53.根據(jù)權(quán)利要求49和50的任一項(xiàng)的親和配體在制造用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后的預(yù)后試劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明通過(guò)識(shí)別作為結(jié)腸直腸癌類型的標(biāo)記的SATB2蛋白，提供了與這種癌癥的檢測(cè)、鑒定和預(yù)后有關(guān)的新方法、手段和應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/574GK101460850SQ200780020492公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日發(fā)明者F·龐蒂恩,M·烏萊恩申請(qǐng)人:阿特拉斯抗體有限公司