專利名稱：：使用染料和糊精的蛋白質(zhì)檢測試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于檢測蛋白質(zhì)和定量確定蛋白質(zhì)濃度的試劑、方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：存在許多用于檢測蛋白質(zhì)和確定溶液蛋白質(zhì)濃度的方法。這些包括本領(lǐng)域中熟知的染料-結(jié)合方法，并包括非特異性反應(yīng)，在該反應(yīng)中，蛋白質(zhì)-復(fù)合染料與蛋白質(zhì)結(jié)合。染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成導(dǎo)致染料光學性質(zhì)的改變，以致存在著與樣品中存在的蛋白質(zhì)的量成比例的顏色變化。用于體外蛋白質(zhì)量化的蛋白質(zhì)-復(fù)合染料包括溴甲酚綠(Gindler，美國專利號3,884,637)、HABA和甲基橙，但是由于它們幾乎排他地結(jié)合于白蛋白并通常不是非常靈敏，所以具有局限的應(yīng)用。其他確定蛋白質(zhì)濃度的方法包括縮二脲(Biuret)方法(Mokrasch和McGilvery,生物學和化學雜志(J.Biol.Chem.)(1956).221,第909頁)，其中含有至少兩個肽鍵的肽結(jié)構(gòu)與堿性溶液中的012+反應(yīng)，從而形成紫色螯合物。Lowry等(實驗室臨床醫(yī)學雜志(J.Lab.Clin.Med.)(1951).39,663)使用了利用堿性銅溶液的蛋白質(zhì)預(yù)處理，類似于縮二脲方法，隨后添加福林_西奧卡特(Fdin-Ciocalteu)試劑(其含有磷鉤酸和磷鉬酸的鋰鹽)。產(chǎn)生的顏色是由Cu-蛋白絡(luò)合物和由該蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸將磷鎢酸和磷鉬酸還原為鉤和鉬藍的結(jié)果。縮二脲和Lowry方法的嚴重缺點是它們不能耐受蛋白質(zhì)樣品中經(jīng)常存在的還原劑。已經(jīng)描述了利用考馬斯亮藍G-250作為蛋白質(zhì)-復(fù)合染料形成染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物(Bradford美國專利號4,023,933)?？捡R斯亮藍染料與廣泛多樣7的蛋白質(zhì)結(jié)合。而且，使用處于適當?shù)乃嵝越橘|(zhì)中的G-250導(dǎo)致這樣的蛋白質(zhì)測定試劑，所述蛋白質(zhì)測定試劑具有是縮二脲和常規(guī)染料結(jié)合技術(shù)的大約100倍，是Lowry方法的大約3-5倍的靈敏度(Bradford美國專利號4,023,933)。在美國4,023,933中公開的程序中使用考馬斯亮藍G-250，即"Bradford測定"，具有許多超越使用其他染料方法的優(yōu)點，包括高靈敏度，這允許了當樣品中存在還原劑時，使用小樣品尺寸和效用?？捡R斯亮藍G-250以兩種不同的顏色形式，即紅色和藍色存在。該染料的藍色形式出現(xiàn)在中性和堿性溶液中，而紅色形式出現(xiàn)在明顯酸性的溶液(pHO-l)中。在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250處于紅色和藍色形式的平衡狀態(tài)；這樣的溶液在外表上呈褐色。認為當?shù)鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合時，染料被引入不同的微環(huán)境中，并且然后受到保護以免遭遇為該染料提供紅顏色的酸性介質(zhì)。酸性介質(zhì)的強度對于利用考馬斯染料的蛋白質(zhì)測定的靈敏度很重要，因為酸性介質(zhì)強度的增高導(dǎo)致該測定靈敏度的顯著降低。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物傾向于聚集，這影響顏色產(chǎn)物的穩(wěn)定性。增溶劑，諸如乙醇的存在傾向于在合理的時期內(nèi)保持蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物不聚集；然而，太多的乙醇導(dǎo)致向該染料藍色形式的顯著偏移，即將環(huán)境改變?yōu)檩^小極性的。假定該測定的機制是染料碳負離子與蛋白質(zhì)較小極性環(huán)境的結(jié)合。這可能也解釋了大量去污劑和丙酮對該測定的負作用，因為這些化合物通常是天然非-極性的，且應(yīng)該傾向于改變該染料的環(huán)境。Bradford測定的主要缺點是顯著缺乏在延長時期內(nèi)的顏色穩(wěn)定性，這主要歸因于蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的沉淀;基本不顯示出對不同蛋白質(zhì)相同的反應(yīng)性；不服從Beer法則；和最重要地，樣品中存在的去污劑對該測定的不利作用(Bradford，M"分析生物化學(Anal.Biochem.)，72248-254,1976和美國專利號4,023,933)。染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成還用于對凝膠中的蛋白質(zhì)，諸如電泳中使用的那些進行染色。例如，如此使用了處于高氯酸溶液中的染料考馬斯亮藍G-250(Reisner,A.H.等(1975)分析生物化學(Anal.Biochem.)64,509-516)。目前，許多商業(yè)上的、以考馬斯為基礎(chǔ)的制劑可以用于在電泳分離后對凝膠中的蛋白質(zhì)進行染色。對于許多電泳應(yīng)用，使用去污劑諸如SDS促進蛋白質(zhì)的分離。因為去污劑不利地影響由于考馬斯染料與蛋白質(zhì)結(jié)合引起的顏色改變，所以必須通過若干清洗程序去除去污劑，這導(dǎo)致冗長和復(fù)雜的染色程序。因此，基于染料的蛋白質(zhì)檢測和量化，特別是利用Lowry測定試劑或考馬斯染料的主要缺陷是來自去污劑、表面活性劑和其他兩親性分子的干擾。因此，存在著對這樣的檢測和定量確定蛋白質(zhì)的試劑和方法的需要，所述試劑和方法對樣品中存在去污劑具有提高的耐受性，并具有提高的蛋白質(zhì)-染料顏色穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于檢測蛋白質(zhì)的試劑，其包括或由下列各項組成(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，和(b)—種或多種糊精。所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料是這樣的染料，其典型地由于形成蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物而經(jīng)歷光學性質(zhì)的變化，這可以是如使用考馬斯tm亮藍染料、溴甲酚綠、HABA、甲基橙、縮二脲試劑、具有福林-西奧卡特試劑的縮二脲試劑(Lowry試劑)出現(xiàn)的吸收光譜中的變化；或如對形成熒光蛋白/染料復(fù)合物的染料，例如考馬斯橙tm、熒光素、Alexofliior、藻紅蛋白、德克薩斯紅tm(TexasRed)出現(xiàn)的發(fā)射光譜中的變化。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料不包括蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料不包括抗體或肽。所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料優(yōu)選地是考馬斯染料，諸如考馬斯亮藍染料，例如考馬斯亮藍染料G-250或考馬斯亮藍染料R-250。對于一些蛋白質(zhì)復(fù)合染料，且特別是考馬斯染料，需要低pH，從而在蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物的形成時獲得光學性質(zhì)的必要變化。因此，本發(fā)明還提供用于檢測蛋白質(zhì)的試劑，其包括(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，(b)—種或多種糊精,和，(c)具有4或更低pKa的酸。在所述試劑中，優(yōu)選地，所述染料以約0.001%-約0.1%(w/v),優(yōu)選地約0.005%-0.05%(/力范圍內(nèi)的濃度存在。在使用中，可以稀釋所述試劑，典型地，試劑與稀釋劑，例如包含蛋白質(zhì)的溶液的比例應(yīng)該處于約1:1-約l:60的范圍內(nèi)。為了檢測含有25嗎/ml或更少蛋白質(zhì)的溶液中的蛋白質(zhì)，可以使用1:1的試劑與包含蛋白質(zhì)的溶液的體積比例。對于具有更高蛋白質(zhì)濃度的溶液，例如，0.1mg/ml-2mg/ml，試劑與包含蛋白質(zhì)的溶液的體積比1:60應(yīng)該是合適的。有用的酸具有處于0-4范圍內(nèi)，優(yōu)選地3或更低的pKa，以致所述試劑具有-1到1的pH;更優(yōu)選地，所述酸應(yīng)該具有處于約1-約3范圍內(nèi)的pKa，以致所述試劑具有O-l的pH。在Bradford專利(US4，023,933)和Gindler專禾U(US4,239，495)中確定了許多有用的酸，合適的酸包括磷酸、亞磷酸(膦酸)、高碘酸、硒酸、馬來酸、草酸和二氯乙酸。磷酸和膦酸是優(yōu)選的。優(yōu)選的膦酸是次氨基三(亞甲基)三膦酸(Nitrilotris(methylene)triphosphonicacid，NTP)，其為一種可商購的多元酸。在按照本發(fā)明的試劑中，當酸存在時，通常以約4%-約20%，優(yōu)選地，約4%-約12%，優(yōu)選地，約7.5%-約9.5%(w/v)的濃度存在。在使用中可以稀釋所述試劑，這樣酸的最終濃度在約2%-約20%的范圍內(nèi)。所述酸可以是多元和一元酸的混合物，在所述混合物中，優(yōu)選地，多元與一元酸的比在約2:l-約3:l的范圍內(nèi)。在所述試劑中，多元/一元酸混合物通常以約1-約15%(v/v)，優(yōu)選地，約2%-約5。/。(v/v)范圍內(nèi)的濃度存在。為了使用，可以稀釋所述試劑，從而提供處于約0.5-約15%的范圍內(nèi)的多元/一元酸混合物的最終濃度。按照本發(fā)明的試劑包括一種或多種糊精，所述糊精優(yōu)選地選自線性糊精(D)、環(huán)糊精(CD)、環(huán)化直鏈淀粉(CA)和它們的衍生物。優(yōu)選的試劑包括一種或多種環(huán)糊精。合適的線性糊精包括6個或更多個葡萄糖單位，優(yōu)選地，IO個或更多個葡萄糖單位，例如15個葡萄糖單位；環(huán)糊精通常具有6個(a-CD)、7個(P-CD)、或8個(y-CD)葡萄糖單位；環(huán)化直鏈淀粉通常包括8個或更多個葡萄糖單位。合適的衍生物包括heptakis2,6-二-鄰-丁基P-環(huán)糊精、羧甲基(3-環(huán)糊精和羧甲基(x-環(huán)糊精?？梢允褂煤幕旌衔?，例如環(huán)狀糊精的混合物，諸如兩種或更多選自ot-CD,(3-CD和Y-CD的環(huán)狀糊精的混合物；兩種或更多選自a-CD、P-CD、y-CD和CA的環(huán)狀糊精的混合物；線性和環(huán)狀糊精的混合物，諸如線性糊精與a-CD、(3-CD和Y-CD中的一種或多種的混合物；或線性糊精與(x-CD、(3-CD、y-CD和CA中的一種或多種的混合物。除非上下文另外指出，術(shù)語"糊精"用于本文時，包括糊精和糊精衍生物。環(huán)糊精、糊精和某些環(huán)化直鏈淀粉的一些衍生物可以起到表面活性劑的作用，并且可能更不適合用于本發(fā)明的試劑、方法和試劑盒中。一些處于一定濃度下的糊精，由于該糊精的表面-活化性質(zhì)，將干擾某些染料。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定所述糊精以及它們對不同染料各自的干擾濃度。對于給定的蛋白質(zhì)，可以對所使用的糊精或糊精混合物的選擇進行最優(yōu)化，并且當使用一種或多種糊精時，可以調(diào)節(jié)比例，從而獲得對檢測和/或量化給定的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣品最有效的條件。在本發(fā)明的試劑中，糊精通常以0.01-200mg/ml范圍內(nèi)，優(yōu)選地，0.5-50mg/ml范圍內(nèi)的濃度存在。當使用糊精混合物時，這些濃度涉及總糊精濃度。可以調(diào)節(jié)所述試劑的稀釋，以使最終糊精濃度對于給定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)濃度是最優(yōu)的。當?shù)鞍踪|(zhì)樣品中存在去污劑時，可以針對給定的去污劑和該去污劑的具體濃度最優(yōu)化糊精的選擇和濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員，例如通過在不同濃度的糊精或糊精混合物的存在下，在適當?shù)臅r候，測量蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的吸收或發(fā)射光譜，能夠容易地確定合適的最終糊精濃度。對于考馬斯亮藍G-250,能夠在吸收峰，即595nm處測量吸收。按照本發(fā)明的試劑還可以包括增溶劑，諸如醇，從而維持染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物的溶解性。所述增溶劑可以是任何減少或延遲染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀的試劑。所述試劑中可以包括一種或多種醇，合適的醇包括乙醇、甲醇和丙醇。其他合適的醇是具有良好水溶解性的那些，其幾乎不或不作用為去污劑。當所述試劑中存在醇時，其濃度通常是0.1%-約10%(v/v),優(yōu)選地，約0.1%-約5%(v/v),更優(yōu)選地，約1%-約5%(v/v)。本發(fā)明的試劑可以包括去污劑。能夠以多部分系統(tǒng)，例如作為一種或多種水性組分提供所試劑，所述水性組分結(jié)合形成本發(fā)明的試劑。如果以兩部分提供，則一個部分可以包ii括所述染料，任選地，酸和/或任選地，醇，而另一個部分可以包括所述糊精。每個單獨的組分具有長期的穩(wěn)定性(當冷凍保存時，約1年)，且當相混合形成所述試劑時，該試劑自身在被冷凍保存在4'C時，保持穩(wěn)定超過6個月。通過使一種或多種糊精與可商購的蛋白質(zhì)染色劑，例如Bradford測定試劑或其他考馬斯蛋白質(zhì)染色劑相結(jié)合，可以生成按照本發(fā)明的試劑。通過摻入一種或多種按照本發(fā)明所述的糊精，能夠改造可商購的蛋白質(zhì)染色劑、方法和試劑盒；特別是可商購的Bradford測定試劑、方法和試劑盒。所述可商購的試劑盒的實例包括下列各項Pi6rc6:23236考馬斯加(CoomassiePlus)-更好的Bradford測定試劑盒(TheBetterBradfordAssayKit)(包括標準物)23238考馬斯加-更好的Bradford測定試劑23200考馬斯(Bradford)蛋白質(zhì)測定試劑盒23296考馬斯(Bradford)干蛋白質(zhì)測定平板2x96孔23596考馬斯(Bradford)干蛋白質(zhì)測定平板5x96孑LBioRad:500-0201EDU快速起始Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒(QuickStartBradfordProteinAssayKit)1500-0202EDU快速起始Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒2500-0203EDU快速起始Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒3500-0204EDU快速起始Bradford蛋白質(zhì)測定試劑盒4500-0006EDUBio-Rad蛋白質(zhì)測定染料試劑濃縮(Bio-RadProteinAssayDyeReagentConcentrate)西格瑪-奧德里奇(SigmaAldrich):B6916Bradford試劑(西格瑪(Sigma))27813考馬斯⑧蛋白質(zhì)測定試劑BioChemika(Fluka)12常規(guī)地，利用一些蛋白質(zhì)-復(fù)合染料檢測和量化蛋白質(zhì)常受到來自去污劑的非常顯著的干擾；受到特別不利影響的是蛋白質(zhì)復(fù)合染料考馬斯藍G-250、考馬斯紅G-250、考馬斯橙、縮二脲試劑和具有福林-西奧卡特試劑的縮二脲試劑。本發(fā)明克服了這些難題。在不希望受到理論限制的條件下，認為所述去污劑與所述糊精形成復(fù)合物，且所述去污劑對所述糊精的親和力高于所述去污劑對所述染料的親和力。通過使用合適量的糊精或糊精混合物，所述去污劑能夠被糊精-去污劑復(fù)合物捕獲，由此，限制該去污劑抑制蛋白質(zhì)-染料反應(yīng)的程度。與目前可用于蛋白質(zhì)檢測的試劑相比，當包含蛋白質(zhì)的樣品中存在去污劑時，能夠成功地使用本發(fā)明的試劑。這具有極重大的意義，因為本發(fā)明的試劑容許在富含去污劑或表面活性劑的環(huán)境中檢測蛋白質(zhì)，所述去污劑或表面活性劑諸如可以是增溶膜蛋白所必需的，或利用富含去污劑的溶液，例如可商購的提取溶液，諸如B-PER8、禾BCelLytic直接從微生物中提取蛋白質(zhì)所必需的。本發(fā)明還提供檢測蛋白質(zhì)的方法，其包括使包含蛋白質(zhì)的樣品與包含下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，和，(b)—種或多種糊精，和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。對于需要強酸性條件的染料，本發(fā)明提供了檢測蛋白質(zhì)的方法，其包括使包含蛋白質(zhì)的樣品與包含下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，(b)—種或多種糊精，禾口，(c)具有4或更低pKa的酸；和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成可以包括量化所形成的染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的量，由此確定所述樣品中的蛋白質(zhì)濃度。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供量化蛋白質(zhì)的方法，其包括使包含蛋白質(zhì)的樣品與包含下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，(b)—種或多種糊精，和量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。對于需要強酸性環(huán)境的染料，本發(fā)明提供量化蛋白質(zhì)的方法，其包括使包含蛋白質(zhì)的樣品與包含下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，(b)—種或多種糊精，和，(c)具有4或更低pKa的酸；和量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。包含蛋白質(zhì)的樣品可以是溶液，或者可以在支持體，諸如凝膠、溶膠、層析平板、濾紙、硝化纖維膜或樹脂上提供包含蛋白質(zhì)的樣品。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供檢測蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)提供包括蛋白質(zhì)的支持體，(b)使所述蛋白質(zhì)與包括下列各項的溶液相接觸(i)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料,和，(ii)一種或多種糊精和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。對于需要酸性條件的蛋白質(zhì)復(fù)合物染料，本發(fā)明提供了檢測蛋白質(zhì)的方法，其包括(a)提供包括蛋白質(zhì)的支持體，(b)使所述蛋白質(zhì)與包括下列各項的溶液相接觸(i)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，(ii)一種或多種糊精，禾口，(iii)具有4或更低pKa的酸；和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。以上描述了本發(fā)明方法中所使用的合適的蛋白質(zhì)復(fù)合染料、糊精和如果需要，用于摻入所述溶液中的酸。按照本發(fā)明的試劑能夠提供所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料、一種或多種糊精、和如果存在，具有4或更低pKa的酸，本發(fā)明的試劑可以進行稀釋形成溶液。所述溶液可以包括增溶劑，諸如如本文中所述的醇。所述支持體可以是凝膠、溶膠、層析平板、濾紙、硝化纖維膜或樹脂。所述支持體可以包括去污劑。利用本發(fā)明的方法，接觸可以是在存在去污劑的條件下進行的。這些方法特別適合于檢測聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠或多聚體合成凝膠中的蛋白質(zhì)，例如在已經(jīng)利用電場，例如通過電泳分離蛋白質(zhì)樣品時。本文中所述的用于檢測和定量確定凝膠中的蛋白質(zhì)，諸如在利用電場，例如通過電泳分離后產(chǎn)生的那些蛋白質(zhì)的試劑和方法簡化了常規(guī)程序，這樣不再需要去除去污劑諸如SDS和過量染色(背景染色)的清洗程序。典型地，在室溫下執(zhí)行該方法。在本發(fā)明的方法中，檢測染料蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成可以包括檢測所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的吸收或發(fā)射光譜中的變化。在有些情形中，可以檢測顏色變化；例如當使用考馬斯亮藍染料，諸如G-250時。顏色變化可以利用常規(guī)設(shè)備，諸如，例如能夠測量在570nm-620nm范圍內(nèi)波長處吸收的比色計。對于由于形成蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物而經(jīng)歷了吸收光譜中變化的染料，檢測可以通過，例如利用分光光度法測量吸收而實現(xiàn)。可以使用常規(guī)設(shè)備進行分光光度法分析，諸如使用具有400-700nm波長范圍的UV/VIS分光光度計。對于由于形成蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物而經(jīng)歷了發(fā)射光譜中變化的染料，檢測可以通過，例如利用合適地具有190nm-800nm波長范圍的分光熒光計(發(fā)光分光計)，測量發(fā)射而實現(xiàn)。檢測所述蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物可以包括量化存在的蛋白質(zhì)/染料復(fù)合物的量，從而確定蛋白質(zhì)的量或濃度。量化可以是通過包括測量所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收或發(fā)射光譜中變化的方法實現(xiàn)。量化可以包括，例如測量顏色變化。如所述，吸收可以通過分光光度法測量，且可以測量吸收隨著時間的變化。通常在約400-約700nm的波長范圍內(nèi)測量吸收。對于考馬斯亮藍G-250，在約595nm的波長處測量吸吸收，當該染料與蛋白質(zhì)復(fù)合時，其吸收最大。當利用考馬斯亮藍G-250時，能夠通過監(jiān)測由于形成染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物而引起的595nm處吸收的增加，而檢測蛋白質(zhì)。為了確定蛋白質(zhì)濃度，可以將測量到的吸收或發(fā)射與標準數(shù)值、標準數(shù)值組、或標準曲線相比較。如實施例中所示，該結(jié)果是高度可重現(xiàn)的和精確的。由于利用本發(fā)明的試劑和方法所展示的高靈敏性，能夠選擇低如約0.1^g/lml樣品的蛋白質(zhì)濃度。而且，所述精確靈敏的測定所需的時間少于約2分鐘/樣品，與之相反地，傳統(tǒng)Lowry或縮二脲類型的測定通常需要30-40分鐘。因此，本發(fā)明的方法高度適合于大量樣品的自動化和分析。本發(fā)明還提供用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括一種或多種糊精。用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒可以包括一種或多種糊精和蛋白質(zhì)-復(fù)合染料。另夕卜，試劑盒可以包括一種或多種如本文中所述的酸和/或醇。按照本發(fā)明用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒可以包括本發(fā)明的試劑，所述試劑可以作為多部分系統(tǒng)提供，其中組分相混合形成本發(fā)明的試劑。本發(fā)明還提供一種或多種糊精，在存在去污劑的條件下，增強蛋白質(zhì)-結(jié)合染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供一種或多種糊精，在存在去污劑的條件下，降低去污劑在蛋白質(zhì)-結(jié)合染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成中的干擾的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種或多種糊精，在存在去污劑的條件下，改變?nèi)玖希T如蛋白質(zhì)-復(fù)合染料的光學性質(zhì)的應(yīng)用。圖1:無去污劑的蛋白質(zhì)樣品的標準曲線。兩種方法對無去污劑的樣品提供合理的線性響應(yīng)。兩種方法的曲線斜率和相關(guān)系數(shù)相似，這說明該試劑中包括的糊精不干擾蛋白質(zhì)-染料的結(jié)合。圖2:包括去污劑(0.25%CTAB)的蛋白質(zhì)樣品的標準曲線。只有包括糊精的試劑提供具有與無去污劑樣品的斜率或相關(guān)系數(shù)相似的斜率和相關(guān)系數(shù)的線性響應(yīng)。圖3:檢測聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在每個凝膠上跑下列樣品泳道1分子量標準，Mark1216泳道2p-乳球蛋白0.08mg/ml泳道3(3-乳球蛋白0.16mg/ml泳道4p-乳球蛋白0.31mg/ml泳道5p-乳球蛋白0.63mg/ml泳道6(3-乳球蛋白1.25mg/ml泳道7f3-乳球蛋白2.5mg/ml泳道8空白泳道9(3-乳球蛋白5mg/ml泳道10空白泳道11P-乳球蛋白10mg/ml泳道12分子量標準如實施例3中所述，用溶液B染色凝膠B，用溶液A染色凝膠A。在所述染色溶液中培養(yǎng)1小時45分鐘后，給所述凝膠照相。實施例實施例1:制備Bradford試劑向100mg考馬斯亮藍(G-250)中加入47g乙醇、85g磷酸和850g水。混合該溶液20分鐘，從而確保所有的組分溶解，形成包括0.01%(w/v)考馬斯亮藍0-250、4.7%乙醇(w/v)和8.5%(w/v)磷酸的試劑。如該具體實施例中所指示地，向該溶液中加入不同的糊精。Bradford測定(標準方法)將5微升含有0.1mg/ml-1.5mg/ml蛋白質(zhì)禾口/或0.00%-0.5%去污劑的樣品溶液吸移到96-孔微量滴定平板的孔中。向其中加入300微升Bradford試劑。在595nm處測量吸收。減少去污劑干擾本實驗中使用了5種不同的去污劑，即十二垸基硫酸鈉(SDS)(陰離子)、十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)(陽離子)、吐溫TM-20(非-離子)、17TRITONTM-X100(非-離子)和Brij-35(非-離子)。本實驗中使用了4種不同的糊精，即糊精-15(D15)、a-環(huán)糊精(a-CD)、P-環(huán)糊精(P-CD)和y-環(huán)糊精(Y-CD)，還使用了這些糊精的等質(zhì)量混合物(MIX)。另外，還檢驗了不同的環(huán)化直鏈淀粉濃度。A)Bradford測定，含有總共100mg/ml糊精或不同糊精的飽和濃度。以水樣品作為空白，在595nm處測量的吸收表。無糊精D15a-CD卩-CDy-CDMIXSDS(0.5%w/v)0.3260.0070.0130扁0.0380.047CTAB(0.25%w/v)0.7850.0240扁0.0670.0150.020吐溫-20(0.25%w/v)1.0270.4530.1340.0770.3440.041TRITON-X100(0.10%w/v)0.6770.1010,0340.0170.0220.003Brij-35(0.50%w/v)0.2310.0350.0150.0190.1430.018B)Bradford測定，含有不同糊精的總共10mg/ml的糊精。以水樣品作為空白，在595nm處測量的吸收表。無糊精D15a-CD(3-CDY-CDMIXSDS(0.5%w/v)0.3260.0510細0.0250.0050細CTAB(0.25%w/v)0.7850.1840.0260.0290.1640細吐溫-20(0.25%w/v)1.0270,8550.1670.1710.6250.376TRITON隱XIOO(0.10%w/v)0.6770.0760扁0.0060.0190.095Brij-35(0.50%w/v)0.2310,046-0.020扁0.0070.026C)Bradford測定，含有不同糊精的總共lmg/ml的糊精。以水樣品作為空白，在595nm處測量的吸收表。無糊精D15a-CDP-CDMIXSDS(0.5%w/v)0.3260.1950.0100.0560.0790.020CTAB(0.25%w/v)0.7850.6740.1630.1760.6030.407吐溫-20(0.25%w/v)1.0270.9990.8420.8030,9520.94718<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>D)Bradford測定，含有不同濃度的環(huán)化直鏈淀粉(CA)。以水樣品作為空白，在595nm處測量的吸收表。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>595nm處的吸收提供對考馬斯G-250染料藍色形式的量的指示。在給定的具體去污劑濃度下，高吸收值表示高背景，由于該去污劑的存在，以致檢測到的藍色不代表存在的蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物的量，并且由此不代表蛋白質(zhì)的濃度。可以看到，對于每種檢驗的去污劑，溶液中一種或多種糊精的存在導(dǎo)致較低的吸收值，這說明存在較低的背景干擾，并且糊精的存在增高了蛋白質(zhì)檢測的靈敏性和精確性。對于給定的去污劑，能夠通過在存在不同濃度的糊精及其組合的條件下，測量染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收峰處的吸收而確定對糊精和糊精濃度的最佳選擇。實施例2:存在去污劑條件下標準曲線的線性在0.1mg/ml-1.5mg/ml的濃度范圍內(nèi)，創(chuàng)建了兩種不同蛋白質(zhì)的稀釋系列，所述兩種不同蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白(BSA)(Pierce，23209)和牛免疫球蛋白(IgG)(西格瑪(Sigma),15506)。選擇CTAB作為去污劑，并將其加入到蛋白質(zhì)樣品中達到濃度0.25%(w/v)。用含有0.25mg/ml糊精-15(D15)、0.25mg/mla-環(huán)糊精(a-CD)、0.25mg/ml(3-環(huán)糊精((3-CD)和0.25mg/mlY-環(huán)糊精(y-CD)的Bradford試劑進行Bradford測定，將這些與利用不包含糊精的Bradford試劑進行的Bradford測定進行比較。實施例3:檢測聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)制備凝膠染色溶液向80mg考馬斯亮藍(G-250)中加入50g乙醇、80g磷酸和850g水?；旌显撊芤?0分鐘，從而確保所有的組分溶解-這是溶液A。隨后，通過將250mg糊精-15,250mga-環(huán)糊精(a-CD)、250mg卩-環(huán)糊精(卩-CD)和250mgY-環(huán)糊精(Y-CD)加入到100ml溶液A中，制成溶液B。制備樣品和凝膠在0.08mg/ml-10mg/ml的濃度范圍內(nèi)，制備p-乳球蛋白(BLG)(西格瑪(Sigma)，L-0130)的稀釋系列。用10微升NupageLDS樣品緩沖液(Invitrogen,NP0007)稀釋30微升樣品。制造所述凝膠一式兩份，將15微升每種樣品上樣到每塊凝膠(Nupage10%Bis-Tris，Invitrogen，NP(B(^)上。將10微升Markl2TM分子量標準(Invitrogen，LC5677)也上樣到該凝膠上。在恒定電壓(200V)下，標準MES緩沖液中，跑凝膠35分鐘。隨后，將一塊凝膠浸沒在25ml溶液B(由25ml如上所述的溶液A組成的染色溶液，其含有糊精的混合物如下2.511^/1111糊精-15(D15)、2.5mg/mla-環(huán)糊精(a-CD)、2.5mg/ml卩-環(huán)糊精(卩-CD)和2.5mg/mlY-環(huán)糊精(Y_CD))中。將另一塊凝膠浸沒在由25ml溶液A組成的染色溶液中。在染色溶液中培養(yǎng)l小時45分鐘后，對凝膠照相(圖3)。20權(quán)利要求1.用于檢測蛋白質(zhì)的試劑，所述試劑包括(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，和，(b)一種或多種糊精.2.按照權(quán)利要求1的試劑，所述試劑包括具有4或更低pKa的酸。3.按照權(quán)利要求1或2的試劑，其中所述染料是考馬斯染料。4.按照權(quán)利要求3的試劑，其中所述染料是考馬斯亮藍染料。5.按照權(quán)利要求4的試劑，其中所述考馬斯亮藍染料是G-250。6.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，其中所述染料以約0.001%-約0.1%(w/v)范圍內(nèi)的濃度存在。7.按照權(quán)利要求2-6中任一項的試劑，其中所述酸具有約l-約3范圍內(nèi)的pKa。8.按照權(quán)利要求2-7中任一項的試劑，其中所述酸是選自下列各項中的酸磷酸、亞磷酸(膦酸)、高碘酸、硒酸、馬來酸、草酸、二氯乙酸、和次氨基三(亞甲基)三膦酸。9.按照權(quán)利要求2-8中任一項的試劑，其中所述酸是一元酸。10.按照權(quán)利要求2-9中任一項的試劑，其中所述酸以約4%-約20%(w/v)的濃度存在。11.按照權(quán)利要求2-6中任一項的試劑，其中所述酸是多元酸和一元酸的混合物。12.按照權(quán)利要求11的試劑，其中所述多元酸與一元酸的比例處于約2:l-約3:1的范圍內(nèi)。13.按照權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的試劑，其中所述酸以約1-約15%(v/v)范圍內(nèi)的濃度存在。14.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，其中所述一種或多種糊精選自線性糊精、環(huán)糊精、環(huán)化直鏈淀粉和它們的衍生物。15.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，其中所述糊精濃度處于約0.01-約200mg/ml的范圍內(nèi)。16.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，包括減少所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀的增溶劑。17.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，包括一種或多種醇。18.按照權(quán)利要求17的試劑，其中所述一種或多種醇選自乙醇、甲醇和丙醇。19.按照權(quán)利要求17或18的試劑，其中所述醇濃度是約0.1%-約10%v/Vo20.按照以上權(quán)利要求中任一項的試劑，所述試劑包括去污劑。21.檢測蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使含有蛋白質(zhì)的樣品與包括下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料,和(b)—種或多種糊精，和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。23.按照權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的方法，其中所述溶液包括按照權(quán)利要求1-20中任一項所述的試劑。24.按照權(quán)利要求21-23中任一項的方法，其中所述含有蛋白質(zhì)的樣品是溶液。25.按照權(quán)利要求21-23中任一項的方法，其中在支持體上提供所述含有蛋白質(zhì)的樣品。26.按照權(quán)利要求21-25中任一項的方法，其中檢測包括檢測所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收或發(fā)射光譜中的變化。27.按照權(quán)利要求21-26中任一項的方法，其中檢測包括檢測顏色變化。28.按照權(quán)利要求21-27中任一項的方法，其中檢測包括測量吸收。29.按照權(quán)利要求28的方法，其中通過分光光度法測量吸收。30.按照權(quán)利要求29的方法，其中在約400-約700nm范圍內(nèi)的波長31.按照權(quán)利要求29的方法，其中所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料是考馬斯亮藍G-250，并在約595nm波長處測量吸收。32.按照權(quán)利要求21-31中任一項的方法，其中所述檢測包括量化。33.按照權(quán)利要求32的方法，其中通過隨著時間測量吸收進行量化。34.量化蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使含有蛋白質(zhì)的樣品與包括下列各項的溶液相接觸(a)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料,和，(b)—種或多種糊精，和量化染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。35.按照權(quán)利要求34的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。36.按照權(quán)利要求34或權(quán)利要求35的方法，其中所述溶液包括按照權(quán)利要求1-20中任一項所述的試劑。37.按照權(quán)利要求34-36任一項的方法，其中量化包括檢測所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收或發(fā)射光譜中的變化。38.按照權(quán)利要求34-37中任一項的方法，其中量化包括檢測顏色變化。39.按照權(quán)利要求34-38中任一項的方法，其中量化包括測量吸收。40.按照權(quán)利要求39的方法，其中通過分光光度法測量吸收。41.按照權(quán)利要求40的方法，其中在約400-約700nm范圍內(nèi)的波長處測量吸收。42.按照權(quán)利要求39或40的方法，其中所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料是考馬斯亮藍G-250，并在約595nm波長處測量吸收。43.按照權(quán)利要求26-33或37-42中任一項的方法，其中將測量到的吸收或發(fā)射與標準數(shù)值、標準數(shù)值組、或標準曲線進行比較。44.檢測蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括(a)提供包括蛋白質(zhì)的支持體，(b)使所述蛋白質(zhì)與包括下列各項的溶液相接觸(i)蛋白質(zhì)-復(fù)合染料,和，(ii)一種或多種糊精和檢測染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。45.按照權(quán)利要求44的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。46.按照權(quán)利要求44或權(quán)利要求45的方法，其中所述溶液包括按照權(quán)利要求1-20中任一項所述的試劑。47.按照權(quán)利要求44-46中任一項的方法，其中所述支持體是凝膠、溶膠、層析平板、濾紙、硝化纖維膜或樹脂。48.按照權(quán)利要求47的方法，其中所述支持體是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠或多聚體合成凝膠49.按照權(quán)利要求48的方法，其中已經(jīng)利用電場，例如通過電泳對所述蛋白質(zhì)進行分離。50.按照權(quán)利要求44-49中任一項的方法，其中所述支持體包括去污劑。51.按照權(quán)利要求44-50中任一項的方法，其中在存在去污劑的條件下進行接觸。52.按照權(quán)利要求44-51中任一項的方法，其中檢測包括檢測所述染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物吸收或發(fā)射光譜中的變化。53.按照權(quán)利要求44-52中任一項的方法，其中檢測包括檢測顏色變化。54.按照權(quán)利要求44-53中任一項的方法，其中檢測包括測量吸收。55.按照權(quán)利要求54的方法，其中通過分光光度法測量吸收。56.按照權(quán)利要求55的方法，其中在約400-約700nm范圍內(nèi)的波長處測量吸收。57.按照權(quán)利要求54的方法，其中所述蛋白質(zhì)-復(fù)合染料是考馬斯亮藍G-250,并在約595nm波長處測量吸收。58.用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括一種或多種糊精。59.用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括一種或多種糊精和蛋白質(zhì)-復(fù)合染料。60.用于檢測和/或量化蛋白質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括按照權(quán)利要求l-20中任一項所述的試劑。61.—種或多種糊精在存在去污劑的條件下，增強蛋白質(zhì)-結(jié)合染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成的應(yīng)用。62.—種或多種糊精在存在去污劑的條件下，降低去污劑在蛋白質(zhì)-結(jié)合染料/蛋白質(zhì)復(fù)合物形成中的干擾的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供用于檢測蛋白質(zhì)和定量確定蛋白質(zhì)濃度的試劑、方法和試劑盒。所述試劑包括蛋白質(zhì)-復(fù)合染料，諸如考馬斯染料和一種或多種糊精，從而消除由去污劑引起的干擾。文檔編號G01N33/68GK101473228SQ200780021434公開日2009年7月1日申請日期2007年4月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月28日發(fā)明者丹尼爾·布萊恩·瓊斯,海基·蘭科里特申請人:伊克斯派德恩有限公司