專利名稱：即用全血收集容器的制作方法
即用全血收集容器
本發(fā)明涉及用于收集和處理全血樣品的采樣管。該采樣管含有用 于差異溶血全血的試劑，其中所述用于差異溶血的試劑含有用于差異
溶血的化學品和抗凝劑，其中所述采樣管為即用型(ready-to-use) — 次性使用的采樣管。本發(fā)明還涉及所述采樣管在處理液相色譜的全血 樣品中的用途，還涉及在此采樣管中處理過的血樣在基于液相色譜的 分析中的用途。
發(fā)明嘴景
在臨床常規(guī)中，血液是最重要的待分析樣品源。盡管全血是首先 獲得的樣品，但全血樣品通常必須進一步處理，以便進行便利的樣品 操作或可靠的分析物檢測。
樣品中存在的成分越多，分析其中包含的目標分析物就越困難。 紅細胞含有顯著量的蛋白和小分子量成分，其潛在干擾待檢測的任何 分析物。這就是為什么在臨床常規(guī)中優(yōu)選分別使用血漿(經(jīng)常筒稱為血 漿，即抗凝結的全血樣品；沒有細胞和紅細胞)或血清(經(jīng)常簡稱為血 清，即凝結的全血；沒有細胞、紅細胞和凝血系統(tǒng)的大部分蛋白，尤 其是沒有血纖維蛋白/血纖維蛋白原)的主要原因之一。全血樣品往往 還更難以操作，例如與血清或血漿相比。全血往往不穩(wěn)定，紅細胞的 緩慢破裂損害相當多的目標分析物的可靠檢測。另外，全血樣品的運 輸和儲存需要特殊的防護措施。
如果必須檢測全血中的分析物， 一般習慣于收集全血樣品并在用 適宜的抗凝劑收集血液的過程中或之后立即處理該樣品。在臨床常規(guī) 中，預裝有適宜的抗凝劑的管用于收集全血樣品。顧名思義，這些抗 凝劑阻斷凝結系統(tǒng)的活化。血細胞和紅細胞應盡可能多并盡可能長時間地保持完整。對抗凝結的血液必須非常小心地操作，以便避免例如 由血細胞或紅細胞沉降引起的問題，或由紅細胞裂解引起的問題。通 常，等份試樣的該抗凝結全血樣品隨后用于檢測目標分析物，例如至 少部分地包含在紅細胞中的分析物。
另外，在這一方面，目前在所有現(xiàn)有的在線檢測方法中使用全血 樣品似乎都不可行。例如，在需要基于液相色譜(LC)的分離步驟的臨 床診斷常規(guī)程序中，不可能使用全血樣品。常規(guī)液相色譜分離通?；?于基本上由保護柱材料的過濾單元或濾頭和分離目標分析物所需的 柱材料組成的柱子。如果將全血施加于這樣的柱子，則該柱將相當快 地乃至立刻^^阻塞，這取決于柱子大小和系統(tǒng)。該問題使得幾乎不可
能在與例如在臨床常規(guī)診斷中優(yōu)選的LC-法組合的在線檢測方法中使 用全血。目前，似乎必須通過例如離心、過濾、沉淀或分析物寸是取適 宜地分離/處理血樣，然后可以正確地和可靠地分析這些已處理樣品。
如上所述，可由全血獲得血清或血漿，并用于檢測分析物。在理 論上，細胞和紅細胞還可以通過過濾或離心由全血中除去。然而，這 些方法既不適用于常規(guī)診斷環(huán)境，又不會使它們正確檢測至少部分地 存在于紅細胞中的那些分析物。
在另 一種樣品處理方式中，首先通過選擇性沉淀或提取方法將目 標分析物與大量潛在干擾物質分離。提取可以在液相中或在固相上進 行。這將通過舉例說明用于檢測免疫抑制藥物的某些方法加以例證。
眾所周知的免疫抑制藥物為例如霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素 (RAPA,也稱為西羅莫司)和他克莫司(FK-506)。免疫抑制藥物的治療 藥物監(jiān)測對移植患者以及罹患AIDS的患者尤其重要(參見例如:Drug. Ther. Perspect 17 (2001) 8-12)。進行實體器官移植的大部分患者需要終 身的免疫抑制治療，以防止同種異體移植排斥。但是，因為許多免疫 抑制劑的治療范圍(也稱為治療窗)狹窄，并伴有多種毒性和藥物相互 作用潛力，所以治療藥物監(jiān)測(TDM)連同患者的臨床評價一起使用可 能特別重要。
5霉酚酸酯是一種前藥。在口服給藥后，霉酴酸酯(MMF)在腸和血 液中進行快速水解，形成其活性代謝物霉酚酸(MPA)。 MMF可廣泛應 用，在美國和英國被批準與皮質類固醇和環(huán)孢菌素聯(lián)合用于預防腎 臟、肝臟或心臟的同種異體移植排斥。該藥物在降低腎臟同種異體移 植的急性排斥發(fā)病率方面已證實優(yōu)于咪唑硫嘌呤。治療劑谷濃度在 1-3.5 mg/L的范圍內。MMF可由血漿和全血4僉測。
他克莫司是大環(huán)內酯抗生素，首先由美國食品和藥品監(jiān)督管理局 (FDA)于1994年批準用于預防肝臟同種異體移植排斥。其在體外的效 力高達環(huán)孢菌素的IOO倍，在臨床上，其與組織排斥發(fā)病率的大幅下 降相關。他克莫司在進行各種不同移植程序的患者中作為一線免疫抑 制治療和作為拯救治療用于肝臟或腎臟移植后難醫(yī)治的急性同種異 體移植排斥患者這兩方面均已經(jīng)證實有效。治療劑谷濃度在5-20 fig/L 的范圍內。
因為循環(huán)中存在的至少部分他克莫司被分隔在紅細胞中，所以在 該藥物的臨床常規(guī)檢測中使用全血樣品。他克莫司例如可以通過高效 液相層析(HPLC)、 HPLC質語(MS)、放射性受體測定(RRA)或免疫測 定(IA)檢測。后兩種方法檢測他克莫司及其多種代謝物中的某一些的 靈敏度不同。這可能對所用方法產(chǎn)生干擾(Murthy, J. N.等，Clin. Biochem. 31 (1998) 613-617)。至少在多種他克莫司代謝物的檢測中 HPLC-MS-法可被認為是金標準。然而，以上提及的所有方法均需要 由全血提取他克莫司。通常，在臨床常規(guī)中使用乙腈由全血提取他克 莫司，似乎不存在會允許由全血樣品在線檢測他克莫司的方法。
西羅莫司和他克莫司一樣，是一種大環(huán)內酯抗生素。其首先在 1999年被US FDA批準用于預防腎臟移植后的同種異體移植排斥，實 際上其在聯(lián)合環(huán)孢菌素和皮質類固醇急性使用時在這方面已經(jīng)顯示 出有前景的結果。在體外，西羅莫司的效力高達環(huán)孢菌素的IOO倍， 在臨床上，其可以與環(huán)孢菌素表現(xiàn)出協(xié)同性，這可能使環(huán)孢菌素劑量 下降。治療劑谷濃度在5-15pg/L的范圍內。
6對于他克莫司，在紅細胞中存在顯著量的西羅莫司。因此，不論 使用哪種檢測方法，都需要提取全血樣品。在臨床常規(guī)中，對疑似含
有西羅莫司的樣品進行HPLC，西羅莫司通過紫外線(UV)或通過 MS/MS檢測。最近，還已描述了一種微粒酶免疫測定(Jones, K.等， Clinical Therapeutics 22,增刊B (2000) B49-B61)。
葉酸是氧化狀態(tài)不同的 一類相關分子的共同名稱。葉酸是水溶性 維生素B族的組成部分，作為輔酶對高半胱氨酸代謝和DNA復制所 需的一碳基團的轉移很重要。葉酸不足狀態(tài)與神經(jīng)管缺陷的風險增加 相關，與心血管疾病、貧血、某些癌癥和阿爾茨海默氏病有關聯(lián)。血 清或血漿葉酸濃度反映出近期的膳食攝取，而紅細胞葉酸濃度更加表 現(xiàn)出身體儲備(Gunter， E.W.等，Clin. Chem. 42 (1996) 1689-1694; Fazili, Z.等，CIin. Oiem. 51 (2005) 23T8-2325; Pftfffer, C.M.等，Clin. Oreffi. 5t) (2004) 423-432)。紅細胞總葉酸(紅細胞葉酸-RBC-葉酸)是整個機體葉 酸狀態(tài)的最佳檢測。近期的研究已經(jīng)表明，5-甲基四氫葉酸是循環(huán)紅 細胞中的優(yōu)勢葉酸類維生素。為了診斷葉酸缺乏，推薦不僅由血清或 血漿進行測定，而且由紅細胞進行測定，因為95%以上的葉酸位于后 者當中。紅細胞中的濃度更真實地反映了實際葉酸狀態(tài)。
眾多方法可用于檢測不同基質中的葉酸。主要的分析方法是微生 物測定、放射免疫測定、化學發(fā)光、色譜法和質譜法。大部分方法基 于與葉酸結合蛋白竟爭性結合葉酸。
為了檢測RBC-葉酸，使用溶血試劑明顯是強制性的。例如，用 于測定RBC葉酸的ElecsysTM測定(Elecsys是Roche Group成員的商標) 使用抗壞血酸作為裂解試劑。Elecsys RBC-葉酸溶血試劑與Elecsys葉 酸測定一起用于紅細胞中葉酸(RBC-葉酸)的定量測定。用抗壞血酸溶 液(0.2%)稀釋用抗凝劑(肝素或EDTA)處理的全血，并于20-25。C溫育 約90分鐘。紅細胞發(fā)生裂解，釋放胞內葉酸。然后，溶血產(chǎn)物用作 "預稀釋"樣品(和血清類似)，用于隨后在Elecsys葉酸測定中進行檢 測。在全血中測定的血細胞比容值和通過預處理樣品產(chǎn)生的稀釋作用
7在紅細胞葉酸濃度計算中被補償(Gremng, H., Gressner， A.M.， Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie,第3版,Stuttgart, New York, Schattauer (1995) 460-462頁；Gunter， E.W.等，Clin. Chem. 42(1996) 1689-1694)。
用抗壞血酸處理產(chǎn)生的溶血產(chǎn)物不能用于常規(guī)色譜方法。為了在 色譜方法或質譜測定中使用這樣的溶血產(chǎn)物，必須在分析前除去細胞 碎片和沉淀蛋白。
通常通過離心、離線過濾或固相提取由樣品中除去碎片和沉淀蛋白。
固相提取(SPE)是一種例如廣泛用于預濃縮和后處理分析樣品、 純化多種化學品和由水溶液中除去毒性物質或取出有價值物質的色 譜技術。SPE逋常使用含有適當樹脂的柱或筒進行。己開發(fā)^f吏用吸 附劑的SPE方法，所述吸附劑可通過疏水、離子交換、螯合、吸附和 其它機制與分析物相互作用，以結合和除去流體中的分析物。因為用 于不同類型分析物的不同SPE應用可能需要不同的吸附劑，所以伴隨 需要具有特定特性的吸附劑，其對目標分析物或目標分析物類型具有 專一選擇性。SPE材料和SPE柱的代表性實例可分別見于US 6,322,695和US 6,723,236。
和相當多的其它目標分析物一樣，似乎沒有可用的方法會允許以 在線方法由全血樣品檢測西羅莫司或他克莫司。
血紅蛋白自身的濃度以及糖化血紅蛋白(HbAlc)對非糖化血紅蛋 白的比率是血液學和糖尿病的重要分析物。在該類評價中，包含在全 血樣品中的紅細胞4支裂解，然后檢測血紅蛋白。US 6,050,956描述了 預裝有標準化量的血液溶解液的溶血管。然而，全血首先^皮收集到常 規(guī)采血管中。此后，將血液以1加100稀釋入溶血管中。由于血紅蛋 白的濃度非常高，所以全血的1加100稀釋度是可以接受的，不需要 差異溶血，即不需要溶血來避免如蛋白沉淀和/或DNA釋放的不利副 作用。Coulter International Inc.的多個同族專利，如US 5,874,310、 EP 1 000 356、 EP 0 874 988、 EP 0 305 491或EP 0 185 048，涉及血液學領 域，尤其是涉及血細胞分析。EP 1 000 356例如描述了一種用于稀釋 血樣的改善的稀釋劑，其適于單個血樣中的血細胞的計數(shù)和篩分、血 紅蛋白參數(shù)的測定和白細胞亞群的分化。分析使用適宜的電子設備進 行。對于該分析，血液通常由醫(yī)師收集，然后必須運輸?shù)脚R床實驗室， 僅僅在分析前不久才加入溶解試劑。
顯而易見的是，小心運輸抗凝結的全血樣品是至關重要的。必須 避免冷凍和溫度升高。還有與運輸抗凝結的全血樣品相關的顯著的生 物危害。在運輸過程中泄露或破裂的管可能污染包裝材料，或者可能 是傳染性的。
由上迷現(xiàn)有技術狀態(tài)顯而易見的是，全血在臨床常規(guī)中還是沒有 受到足夠的重視(stepchild)。所有的常規(guī)方法即便在現(xiàn)今也似乎需要抗 凝處理、高度稀釋樣品和/或將目標分析物或某些類型的化合物與包含 在該樣品中的剩余化合物分離或分級分離。另外，似乎沒有可用的在 線檢測全血樣品的方法。
然而，如果全血可直接并容易地用作樣品，則它應當是高度合乎 需要的。這應當尤其有利于利用液相色譜(LC)分離步驟的在線檢測方 法。同樣顯而易見的是，直接處理全血樣品使處理過的樣品更易于儲 存、操作和運輸，對臨床常規(guī)診斷應用應當是一個重大的進步。
令人驚奇的是，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并可以確認，將全血樣品收集到即 用型一次性使用的全血采樣管中是極為有利的，所述采樣管預裝有用 于差異溶血所述全血樣品的試劑。本發(fā)明的采樣管極大地促進了全血 樣品的使用，使該樣品的操作還有該樣品的運輸容易且便利，并允許 直接檢測全血樣品中的分析物。將全血收集到本發(fā)明的采樣管中，例 如使全血成為適于通過色譜直接分離的樣品，和例如通過質譜法進行 檢測的分析物。這對于在紅細胞中也以相關程度存在的分析物尤其有 價值，所述分析物例如為葉酸或免疫抑制藥物西羅莫司和他克莫司。
9發(fā)明概述
在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及收集和加工全血樣品的采樣 管，所述采樣管含有用于差異溶血所述全血樣品的試劑，其中所述差 異溶血試劑含有用于差異溶血的化學品和抗凝劑，其中所述采樣管為 即用型 一 次性使用的采樣管。
在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的采樣管在用于液相色 譜的全血樣品處理中的用途。
在又一個實施方案中，本發(fā)明描述了在本發(fā)明的采樣管中通過差 異溶血獲得的已處理血樣在基于液相色譜的分析中的用途。
本發(fā)明還涉及適于差異溶血全血樣品的試劑組合物在用于液相 色譜妁全血樣品處理^的用途，其中所述試劑紐合物-包含抗凝劑。
發(fā)明詳述
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于收集和處理全血樣品的采 樣管，該釆樣管含有用于差異溶血所述全血樣品的試劑，其中所述差 異溶血試劑包含用于差異、溶血的化學品和抗凝劑，其中所述采樣管為 即用型一次性使用的采樣管。
在本發(fā)明意義上，"抗凝劑，，是用于阻止實驗室血液標本凝結的 物質。這些物質包括肝素和幾種使鈣離子不能用于凝結過程并由此防
止形成凝結的物質；這些物質包括例如乙二胺四乙酸(通常稱為 EDTA)、 EGTA、檸檬酸鹽、草酸鹽和氟化物。用于本發(fā)明采樣管中 的差異溶血試劑的優(yōu)選抗凝劑為肝素、EGTA和檸檬酸鹽。優(yōu)選地， 抗凝劑為肝素或檸檬酸鹽。
本發(fā)明的"采樣管，，可以為具有適于容納收集的血樣的貯存庫的 任何裝置。技術人員會意識到，采樣管實際上優(yōu)選為管狀物。優(yōu)選地， 采樣管具有適于匹配自動化分析儀的樣品接受站要求的大小和尺寸， 所述自動化分析儀例如為Roche Diagnostics的Elecsys⑧分析儀。采樣管可以具有圓錐形底或優(yōu)選具有圓底。在臨床常規(guī)中，使用標準管尺 寸，其與市場上的分析儀系統(tǒng)相適。標準并優(yōu)選的管例如具有以下尺
寸:13x75 mm、 13x100 mm或16x100 mm。
本文使用的冠詞"一種"或者沒有翻譯出不定冠詞的名詞是指一 個或一個以上(即至少一個)的冠詞的語法賓語。作為實例，沒有譯出 不定冠詞的"紅細胞"意指1個紅細胞或1個以上的紅細胞。
本發(fā)明的采樣管預裝有差異溶血試劑，即其含有該試劑。該管以 即用形式提供給用戶。用戶不需要制備或處理差異溶血試劑，因為其 提供了適于實現(xiàn)血樣的差異溶血的量和濃度。
在又一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的采樣管具有低于大氣壓的內 部壓力。優(yōu)選地，采樣管提供與BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ經(jīng) 銷的vacufaineriS)品牌系相關的優(yōu)勢。
本發(fā)明的血液收集管僅使用一次，即其是一次性使用裝置。
本發(fā)明的采樣管不僅適于收集全血樣品，而且適于對全血樣品進 行處理。通過將全血收集到預裝有差異溶血試劑的采樣管中，實現(xiàn)所 需結果，即差異溶血。
在本發(fā)明的又一個優(yōu)選的實施方案中，用于收集和處理全血樣品 的采樣管的特征還在于，差異溶血試劑引起紅細胞細胞膜裂解，同時 不會引起樣品成分沉淀。
在本發(fā)明意義上，"紅細胞"為不具有細胞核的紅細胞。這樣的 不具有細胞核的紅細胞例如為存在于哺乳動物循環(huán)中的成熟紅細胞。 本發(fā)明不涉及有核紅細胞，例如已知得自鳥類物種的有核紅細胞。后 者應滿足有核細胞或真核細胞的標準。
用于本發(fā)明用途的"哺乳動物"是指^f皮分類為哺乳動物的任何動 物，包括人、家畜和農(nóng)場動物，以及動物園動物、竟賽動物或寵物， 例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。優(yōu)選地，所述哺乳動 物為人。
在本發(fā)明意義上，"真核細胞"或"有核細胞"為來源于真核生
ii物并仍具有其細胞核的細胞。真核細胞的實例為來源于有核組織的細 胞、有核組織培養(yǎng)細胞和有核血細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，真核 細胞為有核血細胞，如血小板、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒 細胞或白細胞。低等生物如細菌的細胞，盡管含有遺傳物質，但不是 真核細胞。
根據(jù)本發(fā)明，全血樣品-故裝填到即用型采樣管中。將該樣品與所 述管中含有的差異溶血試劑混合，由此實現(xiàn)差異溶血。使用適宜的差
異溶血試劑確保滿足以下兩種要求a)裂解紅細胞膜和b)同時不引起 樣品成分沉淀。在本文中，使紅細胞膜破裂但同時不引起樣品成分沉 淀的過程或處理稱為差異溶血。處理過/處理后的樣品;波稱為已差異 溶血的血液或已差異溶血的血樣。
優(yōu)選差異溶血試劑將使樣品中存在的紅細胞的至少95%裂解。進 一步優(yōu)選的差異溶血試劑將使樣品中存在的紅細胞的至少97%、98%、 99%、 99.5%裂解。
盡管希望不囿于以下理論，但是人們仍然可能認為有利的平衡點 (在該平衡點時紅細胞膜破裂，但同時不引起樣品成分沉淀)是克服本 領域已知的至少某些問題所必需的。通過在適宜的條件下應用合適的 差異溶血試劑，細胞膜失去完整性，而完整的細胞膜是例如屏蔽紅細 胞內容物和血漿所必需的。紅細胞內容物(例如血紅蛋白，還有某些目 標分析物)被釋放到周圍液體中。同時不引起樣品成分沉淀。
本領域技術人員會意識到，可能干擾隨后分析的樣品成分尤其可 能分別為DNA和變性蛋白。只要真核細胞(例如淋巴細胞或單核細胞) 的核不被破壞，則這些細胞核不會釋放DNA。只要沒有蛋白沉淀，包 含在進行差異溶血的樣品中的蛋白不會干擾(至少未達到顯著程度)色 譜步驟或分析。
例如通過適宜的活體染色可易于評價紅細胞的完整性。在本發(fā)明 的一個優(yōu)選實施方案中，使用錐蟲藍，以便評價紅細胞膜的完整性。 完整的紅細胞不累積錐蟲藍，而膜破裂的紅細胞#:錐蟲藍染色。在用錐蟲藍染色樣品后，紅細胞的膜完整性易于在顯微鏡下評價。破裂紅
細胞的百分率如下計算計數(shù)處理之前和之后的完整紅細胞，然后用 前一數(shù)目除后一數(shù)目，之后將該值乘以100。溶解的紅細胞被稱為裂 解紅細月包。
適宜的處理將裂解紅細胞，但同時不會引起樣品成分沉淀。預期 適于本發(fā)明方法的溶血處理也會影響真核細胞的外膜。然而，能夠并 且必須注意的是，沒有包含在細胞核中的DNA釋放到樣品中。用于 差異溶血的溶血試劑和條件優(yōu)選不影響核膜，從而細胞核在宏觀上是 完整的，或者至少DNA不會由其周圍的穩(wěn)定DNA的核蛋白中釋放出 來。如果DNA會被顯著程度地釋放，則該DNA可能乃至會干擾樣品 的進一步操作。釋放的DNA例如趨向于使液體非常粘稠。那么，就 不再可能移-取或轉移這些樣品或使其通過某些濾器或柱子。
此外，能夠并且必須注意的是，不要發(fā)生蛋白沉淀。本領域技術 人員知曉，在生物樣品(例如全血樣品)中存在許許多多不同的蛋白。 所有這些蛋白都具有影響它們沉淀或聚集的趨勢的不同特性。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以描述和定義是否可以在合適的條件下用差異溶血 試劑進行如該術語所述的樣品處理，以便一方面裂解紅細胞細胞膜， 同時不引起樣品成分沉淀。未裂解的紅細胞以及沉淀的樣品成分這二 者對這樣的樣品的特性均具有負面影響。
差異溶血的條件是否適合可容易地并優(yōu)選通過使用以下標準化 步驟確定。1:10稀釋血細胞比容為40的全血樣品，然后與〗'矣選溶血 試劑1:1混合。目測觀察產(chǎn)生差異溶血的試劑的效率。在紅細胞裂解 時，混合物變得澄清。如果發(fā)生樣品成分沉淀，則樣品變得混濁或粘 稠或二者兼有。
如上所述，可容易地目測評價用于本發(fā)明的差異溶血方法的條 件。如果全血樣品與適宜的候選差異溶血試劑溫育，則溶解紅細胞所 需的最小濃度可^皮認為是使混濁血樣透明或澄清的濃度。最高的可能 濃度是仍產(chǎn)生透明且不粘稠的樣品的濃度。
13確定候選溶血試劑的適宜的最小終濃度已變得相當容易，因為該濃度導致所處理的全血樣品的透明度發(fā)生變化。該透明度變化與這些
已處理樣品對通過HPLC直接分析的適宜性良好關聯(lián)。
溶血試劑的最大濃度可能是仍不引起DNA釋放和/或蛋白沉淀的濃度。由此，樣品會變得粘稠或混濁或二者兼有，并且不再適于直接HPLC應用。而粘度和混濁度可目測跟蹤，優(yōu)選通過如下所述的HPLC法證實溶血試劑的最大濃度。
仍含有太多未裂解的紅細胞的全血樣品以及含有沉淀的樣品成分的已處理全血樣品將不適于任何色譜步驟。這就是為什么優(yōu)選通過以標準化方式將用候選差異溶血試劑處理的全血樣品施加于HPLC柱來確定適于產(chǎn)生差異溶血的條件的原因。
將50x10 nl處理過的全血樣品施加至HPLC柱，評^介不完全的5容血和/或樣品成分沉淀。為了評價候選化學品或試劑是否適于差異溶血，將所述溶血試劑與全血樣品混合。優(yōu)選使用已用生理鹽水1:10預稀釋的EDTA-血液。其與候選溶血試劑以1:1比率混合，于20。C溫育混合物30分鐘。該混合物中全血的最終稀釋度因此為1:20。將50等份的10 該混合物，即處理過的全血樣品，施加至為HPLC系統(tǒng)組成部分的濾器，該濾器直徑為2mm,孔徑為0.5 pm。如果濾頭為HPLC柱的組成部分，則必須對固定相進行選擇，以便不引起任何干擾或阻塞。監(jiān)測反壓。如果笫50次注射的反壓和第1次注射的反壓彼此相比，用于差異溶血的候選試劑會引起20bar以上的反壓增加，則該候選試劑應纟皮認為是不合適的。這樣，用于差異溶血的適宜試劑的最小以及最大濃度均易于鑒定。最小濃度是如在上述環(huán)境中評價的導致差異溶血的候選溶血試劑的最低濃度。
優(yōu)選用于以上候選差異溶血試劑評價的濾器為HPLC濾頭。還優(yōu)選該濾頭為20mm長的HPLC柱的組成部分，該柱裝填孔徑為100 A的3.5 pm Symmetry C18粒子作為床料，柱內徑為2 mm。
技術人員容易認識到，用于該評價的全血樣品得自健康個體，即
14沒有已知疾病并具有正常范圍的生物化學值的個體。
在本發(fā)明中業(yè)已發(fā)現(xiàn)并確認，可確定對相當多的試劑適宜的條件，以便滿足對差異溶血的兩種要求。
本發(fā)明的差異溶血試劑優(yōu)選基于作為溶劑的水、產(chǎn)生如上所述的差異溶血的化學品或試劑、抗凝劑，還優(yōu)選其可含有緩沖劑、酶和/或防腐劑。用于差異溶血的化學品為具有膜溶解活性或膜裂解活性的化學品。差異溶血試劑優(yōu)選基于具有溶血活性或膜裂解活性的化學
品，該化學品的分子量低于iooo道爾頓，并產(chǎn)生差異膜溶解。
差異溶血試劑優(yōu)選基于 一種或多種以下具有溶血活性的化學品KBr; KJ;和KSCN,或由一種或多種以下的陽離子和陰離子組成的鹽
陽—離子優(yōu)選選釘
其中m為0或1, n為4或6。
陰離子優(yōu)選選自氯離子、四氟硼酸根、辛基>5克酸根、碘離子和石克氰酸根。還有可能使用以上提及的化學品的混合物。技術人員會認識到，就是這些化學品促進差異溶血，而溶血試劑的其它成分可用作緩沖劑或防腐劑。
優(yōu)選用于差異溶血的化學品為 一種這樣的鹽其中陽離子優(yōu)選選
CnH(2n+，)
CH。OC。H0
zN;N、C4K
其中m為O或l, n為4或6，其中陰離子優(yōu)選選自氯離子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘離子和硫氰酸根。
適用于差異溶血的化學品優(yōu)選選自四氟硼酸l-丁基-4-甲基吡啶鏡、四氟硼酸l-丁基-3-甲基-咪唑輸、辛基硫酸l-丁基-3-曱基-咪唑鎖、氯化l-丁基-3-曱基吡啶輸、氯化1-己基吡啶鎖、氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷錨、氯化N-辛基吡啶錄、、氯化3-氨甲酰基-l-辛基氧基甲基吡啶徵、KBr、 KJ和KSCN及其組合。
還優(yōu)選用于差異溶血的化學品選自四氟硼酸1 -丁基-4-甲基吡啶鏡、四氟硼酸1-丁基-3-甲基-咪唑鐨、辛基硫酸l-丁基-3-曱基-咪唑錨、氯化l-丁基-3-甲基吡啶輸、氯化1-己基吡啶輸、氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鏡、氯化N-辛基吡啶鏡和氯化3-氨曱?；?l-辛基氧基曱基吡啶輸。還優(yōu)選使用這些試劑中的一種和KSCN的混合物。
對技術人員顯而易見的是， 一旦已在以上定義的基于1:20稀釋度的全血樣品的候選溶血試劑溶液的方法中鑒定出候選差異溶血試劑的適宜濃度，則可根據(jù)需要使用全血樣品對調整過的溶血試劑的另一個比率。
如果預期目標分析物在所研究血樣中是高度濃縮的，則溶血試劑的濃度可保持與在以上環(huán)境中鑒定的相同，并可以使用低比率的全血對溶血試劑，例如1:30、 1:40或1:50。優(yōu)選地，在差異纟容血試劑中，
16以如上確定的足以實現(xiàn)差異溶血的至少最小濃度使用具有溶血活性的化學品。
如果目標分析物以相當?shù)偷臐舛却嬖?，則可能不必1:20稀釋全血樣品，而是不到1:20。這是可行的，方法為相應地調整溶血試劑的濃度，使得在溶血試劑和全血樣品的混合物中溶血試劑對全血的最終相對濃度保持與對如在上述評價中確定的溶血試劑的所需最小濃度鑒定的比率相同。最大濃度是如在上述環(huán)境中評價的導致差異溶血但不51起樣品成分沉淀的候選溶血試劑的最高可能濃度。
作為實例業(yè)已發(fā)現(xiàn)，氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鎖/KSCN如果分別以1%和0.4%的終濃度使用，則適于實現(xiàn)所需結果，即以最終的1:20稀釋度差異溶血全血樣品。如果例如該溶血試劑的濃度^^皮分別調整到2% (針對氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷鏡)和0.8% (針對KSCN)，則分析物在已處理血樣中的稀釋度可以降低。此調整過的溶血試劑如果以后與l:5稀釋的全血樣品以1:1混合，也導致全血樣品差異溶血，因為全血對溶血試劑的比率保持恒定。如果lml分別含有10。/。氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷輸和4% KSCN的溶血試劑與1 ml用PBS以1:1稀釋的全血混合，則也觀察到差異溶血?；蛘撸蓪ml全血加入2ml分別含有10%氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷輸和4% KSCN的溶血試劑中。
對于許多常規(guī)應用，預期全血樣品對溶血試劑的理想比率在10:1至1:20之間。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中，全血樣品以5:1至1:15的比率與溶血試劑混合。更優(yōu)選地，該比率介于2: 1至1:10之間，還優(yōu)選1: 1至1:5。用于臨床常規(guī)的已調整溶血試劑的最終濃度，即最高可能濃度，取決于溶解性還有該試劑的價格。
如果四氟硼酸l-丁基-4-甲基吡啶鏡或四氟硼酸l-丁基-3-甲基-咪唑鏡在差異溶血試劑中分別用作唯一的膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以10-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以12-25%的濃度含有該化學品。如果辛基硫酸l-丁基-3-曱基咪唑輸在差異溶血試劑中用作唯一
的膜溶解化學品，則本發(fā)明的釆樣管優(yōu)選以1-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以2-10%的濃度含有該化學品。
如果-丁基-3-甲基吡啶輸在差異溶血試劑中用作陽離子，則其優(yōu)選與作為陰離子的碘離子或硫氰酸根一起使用，本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以5-30%的濃度含有l(wèi)-丁基-3-甲基吡啶鏡，還優(yōu)選以10-25%的濃度含有l(wèi)-丁基-3-甲基吡啶錨。
如果氯化1-己基吡啶鐠在差異溶血試劑中用作唯一的膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以15-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以20-25%的濃度含有該化學品。
如果氯化1-己基吡啶輸與等摩爾濃度的KSCN在差異溶血試劑中組合用作膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以4-3力Q為的濃度含有氯化1-己基吡啶镥，還優(yōu)選以5-20%的濃度含有氯化1-己基吡啶鏘。
如果氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷輸在差異溶血試劑中用作唯一的膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以5-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以10-25%的濃度含有該化學品。
如果氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷錄與等摩爾濃度的KSCN組合用于差異溶血試劑，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以1-30%的濃度含有氯化1-曱基-l-辛基吡咯烷輸，還優(yōu)選以1-20%的濃度以及1-10%或1-5%的濃度含有氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷鏡。
如果氯化N-辛基吡啶輸在差異溶血試劑中用作唯一的膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以10-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以10-25%的濃度含有該化學品。
如果氯化3-氨甲酰基-l-辛基氧基曱基吡啶翁1在差異溶血試劑中用作唯一的膜溶解化學品，則本發(fā)明的采樣管優(yōu)選以0.5-30%的濃度含有該化學品，還優(yōu)選以0.75-25%的濃度以及1-10或1-5%的濃度含有該化學品。
進 一 步優(yōu)選的用于本發(fā)明溶血管的差異溶血化學品為1 -己基吡
18啶輸陽離子組合SCN—陰離子、l-甲基-l-辛基吡咯烷輸陽離子組合
SCN_陰離子和3-氨曱酰基-l-辛基氧基甲基吡咬輸陽離子。
優(yōu)選地，包含在本發(fā)明的即用型管中的差異溶血化學品以不超過50%重量/體積、還優(yōu)選不超過30%或還優(yōu)選不超過25或20%重量/體積的濃度使用。
差異溶血伴隨著胞內成分如蛋白(包括蛋白酶)的釋放。在某些應用中，如蛋白檢測，封閉酶如蛋白酶的活性將是有利的。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的釆樣管包含差異溶血試劑，該試劑還含有酶抑制劑。優(yōu)選地，酶抑制劑為蛋白酶抑制劑。
蛋白酶的數(shù)量一直在增加，對應的蛋白酶抑制劑也一直在增加，可根據(jù)需要選擇適宜的蛋白酶抑制劑。 一類重要的蛋白酶是所謂的絲
氨酸蛋白酶，其在它們的活性中心具有氨基餿絲氨酸。絲氨酸蛋白酶的眾所周知的實例為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽釋放酶和尿激酶。技術人員熟知以下事實某些蛋白酶抑制劑對絲氨酸蛋白酶有活性。這些蛋白酶的抑制潛力及其活性譜例如描迷于供應商(如Serva,Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)的資料表。優(yōu)選地,絲氨酸蛋白酶抑制劑選自AEBSF-HC1 (例如Serva目錄號1274》、APMSF-HC1 (例如Serva目錄號12320)、抑肽酶(例如Roche Diagnostics,目錄號10 981 532 001)、抑凝乳蛋白酶抑制劑(例如Roche Diagnostics,目錄號11 004 638 001)、 Pefabloc SC (例如Roche Diagnostics,目錄號11 585 916 001)和PMSF (例如Roche Diagnostics,目錄號10 837091 001)。
更重要的一類蛋白酶是所謂的半胱氨酸蛋白酶，其在它們的活性位點具有氨基酸半胱氨酸。眾所周知的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶和釣蛋白酶(calpain)。技術人員熟知以下事實某些蛋白酶抑制劑對半胱氨酸蛋白酶有活性。這些抑制劑的某一些還對絲氨酸蛋白酶有活性，例如，PMSF可用作半胱氨酸蛋白酶的抑制劑以及絲氨酸蛋白酶的抑制劑。這些蛋白酶的抑制潛力及其活性譜例如描述于供應商(如
19Serva, Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)的資為+表。優(yōu)選地，半胱氨酸蛋白酶抑制劑選自亮抑酶肽(leupeptine)(例如RocheDiagnostics,目錄號11 034 626 001)、 PMSF (參見上文)和E-64 (例如Roche Diagnostics,目錄號10 874 523 001)。
更重要的一類蛋白酶是所謂的金屬蛋白酶。金屬蛋白酶的特征在于在活性中心含有金屬離子，例如Zi^+、 Ca"或Mn"。眾所周知的金屬蛋白酶實例為消化酶，例如羧肽酶A和B以及嗜熱菌蛋白酶。技術人員熟知以下事實某些蛋白酶抑制劑對金屬蛋白酶有活性。金屬蛋白酶最容易被結合金屬離子并與其形成金屬螯合復合物的物質失活。優(yōu)選地，使用乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)和/或1,2-二氨基環(huán)己烷-N,N,N',N'-四乙酸(CDTA)失活金屬蛋白酶。其它適宜的金屬蛋白酶抑制劑為膦酰二肽鈉(Phosphommidon)( = N-(a-吡喃鼠李糖基氧基羥基氧膦基)-L-亮氨?；?L色氨酸二鈉鹽；例如Roche Diagnostics目錄號10 874 531 OOl)和苯丁抑制素(例如Roche Diagnostics目錄號10 874 515 001)。這些蛋白酶抑制劑的抑制潛力及其活性譜例如描述于供應商(如Serva， Heidelberg或Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)的對應資料表。優(yōu)選的金屬蛋白酶抑制劑為EDTA、 EGTA和/或苯丁抑制素。
更重要的一類蛋白酶已知為天冬氨酸(酸性)蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶的特征在于在活性中心具有天冬氨酸殘基。天冬氨酸蛋白酶的眾所周知的實例為胃蛋白酶、組織蛋白酶D、凝乳酶和腎素。技術人員熟知某些蛋白酶抑制劑對天冬氨酸蛋白酶有活性的事實。優(yōu)選的天冬氨酸蛋白酶抑制劑為a2-巨球蛋白(例如Roche Diagnostics目錄號10602 442 OOl)和抑肽素(例如Roche Diagnostics目錄號11 359 053 001)。
對于某些應用，有可能使用含有針對某些蛋白酶類型的蛋白酶抑制劑的差異溶血試劑。
以下代表了本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案使用兩種或更多種蛋白酶抑制劑的混合物在差異溶血的血樣中抑制不需要的蛋白分析物降解。優(yōu)選地，用于本發(fā)明采樣管的差異溶血試劑含有至少兩種不同的
蛋白酶抑制劑，其具有針對選自以下的兩類蛋白酶的活性絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。還優(yōu)選這些酶類型中的至少3種被合適的抑制劑混合物抑制。優(yōu)選地，本發(fā)明的糞便樣品稀釋液含有蛋白酶抑制劑混合物，其由分別具有針對絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶的活性的蛋白酶抑制劑組成。
優(yōu)選地，使用10種以下的不同蛋白酶抑制劑，其足以實現(xiàn)足夠的蛋白酶抑制，以穩(wěn)定在差異溶血血樣中的目標蛋白分析物。
優(yōu)選地，蛋白酶抑制劑選自抑肽酶、抑凝乳蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽、EDTA、 EGTA、 CDTA、抑胃肽A、苯曱基磺酰氟(PMSF)和Pefabloc SC。優(yōu)選地，差異溶血試劑中另外含有的蛋白酶抑制劑包含蛋白酶抑制劑抑凝乳蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽、CDTA、抑胃肽A、 PMSF和Pefabloc SC中的一種或多種。還優(yōu)選其含有抑肽酶、亮抑酶肽、EDTA和Pefabloc SC。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的采樣管含有如上所述的用于差異溶血的化學品和抗凝劑，并另外包含核酸酶。差異溶血的血樣的長期儲存或運輸可以伴發(fā)核酸釋放，尤其是可由真核血細胞的核釋放DNA。如果會釋放出顯著量的DNA，則這會產(chǎn)生高粘度的樣品，該樣品不能再用于診斷常規(guī)。該作用可使用核酸酶抵消。優(yōu)選地，本發(fā)明的采樣管含有包含DNA酶的差異溶血試劑。優(yōu)選的DNA酶為benzo加se。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及含有差異溶血化學品和抗凝劑的即用型一次性使用的采樣管在處理用于液相色譜的全血樣品中的用途。上述對采樣管和包含在其中的差異溶血試劑優(yōu)選的實施方案也適用于該釆樣管在處理用于液相色譜的全血樣品中的使用。
液相色譜(LC)是一種極為重要的分析技術，用于分離、鑒定和定量目標分析物，即便目標分析物存在于不同樣品成分的復雜混合物中。在LC當中，混合物中的化學組分借助液體流動相的流動通過固定相。利用分析物與流動相和固定相這二者的相互作用的差異實現(xiàn)在液相色譜中的分離。技術人員會認識到，必須選擇對所研究分析物均適合的固定相和流動相。另外，用戶將確定在樣品通過固定相柱向抬，測器移動的同時適于保持分析物條帶清晰度的色譜條件。
高效液相色譜，也稱為高壓液相色譜，縮寫為HPLC,是一種特殊形式的液相色譜，現(xiàn)今經(jīng)常用于生物化學和分析化學。分析物在高壓下于液體(流動相)中被強行通過柱子的固定相，這減少了分離組分保留在固定相上的時間，由此減少了它們必須在柱子內擴散的時間。這在所獲的色譜圖中產(chǎn)生窄峰，由此產(chǎn)生與LC相比更好的分辨率和靈敏度。
選擇流動相，以確保樣品溶質的溶解性。^"于固定相，優(yōu)選地，使用微粒二氧化硅(無修飾的或化學修飾的)，因為其高表面積增強了溶液相-固定相相互作用的差異。使用相對于溶質流動相相互作用與溶質強相互作用的固定相產(chǎn)生非常長的保留時間，這是一種在分析上沒有用的情況。因此，必須選擇固定相，以便提供相對于在流動相中的溶質相互作用弱至中等的溶質相互作用。因此，溶質的性質決定選定的LC類型。在流動相中應發(fā)生較強的相互作用，以確保樣品溶解性和預備洗脫，而固定相應對溶質之間更細微的差別有反應。例如，通常使用極性流動相連同分辨溶質分散特征的細微差別的非極性固定相更好地分析極性中性化合物。HPLC的強有力方面之一在于可改變流動相，以改變保留機制。可向流動相加入修飾物以控制保留。例如，pH是水性流動相的一個重要變量。
可以區(qū)分5種一般類型的LC:
1. 正常相色譜要求使用極性固定相連同非極性(分散的)流動相。
2. 反相色譜，相反的可能性，要求使用非極性固定相和極性流動相(由一種或多種溶劑(水、甲醇、乙腈和四氫呋喃)組成)。
3. 離子交換色譜涉及離子相互作用。在此情況下，流動相必須支持離子化，以確保離子溶質的溶解性。固定相必須也是部分離子化的，以促進一定的保留。因此，與固定相的相互作用強，這通常反映為較長的分析時間和寬峰。
4. 大小排阻色譜包括基于單獨的分子大小的分離，理論上需要溶質與固定相沒有有力的相互作用。
5. 親和色譜基于特異性相互作用，例如特異性結合對成員之間的
相互作用，例如抗原和對應的抗體或者受體和對應的配體。例如，結合對的首個配偶體結合適宜的固定相，并用于捕獲結合
對的笫二個配偶體。第二個配偶體可通過適宜的方法;故釋放和分離。
在常規(guī)應用中，將RP-HPLC應用中的固定相(所謂的床料，例如包^皮烷基硅烷醇的多孔二氧化硅顆粒)裝填到適宜的柱子中。對于大部分HPLC應用，固定相顆粒的直徑通常在l-10pm的范圍內，這些顆粒的平均孔徑由幾納米至數(shù)百納米變化。在某些HPLC應用中還使用無孔顆粒。另夕卜，所謂的整體材料(monohthicmaterial)也可用于HPLC應用。固定相材料的小顆粒迫使在HPLC中使用高壓。床料通常受到濾頭的保護。典型的濾頭具有l(wèi)pm、 0.45 nm或0.2 nm孑L徑。顆粒越小，濾頭的孔徑通常就越小。如果樣品包含能夠阻塞HPLC濾頭的成分，則這對任何常規(guī)分析都是有害的。
全血樣品以及含有樣品成分沉淀的"過處理的"全血樣品使任何
常規(guī)的HPLC濾頭或柱子快速阻塞。技術人員會認識到，濾頭孔徑越低，固定相顆粒的直徑越小，柱子直徑越小，用于HPLC柱的濾頭就越快發(fā)生阻塞。如果沒有適宜地選擇濾頭，即孔徑太大，則柱填料的顆粒大小也應是個問題，顆粒越小，柱子本身就應越快阻塞。
通過將全血樣品直接采集到本發(fā)明的釆樣管中，獲得處理過的全血樣品，其可直接施加至HPLC柱，而不會形成阻塞柱子的風險。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及將血樣收集到本發(fā)明的即用采樣管中的方法，由此處理全血樣品，以差異溶解血樣，此后對所述已處理
23血樣實施HPLC步驟。
優(yōu)選地，用于此HPLC步驟的固定相顆粒的直徑在1-10 pm的范 圍內，還優(yōu)選在2-7 ^m的范圍內。優(yōu)選地，用于此HPLC步驟的濾 頭的孔徑為0.45 ^m，或者還優(yōu)選0.2 pm。
在又一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及通過將全血收集到本發(fā) 明的采樣管中獲得的差異溶血血樣在目標分析物的基于液相色譜的 分析中的用途。
目標分析物可通過任何適宜的方法檢測。適宜的和優(yōu)選的檢測器 感應通過的化合物的存在情況，并提供電信號至記錄儀或計算機數(shù)據(jù) 站。輸出通常為色譜圖的形式，目標物質通常存在于某一個峰中。峰 面積或峰高度可用于定量所研究樣品中存在的分析物的量。
用于HPLC系統(tǒng)的檢測器是由于洗脫樣品化合物而發(fā)射應答并隨 后在色譜圖上發(fā)出峰信號的組分。其緊鄰固定相后方定位，以便在化 合物由柱中洗脫出來時檢測它們。技術人員可以控制檢測參數(shù)和靈敏 度參數(shù)。有許多類型的檢測器可與HPLC—起使用。 一些更常見的檢 測器包括折射率(RI)、紫外線(UV)、熒光、放射化學、電化學、近 紅外(Near-IR)、質語(MS)、核磁共振(NMR)和光散射(LS)。
折射率(RI)檢測器測量樣品分子變向或折射光的能力。每種分子 或化合物的該特性都被稱為其折射率。對于大多數(shù)RI檢測器，光穿 過雙坤莫流動池到達光探測器。流動池的一個通道引導流動相通過柱， 而另一個僅引導流動相。當光由于樣品由柱中洗脫出來而變向時發(fā)生 檢測，這4皮讀作兩個通道之間的差異。
熒光檢測器分別檢測化合物于給定波長吸收光然后再發(fā)射光的 能力。每種能夠發(fā)射熒光的化合物都具有特征性激發(fā)和發(fā)射波長。激 發(fā)光通過流動池，同時在垂直位的光檢測器檢測特定波長的發(fā)射光。
放射化學檢測包括使用放射性標記的物質，通常為氚(3H)或碳-14
(14C)。其通過檢測與(3-粒子離子化相關的熒光來運行，其在代謝物研 究中最常見。
24電化學檢測器測量經(jīng)歷氧化或還原反應的化合物。這通常通過在 遷移樣品于給定電位差在電極之間通過時測量它們獲得或失去的電 子來完成。
質譜法是一種用于檢測離子的質荷比(m/z (或m/q))的分析技術。 其最通常通過產(chǎn)生代表樣品組分質量的質譜用于分析實際樣品的組 成。該技術具有幾種用途，包括通過化合物和/或其片段的質量鑒定 未知的化合物；確定化合物中的一種或多種元素的同位素組成；通過 觀察化合物的片段化確定化合物的結構；使用精心設計的方法定量樣 品中化合物的量(質譜法不一定是定量的)；研究氣相離子化學的基本 原理(離子化學和真空中的中性)；用多種其它方法確定化合物的其它 物理、化學乃至生物特性。
質譜儀是一種用于質譜法的裝置，并產(chǎn)生樣品的質譜，以分析其 組成。這通常如下實現(xiàn)離子化樣品，并分離不同質量的離子，通過 檢測離子流的強度記錄它們的相對豐度。典型的質語儀包括3個部分 離子源、質量分析器和檢測器。
離子源的種類是強烈影響質譜法可分析什么類型樣品的影響因 素。電子電離和化學電離用于氣體和蒸汽。在化學電離源中，分析物 通過在所述源中碰撞的過程中的化學離子-分子反應被電離。經(jīng)常使用 液體和固體生物樣品的兩種技術包括電噴霧電離(ESI)和基質輔助的 激光解吸/電離(MALDI)。其它技術包括快原子轟擊(FAB)、熱噴霧、 大氣壓化學電離(APCI)、 二次離子質譜(SIMS)和熱電離。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用本發(fā)明的方法檢測分析物是通過質 譜進行。
核磁共振(NMR)檢測基于以下事實某些原子核具有奇數(shù)質量， 包括H和"C，以隨機方式在軸附近自旋。然而，當處于強磁場時， 自旋與磁場平行或反向平行排列，平行方向是有利的，因為其能量稍 低。這些磁核在處于特定強度的磁場中時可吸收RF能量。在發(fā)生這 種吸收時，所述核被說成是處于共振狀態(tài)。令分析科學家感興趣的是，
25分子內的不同原子在給定磁場強度以不同頻率共振。分子共振頻率的 觀測結果使用戶可以發(fā)現(xiàn)有關該分子的結構信息。
當某個光源發(fā)射的平行光束遇到溶液中粒子時，光被反射、吸收、 透射或散射。這些現(xiàn)象可以通過光散射(LS)檢測器來檢測。最主要的
LS檢測形式被稱為濁度測定和濁度分析。濁度測定被定義為檢測由照 射體積的懸浮液發(fā)射的散射光的強度。將散射強度對照射強度的比率 與標準已知特性相比較。濁度分析被定義為檢測由于溶液中的顆粒而 透射的光的減少。其檢測由于透過顆粒溶液的光的減少的光散射。因 此，其定量透過的殘余光。
近紅外檢測器通過在700-1100 nm的光譜中掃描化合物來操作。 于特定波長檢測每個分子中的具體化學鍵的伸縮振動和彎曲振動。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，來源于哺乳動物的全血樣品或 來源于哺乳動物的抗凝結的全血樣品將被收集到本發(fā)明的即用釆樣 管中，在線檢測包含在由此獲得的已處理樣品中的目標分析物，即沒 有任何額外的步驟，如過濾、沉淀或離心。在一個優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明由此涉及分析全血樣品的方法，包括以下步驟將樣品收集到 本發(fā)明的即用采樣管中，獲得差異溶血的全血樣品，對該已處理樣品 實施HPLC步驟，并由此或此后檢測所述樣品中的目標分析物。
本發(fā)明的分析物可以為任何無機或有機分子，包括生物分子。優(yōu) 選分析物不是核酸，尤其是其不為DNA。優(yōu)選地，分析物選自多肽、 碳水化合物和無機或有機藥物分子。優(yōu)選目標分析物的分子量為 10,000Da以下，還分別優(yōu)選9kDa以下、8kDa以下、7kDa以下、6 kDa以下或5kDa以下的分子量。
多肽或蛋白l基本上由氨基酸組成的分子，其具有至少兩個通過 肽鍵連接的M酸。就本文公開的方法中研究的目標分析物而言，多 肽優(yōu)選由至少3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12、 15、 20、 25和30個 至多達約IOO個氨基酸組成。優(yōu)選多肽包含5-100個氨基酸，還優(yōu)選 包含10-40個氨基酸。適宜的目標肽分析物為例如肽激素，在循環(huán)中
26存在的其它多肽，尤其是例如由于全血樣品在本文公開的采樣管中溫 育而由紅細胞釋放的多肽。
優(yōu)選本發(fā)明的方法用于在線檢測全血樣品中的分析物，其中所述 分析物至少部分地位于紅細胞中。
本發(fā)明的優(yōu)選的目標分析物選自濫用藥物和免疫抑制藥物。
優(yōu)選的目標分析物為濫用藥物。濫用藥物優(yōu)選選自安非他明、可 卡因和可卡因代謝物，如苯曱酰芽子堿、去氧麻黃堿、鴉片劑和鴉片 劑衍生物、大麻類物質如四氫大麻醇和苯環(huán)己哌咬。
優(yōu)選的目標分析物為免疫抑制藥物。免疫抑制藥物優(yōu)選選自環(huán)孢
菌素(CsA)、霉酚酸酯(MMF)、雷帕霉素(RAPA,也稱為西羅莫司)、 他克莫司(FK-506)、咪唑硫嘌呤(AZA)和甲基強的松龍(MP)。
進一步優(yōu)選的目標分析物為葉酸，尤其是包含在血漿和紅細胞這 二者中的總葉酸。
收集到本發(fā)明的采樣管中的全血樣品中待檢測的優(yōu)選分析物為 西羅莫司、他克莫司和葉酸。
在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有全血樣品的差異溶血試劑 的采樣管在處理用于液相色譜的全血樣品中的用途，其中所述差異溶 血試劑含有具有溶血活性的化學品和抗凝劑，其中所述采樣管為即用 型一次性使用的采樣管。上述對包含在本發(fā)明采樣管中的差異溶血試 劑的優(yōu)選實施方案也適用于溶血試劑在處理用于液相色譜的全血樣 品中的用途。
本發(fā)明的用于全血樣品的即用型 一次性使用采樣管及其在常規(guī) 診斷環(huán)境中的用途具有突出優(yōu)勢全血樣品在采樣時^f皮直接處理為差 異溶血血樣。這避免了防范措施，要不然操作和儲存全血樣品或抗凝 的全血樣品需要這些防范措施。差異溶血的血液可如血漿或血清樣品 一樣操作。沒有細胞能沉淀下來，不再發(fā)生可能干擾正確的分析物檢 測的溶血未逐漸增加。運輸差異溶血的血樣是容易且方便的。病毒顆 粒如果存在的話，則在與差異溶血試劑接觸的情況下也應^f皮溶解并破壞。盡管沒有檢驗，但由此預期，通過使用本發(fā)明的全血采樣管甚至 極大降低生物危害風險。
提供以下的實施例和附圖是為了幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實 范圍由隨附的權利要求陳述?？稍诓黄x本發(fā)明宗旨的情況下對所陳 述的方法進行修改。
附圖簡述
圖l用水溶血的1:10稀釋的全血的光學顯微鏡檢查。已應用了 May-Grtinwald染色。紅細胞膜和細胞核是可見的。
圖2用四氟硼酸1-丁基-4-曱基吡啶鐠(25%)溶血的1:10稀釋的 全血的光學顯微鏡檢查。已應用了 May-Grtinwald染色。沒有剩下紅 細胞或膜，細胞核仍是完整的。
圖3用水溶血的1:10稀釋的全血的光學顯微鏡檢查。已使用錐 蟲藍染色。
圖4用四氟硼酸1-丁基-4-曱基吡啶輸(25%)溶血的1:10稀釋的 全血的光學顯微鏡檢查。已應用了錐蟲藍染色。a)2.5分鐘溫育時間 只剩下少量殘余紅細胞，b)15分鐘溫育時間沒有剩下紅細胞或膜。
實施例1
多種候選溶血試劑的評價 實施例1.1溶血的目測評價
溶液A:用0.15摩爾氯化鈉溶液以1:10比率稀釋新鮮EDTA-穩(wěn) 定的全血(50 (LiL EDTA-血液加450 pL氯化鈉溶液)。
溶液B:制備候選溶血試劑在0.15摩爾氯化鈉中的溶液，其中溶 血試劑的濃度為溶血產(chǎn)物中所需終濃度的2倍高，例如為得到25%四 氟硼酸l-丁基-4-甲基吡啶輸?shù)慕K濃度，制備50%溶液(50 mg鹽加50 mL 0.15摩爾氯化鈉的水溶液)。在加入第二種陰離子如碟化物的情況 下，所述鹽(氯化l-丁基-3-甲基吡啶鏡/KJ)以等摩爾的量加入。
28通過將溶液A和溶液B等量混合，例如500 pL溶液A加500 nL 溶液B，制備溶血產(chǎn)物。
在混合后即時、混合后1分鐘、2分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、 20分鐘和40分鐘目測檢查溶血產(chǎn)物的混濁度和澄清度。記錄直至觀 察到澄清溶液的時間。
表l:候選差異溶血試劑的目測評價
溶血試劑終濃度(重量/ 體積)(分鐘)后澄 清
四氟硼酸l-丁基-4-曱基吡啶鏡25%20分鐘
四氟硼酸l-丁基-4-曱基吡啶鏡12.5%40分鐘
四氟硼酸l-丁基-4-曱基吡啶鐠6%混濁
四氟硼酸l-丁基-3-曱基-咪唑鏡25%20分鐘
辛基硫酸l-丁基-3-曱基-咪唑鏡25%立印
氯化l-丁基-3-曱基吡啶鏘25%混濁
氯化l-丁基-3-甲基吡啶錄7KJ25%/22%20分鐘
氯化l-丁基-3-甲基吡啶鏡VKSCN25%/13%5分鐘
氯化l-己基吡啶镥/KSCN25%/12%立即
氯化1 -己基吡啶鏡/KSCN12.5%/6%l分鐘
氯化l-己基吡p定鎖/KSCN6.25%/3%6分鐘
氯化l-己基吡啶鏡/KSCN3.12%/1.5%混濁
氯化l-己基吡啶鏘25%7分鐘
氯化1-己基吡啶鏡12.5%混濁
氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鏡/KSCN25%/10%立即
氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷錄VKSCN12.5%/5%立即
氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷錄7KSCN6.25%/2.5%立即
氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷輸/KSCN3.12%/1.25%立即
氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鏡/KSCN2.5%/1%立即
氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鏡/KSCN1.25%/0.5%2分鐘
氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷輸/KSCN0.62%/0.25%混濁
氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷鏡25%立即
氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷鏡2.5%混濁
29溶血試劑終濃度(重量/ 體積)(分鐘)后澄 清
氯化N-辛基吡啶錫25%2分鐘
氯化3-氨甲?；?l-辛基氧基甲基吡啶鏡12.5%立即
氯化3-氨甲酰基-l-辛基氧基甲基吡啶鏡6.25%立即
氯化3-氨甲?；?l-辛基氧基甲基吡啶鏡1.5%立即
由上表清楚可見，通過目測評價可以目測鑒定良好的候選差異溶
血試劑。
實施例1.2 溶血的顯微鏡評價
溶液A:用0.15摩爾氯化鈉溶液以1:10比率稀釋新鮮的EDTA-穩(wěn)定的全血(50 |nL EDTA-血液加450 pL氯化鈉溶液)。
溶液B:制備溶血試劑在0.15摩爾氯化鈉中的溶液，其中溶血試 劑的濃度為溶血產(chǎn)物中所需終濃度的2倍高，例如為得到25%四氟 硼酸l-丁基-4-甲基吡啶輸?shù)慕K濃度，制備50%溶液(50 mg鹽加50 mL 0.15摩爾氯化鈉的水溶液)。在加入第二種陰離子如碘化物的情況下， 所述鹽(氯化l-丁基-3-甲基吡啶鎖/KJ)以等摩爾的量加入。
通過將溶液A和溶液B等體積混合，例如20 pL溶液A加20 pL 溶液B,制備溶血產(chǎn)物。
May-Griinwald染色和顯微鏡檢查
在溶血產(chǎn)物混合后，在顯微鏡載玻片上涂布液滴，于室溫風干， 并用May-Griinwald染色試劑(Merck目錄號1.01424 May-Grtinwald 的曙紅亞甲基藍溶液)染色。在May-Griinwald染色的核染色至可變的 紫色陰影之后，可見藍色調至淺粉色色調的胞質，在某些細胞類型的 胞質中可存在精美的微紅色至淡紫色顆粒，嗜堿細胞在胞質中表現(xiàn)為 深藍黑色顆粒，嗜酸細胞在胞質中表現(xiàn)為鮮橙色顆粒，而紅細胞坤皮染 色為粉色至橙色。
30通過油浸光學顯微鏡(放大倍率x630)進行顯微鏡檢查
比較結果

圖1，通過水獲得的裂解物，圖2，用適于差異溶血 的試劑獲得的裂解物，表明在幾分鐘內加入適宜的溶血試劑將導致紅 細胞完全裂解。
錐蟲藍染色和顯微鏡檢查
處理過的全血樣品(l:l)與錐蟲藍溶液(Merck目錄號1.11732; Trypanblau C.I. 23850)混合，并分配入顯微鏡的Neugebauer-室中。顯 微鏡檢查通過油浸光學顯微鏡進行(放大倍率x630)。
比較結果-圖3，通過水獲得的裂解物，以及圖4a)和b),用適于 差異溶血的試劑獲得妁裂解物，表明，在幾分鐘內加入適宜的溶血試 劑將導致紅細胞完全裂解。
實施例2
通過HPLC評價多種候選溶血試劑
為評價裂解效率，將按照實施例1制備的已溶血的全血樣品注射 入HPLC系統(tǒng)中，并監(jiān)測系統(tǒng)的反壓。
HPLC系統(tǒng)由配有DR 5溶劑輸送系統(tǒng)的HP 1090液相色譜儀 (Agilent)、配備自動取樣器的自動調溫器和自動進樣器組成。通過將 50x10 jiL已處理全血樣品施加至HPLC柱評價裂解效率，該HPLC柱 以5 pm Symmetry C18顆粒作為床料，柱內徑為2 mm,柱長為20 mm, 濾頭為0.5 nm孔徑。洗脫液為5分鐘內含0.1 %甲酸的水至含0.1 %甲 酸的乙腈的梯度，流速為0.2 mL/分鐘。在50次注射后觀察到的反壓 增加低于20 bar。
如果裂解僅用蒸餾水實現(xiàn)，則在以上HPLC條件下觀察到的反壓 增加大于100 bar。
實施例3
31將EDTA抗凝結的全血吸取到含有差異溶血試劑的管中并溫和振蕩 混合物，處理EDTA抗凝結的全血
3.1 四氟硼酸l-丁基-4-甲基吡啶輸
將11.25 mL硫氰酸鉀溶液(O.l摩爾；即9.72克KSCN溶于1升 蒸餾水中)與12.5 mL四氟硼酸l-丁基-4-甲基吡咬鏡(BMPBF4)和23.7 mL氯化鈉(0.15摩爾的水溶液)混合，制備裂解試劑。該差異溶血試劑 因此具有約25% BMPBF4的濃度。硫氰酸鉀以低得多的摩爾濃度存 在，因此多半不會顯著影響所觀測到的作用。
將250 jul EDTA-抗凝結的全血吸取入含有5 ml該裂解試劑的小 瓶中。為了溶血，通過振蕩溫和混合管的內容物。5分鐘內獲得光學 上澄清的裂解物。將裂解浙于4。C儲存。在1 、 4和7天后通過目測 檢查來檢查裂解物的穩(wěn)定性。裂解物在7天內保持光學澄清。
3.2 硫氰酸鉀和氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷錄
將23.7 mL硫氰酸鉀溶液(0.2摩爾；9.72克KSCN溶于0.5升蒸 餾水中)與1000 mg氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷錨(Me-octPCl)和23.7 mL氯化鈉(0.15摩爾的水溶液)混合，制備該裂解試劑。該差異溶血試 劑因此具有約2% Me-octPCl的濃度。
將250 EDTA-抗凝結的全血吸取入含有5 ml該裂解試劑的小 瓶中。為了溶血，通過振蕩溫和混合管的內容物。5分鐘內獲得光學 上澄清的裂解物。將裂解物于4。C儲存。在1、 4和7天后通過目測 檢查來檢查裂解物的穩(wěn)定性。裂解物在7天內保持光學澄清。
3.3 氯化l-曱基-l-辛基吡咯烷鎰和硫氰酸鉀
將470 )iL硫氰酸鉀溶液(l摩爾)與300 氯化鈉溶液(0.15摩爾 的水溶液)和110 mg氯化l-甲基-l-辛基吡咯烷輸混合，制備這種與實 施例3.2相比更濃的裂解試劑。該差異溶血試劑具有約15%Me-octPCl
的濃度。將20 |ul EDTA-抗凝結的全血吸取入含有80 )LiH亥裂解試劑的容 器中。為了溶血，通過振蕩溫和混合管的內容物。5分鐘內獲得光學 上澄清的裂解物。將裂解物于4。C儲存。在1和2天后通過目測檢查 來檢查裂解物的穩(wěn)定性。裂解物保持光學澄清。
3.4 氯化S-氨甲?；?l-辛基氧基甲基吡咬輸
將80 pL水與50 pL氯化鈉溶液(0.15摩爾的水溶液)和20 mg氯 化3-氨甲酰基-l-辛基氧基甲基吡啶鎖混合，制備該裂解試劑。該差異 溶血試劑具有約10%COMPC1的濃度。
將50 pi EDTA-抗凝結的全血吸取入含有130 pi該裂解試劑的容 器中。為了溶血，通過振蕩溫和混合管的內容物。5分鐘內獲得光學 上澄清的裂解物。將裂-解物于4-。C儲存。在1和2天后通過目測檢查 來檢查裂解物的穩(wěn)定性。裂解物保持光學澄清。
根據(jù)以上論述的實驗，對扶術人員顯而易見的是，現(xiàn)在有可能并 有利的是在即用型釆樣管中直接包含抗凝劑，由此產(chǎn)生含有用于差異 溶血全血樣品的試劑的采樣管，其中所述差異溶血試劑還含有抗凝 劑。
權利要求
1. 一種用于收集和處理全血樣品的采樣管，所述采樣管含有用于全血樣品的差異溶血的試劑，其中所述用于差異溶血的試劑包括鹽和抗凝劑，其中所述鹽選自KBr、KJ、KSCN或由一種或多種陽離子和陰離子組成的鹽，所述陽離子為其中m為0或1，n為4或6，所述陰離子為氯離子、四氟硼酸根、辛基硫酸根、碘離子和/或硫氰酸根，其中所述采樣管為即用型一次性使用的采樣管。
2. 權利要求1的采樣管，其中所述用于差異溶血的試劑引起紅細 胞細胞膜裂解，同時不會引起樣品成分沉淀。
3. 權利要求1或權利要求2的采樣管，其中所述用于差異溶血的 試劑還包含蛋白酶抑制劑。
4. 權利要求1-3中任一項的采樣管，其中所述用于差異溶血的試 劑還包含核酸酶。
5. 權利要求4的釆樣管，其中所述核酸酶為脫氧核糖核酸酶。
6. 權利要求5的采樣管，其中所述脫氧核糖核酸酶為benzonase。
7. 權利要求1-6中任一項的采樣管，其中所述用于差異溶血的試 劑導致經(jīng)處理的全血樣品可以至少50等份的10 試樣施加于2 mm 直徑和0.5 Mm孔徑的濾器而不阻塞濾器。
8. 前述權利要求中任一項的采樣管的用途，所述采樣管用于液相色譜的全血樣品的處理。
9. 在權利要求1-7中任一項的采樣管中通過差異溶血獲得的已 處理血樣用于基于液相色譜的分析中的用途。
10. 適于全血樣品的差異溶血的試劑組合物在用于液相色語的全 血樣品處理中的用途，其中所述組合物含有抗凝劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于收集和處理全血樣品的采樣管。該采樣管含有用于差異溶血全血的試劑，其中所述用于差異溶血的試劑含有用于差異溶血的化學品和抗凝劑，其中所述采樣管為即用型一次性使用的采樣管。本發(fā)明還涉及所述采樣管在處理液相色譜的全血樣品中的用途，還涉及在此采樣管中處理過的血樣在基于液相色譜的分析中的用途。
文檔編號G01N33/50GK101467038SQ200780021092
公開日2009年6月24日 申請日期2007年6月4日 優(yōu)先權日2006年6月6日
發(fā)明者H·馮德埃爾茨, R·赫曼, T·多爾弗, U·科博爾德, W·納瑟 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司