專利名稱：：循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析的制作方法循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及胂瘤學(xué)和診斷性檢驗(yàn)的領(lǐng)域，和更具體地用于癌篩查和用于預(yù)測(cè)和監(jiān)控化學(xué)療法治療反應(yīng)、癌的復(fù)發(fā)等的方法。發(fā)明背景胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-l)是在血漿中以高濃度循環(huán)并且可以在大多數(shù)組織中檢測(cè)到的一種7.5kD多肽。IGF-1在結(jié)構(gòu)上與胰島素相似，其刺激細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖并且是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞型持續(xù)增殖所需要的。這些細(xì)胞型尤其包括人二倍體成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞。產(chǎn)生由IGF-1-刺激的細(xì)胞增殖或分化的轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中的第一個(gè)步驟是IGF-1或IGF-2(或超生理學(xué)濃度的胰島素)結(jié)合于IGF-1受體(IGF-1R)。IGF-1R屬于酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體家族(Ullrich等人，Cell61:203-212,1990)并且在結(jié)構(gòu)上與胰島素受體相似(Ullrich等人，EMB0J.5:2503-2512，1986)。流行病學(xué)研究建議，與IGF-1水平處于正常水平低端的個(gè)體相比，IGF-1正常水平的高端使癌危險(xiǎn)增加，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌。此外，有相當(dāng)多的證據(jù)證明IGF-1和/或IGF-IR在體外和體內(nèi)維持腫瘤細(xì)胞的作用。在以下腫瘤中IGF-1R水平有所升高肺腫瘤(Kaiser等人，/.Ca/zcerAes.C/i/z.toco/.119:665-668，1993;Moody等人，"尸e5We/2ces52:1161-1173，1993;Macauley等人，Cer組，50:2511-2517，1990)、乳腺腫瘤(Pollak等人，Ze",38:223-230，1987;Foekens等人，C講er紐49:7002-7009，1989;Arteaqa等人，/,C7/幾/扁化84:1418-1423，1989)、前列腺和結(jié)腸肺瘤(Remaole-Bennet等人，/,A油cr/加/.淑a6.75:609-616，1992;Guo等人，6^"r,&ro/.102:1101-1108，1992)。IGF-1在前列腺上皮中的反常表達(dá)在轉(zhuǎn)基因小鼠中引起肺瘤形成(DiGiovanni等人，彥.鵬97:3455-3460，2000)。另外，IGF-1似乎是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的自泌刺激物(Sandberg-Nordqvist等人，C露cr組53(11):2475-78，1993)，而IGF-1已經(jīng)表明刺激過(guò)度表達(dá)IGF-1R的纖維肉瘤的生長(zhǎng)(Butler等人，Cfl力cer^3s.58:3021-3027，1998)。關(guān)于IGF-1/IGF-1R相互作用在各種人腫瘤生長(zhǎng)中所起作用的綜述，參見(jiàn)Macaulay，/.Ca/cer，65:311-20，1992。使用IGF-1RRNA的反義表達(dá)栽體或反義寡核苷酸，已經(jīng)表明用IGF-1R進(jìn)行干涉引起IGF-1-介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(參見(jiàn)例如，Wraight等人，^Z,"i'Wec力，18:521-526，2000)。生長(zhǎng)還可以使用以下物質(zhì)來(lái)抑制IGF-1的肽類似物(Pietrzkowski等人，^ro^力》"i/T.3:199—205，1992;Pietrzkowski等人，Ce".A/o厶12:3883-3889，1992),或表達(dá)對(duì)IGF-1RNA的反義RM的載體(Trojan等人，Sc/歸e259:94-97，1992)。另外，IGF-1R的抗體(Arteaga等人，Area"C羅.她7>6"邁，22:101-106，1992;和Kalebic等人，Ca/7"r54:5531-34，1994)和IGF-1R的顯性失活突變體(Prager等人，^r7JcaAMJ91:2181-85，1994;Li等人，/.269:32558-2564，1994;Jiang等人，ft2coge/e18:6071-6077，1999)可以反轉(zhuǎn)變形的表現(xiàn)型、抑制腫瘤發(fā)生和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性表現(xiàn)型的損失。IGF-1對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡同樣重要。細(xì)胞凋亡是編程性細(xì)胞死亡，其涉及多種進(jìn)化過(guò)程，包括免疫和神經(jīng)系統(tǒng)成熟。除了在發(fā)育中的作用之外，細(xì)胞凋亡還已經(jīng)作為針對(duì)腫瘤發(fā)生的重要的細(xì)胞保護(hù)措施(Williams,Cell65:1097-1098，1991;Lane，Nature362:786-787，1993)。凋亡程序的抑制可有助于惡性胂瘤的形成和進(jìn)展。IGF上1通過(guò)在IL-3-依賴性造血細(xì)胞中的細(xì)胞因子退隱來(lái)保護(hù)免6于細(xì)胞凋亡(Rodriguez-Tarduchy，G.等人，J./邁層o厶149:535-540，1992),并且在Rat-1/mycER細(xì)胞中保護(hù)免于血清退隱(Harrington,E.等人，/.13:3286-3295，1994)。c-myc驅(qū)動(dòng)的成纖維細(xì)胞的存活依賴IGF-1的論證提示，IGF-1受體在維持肺瘤細(xì)胞方面有重要的作用，具體地是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，這是與IGF-l或IGF-IR的增殖作用不同的作用IGF-l對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用依賴于在細(xì)胞上存在有IGF-IR來(lái)與IGF-1相互作用(Resnicoff等人，CancerRes.55:3739-41，1995)。還通過(guò)使用IGF-1R的反義寡核甘酸進(jìn)行的研究提供了對(duì)IGF-IR維持腫瘤細(xì)胞的抗凋亡功能的支持，所述研究確定了IGF-1R水平、細(xì)胞凋亡的程度和大鼠同基因腫瘤的致瘤潛能之間的數(shù)量關(guān)系(Rescinoff等人，CancerRes.55:3739-3741，1995)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)的IGF-IR在體外保護(hù)胂瘤細(xì)胞免于依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Sell等人，^/zcerAw,55:303-06，1995)并且，更引人注目的是，IGF-IR水平降低到低于野生型水平在體內(nèi)引起腫瘤細(xì)胞的大規(guī)模細(xì)胞凋亡(Resnicoff等人，C謹(jǐn)er組55:2463-69,1995)。一些研究提示IGF-IR的表達(dá)水平與臨床結(jié)果相關(guān)。在腫瘤模型中，IGF-IR調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移，并且i秀導(dǎo)對(duì)耙向治療的抵抗性。抑制IGF-IR顯著地增加胞毒劑的活性(Cohen，B.等人，Ca/2cer11(5):2063-73)。因此，抑制IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎是開(kāi)發(fā)新的癌療法的有前途的策略。上皮組織的惡性肺瘤是癌的最常見(jiàn)形式，并且引起大多數(shù)與癌有關(guān)的死亡。由于這些腫瘤的外科治療的進(jìn)展，死亡率越來(lái)越涉及早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這在最初診斷時(shí)經(jīng)常是隱蔽的(Racila等人，Proc.^〃/jcsd.95:4589—94，1998;Pantel等人，/.y"〃Cs/icer91(13):1113-24，1999)。例如，一些器官的遠(yuǎn)距離解剖學(xué)部位使得在那些器官上的腫瘤不太可能在侵入相鄰組織和生長(zhǎng)到大于1cm之前被檢測(cè)到。即使對(duì)于乳腺癌，通過(guò)乳腺攝影檢測(cè)的小的乳腺癌砟瘤&1cm)已'經(jīng)有12-37%在診斷時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)移(ChadhaA，，Cancer73(2):350-3，1994)。循環(huán)肺瘤細(xì)胞("CTC")是在患有不同實(shí)體惡性腫瘤的患者的循環(huán)中存在的上皮來(lái)源的細(xì)胞。它們來(lái)源于原發(fā)腫瘤的克隆并且是惡性的。(參見(jiàn)Fehm等人，Ca/cer8:2073-84，2002)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)有越來(lái)越多的證據(jù)表明CTC可以被認(rèn)為是以下癌的癌癥進(jìn)展的獨(dú)立it斷(Beitsch&Clifford,^瓜/.i^rg.180(6):446-49，2000(乳腺癌)；Feezor等人，j"/2.。"co/.5T/i^.9(10):944-53，2002(結(jié)腸直腸癌)；Ghossein等人，"/ag".尸"力o/.8(4):165-75，1999(黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌)；Glaves，5二/.Ca/cer48:665-73，1983(肺癌)；Matsunami等人，^wz.S"/^.toco7.10(2):171-5，2003(胃癌);Racila等人，1998;Pantel等人，1999)。有許多理由使得循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和計(jì)數(shù)對(duì)于病人監(jiān)護(hù)是重要的。它們可以在原發(fā)腫瘤之前被檢測(cè)到，因此允許早期的診斷。它們響應(yīng)治療而降低，因此，計(jì)數(shù)CTC的能力允許監(jiān)控給定治療方案的有效性。它們可在輔助性情況中用作工具來(lái)監(jiān)控在沒(méi)有可測(cè)量的疾病的患者中的復(fù)發(fā)。例如，發(fā)現(xiàn)在乳房切除術(shù)8-22年之后的乳腺癌患者中有36。/。存在有CTC，顯然來(lái)自微小轉(zhuǎn)移(單個(gè)腫瘤細(xì)胞沉積或贅生性細(xì)胞的非常小的聚簇)。Meng等人，Ca幾紐10(24):8152-62，2004。另外，CTC可用于預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展的存活率(PFS)和總的存活率(0S)，因?yàn)橐呀?jīng)證明了轉(zhuǎn)移性癌患者中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在/數(shù)量與PFS和0S都相關(guān)。參見(jiàn)例如，Cristofanilli等人，/.O腳厶23(1):1420—1430，2005;Cristofanilli等人，疋^2g厶/.W^f,351(8):781-791，2004。然而，仍需要比僅僅檢測(cè)CTC更靈敏的快速的和可靠的測(cè)定法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)IGF-1R拮抗劑治療在患者中的效力的方法，包括以下步驟a)從患者獲得生物標(biāo)本；b)制備樣本，其中將生，舉與配體混合，所述配體特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，以便基本上排除其它樣本組分；c)使樣品與特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的至少一種試劑接觸；d)使樣品與對(duì)于細(xì)胞上的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1R)有結(jié)合親合力的試劑接觸；和e)分析樣品來(lái)決定表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在，在樣品中表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在是患者中IGF-1R拮抗劑治療的效力的預(yù)報(bào)。本發(fā)明還涉及監(jiān)控患者中IGF-1R拮抗劑治療在患者中的效力的方法，包括以下步驟a)從患者獲得第一生物標(biāo)本；b)制備第一樣本，其中將第一生物標(biāo)本與配體混合，所述配體特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，以便基本上排除其它樣本組分；c)使第一樣本與特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的至少一種試劑接觸；d)使第一樣本與對(duì)于細(xì)胞上的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1R)有結(jié)合親合力的試劑接觸；e)分析第一樣本，以測(cè)定表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在和數(shù)量；f)對(duì)所述患者給予IGF-1R拮抗劑治療；g)在給予IGF-1R拮抗劑治療之后，從患者獲得第二生物標(biāo)本；h)從第二生物標(biāo)本制備第二樣本，其中將第二生物標(biāo)本與配體混合，所述配體特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，并且對(duì)第二樣本進(jìn)行步驟c)-e);和i)將笫一樣本中的表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞數(shù)目與第二樣本中的表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行比較，笫二樣本中的數(shù)目較小表示IGF-1R拮抗劑治療對(duì)所述患者的有效性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，IGF-1R拮抗劑治療是抗-IGF-1R抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于篩查患者樣本是否存在表達(dá)IGF-1R的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，包括a)包括磁芯材料的有涂層的磁性納米粒子、蛋白質(zhì)基礎(chǔ)涂層材料和特異性地結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的特征決定簇的抗體，所述抗體直接或間接地連接于所述基礎(chǔ)涂層材料;b)用于從分析中排除非腫瘤細(xì)胞的樣本組分的細(xì)胞特異性染料；和c)對(duì)于IGF-1R具有結(jié)合親合力的至少一種可檢測(cè)的標(biāo)記試劑-。為了使本發(fā)明的前述和其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征在下文中變得顯而易見(jiàn)，可以通過(guò)參考以下發(fā)明詳述和隨后的權(quán)利要求更清楚地理解本發(fā)明的性質(zhì)。9圖l是各種細(xì)胞系的IGF-lR-藻紅蛋白染色的頻率曲線的疊加。圖2是標(biāo)記的MCF-7乳腺癌細(xì)胞(A圖)和T-24膀胱細(xì)胞(B圖)的熒光顯微圖像的匯集。圖3是可能的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的熒光顯微圖像的匯集。圖4是用抗-IGF-1R抗體治療的四名患者的總的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目和IGF-lR-陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的圖示。圖5是用抗-IGF-1R抗體與多西他賽的組合治療的四名患者的總的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目和IGF-1R-陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的圖示。圖6是用抗-IGF-1R抗體與紫杉醇和卡鉑的組合治療的四名患者的總的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目和IGF-lR-陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目的圖示。發(fā)明詳述除非在本文中明確定義，涉及本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。另外，除非上下文要求，單數(shù)的術(shù)語(yǔ)包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)包括單數(shù)。在美國(guó)每年確診超過(guò)1000,000的新的癌癥病例；其中大約五分之一的死亡是由癌癥或與其治療相關(guān)的并發(fā)癥引起的。有相當(dāng)多的研究計(jì)劃不斷地針對(duì)改善這種疾病的治療和診斷。大多數(shù)癌癥患者不是被他們的原發(fā)腫瘤殺死；而是死于轉(zhuǎn)移病變從原發(fā)腫瘤分出并且遍及身體傳播的惡性細(xì)胞建立多重分布廣泛的腫瘤集落，經(jīng)常是傳播到遠(yuǎn)的位置。不幸的是，轉(zhuǎn)移性集落經(jīng)常比原發(fā)腫瘤更難以檢測(cè)和清除，并且經(jīng)常是不可能成功地治療它們的全部。惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力仍是癌癥治療的主要阻礙，并且其可由IGF-1受體促進(jìn)。參見(jiàn)例如，Bahr等人，GrowthFactors23:1-14，2005?；诎┌Y和癌癥轉(zhuǎn)移的復(fù)雜性和多年來(lái)治療癌癥患者的挫折，許多努力已經(jīng)開(kāi)始針對(duì)開(kāi)發(fā)診斷檢查，來(lái)指導(dǎo)治療和監(jiān)控這種治療對(duì)轉(zhuǎn)移病變或復(fù)發(fā)的作用。這種檢查可能可用于癌癥篩查，代替相對(duì)粗糙的乳腺攝影或用于前列腺癌的手指直腸檢驗(yàn)?？紤]到已知IGF-1和IGF-1R與某些癌癥的關(guān)系，進(jìn)行了研究來(lái)評(píng)價(jià)抗-IGF-1R抗體對(duì)循環(huán)肺瘤細(xì)胞數(shù)目及其IGF-1R表達(dá)的影響，以及該抗體的臨床效力?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可用于癌癥的診斷和治療的檢測(cè)和計(jì)數(shù)表達(dá)IGF-1R的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(IGF-lR-陽(yáng)性CTC)的測(cè)定法，并且其優(yōu)于涉及CTC的現(xiàn)有技術(shù)方法。所述測(cè)定法可有助于更好地理解IGF-1受體的生物學(xué)功能。例如，盡管已經(jīng)假定IGF-1R水平升高對(duì)于觸發(fā)腫瘤細(xì)胞侵襲性/轉(zhuǎn)移性表現(xiàn)型來(lái)說(shuō)是需要的，但是IGF-1R表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移可能性之間的關(guān)系尚未完全闡明?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IGF-1R-陽(yáng)性CTC計(jì)數(shù)高的患者似乎是具有更具侵襲性的腫瘤，如快速的疾病進(jìn)展所證明的。因此，IGF-IR表達(dá)增加與轉(zhuǎn)移可能性之間的可能的關(guān)系可能是將檢測(cè)IGF-1R-陽(yáng)性CTC作為不良結(jié)果的預(yù)報(bào)和/或治療性介入的基礎(chǔ)。最初，本發(fā)明的CTC-IGF-1R測(cè)定法可用于早期檢測(cè)腫瘤，或者用于證實(shí)診斷。它們還可以用于評(píng)價(jià)預(yù)后。本發(fā)明的方法對(duì)于治療計(jì)劃也是有用的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在治療之前具有IGF-lR-陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞的患者很可能響應(yīng)IGF-IR拮抗劑治療，而沒(méi)有所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的患者不響應(yīng)。通過(guò)在開(kāi)始任何治療之前篩查患者的IGF-lR-陽(yáng)性抗體，有可能預(yù)先選擇很可能響應(yīng)于IGF-IR拮抗劑治療的群體并且因此設(shè)計(jì)治療方案。CTC-IGF-1R測(cè)定法作為抗-IGF-1R抗體的生物標(biāo)志物的可能應(yīng)用可以包括鑒定最佳的生物學(xué)劑量、選擇劑量和治療方案和確定治療持續(xù)時(shí)間。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在血液中的IGF-lR-陽(yáng)性CTC水平變化與化學(xué)療法和臨床狀態(tài)之間具有好的相關(guān)性。考慮到這些相關(guān)性，還有可能使用本發(fā)明的測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)患者對(duì)治療的響應(yīng)或疾病進(jìn)展。測(cè)量循環(huán)腫瘤細(xì)胞上的IGF-1受體提供了真實(shí)的藥效學(xué)(PD)終點(diǎn)。一旦開(kāi)始治療，測(cè)量腫瘤細(xì)胞上的IGF-1R可用于測(cè)定是否已經(jīng)實(shí)現(xiàn)靶的最大抑制而沒(méi)有達(dá)到最大耐受劑量(MTD)。逑《以監(jiān)控對(duì)已知治療的抵抗性的形成。本ii發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)在于，可以通過(guò)測(cè)量CTC比常規(guī)方法更頻繁地測(cè)定藥物的效果。最后，本發(fā)明的方法還可以用于檢測(cè)胂瘤的復(fù)發(fā)，即使在沒(méi)有臨床癥狀的存在下亦如此。本發(fā)明的方法可用于與非血液學(xué)惡性腫瘤的診斷和/或治療結(jié)合，所述非血液學(xué)惡性肺瘤包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和結(jié)腸癌，特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和激素難治療的前列腺癌(HRPC)。對(duì)多腫瘤類型的患者進(jìn)行篩查表明，在HRPC患者中頻繁地檢測(cè)到CTC和IGF-lR-陽(yáng)性CTC。在HRPC中鑒定這些細(xì)胞具有預(yù)后或治療方面的意義。事實(shí)上，在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)CTC的存在是HRPC患者中存活率的最有意義的參數(shù)預(yù)報(bào)(Moreno等人，Urology65:713-718，2005)。多重研究已經(jīng)確立了IGF-1R在前列腺癌形成中的作用，并且體外數(shù)據(jù)顯示，IGF-1R表達(dá)和/或活性的增加與激素難治療的表現(xiàn)型的進(jìn)展有關(guān)(Hellawell等人，CancerRes.，62:2942—2950，2002;Chott等人，J瓜/.戶"力o7.155:1271-1279，1999)。在本文描述的一項(xiàng)研究中，被認(rèn)為是IGF-1R陽(yáng)性(即，檢測(cè)到至少一種IGF-1R-陽(yáng)性CTC)的HRPC患者在登記時(shí)具有比沒(méi)有可檢測(cè)的CTC的那些患者更高的血清PSA中值水平。此外，PSA水平和CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC計(jì)數(shù)在治療響應(yīng)或疾病進(jìn)展過(guò)程中平行地改變。以前已經(jīng)表明具有進(jìn)行性轉(zhuǎn)移性HRPC的患者的CTC計(jì)數(shù)比先前疾病組的那些顯著更高，并且在兩名患者中報(bào)告了在用多西他賽初步治療一周之后CTC計(jì)數(shù)降低(Moreno等人，2005，同前)。然而，這兩名患者都發(fā)生了進(jìn)展，盡管給予了另外的多西他賽劑量，但仍表現(xiàn)出CTC計(jì)數(shù)和PSA水平升高。本文所述的研究提示，只有CTC計(jì)數(shù)的持續(xù)降低才與HRPC中的治療響應(yīng)相關(guān)。因此，CTC計(jì)數(shù)可以提供獨(dú)立于PSA水平的預(yù)后信息。重要的是，臨床前數(shù)據(jù)表明，PSA響應(yīng)抗-IGF-1R治療的改變反映了前列腺腫瘤生長(zhǎng)的變化(Wu等人，Ca"cei^es.11:3065-3074，2005)。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)組合的抗-IGF-1R抗體和多西他賽治療有響應(yīng)的比例在研究錄入時(shí)具有可檢測(cè)辨I'GF-lR-怍性CTC的那些患者中比在其中沒(méi)有檢測(cè)到這些細(xì)胞的那些患者中更高。此外，在IGF-IR-CTCPetrylak等人，/.Cer98:516-521，2006)。這些數(shù)據(jù)暗示了IGF-IRCTC計(jì)數(shù)用于鑒定可以受益于抗-IGF-lR治療的HRPC患者的可能應(yīng)用。本發(fā)明的方法可用于設(shè)計(jì)和/或監(jiān)控使用抑制IGF-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的各種化學(xué)治療化合物進(jìn)行的治療。特別優(yōu)選的是抗-IGF-lR抗體，例如在美國(guó)專利7，037，498和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0069539中描述的那些。其它優(yōu)選的抗-IGF-lR抗體包括F-50035和MK-0646(PierreFabre/Merck);19D12(Schering-Plough);R1507(Roche/G函ab);EM-164/AVE-1642(Imm畫gen/Sanofi-Aventis);IMC-A12(ImCloneSystems);AMG479(Amgen);以及在國(guó)際專利申請(qǐng)W02006/069202、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0147612、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0084906、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0249730、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0018191、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2005/0136063、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2003/0235582、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0265307、美國(guó)專利申請(qǐng)/>布2004/0228859、美國(guó)專利申請(qǐng)7〉布2005/0008642、歐洲專利申請(qǐng)1622942、美國(guó)專利申請(qǐng)公布2003/0165502和美國(guó)專利公布2005/0048050中描述的抗體。適合用于本發(fā)明的分子的其它類別包括特異性地結(jié)合于IGF-1R的肽適配體、反義寡核苷酸IGF-1R調(diào)節(jié)劑；和小分子的IGF-1R抑制劑。優(yōu)選的小分子的IGF-1R抑制劑包括OSI-906(OSIPharmaceuticals);AEW-541(Novartis);BMS-536924和BMS-554417(Bristol-MyersSquibb);I腿-18(I謂ed);AG-1024(Pfizer);XL228(Exelixis);苦鬼臼脂素；以及在國(guó)際專利申請(qǐng)WO2004/043962和WO2004/054996中披露的那些。如以下更具體地闡迷的，本發(fā)明的方法包括從患者樣本選擇性除去具有某些抗原活性部點(diǎn)的細(xì)胞。用于這種選擇性除去的方法和裝置為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見(jiàn)銜啦，美咽專利4,551,435、4，795，698、4,925,788、5，108，933和5，200，084和美國(guó)專利申請(qǐng)公布2004/0157271。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所關(guān)心的細(xì)胞是使用鐵磁流體從患者樣本免疫磁性分離的。鐵磁流體包含在膠態(tài)懸浮體中的微小的》茲性粒子，其流動(dòng)可以由磁鐵或磁場(chǎng)控制。為了更好地理解本發(fā)明，給出以下實(shí)施例。這些實(shí)施例只是用于說(shuō)明的目的，不應(yīng)將其看作是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例在本文中給出的實(shí)施例中，從人受試者的多個(gè)部位取得血樣到CELLSAVEPreservativeTubes(Immunicon，HuntingdonValley,PA)中，所述CELLSAVEPreservativeTubes為包含細(xì)胞防腐劑以保持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面抗原表達(dá)的排空的1OmL抽血管。將樣本保持在室溫并且在血液收集的72小時(shí)內(nèi)如上所述處理。使用實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors)(RECIST)放射性評(píng)價(jià)患者對(duì)治療的響應(yīng)(參見(jiàn)Therasse等人，J.yV^,/Ca/zcer//2".92:205-216，2000),或者，在HRPC治療的響應(yīng)(參見(jiàn)Bubley等人，J.Clin.Oncol.17:3461-3467，1999)。實(shí)施例1IGF-IR循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)定法的開(kāi)發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞摻入示蹤劑(spiking):在包含補(bǔ)充有10%FCS的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基的燒瓶中培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞系MCF-L前列腺細(xì)胞系PC3-9、膀胱細(xì)胞系T-24和造血細(xì)胞系CEM，并且隨后使用胰蛋白酶收獲細(xì)胞。只有在通過(guò)臺(tái)盤藍(lán)染料排除試驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞懸液的細(xì)胞存活力超過(guò)90°/。時(shí)才使用所述細(xì)胞懸液。為了測(cè)定實(shí)際的細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞的50juL等分試樣透化處理并且通過(guò)加入包含0.G5。/。皂苷和與最終疾度為0.5jug/ml的藻紅蛋白(PE)綴合的i(5pl抗細(xì)胞角蛋白單克隆抗體的200ji1PBS進(jìn)行熒光標(biāo)記。在室溫培養(yǎng)15分鐘之后，加入200M1緩沖液和包含總計(jì)大約20,000個(gè)小珠的20|li1熒光小珠(Beckman-Coulter,Inc.,Miami,FL)。將只含小珠的雙份的管在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(FACSCalibur,BDBiosciences,SanJose,CA)上運(yùn)行，直到100%的樣品被吸出。這樣提供了存在于20p1中小珠數(shù)目的精確估計(jì)值。然后在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上一式三份檢測(cè)實(shí)驗(yàn)管，直到在每個(gè)管中計(jì)數(shù)到10，000個(gè)小珠。使用已知的每單位體積的小珠數(shù)，測(cè)定細(xì)胞的濃度。對(duì)于IGF-1R檢測(cè)，估計(jì)在7.5mL血液中摻入示蹤劑的細(xì)胞數(shù)為130到220個(gè)。CTC的分離和計(jì)數(shù)制備用于從血液分離細(xì)胞的樣本并且使用CELLTRACKS系統(tǒng)(Immunicon，HuntingdonValley,PA)進(jìn)行分析，所述CELLTRACKS系統(tǒng)包括CELLTRACKSAUTOPREP系統(tǒng)、試劑盒和CELLSP0TTER分析儀。CELLTRACKSAUTOPREP系統(tǒng)是用于稀疏細(xì)胞檢測(cè)的自動(dòng)的樣品制備系統(tǒng)。所述試劑盒包括涂有免疫磁性富集細(xì)胞的抗體的鐵磁流體；熒光結(jié)合的抗體(與分別用于標(biāo)記上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的PE和別藻藍(lán)蛋白(APC)結(jié)合的抗體)；細(xì)胞核染料；用于洗滌、透化和再懸浮細(xì)胞的緩沖液的混合物。為丁檢測(cè)癌細(xì)胞，將7.5mL血液與涂有針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原EpCAM(上皮細(xì)胞粘著分子、或上皮細(xì)胞表面抗原)的抗體的鐵磁流體混合。在免疫磁性富集之后，將識(shí)別細(xì)胞角蛋白4、5、6、8、10、13、18和19的異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的抗體，識(shí)別白細(xì)胞抗原CD45的APC-標(biāo)記的抗體，識(shí)別IGF-1R的PE-標(biāo)記的抗體，和核酸染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)與透化緩沖液一起加入，以便熒光標(biāo)記所述免疫磁性標(biāo)記的細(xì)胞。在系統(tǒng)上進(jìn)行培養(yǎng)之后，重復(fù)磁力分離并且吸出過(guò)量的染色劑。在最后的處理步驟中，將細(xì)胞再懸浮在MAGNESTCellPresentationDevice(I,nicon，HuntingdonValley,PA)中。這個(gè)裝置包括一個(gè)腔室和兩個(gè)磁鐵，所述磁鐵使免疫磁性標(biāo)記的細(xì)胞定向，以便使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析。將MAGNEST置于CELLSPOTTER分析儀上，所述CELLSP0TTER分析儀為四色半自動(dòng)熒光顯微鏡。抓拍覆蓋四個(gè)熒光濾光器立方體中的每一個(gè)的盒體(cartridge)的整個(gè)表面的圖像畫面。包含滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)象的抓拍圖像自動(dòng)地呈現(xiàn)在能上網(wǎng)的瀏覽器中，由操作者從中進(jìn)行最后的細(xì)胞選擇。定義為CTC的對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)包括圓形到橢圓形的形態(tài)、可見(jiàn)的細(xì)胞核(DAPI陽(yáng)性)、細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性染色和沒(méi)有CD45表達(dá)(通過(guò)陰性CD45-APC染色測(cè)定的)。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果總是表示為每7.5mL血液中的細(xì)胞數(shù)目。選擇IGF-1R抗體和在腫瘤細(xì)胞系上檢測(cè)IGF-1R:在來(lái)自乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞上滴定抗IGF-1R抗體1H7(PE綴合物；BDBiosciences,SanJose，CA)和33255.Ill(R&DSystems,MinneapolisMN)。交叉阻斷實(shí)驗(yàn)顯示沒(méi)有抑制，表明這些抗體結(jié)合于IGF-IR的不同的和非竟?fàn)幮缘目乖瓫Q定部位。使用CP-751,871人抗-IGF-lR抗體(PfizerInc.;參見(jiàn)美國(guó)專利7，037，498)進(jìn)行的交叉阻斷實(shí)驗(yàn)表明，抗體33255.Ill完全地被基本上等摩爾量的CP-751,871阻斷，不能結(jié)合細(xì)胞。相反，1H7抗體表現(xiàn)出在CP-751,871的存在下結(jié)合沒(méi)有受到抑制。這些數(shù)據(jù)顯示，33255.Ill和CP-751,871結(jié)合于相同或相關(guān)的抗原決定部位。因?yàn)?H7抗體對(duì)IGF-1R的結(jié)合沒(méi)有在CP-"l，871的存在下被阻斷，選擇1H7用于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。通過(guò)用PE標(biāo)記的抗-IGF-1R抗體1H7染色隨后進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)造血細(xì)胞系CEM、前列腺癌細(xì)胞系PC3-9、膀胱細(xì)胞系T-24和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系上的抗原密度。圖l表示各種細(xì)胞系的IGF-1R-PE染色的頻率曲線的疊加。CEM細(xì)胞的染色與對(duì)照相似，因此，IGF-IR密度低于檢測(cè)極限?？梢詮谋尘胺直鍼C3-9細(xì)胞的IGF-1R-PE染色，并且T24和MCF-7細(xì)胞明顯地具有更亮的染色。通過(guò)用具有已知數(shù)量PE分子的小珠校準(zhǔn)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)得到對(duì)抗原密度的估計(jì)值。PC3-9細(xì)胞上的IGF-IR密度為約10，000IGF-1R抗原，T-24上為約50,000IGF-IR抗原，MCF-7細(xì)胞上為約1，000，000IGF-IR抗原。IGF-IR測(cè)定法表征使用CELLTRACKS系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)的CTC測(cè)定法使用PE來(lái)檢測(cè)在上皮來(lái)源的細(xì)胞上存在的細(xì)胞角蛋白，使用APC來(lái)檢溯遷血來(lái)源的細(xì)胞上存在的CD45,和使用FITC來(lái)樘鍘被定義為嘲胞16角蛋白陽(yáng)性的、CD45-陰性的有核細(xì)胞的CTC上的被分析物特異性試劑。用于使用FITC標(biāo)記抗體檢測(cè)抗原的CELLSPOTTER分析儀s的目前的檢測(cè)極限為約每細(xì)胞大約100，000抗原。為了增加這個(gè)靈敏度，對(duì)CTC測(cè)定法進(jìn)行重新配置，以便降低IGF-IR檢測(cè)的檢測(cè)極限。用FITC標(biāo)記在上皮細(xì)胞上以高密度表達(dá)的細(xì)胞角蛋白，其允許使用PE標(biāo)記的抗-IGF-1R抗體。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將130到200個(gè)PC3-9、T-24或MCF-7細(xì)胞摻入7.5mL血液中并且用新配置的染色劑進(jìn)行準(zhǔn)備。在制備之后，將樣品在CELLSPOTTER分析儀上掃描。所述分析儀被重新配置為使得為用戶提供細(xì)胞角蛋白FITC-陽(yáng)性的、有核的DAPI-陽(yáng)性的結(jié)果作為CTC候選物。在圖2的A圖中，表示了從7.5mL血液回收的MCF-7細(xì)胞的典型實(shí)例。頂行表示明顯表達(dá)IGF-1R受體的3個(gè)MCF-7細(xì)胞的聚簇，緊挨著合成圖像的檢驗(yàn)記號(hào)表明操作者將該細(xì)胞分類為CTC,緊挨著表示IGF-1R染色的圖像的檢驗(yàn)記號(hào)表明操作者將這些CTC分類為表達(dá)IGF-1R的CTC。在A圖中所示的所有細(xì)胞都明顯地表達(dá)IGF-1R受體。在摻有MCF-7細(xì)胞的得自十六名健康個(gè)體的血液中，回收的MCF-7細(xì)胞有80.6%(SD7.7)被分類為表達(dá)IGF-1R的CTC。在圖2的B圖中，表示了從7.5mL血液回收的T-24細(xì)胞的典型實(shí)例。與MCF-7細(xì)胞的IGF-1R染色相比，四個(gè)T-24細(xì)胞的IGF-1R表達(dá)明顯更加模糊，并且操作者只將底部的兩個(gè)細(xì)胞分類為表達(dá)IGF-1R受體的CTC。在摻有T-24細(xì)胞的得自六名健康個(gè)體的血液中，回收的MCF-7細(xì)胞有13.6%鵬.9)被分類為表達(dá)IGF-1R的CTC。在摻有PC3-9細(xì)胞的得自六名健康個(gè)體的血液中，回收的MCF-7細(xì)胞有3.8%(SD6.O)被分類為表達(dá)IGF-1R的CTC。這些數(shù)據(jù)為轉(zhuǎn)移性癌患者的CTC上的IGF-1R抗原密度提供指導(dǎo)，其需要通過(guò)這個(gè)測(cè)定法來(lái)檢測(cè)。轉(zhuǎn)移性癌中的CTC上的IGF-1R表達(dá)在得自139名健康個(gè)體的7.5mL血液中，實(shí)際上不含CTC(在135名個(gè)體中為0CTC，在4名個(gè)體中為1CTC)。為了檢驗(yàn)是否可以確實(shí)地在轉(zhuǎn)移性癌患者中的CTC上檢測(cè)HF-l及，對(duì)得自50名患者的血樣進(jìn)行檢驗(yàn)。在7.5齓血液中，在50名患者中的11名(22%)中檢測(cè)到CTC。在這50名患者中，18名患有乳腺癌并且在28%中檢測(cè)到了CTC,13名患有結(jié)腸直腸癌并且在31%中檢測(cè)到了CTC，3名患有前列腺癌并且在33%中檢測(cè)到了CTC，12名患有肺癌并且在8%中檢測(cè)到了CTC，在患有卵巢癌的4名患者中沒(méi)有檢測(cè)到CTC。檢測(cè)的CTC的實(shí)例表示在圖3中。在該圖中表示了八個(gè)CTC候選物。事件1、事件4、事件5、事件7和事件8被分類為CTC，只有第1和4行的CTC被分類為表達(dá)IGF-1R的CTC。指出的是，在第5和7行中的CTC可以觀察到可能的IGF-1R染色，但是認(rèn)為這不足以將其分類為IGF-1R陽(yáng)性CTC。表1表示在具有CTC的ll名患者中檢測(cè)到的CTC數(shù)目、表達(dá)IGF-1R的CTC數(shù)目和表達(dá)IGF-1R的CTC的比例。在11名患者中的8名(91°/。)中檢測(cè)到表達(dá)IGF-1R的CTC。然而，表達(dá)IGF-1R的CTC的比例變化很大。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例2在抗-IGF-lR抗體的l期劑量-確定研究中在CTC上的IGF-R表達(dá)研究1是用f劑量確定的1期研究，其設(shè)計(jì)用于確定如美閨夸剩-1R抗體在晚期實(shí)體瘤患者中的安全性和耐受性。在這項(xiàng)研究中，每21天給予3-20mg/kg劑量的抗-IGF-1R抗體治療(21天周期)。為了評(píng)價(jià)用抗-IGF-lR抗體進(jìn)行治療對(duì)這些患者中的CTC和表達(dá)IGF-1R的CTC的數(shù)目的影響，在每個(gè)21天治療周期的篩選時(shí)、在劑量給藥前1天和研究的第8天抽取血樣。在患者無(wú)論何時(shí)由于疾病進(jìn)展退出該研究時(shí)取得另一個(gè)樣本。有26名患者提供了用于在研究過(guò)程中計(jì)數(shù)CTC的血樣。在26名患者中有16名(61%)在研究過(guò)程中的某一時(shí)間點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)CTC(劑量給藥前或治療過(guò)程中)。在研究過(guò)程中的某一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到CTC的16名患者中有3名沒(méi)有檢測(cè)到IGF-1R-陽(yáng)性CTC。在兩種情況中，在7.5niL血液中只檢測(cè)到一個(gè)CTC。將CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC的水平相對(duì)于時(shí)間繪圖并且觀察對(duì)抗-IGF-1R抗體治療的響應(yīng)的幾種模式。在圖4中描繪了四個(gè)實(shí)例。在A圖中，表示了得自用6mg/kg抗-IGF-1R抗體的單劑量治療的患者的CTC計(jì)數(shù)。在這名患者中，在用抗-IGF-1R抗體治療的第8天，CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC的數(shù)目降低，并且在第15天不再可檢測(cè)到，然后在第2周期開(kāi)始之前重現(xiàn)。在B圖中，表示了得自用10mg/kg抗-IGF-1R抗體的單劑量治療的患者的CTC計(jì)數(shù)。在治療的8和15天CTC有輕微的減少之后，隨著患者中斷研究，CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC的數(shù)目隨時(shí)間增加。通過(guò)CT掃描確定這名患者出現(xiàn)了疾病進(jìn)展。在C圖中，表示了得自用單劑量的20mg/kg抗-IGF-lR抗體治療的患者的CTC計(jì)數(shù)。除了在給予所述劑量15天之后出現(xiàn)的CTC峰之外，CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC數(shù)量未受影響。D圖表示得自用單劑量的3mg/kg抗-IGF-1R抗體治療的患者的CTC計(jì)數(shù)，其中幾乎所有檢測(cè)到的CTC都表達(dá)IGF-1R。在患者中斷研究時(shí)發(fā)現(xiàn)CTC增加。隨這些數(shù)據(jù)的一個(gè)可能的解釋是，這些患者中的大多數(shù)循環(huán)腫瘤細(xì)胞都表達(dá)IGF-1R，并且用抗-IGF-1R抗體進(jìn)行治療似乎是阻斷了保存CTC所需的存活信號(hào)。或者，抗-IGF-1R抗體的作用可能是直接地針對(duì)腫瘤質(zhì)量，抑制CTC的遷移。盡管有易變性，但是觀察到在劑量給藥后的CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC數(shù)目減小以及在結(jié)束治療周期時(shí)循環(huán)細(xì)胞數(shù)目的反彈。在研究后的隨訪中也觀察到CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC數(shù)目的增加。這些數(shù)據(jù)支持了CTC和CTC-IGF-1R測(cè)定法在監(jiān)測(cè)對(duì)抗-IGF-1R抗體的生物學(xué)響應(yīng)和臨床響應(yīng)中的作用。實(shí)施例3在抗-IGF-lR抗體與多西他賽組合的研究中的CTC上的IGF-IR表達(dá)研究2是用如美國(guó)專利7，037，498所述的完全的人抗-IGF-2R抗體與多西他賽(TAXOTERE)的組合在晚期實(shí)體瘤患者中的劑量確定的lb期研究。在第1天和第22天將多西他賽和抗-IGF-IR抗體分別以75mg/m2和0.1-10mg/kg的劑量給藥。有27名患者提供了用于計(jì)數(shù)CTC的血樣，包括19名激素難治療的前列腺癌(HRPC)患者。在每個(gè)周期的劑量給藥前第l天和第8天收集CTC樣本。27名患者中有19名(70%)在研究過(guò)程中在某一時(shí)間點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)CTC。在研究的某一時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到CTC的十九名患者中，只有一名沒(méi)有檢測(cè)到IGF-1R-陽(yáng)性CTC。有趣的是，在這名患者的所有的5次CTC評(píng)價(jià)中，都檢測(cè)到CTC，但是沒(méi)有檢測(cè)到IGF-1R-陽(yáng)性CTC,表明這名患者腫瘤位點(diǎn)本身不能表達(dá)IGF-1R。在大多數(shù)患者中觀察到響應(yīng)于治療的CTC數(shù)目減少。將CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC相對(duì)于時(shí)間繪圖并且觀察對(duì)抗-IGF-1R抗體治療的響應(yīng)的幾種模式。在圖5中描繪了四個(gè)實(shí)例。A圖描繪在用10mg/kg抗-IGF-IR抗體和75mg/m2的多西他賽(21天周期)治療的激素難治療的前列腺癌患者中的CTC和IGF-lR-陽(yáng)性CTC數(shù)目。在治療之后，CTC的總數(shù)減少，反映了對(duì)聯(lián)合治療的反應(yīng)。得自這名患者的PSA值證實(shí)了對(duì)治療的臨床反應(yīng)。另外，在這名患者中，在抗-IGF-lR抗體/多西他賽治療之前，大約50%的CTC原來(lái)是IGF-1R-陽(yáng)性的；IGF-1R-陽(yáng)性CTC的數(shù)目隨著治療迅速地減少。因?yàn)榭?IGF-1R抗體的生物學(xué)效應(yīng)是誘導(dǎo)IGF-1R的向下調(diào)節(jié)，這些數(shù)據(jù)支持了CTC和CTC-IGF-1R測(cè)定法在監(jiān)控抗-IGF-1R抗銀的嗨床和生々物學(xué)(生物標(biāo)志物)活性中的可能的20作用。B圖描繪了CTC和IGF-1R陽(yáng)性CTC數(shù)目發(fā)生類似減少的患者。C和D圖描繪了其中在給予每個(gè)劑量之后CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC數(shù)目減小但是每次都反彈的兩名患者。兩名患者都用低劑量的抗-IGF-lR抗體治療(分別為0.8和3mg/kg)。加入研究2的在登記時(shí)具有至少一個(gè)可檢測(cè)的IGF-lR-陽(yáng)性CTC的HRPC患者具有比IGF-1R-CTC陰性的那些(n-8,PSA中位值為92ng/mL)更高的PSA水平(n=10，PSA中位值為475ng/mL)。由于遺漏樣本，不可能在兩名患者進(jìn)行評(píng)價(jià)。盡管有明顯更高的腫瘤負(fù)荷，在登記時(shí)為IGF-1R-CTC陽(yáng)性的患者以比IGF-1R-CTC陰性的那些(8名中的2名)更高的比例(10名中有6名)以PSA標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)，并且總的說(shuō)來(lái)，對(duì)多西他賽和抗-IGF-1R抗體的組合響應(yīng)更早。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在研究登記時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到CTC的8名患者中，有6名對(duì)治療無(wú)反應(yīng)，并且實(shí)際上它們中的3名在疾病進(jìn)展時(shí)經(jīng)歷了CTC和IGF-IR-陽(yáng)性CTC計(jì)數(shù)的增加。最后，用多西他賽和抗-IGF-1R抗體治療的檢測(cè)到CTC但是沒(méi)有檢測(cè)到IGF-IR-陽(yáng)性CTC的一名HRPC患者對(duì)聯(lián)合治療沒(méi)有反應(yīng)。其CTC計(jì)數(shù)的減小也是暫時(shí)的(l個(gè)周期)。在表3中，顯示了研究2中HRPC患者的患者最好反應(yīng)的概要。在開(kāi)始治療前沒(méi)有在7.5niL中檢測(cè)到IGF-lR-陽(yáng)性CTC的8名患者中有2名(25%)表現(xiàn)出對(duì)治療的部分反應(yīng)，而在7.5fflL中有〉l個(gè)IGF-1R-陽(yáng)CTC的11名患者中有6名(55%)表現(xiàn)出部分反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地支持了如下的概念，即，CTC-IGF-1R測(cè)定法可用于確定患者可受益于抗-IGF-lR抗體治療，以及用于確定最佳劑量和決定治療持續(xù)時(shí)間。表3研究2中的IGF-lR-陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞和患者最好反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>計(jì)=2PR/8忠者PD=疾病進(jìn)展；SD=疾病穩(wěn)定；PR=部分反應(yīng)實(shí)施例4將抗-IGF-lR抗體與紫杉醇和卡鈿組合的研究中在CTC上的IGF-IR表逸研究3是用如美國(guó)專利7,037,498所述的完全的人抗-IGF-3R抗體與紫杉醇(TAX01)和卡鉑(PARAPLATIN)的組合在晚期實(shí)體瘤患者中的lb期研究。紫杉醇、卡鉑和抗-IGF-1R抗體的劑量分別是200mg/m2、6AUC和0.05-10mg/kg。41名患者提供了用于計(jì)數(shù)CTC的血樣。在每個(gè)周期的劑量給藥前第1天和第8天收集血樣。41名患者中有21名(51%)在舒寇逸程中的某一點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)CTC,而41名患者中有IO名(24%)在給予第一劑量之前具有一個(gè)或多個(gè)CTC。41名患者中有16名(39%)在研究過(guò)程中的某一點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)IGF-lR-陽(yáng)性CTC，而41名患者中有8名(20%)在給予第一劑量之前具有一個(gè)或多個(gè)IGF-1R-陽(yáng)性CTC。參加研究的一名HRPC患者在研究登記時(shí)具有大的CTC數(shù)目(71CTC和15IGF-lR-陽(yáng)性CTC)，所述數(shù)目響應(yīng)于治療而減小(在治療第21天為21CTC和2IGF-1RCTC)。將CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC水平相對(duì)于時(shí)間繪圖并且觀察響應(yīng)治療的幾種模式。在圖6中描繪了四個(gè)實(shí)例。A圖表示得自在參加研究時(shí)具有極低CTC數(shù)目的患者的數(shù)據(jù)在用紫杉醇/卡鉑和0.05mg/kg的抗-IGF-1R抗體治療6個(gè)周期和隨后用3mg/kg的抗-IGF-lR抗體治療2個(gè)另外的周期之后，該患者不再對(duì)治療有反應(yīng)。這種臨床反應(yīng)的缺少涉及CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC數(shù)目的顯著增加。通過(guò)CT掃描證實(shí)了這名患者的疾病進(jìn)展。在B圖中，數(shù)據(jù)得自在研究過(guò)程中CTC和IGF-1R-陽(yáng)性CTC具有類似的增長(zhǎng)模式的患者。在C和D圖中，顯示兩名患者在開(kāi)始治療之前的CTC。所述患者分別接受1.5和6mg/kg的抗-IGF-1R抗體。在患者接受抗-IGF-lR治療時(shí)，IGF-1R-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目似乎是降低的(C圖)或保持低的(D圖)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了CTC和CTC-IGF-1R測(cè)定法在監(jiān)控對(duì)抗-IGF-lR抗體治療的作用和抵抗性形成中的可能的作用。盡管已經(jīng)在本文中描述了本發(fā)明的目前優(yōu)選的實(shí)施方案，但是對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的路上人員顯而易見(jiàn)的是，可對(duì)所述的實(shí)施方案進(jìn)行改變和修飾而不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和范圍。因此，意在本發(fā)明只受隨后的權(quán)利要求和法律的適用條款所要求的程度的限制。權(quán)利要求1.用于預(yù)測(cè)患者中IGF-1R拮抗劑治療在患者中的效力的方法，包括以下步驟a)從患者獲得生物標(biāo)本；b)制備樣本，其中將所述生物標(biāo)本與配體混合，所述配體特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)，以便基本上排除其它樣本組分；c)使所述樣品與特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的至少一種試劑接觸；d)使樣品與對(duì)于細(xì)胞上的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1R)有結(jié)合親合力的試劑接觸；和e)分析樣品，以便確定表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在，樣品中表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在是IGF-1R拮抗劑治療在所述患者中的效力的預(yù)報(bào)。2.權(quán)利要求1的方法，另外包括測(cè)定表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目的步驟。3.權(quán)利要求1的方法，其中將可以特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的配體偶聯(lián)于第一可檢測(cè)標(biāo)記，將特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的試劑偶聯(lián)于第二可檢測(cè)標(biāo)記，并且對(duì)于IGF-1R有結(jié)合親合力的試劑偶聯(lián)于第三可檢測(cè)標(biāo)記，第一、第二和第三可檢測(cè)標(biāo)記是不同的，并且其中至少一種試劑特異性地結(jié)合細(xì)胞角蛋白。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述配體特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的上皮細(xì)胞粘著分子。5.權(quán)利要求1的方法，另外包括向樣品加入細(xì)胞特異性染料的步驟，以便從分析中排除殘余的無(wú)核細(xì)胞和細(xì)胞碎片。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)選自以下的至少一種方法來(lái)分析標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、免疫熒光顯微術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)、基于亮視野的圖像分析、毛細(xì)管容量分析、光譜圖像分析、手動(dòng)細(xì)胞分析、CELLSPOTTER分析和自動(dòng)細(xì)胞分析。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是免疫磁性樣本，其包括與偶聯(lián)于配體的磁性粒子相混合的生物標(biāo)本，并且所述方法另外包括使所述免疫磁性拜本經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)的步驟，使得免疫磁性樣本變?yōu)楦患[瘤細(xì)胞的懸浮液。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述磁性粒子是膠態(tài)的。9.用于監(jiān)控患者中IGF-1R拮抗劑治療在患者中的效力的方法，包括以下步驟a)從患者獲得笫一生物標(biāo)本；b)制備第一樣本，其中將第一生物標(biāo)本與配體混合，所述配體特異性地與肺瘤細(xì)胞反應(yīng)，以便基本上排除其它樣本組分；c)使第一樣本與特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的至少一種試劑接觸；d)使第一樣本與對(duì)于細(xì)胞上的胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGF-1R)有結(jié)合親合力的試劑接觸；e)分析第一樣本，以測(cè)定表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞的存在和數(shù)量；f)對(duì)所述患者給予IGF-1R拮抗劑治療；g)在給予IGF-1R拮抗劑治療之后，從患者獲得第二生物標(biāo)本；h)從笫二生物標(biāo)本制備第二樣本，其中將第二生物標(biāo)本與配體混合，所述配體特異性地與胂瘤細(xì)胞反應(yīng)，并且對(duì)第二樣本進(jìn)行步驟c)-e);和U將第一樣本中的表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞數(shù)目與第二樣本中的表達(dá)IGF-1R的腫瘤細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行比較，第二樣本中的數(shù)目較小表示IGF-1R拮抗劑治療對(duì)所迷患者的有效性。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述配體特異性地結(jié)合于腫瘤細(xì)胞上的上皮細(xì)胞粘著分子。'11.權(quán)利要求9的方法，其中將可以特異性地與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的配體偶聯(lián)于第一可檢測(cè)的標(biāo)記，將特異性地結(jié)合上皮細(xì)胞的試劑偶聯(lián)于第二可檢測(cè)標(biāo)記，并且對(duì)于IGF-1R有結(jié)合親合力的試劑偶聯(lián)于第三可檢測(cè)標(biāo)記，第一、第二和第三可檢測(cè)標(biāo)記是不同的。12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)選自以下的至少一種方法來(lái)分析標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞多參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、免疫熒光顯微術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)數(shù)、基于亮視野的圖像分析、毛細(xì)管容量分析、光譜圖像分析、手動(dòng)細(xì)胞分析、CELLSPOTTER分析和自動(dòng)細(xì)胞分析。13.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中所迷樣品是免疫磁性樣本，其包括與偶聯(lián)于配體的磁性粒子相混合的生物標(biāo)本，并且所述方法另外包括使所述免疫磁性樣本經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)的步驟，使得免疫磁性樣本變?yōu)楦患[瘤細(xì)胞的懸浮液。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述磁性粒子是膠態(tài)的。15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述IGF-1R拮抗劑治療包括抗-IGF-1R抗體。16.用于篩查患者樣本是否存在表達(dá)IGF-1R的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢驗(yàn)試劑盒，包括a)包括磁芯材料的有涂層的磁性納米粒子、蛋白質(zhì)基礎(chǔ)涂層材料和特異性地結(jié)合于腫瘤細(xì)胞的特征決定簇的抗體，所述抗體直接或間接地連接于所述基礎(chǔ)涂層材料；b)用于從分析中排除不同于腫瘤細(xì)胞的樣本組分的細(xì)胞特異性染料；和c)對(duì)于IGF-1R具有結(jié)合親合力的至少一種可檢測(cè)的標(biāo)記試劑。17.權(quán)利要求16的檢測(cè)試劑盒，另外包括用于分析表達(dá)IGF-1R的循環(huán)胂瘤細(xì)胞的裝置。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)、計(jì)數(shù)和分析表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-1R)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。這些方法可用于癌癥篩選和分級(jí)、開(kāi)發(fā)治療方案和用于監(jiān)控治療反應(yīng)、癌癥復(fù)發(fā)等。還提供了促進(jìn)這種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和分析的檢驗(yàn)試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/50GK101600966SQ200780027121公開(kāi)日2009年12月9日申請(qǐng)日期2007年5月29日優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日發(fā)明者A·瓜爾貝托,C·L·梅爾文,D·A·錢尼斯,L·M·羅伯茨,L·W·M·M·特斯塔潘,M·C·康奈利,M·I·雷伯萊特申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司;維利迪克斯有限責(zé)任公司