專利名稱：：抗纖維蛋白溶酶切割酶的底物和抑制劑及其應(yīng)用方法抗纖維蛋白溶酶切割酶的底物和抑制劑及其應(yīng)用方法背景本發(fā)明涉及但不限于(X2-抗纖維蛋白溶酶切割酶的底物和抑制劑，并且涉及用于鑒定這種抑制劑的篩選方法，且涉及用于治療涉及纖維蛋白和012-抗纖維蛋白溶酶的狀況包括斑和凝塊形成以及動脈粥樣硬化的方法。012-抗纖維蛋白溶酶(a2AP)是一種血漿蛋白，其快速和特異性抑制酶-纖維蛋白溶酶，所述纖維蛋白溶酶消化血凝塊，無論凝塊是早期作為血管內(nèi)血小板-纖維蛋白沉積出現(xiàn)還是作為部分或者完全閉塞血栓出現(xiàn)。類似的，纖維蛋白溶酶和a2AP活性對于在炎癥、傷口愈合和幾乎所有形式的癌癥及其轉(zhuǎn)移中所發(fā)生的纖維蛋白發(fā)育和存活是重要的。人(X2-抗纖維蛋白溶酶(a2AP)也被稱作ct2-纖維蛋白溶酶抑制劑，是纖維蛋白溶酶的主要抑制劑。纖維蛋白溶酶在纖維蛋白的蛋白酶解和組織重建中發(fā)揮關(guān)鍵作用。a2AP抑制纖維蛋白溶酶與血凝塊以及纖維蛋白溶解穩(wěn)態(tài)的生理學(xué)關(guān)聯(lián)得到下列觀察結(jié)果的支持(1)循環(huán)a2AP使游離纖維蛋白溶酶失活的速度比纖維蛋白溶酶消化纖維蛋白(原)的速度快得多，這樣排除了全身性溶解狀態(tài)以及后續(xù)出血的可能性；(2)a2AP通過激活的凝血因子XIII(FXIIIa)與正在形成的纖維蛋白交聯(lián)，并且以與所摻入的量成正比地抑制纖維蛋白溶酶介導(dǎo)的溶解；和(3)具有純合oi2AP缺陷的患者顯示出嚴(yán)重的出血傾向，而雜合子僅在大外傷或外科手術(shù)后傾向于出血。最初在肝中合成人(X2AP，且在血漿中的循環(huán)過程中，分泌的前體形式Met-ot2-抗纖維蛋白溶酶(Met-a2AP),—種具有甲硫氨酸作為N-末端的464殘基蛋白，經(jīng)歷了Pro12和Asnl3之間(P廣P!，易分裂鍵)的蛋白酶剪切，以產(chǎn)生Asn-a2-抗纖維蛋白溶酶(Asn-a2AP),—種具有天冬酰胺作為N-末端的452殘基版本。Met-ot2AP占循環(huán)a2AP的大約30%,而Asn-a2AP占大約70%。在血漿中發(fā)現(xiàn)Met型a2AP并對其基因進行測序時，一開始似乎在編碼笫六氨基酸的核苷酸之一中存在差異。兩個研究組發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致Arg作為第六氨基酸的胞嘧啶(C),且一個研究組發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該位置為6Trp的胸腺嘧啶(T)。這暗示，這種區(qū)別是由于一個研究組使用肝癌細胞作為DNA來源，而另外兩個研究組使用正常細胞。目前已經(jīng)確定Arg6型和Trp6型Met-(X2AP都存在于正常的人血漿樣品中。對有出血傾向的家族中突變a2AP的研究確認(rèn)該突變連同(X2AP基因中包括該C/T單核苷酸多態(tài)性(SNP)的三個多態(tài)是造成無效a2AP的原因；該研究檢查了30個正常血液供體，并報道C/TSNP的等位基因頻率為0.81/0.19。目前還沒有進行更大正常群體的研究以檢查純合子和雜合子的頻率，或者是否基因型可能影響Met-a2AP和Asn-a2AP在血漿中的比率。顯然Arg6TrpSNP被假定為沉默多態(tài)，但是對于兩種多態(tài)形式的Met-a2AP產(chǎn)生衍生形式Asn-a2AP、將其摻入到纖維蛋白中以及對纖維蛋白溶解的影響的生化檢驗在本發(fā)明工作之前還從未評定。發(fā)明概述本發(fā)明涉及抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑，用于涉及纖維蛋白和ar抗纖維蛋白溶酶的各種治療，且涉及APCE的底物，其可以被用于例如鑒定這種抑制劑的篩選方法。本發(fā)明進一步涉及但不限于通過改變血漿012-抗纖維蛋白溶酶類型的比率和抑制APCE來治療或抑制動月永粥辨J更4t和血栓病癥的方法。附圖簡述圖1.作為總a2AP的百分比且按照基因型的Met-a2AP。從RR(n=15)、RW(n=15)和WW(n=5)基因型的人的每種血漿純化a2AP，并通過Edman降解測定氨基末端序列。從第一循環(huán)中回收的皮摩爾Met和Asn計算Met-a2AP百分比。圖2.正常群體中的血漿APCE水平并按照基因型分開。通過ELISA確定血漿樣品中的APCE水平。圖A.正常群體(n=109)中的APCE濃度的柱狀圖。圖B。按照Met-a2AP基因型的APCE水平。圖3.多態(tài)形式Met-(X2AP的APCE切割。等量的(40pg)純化的Met-a2AP(Arg6)和Met-ot2AP(Trp6)被APCE消化。在選擇的時間停止反應(yīng)后，通過電噴射質(zhì)語分析法評估樣品從每種Met-a2AP形式產(chǎn)生的氨基末端12氨基酸肽的量。圖4.Met-ot2AP基因型對血漿中Asn-a2AP產(chǎn)生隨時間過去的作用。來自RR、RW或WW基因型的人的血漿樣品在29。C溫育；在選擇的時間，從每種樣品純化(X2AP,并進行氨基末端序列分析。從在第一循環(huán)中回收的皮摩爾Met和Asn計算Asn-a2AP/Met-a2AP的比率。圖5.按照Met-a2AP基因型的血漿凝塊溶解時間(PCLT)。對來自RR、RW和WW人的血漿樣品測定PCLT。圖A.通過基因型區(qū)分PCLT值，并對總?cè)后w、僅男性和僅女性作圖為平均值士S.E.M.。圖B.與每種基因型中總?cè)后w(n=200)的百分比相比，不溶解的血漿(n=14)的百分比。圖6.除去APCE對Met-a2AP隨時間過去轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP的作用。從RRMet-oi2AP基因型的人提取血漿，并分成3等分試樣。一等分試樣與結(jié)合到層析珠的APCEF19mAb(F19)混合，并在4。C下溫育以除去APCE。第二等分試樣在4匸下與結(jié)合到珠上的非特異性兔a-山羊Ab(RAG)溫育。第三等分試樣(RR)沒有接受處理。在除去珠后，將每種樣品在29°C下溫育，并在選擇的時間測定Asn-a2AP/Met-a2AP比率。另外，將F19結(jié)合的珠和RAG結(jié)合的珠與SDS煮沸以除去抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)。將樣品在10%Bis-TrisSDS-PAGE凝膠上進行電泳，并印跡到硝酸纖維素上。通過蛋白印跡使用針對其氨基末端區(qū)域的山羊Ab鑒定APCE(97kDa)，并使用化學(xué)發(fā)光底物使其顯現(xiàn)。圖7顯示Val-boroPro對APCE將Met-a2AP轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP的抑制劑作用。圖8顯示FRET肽的非限制性示例序列(SEQIDN0:5)。圖9顯示在P2-P廣Pi，基團的Pi，位可以做出的各種取代，以及在P2殘基的上游(N-末端方向)殘基以及對P!，殘基的下游(C-末端方向)殘基可以做出的各種取代(SEQIDNO:6)。圖10.抗纖維蛋白溶酶肽(SEQIDNO:7)的LC/MS分析，用于P7位(P!Pro上游的第6個氨基酸)的底物偏愛測定。具有正電荷His(H)、Lys(K)和Arg(R)的那些增強對Pro12-N13鍵的切割速度。圖11.Arg相對于Pro-Asn易分裂鍵的位置的重要性?；诳估w維蛋白溶酶氨基末端序列(4-17)的四種類似的肽被APCE消化，且接著進行LC/MS分析。每種反應(yīng)溶液均含有一種實驗肽和對照肽，其中對于任何給定的肽，Arg在Ps、P7、P6、P5或P4(未顯示)位，且甘氨酸在另外三個可變化的位置。P4的取代給出了與Ps幾乎相同的結(jié)果。8[OOll]圖12.抗纖維蛋白溶酶肽的LC/MS分析，用于位置P4、P3、P2、Pi中底物偏愛測定。代表人抗纖維蛋白溶酶序列第6~17位的肽文庫被APCE(也被稱作可溶性FAP)處理。紅色的苯丙氨酸被加入以增強與反相HPLC柱的結(jié)合。蛋白質(zhì)共有的氨基酸，較少的半胱氨酸在P廣P4的每個位置上一次被取代一個(SEQIDNO:8)。通過LC/MS分析測定Pro-Asn鍵的相對切割速度。圖13顯示氨基酸序列的可替代實施方案(SEQIDNO:9),其包含部分本發(fā)明的FRET肽或抑制劑。該序列在C-末端方向上可以被延長，例如圖9所顯示的序列，其從N13沿著N-末端方向延長，或者從N13沿著C-末端方向延長。圖14顯示各種抑制性擬肽(peptidomimetics)(SEQIDNO:11-13)的APCE抑制作用，其中抑制劑濃度為20|liM，其中脯氨酸已經(jīng)凈皮六氫吡啶羧酸取代。發(fā)明的詳細描述人Met-a2AP是APCE的生理學(xué)上重要的底物，因為Prol2-Asn13之間的蛋白酶剪切產(chǎn)生了更具活性的衍生物Asn-a2AP,其通過FXIIIa與纖維蛋白的交聯(lián)顯著地比Met-a2AP快，且因此增強了纖維蛋白對纖維蛋白溶酶消化的抗性。因為人APCE通過提高更快交聯(lián)形式(即Asn-a2AP)的可用性而增大了纖維蛋白溶解的抑制，所以已如本文所述發(fā)現(xiàn)的APCE有效和選擇性的抑制劑使得能夠?qū)sn-a2AP生產(chǎn)滴定至更低的體內(nèi)水平，且從而同時增強了內(nèi)源和外源纖維蛋白溶解(纖維蛋白除去)。根據(jù)關(guān)于.(X2AP缺陷雜合的人具有最低出血風(fēng)險的觀察，使用本文所描述的治療是不太可能有出血并發(fā)癥的。因此，存在用于降低健康人中a2AP功能的安全的階段。特別的，在可能形成纖維蛋白的臨床情況中，APCE抑制劑將導(dǎo)致降低的當(dāng)發(fā)展血栓或炎癥進展的時候可以與纖維蛋白交聯(lián)的Asn-a2AP的量。這樣，所產(chǎn)生的纖維蛋白溶酶的內(nèi)源水平，或者通過施用少量的纖維蛋白溶酶原激活劑所生成的纖維蛋白溶酶可以足以實現(xiàn)纖維蛋白的除去，從而血管開放和器官功能被維持，且出血風(fēng)險最小化。正如上面所述的，APCE將Meta2AP切割成衍生物Asna2AP,其被更有效地?fù)饺氲嚼w維蛋白中，并隨后使其顯著地抵抗纖維蛋白溶酶消化。因此，APCE代表了藥理調(diào)節(jié)和抑制纖維蛋白溶解系統(tǒng)的新靶，因為較少生成，且所以摻入較少的Asn-a2AP導(dǎo)致在動脈粥樣硬化生成、血栓形成和炎癥狀態(tài)過程中纖維蛋白溶酶較快地除去纖維蛋白。本發(fā)明涉及抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑，其用于涉及纖維蛋白和012-抗纖維蛋白溶酶的各種治療中，并且涉及APCE的底物，其可以被用于例如鑒定這種抑制劑的篩選方法中。本發(fā)明進一步涉及但不限于治療或抑制動脈粥樣硬化和血栓病癥的方法，其通過改變血漿012-抗纖維蛋白溶酶類型的比率實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，APCE的抑制在本文中被定義為APCE活性的至少50%抑制，例如在抑制劑濃度為20juM時。Asn-a2AP以Met-a2AP的大約13倍的速度與纖維蛋白交聯(lián)。較快的交聯(lián)速度導(dǎo)致更大數(shù)目的抗纖維蛋白溶酶分子結(jié)合到新形成的纖維蛋白上以及所得到的增強的對纖維蛋白溶解的抗性。因此，抑制血漿APCE可降低交聯(lián)的抗纖維蛋白溶酶分子的數(shù)目，進而導(dǎo)致凝塊更容易在纖維蛋白溶解過程中被除去。因此，可以使用APCE特異性抑制劑調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解。正如上面所提到的，人Met-a2AP在成熟序列的位置6處存在兩種多態(tài)性形式，其中精氨酸占優(yōu)勢，且色氨酸占較少的百分比。本文中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制APCE可將血漿中a2AP的比率從大約30%Met-a2AP:70%Asn-a2AP改變?yōu)榇蠹s60%70%Met-a2AP:40%30%Asn-a2AP。a2-抗纖維蛋白溶酶比率的調(diào)節(jié)在本發(fā)明工作中，我們在大得多的正常群體中測定了多態(tài)的流行，且接著評定是否其涉及a2AP的抑制功能。本文中提供了關(guān)于下列的結(jié)果(1)Met-a2AP中Arg6TrpSNP的基因型頻率；(2)每種形式如何影響對APCE切割的易感性；(3)對于兩種多態(tài)的每一種，在血漿中Met-a2AP的百分比；(4)血漿凝塊溶解時間與基因型的關(guān)系；以及(5)除去循環(huán)APCE防止Met-a2AP轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP的證據(jù)。材料和方法材料從SylvanGoldmanBloodInstitute(OklahomaCity,OK)購買用于純化蛋白質(zhì)的新鮮冷凍人血漿。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)(Manassas,VA)購買10分泌F19抗體的雜交瘤細胞，并培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中；使用MEP-Hypercel層析(Pall，EastHills,NY)從培養(yǎng)基純化F19抗體。board(IRB)對這些研究的許可(IRB#10142和Jl89)。分離a2AP通過修改的公開純化程序使用附著到瓊脂糖4B的纖維蛋白溶酶原三環(huán)(kringles)l-3作為親和基質(zhì)分離Met-a2AP和Asn-a2AP的混合物。通過如之前所述的免疫親和層析分離Met-a2AP和Asn-a2AP。在通過EdmanP爭解(AppliedBiosystemsProcise492型，F(xiàn)osterCity,CA)自動蛋白質(zhì)測序的過程中，通過比較在從第一循環(huán)中回收的皮摩爾Met對Asn測定血漿樣品中Met-a2AP與Asn-a2AP的比率。分離APCE根據(jù)之前所描迷的(US系列號NO.10/774,242)從人血漿純化APCE。簡言之，使用硫酸銨沉淀、疏水相互作用和免疫親和層析的組合進行純化。在保存在-80。C之前，將甘油加入到純APCE中以提供20%的終濃度。測定(X2AP基因型招募兩百位隨機響應(yīng)的正常志愿者，自己報告是健康的并且沒有急性疾病，獻血用于測定正常群體中基因型頻率和血漿凝塊溶解時間(PCLT;參見下一部分)。使用AquaPureGenomicDNABloodKit(Bio-Rad,Hercules,CA)從每個供體的全血分離DNA。使用寡聚核苷酸引物(5'-GACCTCCTATCCTCATCCCTTT(SEQIDNO:l)和5'-CTGGTTCGGCCCGCTAGTTAG(SEQIDNO:2》、dNTP(TakaraMimsBio,Madison,WI)和PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增包含Arg6TrpSNP的DNA部分。擴增之后，使用MinElutePCR純化試劑盒(PurificationKit)(QiagenOperon,Alameda，CA)純化PCR產(chǎn)物并使用ABI3730自動DNA測序儀進行測序。測量血漿凝塊溶解時間為了測量血漿凝塊溶解時間(PCLT)，將1單位/ml凝血酶、16mMCaCl2和45IU/ml尿激酶(uPA)(Abbott,Chicago,IL)的混合物加入到每個志愿者的血漿中以基本上立即催化纖維蛋白凝塊的形成，并啟動纖維蛋白溶解；通過濁度測定微量滴定板法測定血漿凝塊溶解速度。測定切割速度通過APCE消化含有等量(40ug)的純Met-ot2AP(Arg6)和純Met-a2AP(Trp6)的反應(yīng)混合物。在選擇的時間，通過使用三氟乙酸將pH從7.5降低到4.0停止消化。通過Microcon(Millipore，Bedford,MA)離心超濾利用30kDa截斷膜從混合物除去蛋白質(zhì)。從超濾的消化混合物分離肽，其通過結(jié)合到裝入玻璃純化毛細管(Proxeon,Odense,丹麥)的POROS-50反相介質(zhì)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)實現(xiàn)。接著，直接將肽從POROS-50洗脫入涂覆金屬的玻璃納米噴射(nanospray)毛細管中，其具有2.0^1溶于1:1甲醇/水中的0.5%乙酸。將納米噴射毛細管安裝在QSTARESI-Quad-TOF質(zhì)語儀的納米噴射電離源上，所述質(zhì)譜儀在AnalystQS軟件1.0版(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)離子噴射電壓為1400伏下運行。收集3001500Da質(zhì)量范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)。通過對每種肽的所觀察到的電荷形式的四種豐度最高的同位素峰的面積進行加和，測定所產(chǎn)生的兩種tx2AP氨基末端12氨基酸肽的相對量，MEPLGRQLTSGP(SEQIDNO:3),Mr=1284.65對應(yīng)Met-a2AP(Arg6),以及MEPLGWQLTSGP(SEQIDNO:4),Mr=1314.63對應(yīng)Met-a2AP(Trp6)。通過對所加入的不含脯氨酸的惰性內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)肽進行類似定量，對每個時間點的數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化。測定APCE抗原水平開發(fā)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以測定人血漿中的抗原水平。制備針對APCE氨基末端15個氨基酸序列的山羊抗體，其使用在我們實驗室構(gòu)建以含有通過它們的羧基末端與7個賴氨酸的核心肽連接的8個拷貝的氨基末端肽的多抗原肽(MAP)作為免疫原。這種山羊MAP(氨基末端15個殘基的APCE肽)抗體結(jié)合到白色高結(jié)合聚苯乙烯測定板(Coming,Corning,NY),并用做捕獲抗體。在與血漿的稀釋物溫育后，施用從商業(yè)上可獲得的F19雜交瘤(ATCC,Manassas,VA)純化的單克隆抗體，接著施用過氧化物酶綴合的抗小鼠抗體(Sigma,St.Louis,MO)。加入化學(xué)發(fā)光底物SuperSignalELISAPico(Pierce,Rockford,IL),并使用BIO-TEKFL600讀板儀(Winooski,VT)監(jiān)控發(fā)光。使用純化的人APCE作為標(biāo)準(zhǔn)對抗原水平進行定量。從血漿除去APCE將F19mAb連接到POROSEP20聚(苯乙烯二乙烯基苯)灌注層析珠(AppliedBiosystems,FosterCity,CA),并將非特異性抗體兔抗山羊連接到相同類型的介質(zhì)。將來自單一RR基因型供體的血漿分成3等分試樣，使用PBS1:1稀釋，并分別與兩種珠連接的抗體，非特異性Ab或F19mAb的每一種在4。C下溫育過夜。第3等分試樣未接受處理。通過過濾從血漿取出珠且然后在29。C溫育血漿。在0時間、24小時和48小時取出這些等分試樣。從每個等分試樣純化a2AP，并根據(jù)之前的描述測定Asn-a2AP/Met-a2AP比率。從血漿中取出后，將F19mAb珠用25mMNaPO4/0.5MNaCl進行洗滌，接著使用SDS加樣緩沖液進行煮沸。接著通過在10%Bis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上的電泳分離SDS緩沖液提取物，并印跡到硝酸纖維素上。通過蛋白印跡鑒定APCE,其使用在本方法部分前述的山羊氨基末端MAP抗體，并使用SuperSignalWestFemto最大靈敏性化學(xué)發(fā)光底物(MaximumSensitivityChemiluminescentSubstrate)(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL)進行顯現(xiàn)。結(jié)果a2AP基因型測定按照間隔大約2年的每批大約100人的兩批招募的一組201個正常志愿者提供用于測定a2APC/TSNP頻率的血液樣品o總?cè)后w由61個男性和139個女性構(gòu)成，年齡為21-69歲，其種族劃分與正如在美國人口普查網(wǎng)站(factfinderxensus.gov)上所列舉的2000年Oklahoma人口的人口統(tǒng)計學(xué)緊密匹配。對這些受試者中的200位進行測定基因型。只有一份DNA樣品沒有通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增，可能是由于阻止引物之一結(jié)合的突變，盡管這一點還未被進一步探究。兩個正常群體的基因型頻率基本上相同，任何基因型都具有低于1%的差異。在將兩批組合后，整個群體的頻率為RR62.5%;RW34.0%;WW3.5%。R等位基因具有79.5%的頻率，且W等位基因具有20.5%的頻率。在男性和女性之間基因型頻率沒有差異。因為該群體是72%的高加索人，其他28%被分成6個種族類別，因此不可能測定是否基因型在種族組之間變化。血漿中的Met-a2AP和Asn-a2AP水平從15個RR基因型的人、15個RW基因型的人和5個WW基因型的人的血漿純化a2AP。通過Edman降解對a2AP進行測序，并測定第一循環(huán)的Met和Asn的皮摩爾回收，以計算Met-a2AP和13Asn-oi2AP的百分比。圖1顯示按照基因型分開的顯著不同(p<0.001)的結(jié)果，其中WW具有最高的Met-a2AP百分比(56.4%);RR最少(23.6%),且RW落入之間(40.6%)。為了了解人血漿中不同百分比Met-a2AP的機制，我們檢查是否將Met-d2AP轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP的酶即APCE的水平變化可能解釋這些基因型中的差異。為了研究這種可能性，我們開發(fā)了ELISA方法用于定量血漿中的APCE抗原水平，并接著測定來自我們正常群體的109個受試者的血漿中APCE的濃度。正如在圖2a中可以看到的，正常人血漿中APCE水平分布在38159ng/ml的范圍內(nèi)，這與年齡或性別無關(guān)，盡管暗示APCE水平與基因型可能有聯(lián)系(RR:70.4±26;RW:66.6士24.5;WW:64.7±10.1),但這種差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的(圖2b)。因此，APCE水平似乎并不是這些基因型中Met-a2AP水平變化的原因。這三種所探究的基因型中不同Met-a2AP百分比的另一種解釋是對于APCE,Met-a2AP(Arg6)是比Met-ot2AP(Trp6)好的底物。為了檢驗這種假說，從RR和WW血漿純化a2AP,并測定每種多態(tài)性形式Met-a2AP(Arg6)和Met-a2AP(Trp6)的切割速度，其使用質(zhì)i普分析法用于監(jiān)控隨著時間過去12個殘基氨基末端肽的產(chǎn)生。正如在圖3中可以看到的，反應(yīng)速度的比較基于早期時間點的線性回歸分析，并顯示APCE切割Met-ot2AP(Arg6)是切割Met-a2AP(Trp6)的約8倍快。為了檢查在位置6上存在R或W的基礎(chǔ)上，全血漿中Met-a2AP的切割速度是否提供了類似的結(jié)果，從基因型被測定為RR、RW和WW的個體獲得新鮮血漿樣品，在29。C溫育，各自在0、24、48小時分析Asn-a2AP/Met-a2AP比率。從每個樣品純化a2AP，并通過在Edman降解的第一循環(huán)中氨基末端殘基的皮摩爾回收測定兩種多態(tài)性形式的比率。如在圖4中可以看到的，在來自RR基因型的正常志愿者的血漿中Asn-a2AP以比RW或WW基因型患者中高得多的速度提高。顯然，這些結(jié)果與顯示APCE切割Met-a2AP(Arg6)是切割Met-a2AP(Trp6)的約8倍快的純a2AP和APCE的反應(yīng)混合物的結(jié)果一致。血漿凝塊溶解對來自包括正常群體的200個女性和男性的血液樣品測定血漿凝塊溶解時間(PCLT)。我們沒有嘗試控制已知由于激活劑釋放、激活劑-抑制劑相互作用、纖維蛋白原水平或者由于脂類對酶底物機制的影響而發(fā)生的凝塊溶解的變化；因此，不將性別、年齡、腎上腺素能狀況、吸煙、肥胖、酒精消耗、血清脂類和纖維蛋白原測量、藥物治療、晝夜活動等作為志愿者參與本研究的限制。而是，"所有前來者(all-comer)，，都進入，只要他們報告自身健康狀態(tài)良好，相信該研究參與者的溶解時間將或多或少地反映在任何時間點每種基因型中所有生理/藥理影響的"平均"，并且如果在我們的條件下，多態(tài)的確可檢測地影響血漿凝塊溶解，則將強調(diào)其潛在的重要性。強調(diào)的要點是，男性的平均PCLT比女性的值顯著地長(p-0.0002)。正如在圖5中所顯示的，RR、RW和WW基因型組的平均PCLT顯示了重大的線性下降，而在三種基因型中平均PCLT之間的差異則不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。如圖5A中所示，在通過性別分開基因型后，基因型中的平均PCTL差異顯示對于WW基因型在男性和女性中都有顯然溶解時間更短的傾向。因為PCLT的分布是不對稱的，因此使用非參數(shù)統(tǒng)計學(xué)方法來分析數(shù)據(jù)。RR和RW的中值是類似的，并且分布有重疊，這暗示R等位基因是顯性的。當(dāng)將RR和RW組進行合并并與WW進行比較時，在解釋由于性別變化之后，該差異接近顯著(p-0.061)。正如在圖5B中所示的，RR基因型中有12位(10%)人和RW基因型中有2位(3%)具有在整個1小時的測定時間段過程中完全保持完整的血漿凝塊；WW基因組中沒有溶解時間大于2100秒的人。從血漿除去APCE在最后確定APCE是負(fù)責(zé)Met-a2AP轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP的酶的努力中，我們通過將血漿與共價附著到POROS層析珠的FAP特異性單克隆抗體F19溫育從血漿除去APCE。取出珠后，在29。C下將血漿的溫育持續(xù)選擇的時間，以使得Met-a2AP轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP。圖6中的圖表顯示沒有與POROS結(jié)合的抗體溫育的對照血漿中Asn-a2AP/Met-a2AP的比率在溫育48小時后從2.62提高到6.12。在第二對照中，即與結(jié)合到POROS層析珠的非特異性抗體溫育的血漿，在48小時后，Asn-a2AP/Met-a2AP的比率從2.54顯著提高到5.2。然而，與F19抗體溫育的血漿顯示相同的溫育時間段后，該Asn-a2AP/Met-a2AP比率中沒有提高，即2.4到2.17,從而說明由F19抗體除去了APCE。這些結(jié)果明顯證明從血漿中除去APCE取消Met-a2AP轉(zhuǎn)變成較短的、與纖維蛋白更快交聯(lián)的形式Asn-a2AP。作為對于該結(jié)論的進一步支持，我們還通過15蛋白印跡分析證明的確是APCE被珠連接的F19mAb結(jié)合并除去。圖6中的蛋白印跡分析顯示在從F19連接的珠洗脫的樣品中的APCE單體97kDa帶；在兔抗山羊(RAG)Ab連接的珠上不存在這種帶。其他可以見到的帶是第二Ab與樣品中免疫球蛋白非特異性結(jié)合的結(jié)果，其通過在SDS中煮沸的提取過程中從珠濾去。在本研究中，在不同時間范圍內(nèi)我們分析的兩群正常志愿者基本上是相同的，所匯合的基因型頻率為RR,62.5%;RW,34.0%;和WW,3.5%。等位基因頻率值0.795/0.205與我們已知的唯一其他研究即Lind和Thorsen的一致，后者報道在30名正常血液供體中單核甘酸轉(zhuǎn)換值為0.81/0.19。因為這種多態(tài)性出現(xiàn)在被從較長的前體形式a2AP除去的12個殘基氨基末端肽中，并且已知正電荷的親水精氨酸(R)被取代為疏水氨基酸色氨酸(W),我們提出疑問是否這種差異可能影響APCE切r^>，Itl,/、》r:C、，"rf/-+、f.，一TT/\j>/,ATI/一J、A>-1TTTl入L▲TT^1~l"t'J月尺日3還乂艮K/、久后5買修八:^Jj^估7^力、曰35T5TE賞曰t。戮iij及;t兄^iAmi切割WW基因型的純Met-a2AP的速度是RR個體的血漿中純Met-a2AP的大約1/8。圖4明確顯示在允許新鮮提取的血漿在29。C下溫育時，含有兩種多態(tài)形式Met-a2AP每一種的血漿樣品中天然前體Met-ot2AP/衍生Asn-a2AP的比率自發(fā)隨時間過去變化。這種切割一定是由于自然存在的血漿APCE水平，因為如圖6所示，使用特異性單克隆抗體除去APCE完全中斷了在相同溫育時間過程中衍生Asn-a2A的產(chǎn)生。因為該切割是在循環(huán)血液中自發(fā)發(fā)生的，所以前體Met-a2AP/衍生Asn-a2AP的比率應(yīng)該在來自3種基因型的循環(huán)血漿內(nèi)變化，實際上我們通過對35個所分析的人進行前體/衍生a2AP形式的定量氨基末端分析證明了這一點。正如所預(yù)測的，RR基因型的人具有最少量的循環(huán)Met-a2AP(23.6%);RW為中間(40.6%);以及WW為最高(56.40/。)。我們的結(jié)果不能被APCE水平的變化所解釋，因為如圖2b所示的，在這三種基因型中抗原水平?jīng)]有顯著差異。RR、RW和WW基因型與對應(yīng)的Met-a2AP/Asn-a2AP的比率之間的關(guān)系提出了后者將影響個體的纖維蛋白溶解活性的可能性，從而在生命過程中，血管內(nèi)產(chǎn)生的纖維蛋白對內(nèi)源性纖維蛋白溶解的易損性以及后續(xù)其存活受到Met-a2AP基因型的不同影響。結(jié)果，WW基因型的人將具有不易于由于APCE的切割而轉(zhuǎn)變成Asn-a2AP且因此不太有效地被引入正在形成的纖維蛋白的Met-a2AP，從而使得任何所產(chǎn)生的纖維蛋白更容易被纖維蛋白溶酶消化。使用盡可能接近天然狀態(tài)的全血漿進行實驗以證明這一點。正如在前面部分所描述的，僅有最低限度的嘗試將從健康志愿者提取所有樣品的條件標(biāo)準(zhǔn)化,其基礎(chǔ)是如果確實WW基因型組具有縮短的纖維蛋白溶解時間，則優(yōu)勢是對于大多數(shù)時間情況是這樣的。大部分已知影響纖維蛋白溶解時間的擾動-急性或者慢性-在人的壽命中有作用，且盡管存在這些影響，但我們?nèi)哉J(rèn)為平均上纖維蛋白溶解狀態(tài)將根據(jù)Met-a2AP的基因型而區(qū)分開。值得注意的是在我們的所有分析中，RR基因型的人具有最長的平均PCLT,RW組為中間，且WW基因型中的最短，這暗示W(wǎng)W人長期具有比RW組活性更高的纖維蛋白溶解系統(tǒng)，且當(dāng)然具有比RR基因型更高的活性。RR基因型含有比從未溶解纖維蛋白的人所預(yù)期百分比高的百分比，并且如果這些是被指定的PCLT值，其超出我們的研究中任何人的最大測量值1/2,接著對于男性，平均溶解時間與RR和RW的聯(lián)系達到了pO.05水平的顯著性。我們的結(jié)果顯示，在人的壽命中，W等位基因可以作為"保護因素"(與公知的術(shù)語"危險因素"相反)，其通過提高發(fā)展中的血管內(nèi)血栓對被纖維蛋白溶酶除去的易感性，從而降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險實現(xiàn)。進一步，這些結(jié)果證明了提高Met-a2AP/Asn-a2AP比率到接近加速纖維蛋白溶解的比率的效用。正如在a2AP功能缺陷的雜合子中所例證的，通過將(X2AP-基本上是纖維蛋白溶酶的唯一體內(nèi)抑制劑-的功能降低到具有很小的大出血風(fēng)險的水平，且維持內(nèi)源性溶解活性的慢性水平，則血管內(nèi)纖維蛋白-血小板血栓在動脈粥樣硬化過程中的存活和參與能夠被降低。在其他的研究中，可以從被使用經(jīng)口Val-boroPro(talabostat)實驗處理的轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者中提取血漿樣品，我們已經(jīng)證明所述Val-boroPro是APCE的非特異性抑制劑。圖7顯示APCE抑制劑Val-boroPro提高了血漿中Met-a2AP的百分比，這顯示APCE轉(zhuǎn)變Met-a2AP為Asn-a2AP4交少。纖維蛋白是穩(wěn)定血小板的關(guān)鍵，因為在斑發(fā)展的最早期階段，它們在動脈壁的受傷位點附著并積聚。纖維蛋白繼續(xù)沉積，因為氧化的脂類和巨噬細胞滲入受傷位點，并且斑逐步生長侵占腔的直徑，其具有破裂以及急性閉塞的血栓形成的風(fēng)險。在所有這些階段過程中，如果纖維蛋白含有高或最大的ct2纖維蛋白溶酶，則與如果纖維蛋白含有較少量的(X2AP抑制劑相比，纖維蛋白對被內(nèi)源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)除去的易損性被降低。利用較高循環(huán)血液水平的前體(X2AP,(Met-a2AP),較少的總oi2AP與纖維蛋白交聯(lián)，這使得纖維蛋白更容易被纖維蛋白溶解酶纖維蛋白溶酶從斑位點消化和清除。然而，如果其衍生物Asn-a2AP占優(yōu)勢，則纖維蛋白對纖維蛋白溶解的除去更具抗性。通過抑制APCE,則Met-a2AP的血液濃度提高，并且所形成的任何纖維蛋白更容易被人自身的纖維蛋白溶解系統(tǒng)所除去。熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽底物在一個實施方案中，本發(fā)明預(yù)期熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽(FRET-肽)，其具有P-N(脯氨酸-天冬酰胺)易分裂鍵(PrPr)并且在P!脯氨酸上游的P2位置具有G(甘氨酸)。FRET-肽在P!P!，鍵的一側(cè)上包含猝滅基團例如DABCYL,以及在易分裂鍵另一側(cè)上包含熒光團基團例如EDANS。優(yōu)選，F(xiàn)RET肽在P,脯氨酸的上游具有最高達到13個氨基酸殘基，且在P!，天冬酰胺殘基的下游具有最高達到13個殘基(即，整個肽包含最高達到28個氨基酸)。攜帶猝滅基團的氨基酸(例如賴氨酸)可以是PrPr基團上游或下游最高達到13個氨基酸之一，且攜帶熒光團基團的氨基酸(例如谷氨酸)可以是P廣P!，基團上游或下游最高達到13個氨基酸之一。優(yōu)選，猝滅基團和熒光團基團在FRET肽的遠端，且優(yōu)選該肽的至少一個末端被精氨酸殘基(或者其他正電荷氨基酸)中止或者可替代的，一個末端可以具有正電荷氨基酸，且另一個末端可以具有負(fù)電荷氨基酸。術(shù)語"雜環(huán)"或"雜環(huán)的"是指環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選4、5、6、7元環(huán)結(jié)構(gòu)，且更優(yōu)選56元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)包含1~4個雜原子例如氮、碌u或氧。雜環(huán)基團包括但不限于噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異嗜嗤、p比咬、p比漆、嘧p定和峻口秦。雜環(huán)可以在一個或者多個位置上被諸如下列的取代基取代例如卣素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、酰胺基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、曱硅烷基、醚、烷基硫代、磺酰、酮、醛、酯、雜環(huán)、芳族或雜芳族部分、CF3、CN等。本文所使用的術(shù)語"碳環(huán)"或"碳環(huán)的"是指芳族或非芳族環(huán)，其中環(huán)上的每個原子均為碳，優(yōu)選指4、5、6或7碳環(huán)，且更優(yōu)選5和6碳環(huán)。18本發(fā)明的脯氨酸類似物和擬肽(peptidomimetic)化合物的衍生物可以以特定的幾何學(xué)或者立體異構(gòu)型存在。本發(fā)明預(yù)期所有這些化合物，其包括落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的順式-和反式-異構(gòu)體、R-和S-對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、(D)-異構(gòu)體、(L)-異構(gòu)體、其外消旋混合物和其他混合物。在取代基例如烷基中可以存在其他的非對稱碳原子。本發(fā)明中預(yù)期包括所有這些異構(gòu)體及其混合物。圖8顯示了FRET肽的例子(SEQIDNO:5),其具有Arg6形式的Met-a2-AP的PrPf鍵周圍的天然氨基酸序列。在這種情況中，顯示了用于模擬Met-a2-APN-末端肽底物特征的FRET肽的全面優(yōu)選最大序列。在切割鍵的每側(cè)包含最高達到13個殘基的基本原理是在PrPr鍵的每側(cè)包含相同數(shù)目的氨基酸殘基，因為這種對稱水平使得在酶和底物結(jié)合以切割Pi2-N13(即P!-P!，)鍵時的潛在立體問題最小化。在該實施方案中，在每個末端的任選精氨酸基團增強了在-P-N-鍵被切割時的肽衍生物的溶解度。Gu和P12(即PrPO是優(yōu)選的氨基酸，如果期望該肽成為可切割的底物，則其不能被其他天然存在的氨基酸所取代。在期望用作抑制劑的肽中,脯氨酸可以被其他的脯氨酸-衍生物或類似物或脯氨酸-樣氨基酸所取代。Pl2-N!3-是易分裂鍵。正如所提到的，P!2可以被取代以形成抑制劑。FRET肽的焚光和猝滅基團均被偶聯(lián)到氨基酸上，例如在該實施方案中接近末端的E和K。M!是前體a2AP天然序列的N-末端甲硫氨酸殘基。圖9顯示了可替代的FRET肽序列(SEQIDNO:6),其在包含圖8肽8-18氨基酸的肽的特定位置上具有潛在的可接受取代氨基酸的排列。在FRET肽的優(yōu)選實施方案中，猝滅基團和熒光團基團各自偶聯(lián)到在易分裂鍵每側(cè)且優(yōu)選在易分裂鍵1.0nm-5.0nm范圍內(nèi)的氨基酸殘基上。在另一個優(yōu)選的實施方案中，猝滅和熒光團基團均附著到P2甘氨酸殘基上游的殘基，或者(天冬酰胺或被適當(dāng)取代的氨基酸)殘基的下游的任何一處，其中所述猝滅基團在P2或Pl，殘基的一側(cè)上，而熒光團基團在P2或Pi，殘基的與猝滅基團相對的一側(cè)上。使用肽底物進行實驗以研究位于抗纖維蛋白溶酶切割位點和在其附近的結(jié)構(gòu)變化(氨基酸取代)如何影響APCE切割抗纖維蛋白溶酶。被抗纖維蛋白溶酶切割酶切割的P廣Pi，鍵(即Pro-Asn)周圍的Met-a2AP氨基酸序列被用于引導(dǎo)以產(chǎn)生各種長度的相同合成肽，以測定對于增強肽切割重要的殘基，假定切割速度與結(jié)合成比例。Pi位置的脯氨酸(或者碳環(huán)或雜環(huán)脯氨酸類似物或取代基)對于與APCE結(jié)合是必需殘基，在脯氨酸或脯氨酸取代基或類似殘基上游且鄰近其的P2位置的甘氨酸也如此。通過在脯氨酸上游各個殘基的一組取代的研究，我們發(fā)現(xiàn)在P7(即脯氨酸上游的第6個殘基)或者在位置P5或P6的正電荷氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)對于與APCE的結(jié)合進而切割速度最大化是特別有利的(圖IO和11)。此處引用P5、P6、P7所顯示的標(biāo)記是指沿著N-末端方向從易分裂鍵中Pro殘基開始編號逐漸增加的殘基。例如，Pro是P!,其中下標(biāo)數(shù)字沿著上游方向漸增。圖10顯示在具有SEQIDNO:7的肽中，上游精氨酸或任何正電荷氨基酸對于APCE切割PrPr鍵的切割速度最大化是關(guān)鍵的。圖11顯示，通過在P4、P5、P6和Ps取代Arg,我們已經(jīng)測定P5和P6至少與天然P7位置中的Arg同樣有效，其中P6是最好的。P4和Ps顯著地差，并且顯示沒有增強易分裂鍵的切割。除了在P5、P6或P存在正電荷對易分裂鍵的切割具有加速作用外，還存在間隔需求用以使正電荷作用最大化。在位置P7，Arg是最佳的氨基酸，其相對切割速度是除了Lys外其他氨基酸的大約510倍快，其中l(wèi)ys是arg速度的大約700/0(圖10)。當(dāng)精氨酸位于P6或Ps位時(即P!-Pr鍵上游的4或5殘基)，在位置P7(PJ甫氨酸上游的第6氨基酸)也觀察到了精氨酸增強作用(圖11)，但是當(dāng)arg在P廣Pr鍵的位置P8、P4、P3或P2時，切割速度減少(圖11和12)。例如，圖12顯示在肽(SEQIDNO:8)中P廣P4的每個氨基酸序列位置取代19個氨基酸中每一種的作用，以及對APCE切割肽的P廣P!，4建的反應(yīng)速度的作用。在位置P7、P6和P5,正電荷殘基lys和his能夠取代arg(關(guān)于P7，參見圖10),這說明對PrP!'切割速度的作用是基本上依賴正電荷的(盡管pro、phe、tyr、trp和一些其他氨基酸具有部分活性水平(圖10))。在可替代的實施方案中，本發(fā)明的FRET肽包含圖13所示的肽序列(SEQIDNO:9),其中位置XrX5和X8可以含有選自X廣X5和Xg的每一個下面所示出的氨基酸的氨基酸，前提是XrX3的至少一個選自R、H和K(即，是正電荷氨基酸)。進一步，可以不存在X!、X2和X3的至少一個。如上所述，包含SEQIDNO:9的FRET肽(或者任何肽或擬肽)優(yōu)選包含最高達到并包括28個氨基酸。包含SEQIDNO:9的FRET肽優(yōu)選在gly-pro鍵的相對側(cè)包含猝滅基團和熒光團。SEQIDNO:9可以進一步包含在N-末端方向上N-末端氨基酸上游的110聚體肽，且其可以包含20種天然氨基酸的任何一種，并且可以進一步包含在C-末端方向上C-末端氨基酸下游的110聚體肽，且其可以包含20種天然氨基酸的任何一種。如上所述，焚光共振能量轉(zhuǎn)移肽底物可以在p廣pr鍵的上游包含猝滅基團，且在PrP卩鍵的下游包含熒光團，或者熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽可以在PrPr鍵的下游包含猝滅基團，且在p廣pr鍵的上游包含熒光團。優(yōu)選P!是脯氨酸，或者有效的脯氨酸類似物或取代基，正如這里所描述的Pi，優(yōu)選是精氨酸，且P!上游的P2基團優(yōu)選是甘氨酸。篩選APCE抑制劑在特定的實施方案中，本發(fā)明包括篩選抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑的方法，其包括提供這里所預(yù)期的的熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽，其包含p廣pr鍵，并且包含被P廣Pr鍵隔開的熒光團(例如EDANS)和猝滅基團(例如DABCYL)，從而該肽可被(X2-抗纖維蛋白溶酶切割酶切割，提供一定量的(X2-抗纖維蛋白溶酶切割酶，將(X2-抗纖維蛋白溶酶切割酶暴露到ar抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑候選物以形成測試混合物，將測試混合物與熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽組合，并在Ct2-抗纖維蛋白溶酶切割酶的活性被0t2-抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑候選物抑制時測量從測試混合物的焚光發(fā)射以進行鑒定。APCE抑制劑正如本文所述的，F(xiàn)RET肽和在a2AP易分裂鍵周圍肽序列的各種序列變化已經(jīng)在本文中用于開發(fā)抑制劑。特別的，易分裂鍵的脯氨酸取代為脯氨酸類似物已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)了本文所述的特異性的APCE抑制劑。因此，本發(fā)明預(yù)期APCE-抑制擬肽，其具有最高達到28個或更多個氨基酸，并且包含脯氨酸類似物和衍生物用作P!脯氨酸取代基，其包括但不限于在表I中顯示的脯氨酸類似物和衍生物。擬肽優(yōu)選包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個氨基酸，而不包括分隔化合物的某些氨基21酸的間隔化合物，或者可與其結(jié)合或復(fù)合用于延長肽的血清壽命的化合物，例如PEG或其他聚合材料或載體。因此，優(yōu)選在對應(yīng)于P廣Pr易分裂鍵上游47個殘基的長度(3.524A,即.35nm2.4nm)的距離上具有正電荷殘基的APCE抑制劑可被用作快速、緊密結(jié)合有效的APCE抑制劑。另外，這種抑制劑可以用于抑制緊密相關(guān)的酶，成纖維細胞激活蛋白質(zhì)(FAP),并因此用于治療涉及FAP的病癥，例如在美國專利No.6,949,514中所描述的。P5、P6或P7位置的任一個的正電荷與PrPr易分裂鍵的間隔是相應(yīng)的決定因素，且因此填充該間隔以達到近似長度(即.35nm2.4nm)的任何氨基酸或其他由惰性或中性物質(zhì)構(gòu)成的間隔物將能有效構(gòu)成APCE/FAP抑制劑。在特別有利的FRET肽或APCE抑制劑實施方案中，精氨酸(或者其他正電荷氨基酸)距離易分裂鍵的脯氨酸(或P！殘基取代基)在621A(即.6nm2.1nm)之內(nèi)。優(yōu)選形式的抑制劑包含在從P!-Pr^建的N末端方向上具有26個氨基酸的序列，包含正電荷氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)，且優(yōu)選但不是必要地在P!-Pi，鍵包括pro-asn鍵，且優(yōu)選在P2包含甘氨酸，且優(yōu)選在P!-Pr鍵的下游位置(C末端方向)包含負(fù)電荷或芳力矣氨基酉臾(寸列^口，asp、glu、trp、tyr和phe)。在本發(fā)明抑制劑或FRET肽的優(yōu)選實施方案中，化合物在易分裂鍵和N末端側(cè)的正電荷氨基酸之間可包含間隔基(接頭或填充物)，其中正電荷氨基酸例如arg、his或lys在等同于P7、P6或P5的位置上(例如，參見圖14)。易分裂鍵和Ps、P6或P7位置的正電荷氨基酸之間的間隔基(即接頭或填充物)可以例如包含許多中性、無電荷氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸，并且最優(yōu)選絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、|3-丙氨酸、y-氨基丁酸、s-氨基己酸；或者氨基-PEG衍生物例如8-、11-或14-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸(tetraoxatetradecanoicacid)和PEG寡聚物(例如11=26))。這些間隔基可以是均質(zhì)的(例如全部是甘氨酸、丙氨酸等或者其他一種氨基酸)或非均質(zhì)的(例如多于一種類型的氨基酸或雜合的氨基酸/PEG分子)，且優(yōu)選長度為3.52lA(.35nm2.1nm)(或者17個氨基酸)。間隔基可以包含中性單體例如乙二醇或者其他類似的單體單元(例如丙二醇)，其長度為3.52lA(.35nm2.1nm),從而間隔基將精氨酸(或其他正電荷氨基酸)置于易分裂鍵的脯氨酸或脯氨酸取代基或類似物大約5~25A(.5nm2.5nm)之內(nèi)。因此，在本文所限定的距離內(nèi)存在正電荷氨基酸是本發(fā)明的一個方面，這顯著地有助于與APCE序列結(jié)合的特異性。而且，當(dāng)該間隔內(nèi)的氨基酸被長度為3.5~21A(.35nm2.1nm)的聚乙二醇取代時，P12-N13鍵的切割速度對于下列肽仍是最大的，X-R6-(PEG3)-Gu-Pu畫Nn-Q!4-E！5(SEQIDNO:10),其中(PEG3)代表含有三個乙二醇單元的聚乙二醇，且X是任意氨基酸。已知正電荷效應(yīng)的特異性必須在距離P12(P!)的一定距離內(nèi)，該加入聚乙二醇的肽是通過脯氨酸，P12的選擇修飾或取代開發(fā)抑制劑的基礎(chǔ)，用于抑制APCE的蛋白酶活性。圖14顯示在Pro12被六氫吡咬羧酸，脯氨酸類似物取代時，每種肽均為20|uM的具有指定序列的幾個肽(SEQIDNO:11~13)的APCE抑制作用。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括具有式Xaa廣Sp廣Gly-Cyc-XaarSprXaa3(式I)的化合物。在該實施方案中，Xaai是正電荷氨基酸，包括但不限于精氨酸、組氨酸或賴氨酸。Sp!是間隔分子，其包含16個氨基酸，優(yōu)選中性氨基酸，包括絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸或P-丙氨酸、或y-氨基丁酸、e-氨基己酸、8-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸、11-氨基-3，6，9,12-四氧雜十四烷酸、14-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸、或PEGn或PPGn,其中n=l~6個乙二醇或丙二醇單元，且其中Sp!的長度為3A21A(.3nm-2.1nm)。Gly是甘氨酸。Cyc是碳環(huán)或雜環(huán)。碳環(huán)可以包含4、5、6或7個碳原子，且雜環(huán)可以包含4、5、6或7個原子，例如其中至少一個原子是雜原子例如氮。Xaa2優(yōu)選是谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸或者能夠作為本發(fā)明化合物PrP!，易分裂鍵中Pr原子的任何天然氨基酸。Sp2是間隔分子，并且可以不存在，或者可以包含16個氨基酸，優(yōu)選是中性氨基酸，包括絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、|3-丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或，氨基丁酸、s-氨基己酸、8-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸、11-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸、14-氨基-3，6,9,12-四氧雜十四烷酸、或PEGn或PPGn,其中11=16個乙二醇或丙二醇單元，且其中Sp!的長度為3A~21A(.3nm-2.1nm)。Xaa;是谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨23酸或任何負(fù)電荷氨基酸或芳族氨基酸?；衔锟梢赃M一步包含包含從Xaa!沿著N末端方向延伸的具有110個氨基酸的N-末端寡肽，以及包含從Xaa3沿著C-末端方向延伸的具有110個氨基酸C-末端寡肽，其中N-末端寡肽和C-末端寡肽可以包含20種天然存在氨基酸的一種或者多種。該化合物優(yōu)選被置于本文其他部分所描述的藥物可接受的載體中。在一個實施方案中，本發(fā)明是改變受試者中血漿ar抗纖維蛋白溶酶比率的方法，其中所述受試者具有血漿Met-(X2-抗纖維蛋白溶酶處理前水平和血漿Asn-ct2-抗纖維蛋白溶酶處理前水平。特別地，該方法包括使用抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑處理受試者，其中所述抑制劑特異性抑制抗纖維蛋白溶酶切割酶切割Met-a2-抗纖維蛋白溶酶的Pro-Asn切割位點，其中在處理后，該受試者的處理后血漿Met-ot2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-a2-抗纖維蛋白溶酶水平高至少5%,并且處理后血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的Asn-a2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少5%,從而改變了受試者中血漿Ct2-抗纖維蛋白溶酶的比率。在該方法中，受試者中ar抗纖維蛋白溶酶比率的改變優(yōu)選增強受試者中的纖維蛋白溶解。特別的，該方法是用于抑制或治療動脈粥樣硬化、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、中風(fēng)或肺栓塞的處理。在方法的一個實施方案中，處理后的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ot2-抗纖維蛋白溶酶水平高至少10%,且處理后的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平低至少10%。在另一個實施方案中，處理后的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平高至少15%,且處理后的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平低至少15%。在另一個實施方案中，處理后的血漿Met-ct2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ctr抗纖維蛋白溶酶水平高至少20%，且處理后的血漿Asn-a2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平低至少20%。在方法的另一個實施方案中，處理后的血漿Met-a2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平高至少25%(并且可以是例如高任何百分比)，且處理后的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平低至少25%(并且可以是例如低任何百分比)。在一個實施方案中，本發(fā)明優(yōu)選是通過改變受試者中(X2-抗纖維蛋白溶酶水平治療或抑制受試者中動脈粥樣硬化、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、中風(fēng)或肺栓塞的方法，其中所述受試者具有處理前的血漿Met-oi2-抗纖維蛋白溶酶水平和處理前的血漿Asn-(X2-抗纖維蛋白溶酶水平。該方法包括使用抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑處理受試者，其中所述抑制劑特異性地抑制抗纖維蛋白溶酶切割酶切割Met-oi2-抗纖維蛋白溶酶的Pro-Asn切割位點，其中在治療后，受試者的處理后血漿Met-oi2-抗纖維蛋白溶酶水平分別比處理前的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平高至少5%、10%、15%、20%或25%(或者高任何百分比)，且處理后血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平分別比處理前的Asn-a2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少5%、10%、15%、20%或25%(或者低任何百分比)，從而改變了受試者中的血漿ar抗纖維蛋白溶酶比率。受試者中的ar抗纖維蛋白溶酶比率的改變優(yōu)選通過增強受試者中纖維蛋白溶解而發(fā)生。本發(fā)明進一步預(yù)期用于治療涉及FAP的癌癥和病癥的治療化合物，例如在美國專利No.6,949,514中所描述的，在此將其明確地引入作為參考。治療化合物包括如在本文中所描述的本發(fā)明的APCE抑制劑，其被綴合到能夠通過細胞膜的載體化合物上，包括但不限于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)。PTD是正電荷肽或肽樣分子，其透過細胞膜脂雙層。一般的，PTD含有幾個精氨酸殘基，并且可以用于遞送其他試劑例如肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸或小分子通過細胞膜且進入細胞溶膠。一種PTD是通過合成精氨酸與sACA交替的寡聚物所形成的高度有效分子轉(zhuǎn)運蛋白?？梢杂糜诒景l(fā)明的PTD的例子被顯示在美國專利Nos.:7,166,692;7,217,539;7,053,200;6,835,810;6,645,501;以及公開的美國專利申請2002/0009491;2003/0032593;2003/0162719;2006/0159719;2006/0293234;和2007/0105775中，其各自均:故明確地整體引入本文作為參考。效用本發(fā)明的效用包括但不限于(1)防止或者降低動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和進展，特別是在高風(fēng)險患者中；(2)防止或者降低動脈或者靜脈血液凝塊形成的發(fā)展(動脈血栓形成(atherothrombotic)和靜脈血栓病癥)，特別是在^皮識別為這種凝塊高風(fēng)險的狀況中，例如心臟病發(fā)作或中風(fēng)；(3)增強的血管開放的維持，其通過連續(xù)施用APCE抑制劑實現(xiàn)，可能聯(lián)合同時施用低劑量纖維蛋白溶酶原激活劑藥物；(4)防止或者降低纖維蛋白形成，其中所述纖維蛋白形成可能造成與炎癥狀況相關(guān)的持久的急性或慢性癥狀，例如所有形式的關(guān)節(jié)炎、組織纖維化、不期望的痣痕形成以及癌癥及其轉(zhuǎn)移；(5)在纖維蛋白溶解過度(hyperfibrinolytic)狀態(tài)被誘導(dǎo)時，降低出血的風(fēng)險，已知a2APPro在丕交聯(lián)到纖維蛋白中時與a2APact—樣好地抑制溶液狀態(tài)的纖維蛋白溶酶；(6)輔助防止和治療干擾器官功能的纖維蛋白沉積，所述纖維蛋白沉積可以在動脈血栓形成疾病中發(fā)現(xiàn)，例如冠狀動脈血栓形成、中風(fēng)、肺栓塞、所有其他形式的動脈和靜脈血栓形成、炎癥狀況和癌癥及其轉(zhuǎn)移；(7)測定是否受試者具有ar抗纖維蛋白溶酶中的Trp6或Arg6多態(tài)；以及(8)篩選抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑。因此，本發(fā)明的各種實施方案包括但不限于(1)促進體內(nèi)纖維蛋白消化的治療方法，其包括為受試者施用有效量的抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑；(2)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)肽，其用作APCE的底物；(3)抗纖維蛋酶溶酶切割酶的抑制劑，其中該抑制劑可以包含或者連接到聚合間隔基、接頭或載體上；(4)抗纖維蛋酶溶酶切割酶的抑制劑，其有效結(jié)合或封閉抗纖維蛋酶溶酶切割酶的ar抗纖維蛋白溶酶結(jié)合位點，或者ar抗纖維蛋白溶酶pro-asn切割位點；(5)增強體內(nèi)纖維蛋白消化的方法，其包括為需要凝塊消化或凝塊預(yù)防的受試者同時或者依次提供一定量的纖維蛋白溶酶原激活劑和抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑，其中纖維蛋白溶酶原激活劑的量低于在不存在抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)治療規(guī)程中所提供的量；以及(6)DNA,其編碼本文所預(yù)期的FRET肽或抑制劑肽，以及含有該DNA的質(zhì)粒載體或宿主。本發(fā)明的其他實施方案提供了藥物可以接受的組合物，其包26含治療有效量的一種或者多種本文所描述的化合物，其與一種或者多種藥物可以接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑共同配制。正如下面所詳細描述的，本發(fā)明的藥物組合物可以被具體地配制成以固體或液體形式施用，其包括適于下列的那些(l)經(jīng)口施用，例如水溶液或非水溶液或懸浮液，片劑，例如靶向口腔、舌下和全身性吸收的，大丸劑(bolus),粉末，顆粒，用于舌施用的糊劑(paste);(2)腸胃外施用，例如通過皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射，其作為例如無菌溶液或懸浮液或持續(xù)釋放制劑；(3)局部應(yīng)用，例如作為乳膏、軟膏或控制釋放的貼劑或為皮膚應(yīng)用的噴霧劑；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如作為乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)經(jīng)眼；(7)經(jīng)皮或(8)經(jīng)鼻。本文所使用的短語"治療有效量"的意思是化合物、材料或包含本發(fā)明的化合物的組合物的量，其以可以應(yīng)用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理利益/風(fēng)險比，在動物的至少一種細胞的亞群中有效產(chǎn)生一些期望的治療效果。本文所采用的短語"藥物可以接受的，，是指在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和動物的組織接觸而沒有過度的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或與合理的利益/風(fēng)險比相當(dāng)?shù)钠渌麊栴}或并發(fā)癥的那些化合物、材料、組合物和/或劑型。本文所使用的短語"藥物可以接受的載體"的意思是藥物可以接受的材料、組合物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或者溶劑被嚢化材料，其參與將目標(biāo)化合物從身體的一個器官或部分?jǐn)y帶或轉(zhuǎn)運至身體的另一個器官或部分。每種載體必須在與制劑其他成分相容的意義上是"可接受的"，并且對于患者不是有害的?？勺鳛樗幬锟梢越邮艿妮d體的材料的一些例子包括(l)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石；(8)賦形劑例如可可油和栓劑蠟；(9)油例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(IO)二醇例如丙二醇；(ll)多元醇例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(l5)藻酸；(l6)無致熱原水；(H)等滲鹽水；(l8)林格液；(19)乙醇；(20)pH緩沖溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；和(22)在27藥物制劑中采用的其他無毒性相容物質(zhì)。正如上面所列出的，本發(fā)明化合物的某些實施方案包含堿性官能團，例如氨基或烷基氨基，且因此能夠與藥物可以接受的酸形成藥物可以接受的鹽。在該方面中術(shù)語"藥物可以接受的鹽"是指本發(fā)明化合物的相對無毒、無機和有機酸加成鹽?？梢栽谑┯谩┠辰槲锘騽┬椭圃旃に囍性恢苽溥@些鹽，或者通過分別將游離堿形式的本發(fā)明純化化合物與適當(dāng)?shù)挠袡C酸或無機酸反應(yīng)并分離從而在后續(xù)純化過程中形成的鹽。代表性的鹽包括氬溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、醋酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽(napthylate)、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖醛酸鹽和月桂基磺酸鹽等。目的化合物的藥物可以接受的鹽包括傳統(tǒng)的化合物的無毒鹽或季銨鹽，例如來自無毒有機酸或無機酸。例如這種傳統(tǒng)的無毒鹽包括來自無機酸的那些，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及從有機酸制備的鹽，例如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸(salicyclic)、磺胺酸、2-乙酸基苯甲酸、延胡索酸、甲苯磺酸、曱磺酸、乙烷二磺酸、草酸、異硫羰酸(isothionic)等。在其他情況中，本發(fā)明的化合物可以含有一個或者多個酸性官能團，且因此能夠與藥物可以接受的堿形成藥物可以接受的鹽。在這些情況中術(shù)語"藥物可以接受的鹽"是指本發(fā)明化合物的相對無毒無機和有機堿加成鹽。類似的，可以在施用々某介物或劑型制造工藝中原位制備這些鹽，或者通過分別將游離酸形式的純化化合物與適當(dāng)?shù)膲A如藥物可以接受的金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，與氨，或者與藥物可以接受的有機伯胺、仲胺或叔胺反應(yīng)制備。代表性的堿或堿土鹽包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁鹽等。用于形成堿加成鹽的代表性有機胺包括乙胺、二乙胺、1,2-乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、艱。秦等。在組合物中還可以存在濕潤劑、乳化劑和潤滑劑，例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、隔離劑、涂層劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。藥物可以接受的抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸氬氯化物、碌u酸氫鈉、焦亞-危酸鈉、亞石克酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯曱醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、掊酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金屬螯合劑例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。正如上面所述的，本發(fā)明的制劑包括適于經(jīng)口、經(jīng)鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外施用的那些。這些制劑可以被便利地提供于單位劑型中，并可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域中公知的任何方法進行制備?？梢耘c載體材料組合以生產(chǎn)單個劑型的活性成分的量將根據(jù)被治療的宿主、施用的特定模式而變化。通?？膳c載體材料組合以生產(chǎn)單個劑型的活性成分的量將是產(chǎn)生治療效果的化合物的量。通常，在100%中，該量將在大約1%大約99%活性成分的范圍內(nèi)，優(yōu)選大約5%大約70%,最優(yōu)選大約10%大約30%。在某些實施方案中，本發(fā)明的制劑包含選自下列的賦形劑環(huán)糊精、脂質(zhì)體、微團形成劑例如膽汁酸和聚合載體例如聚酯和聚酐。的化合物與載體以及任選地一種或者多種輔助成分聯(lián)合。通常，這些制劑是通過將本發(fā)明的化合物與液體載體或者精細分開的固體載體或者二者均勻并緊密地聯(lián)合，接著如果必要對產(chǎn)品進行定形而制成的。適于經(jīng)口施用的本發(fā)明的制劑可以是以膠嚢、扁膠劑、丸劑、片劑、糖錠(使用調(diào)味基底，通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)、粉末、微粒、或者作為含水液體或非含水液體中的溶液或懸浮液、或者作為水包油或油包水液體乳劑、或者作為酏劑或糖漿、或者作為錠劑(使用惰性基底例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或作為口洗劑等，各含有預(yù)定量的本發(fā)明的化合物作為活性成分。本發(fā)明的化合物還可以作為大丸劑(bolus)或糊劑施用。在本發(fā)明用于經(jīng)口施用的固體劑型中(膠嚢、片劑、丸劑、粉末、顆粒等)，活性成分與一種或者多種藥物可以接受的載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二辨和/或任何下列G)填充劑或膨脹劑例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑例如羧曱基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)吸濕l將本發(fā)明29劑例如甘油；(4)崩解劑例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑例如石蠟；(6)吸收促進劑例如季銨化合物；(7)潤濕劑例如十六烷醇、甘油單硬脂酸酯和非離子表面活性劑；(8)吸附劑例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；和(10)著色劑。在膠嚢、片劑和丸劑的情況中，藥物組合物還可以包含緩沖劑。也可以采用類似類型的固體組合物作為軟殼和硬殼明膠膠嚢的填充劑，其使用諸如乳糖或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的賦形劑。可以通過壓縮或者塑型制造片劑，任選地利用一種或者多種輔助成分?？梢允褂谜澈蟿?例如明膠或羥丙基曱基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸淀粉鈉或交聯(lián)羧曱基纖維素鈉)、表面活性劑或者分散劑制備壓縮的片劑?？梢酝ㄟ^在合適的機器中塑型用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末化合物的混合物來制備塑型的片劑。片劑和本發(fā)明藥物組合物的其他固體劑型例如糖衣片、膠嚢、丸劑和顆粒任選地可以:故刻痕或用涂層和殼例如腸溶衣和藥物配制領(lǐng)域中公知的其他涂層制備。它們也可以被配制從而提供緩慢或者控制釋放其中的活性成分，其使用各種比例的例如羥丙基甲基纖維素以提供所需的釋放概況，其他的基質(zhì)，脂質(zhì)體和/或小球體。它們可以被配制為用于快速釋放例如凍干。它們可以被滅菌例如在使用之前立即通過過濾經(jīng)過保留細菌的過濾器，或者通過以可溶解在無菌水或者某些其他無菌可注射介質(zhì)中的無菌固體組合物形式摻入滅菌劑。這些組合物也可以任選地含有不透明劑，并且可以是僅釋放活性成分的組合物，或者優(yōu)選地在胃腸道的某些部分中，任選地以延遲的模式?？梢允褂玫陌窠M合物的例子包括聚合材料和蠟?；钚猿煞忠部梢允俏⒈粐盎问降?，如果適當(dāng)具有一種或者多種上述的賦形劑。用于經(jīng)口施用本發(fā)明化合物的液體劑型包括藥物可以接受的乳劑、微乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性成分外，液體劑型可以含有本領(lǐng)域中通常使用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、加溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯曱醇、苯曱酸節(jié)酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性稀釋劑之外，經(jīng)口組合物還可以含有佐劑例如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。除了活性化合物外，懸浮液還可以含有懸浮劑例如乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠及其混合物。本發(fā)明用于直腸或陰道施用的藥物組合物的制劑可以呈現(xiàn)為栓劑，其是通過將本發(fā)明的一種或者多種化合物與一種或者多種適當(dāng)?shù)臒o刺激賦形劑或載體混合而制備的，其中所述無刺激賦形劑或載體包括例如可可油、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽，并且其在室溫下是固體的，但在體溫是液體的，因此在直腸或陰道腔中會熔化并且釋放活性化合物。本發(fā)明適于陰道施用的制劑還包括棉塞(tampon)、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧制劑，其含有本領(lǐng)域中公知的適當(dāng)載體。劑、軟膏、糊劑、ld、洗劑、凝膠:溶液、貼劑(patch)和吸入劑:活性化合物可以在無菌條件下與藥物可以接受的載體以及與任何可以需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。軟膏、糊劑、乳膏和凝膠除了本發(fā)明的活性化合物以外，還可以含有賦形劑，例如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨潤土、硅酸、滑石和氧化鋅或其混合物。粉末和噴霧劑除了本發(fā)明的化合物外，還可以含有賦形劑，例如乳糖、滑石、硅酸、氬氧化鋁、硅酸釣和聚酰胺粉末或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑額外地含有常規(guī)的推進劑，例如含氯氟烴和揮發(fā)性未取代烴例如丁烷和丙烷。經(jīng)皮貼劑具有將本發(fā)明的化合物控制遞送到身體的附加優(yōu)點。這種劑型可以通過將化合物溶解或分散在正確的介質(zhì)中制備。吸收增強劑也可以被用于提高化合物流出通過皮膚?？梢酝ㄟ^提供速度控制膜或?qū)⒒衔锓稚⒃诰酆匣|(zhì)或凝膠中控制這種流出的速度。眼科制劑、眼軟膏、粉末、溶液等也可以預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)。適于腸胃外施用的本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的化合物聯(lián)合一種或者多種藥物可以接受的無菌等滲水溶液或非水溶液、分散體、懸浮液或乳劑或無菌粉末，其可以緊在使用前被重建為無菌可注射溶液或分散體，其可以含有糖、醇、抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與期望受體的血液等滲的溶質(zhì)、或者懸浮劑或增稠劑?？梢栽诒景l(fā)明的藥物組合物中被采用的適當(dāng)含水和非水載體的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?，植物油例如橄欖油，和可注射有機酯例如油酸乙酯。通過使用涂層材料例如卵磷脂，通過維持在分散體情況中所需的粒度，以及通過使用表面活性劑，可維持正確的流動性。這些組合物還可以含有佐劑例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過包括各種抗細菌劑和抗真菌劑例對羥基苯曱酸酯類(paraben)、氯丁醇、苯酚山梨酸等可以確保防止微生物對目標(biāo)化合物發(fā)揮作用。也可以需要向組合物中加入等滲試劑例如糖、氯化鈉等。另外，通過包含延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠而引起可注射藥物形式的延長的吸收。在一些情況中，為了延長藥物的作用，需要使通過皮下或肌內(nèi)注射的藥物吸收變慢。這可以通過使用水溶性差的晶體或無定形材料的液體懸浮液來達到。接著藥物的吸收速度依賴于溶解速度，這接著，可以依賴于晶體大小和結(jié)晶形狀?？商娲模c胃外施用的藥物形式的延遲吸收通過將藥物溶解或懸浮在油媒介物中而達到。可以通過在生物可降解聚合物例如聚交酯-聚乙交酯中形成目標(biāo)化合物的微膠嚢基質(zhì)而制備可注射的儲存形式。依賴于藥物與聚合物的比率以及所采用特定聚合物的特征，可以控制藥物釋放的速度。其他生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。儲存可注射制劑也可以通過將藥物包載在與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳劑中而制備。在將本發(fā)明的化合物作為藥物施用給人和動物時，它們可以作為本身提供，或者作為藥物組合物提供，其中所述藥物組合物含有例如0.1~99.5%(更優(yōu)選0.590%)的活性成分聯(lián)合藥物可接受的載體?？梢酝ㄟ^經(jīng)口、腸胃外、局部或直腸提供本發(fā)明的制劑。當(dāng)然，它們以適于每種施用途徑的形式提供。例如，它們通過注射、吸入、32眼洗劑、軟膏、栓劑等以片劑或膠嚢的形式施用，通過注射、灌輸或吸入施用，通過洗劑或軟膏局部施用；和通過栓劑直腸。優(yōu)選經(jīng)口施用。在本文中所使用的短語"腸胃外的施用，，和"腸胃外施用"的意思是除了腸施用和局部施用之外的施用才莫式，通常通過注射，且包括并不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下(subeuticular)、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射和灌輸。在本文中所使用的短語"全身性施用"、"全身施用"、"外周施用"和"外周性施用"的意思是不同于直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的化合物、藥物或其他材料施用，從而它能夠進入患者系統(tǒng)，并因此進行代謝和其他類似的過程，例如皮下施用。動物用于治療，包括經(jīng)::經(jīng)鼻，;為;如噴霧劑:直腸，陰道內(nèi)，、腸胃外，腦池內(nèi)和局部，作為粉末，軟膏或滴劑，包括口腔和舌下。與所選擇的施用途徑無關(guān)，可以以適當(dāng)?shù)乃闲问绞褂玫谋景l(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物被通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法配制成藥物可以接受的劑型。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化從而獲得有效達到特定患者、組合物和施用模式的所需治療應(yīng)答的活性成分的量，而對患者沒有毒性。所選擇的劑量水平將依賴于多種因素，包括本發(fā)明所采用特定化合物或其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時間，所采用特定化合物的排泄或代謝的速度，治療持續(xù)時間，與所采用特定化合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、綜合健康狀況和以前的醫(yī)療史以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的類似因素。具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)可確定并開處方所需藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可從低于為達到所需的治療效果所需水平的藥物組合物中所采用的本發(fā)明化合物的劑量開始，且逐步提高劑量直到達到所需的效果。通常，本發(fā)明化合物的適當(dāng)日劑量將是有效產(chǎn)生治療效果的最低劑量的化合物量。這種有效劑量將通常依賴于上面所述的因素。通常，在用于顯示的止痛效果時，用于患者的本發(fā)明化合物的靜脈內(nèi)、腦室內(nèi)和皮下劑量將在每日每千克體重大約0.0001大約100mg的范圍內(nèi)。如果需要，活性化合物的有效日劑量可以作為2、3、4、5、6或更多次子劑量分別在一天內(nèi)以適當(dāng)時間間隔施用，任選地以單位劑型。盡管本發(fā)明的化合物可能被單獨施用，但優(yōu)選將該化合物作為藥物制劑(組合物)施用。在另一個方面中，本發(fā)明提供了藥物可以接受的組合物，其包含藥物有效量的一種或者多種上述的目標(biāo)化合物，其是連同一種或者多種藥物可以接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑所配制的。正如下面詳細描述的，本發(fā)明的藥物組合物可以;故特別配制用以以固體或液體形式施用，包括適于下列的(l)經(jīng)口施用，例如水溶液或非水溶液或懸浮液、片劑、大丸劑、粉末、顆粒、糊劑用于應(yīng)用給舌；(2)腸胃外施用，例如通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如作為無菌溶液或懸浮液；(3)局部應(yīng)用，例如作為乳膏、軟膏或噴霧劑應(yīng)用到皮膚、肺或口腔；或(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)(intravectally),例如作為陰道栓劑、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)經(jīng)眼；(7)經(jīng)皮；或者(8)經(jīng)鼻。根據(jù)其他藥物類推，根據(jù)本發(fā)明的化合物可以被配制成用以以任何便利的方法施用用于人用或獸醫(yī)用藥。術(shù)語"治療"意欲包括預(yù)防、治療和治愈。接受這種治療的患者是有此需要的任何動物，通常包括靈長類特別是人以及其他哺乳動物例如馬、牛、豬和羊；以及家禽和寵物。本發(fā)明的化合物可以原樣地被施用，或者與藥物可以接受的載體混合施用，且也可聯(lián)合抗微生物試劑施用，例如青霉素、頭孢菌素、氨基糖苷和糖肽。這樣，聯(lián)合治療包括依次、同時和分別施用活性化合物，其以在施用后續(xù)物時首次施用的治療效果沒有完全消失的方式。正如這里所使用的，術(shù)語"受試者"或"患者"優(yōu)選指溫血動物，例如患有特定炎癥疾病狀態(tài)的哺乳動物。應(yīng)理解，豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、馬、牛、羊和人是在該術(shù)語意義范圍內(nèi)的動物例子。被作為本領(lǐng)域技術(shù)人員的主治診斷醫(yī)生通過使用傳統(tǒng)技術(shù)并iii觀察在類似環(huán)境下所得到的結(jié)果來確定。在確定治療有效劑量中，主治診斷醫(yī)生考慮許多因素，包括但不限于哺乳動物的物種；其尺寸、年齡和綜合健康狀況；具體的所涉及的疾病或狀況；疾病或狀況的程度或受累或嚴(yán)重程度；個體受試者的應(yīng)答；所施用的特定化合物；施用模式；所施用制劑的生物利用率特征；所選擇的給藥方案；伴隨藥療法的使用；以及其他相關(guān)的情況。本發(fā)明組合物的治療有效量通常將含有充分的活性成分(即APCE或其抑制劑)以用于遞送大約0.1pg/kg大約100mg/kg(活性成分的重量/患者的體重)。優(yōu)選，該組合物將遞送至少0.5|iig/kg50mg/kg，且更優(yōu)選至少1j^g/kg10mg/kg。本發(fā)明方法的實踐包括向受試者施用治療有效量的活性成分，以任何適當(dāng)?shù)娜砘蚓植恐苿?，以有效遞送上述劑量的量。劑量可以一次施用，或者(例如)每日1次5次或者每周一次或兩次，或者通過靜脈滴注連續(xù)地，或者其他方式，這依賴于所需的治療效果。正如所述的，優(yōu)選的施用量和模式能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。制備制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易選擇正確的施用形式和模式，這依賴于所選擇化合物的特定特征，被治療的疾病狀態(tài)，疾病的階段和其他相關(guān)情況，其使用本領(lǐng)域中已知的制劑技術(shù)，例如在Remington'sPharmaceuticalSciences,最新版，MackPublishingCo.中所描述的?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)制造藥物組合物。通常，治療有效量的化合物將與藥物可以接受的載體混合。本發(fā)明所描述的分子的半衰期可通過使用本領(lǐng)域中已知的方法綴合到其他分子例如聚合物上以形成藥物-聚合物綴合物而被延長。例如，這些分子可以結(jié)合到本領(lǐng)域中已知的惰性聚合物分子，例如在被稱作"加入聚乙二醇，，方法中的聚乙二醇(PEG)分子。因此，加入聚乙二醇可延長體內(nèi)壽命，且因而擴大分子的治療效率。PEG分子可以被官能團修飾，例如在Harris等人，"Pegylation，ANovelProcessforModifyingPhararmacokinetics",ClinPharmacokinet,2001:40(7);539-551中所顯示的，且分子的氨基末端或半胱氨酸殘基(如果存在的話)，或者其中其他連接氨基酸可連接到其上，其中PEG分子可以攜帶一種或多種分子類型的一種或者多種。"聚乙二醇"或"PEG，，的意思是聚(亞烷基)二醇化合物或其衍生物，其利用或不利用偶聯(lián)劑，或者利用偶聯(lián)或激活部分衍生(例如具有硫醇、三氟甲磺酸鹽、三氟乙磺酸鹽、氮丙啶、環(huán)氧乙烷或優(yōu)選具有馬來酰亞胺部分)?；衔镏T如馬來酰亞胺單甲氧基PEG是本發(fā)明示范性或激活的PEG化合物。其他的聚(亞烷基)二醇化合物例如聚丙二醇可以用于本發(fā)明中。其他適當(dāng)?shù)木酆衔锞Y合物包括但不限于例如非多肽聚合物，下列類型的帶電荷或中性聚合物葡聚糖、多聚乙酰神經(jīng)氨酸或其他基于碳水化合物的聚合物、生物素衍生物和樹狀聚體。術(shù)語PEG的意思還包括其他聚環(huán)氧烷類型的聚合物。PEG可以連接到本文所描述分子的任何N-末端氨基酸，以及/或者可被連接到N-末端氨基酸下游的氨基酸殘基，例如賴氨酸、組氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸，例如或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的這種氨基酸。附著到所述肽的PEG載體部分的分子量可以在大約20020,000M的范圍內(nèi)。優(yōu)選，PEG部分將為大約1,000~8,000MW,更有選為大約3,2505，000MW,最優(yōu)選大約5,000MW。與每個本發(fā)明的分子共價結(jié)合的PEG分子的實際數(shù)目可以有很大變化，這依賴于所需的穩(wěn)定性(即血清半衰期)。使用例如(但不限于)在美國專利Nos.4,179,337;5,382,657;5,972,885;6,177,087;6,165,509;5,766,897;和6,217，869中所描述的技術(shù)，本發(fā)明所預(yù)期的分子可被連接到PEG分子上，將每份專利的說明書和附圖都明確地引入本文作為參考?？商娲?，可能將分子包載在微膠嚢中，所述微膠嚢通過例如凝集技術(shù)或通過界面聚合(例如分別為羥曱基纖維素或明膠-微膠嚢和聚(曱基丙烯酸甲酯)微膠嚢)，在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白小球體、微乳劑、納米顆粒(nano-particle)和納米膠嚢(nanocapsule)),或者在粗乳劑中制備。這些技術(shù)被公開在最近版本的Remington'sPharmaceuticalSciences中。美國專利No.4,789,734描述了用于將生化藥品被嚢化在脂質(zhì)體中的方法，且在此將其明確并入作為參考?；旧?，將材料溶解在水溶液中，加入適當(dāng)?shù)牧字椭|(zhì)，以及如果需要的話連同加入表面活性劑，并如果必要將材料透析和超聲處理。已知方法的綜述是G.Gregoriadis，Chapter14."Liposomes",DrugCarriersinBiologyandMedicine,pp.287-341(AcademicPress,1979)。由聚合物或蛋白質(zhì)形成的小球體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可被調(diào)節(jié)成通過胃腸道直接進入36血流。可替代的，試劑可以被摻入，小球體或小球體的復(fù)合物被植入以用于緩慢釋放一段時間，在幾天到幾個月的范圍內(nèi)。參見例如美國專利Nos.4,906,474;4，925,673;和3,625,214,其并入本文作為參考。在將組合物用作可注射材料時，可以將其配制到傳統(tǒng)的可注射載體中。適當(dāng)?shù)妮d體包括生物相容和藥物可以接受的磷酸緩沖鹽水溶液，其優(yōu)選是等滲的。根據(jù)本發(fā)明，為了對凍干產(chǎn)品進行重建，人們可以采用無菌料:在該方面:無菌稀釋劑可以含有緩沖劑以獲^尋生理上可以接受的pH,例如氯化鈉、鹽水、磷酸緩沖鹽水和/或其他生理上可以接受和/或使用安全的物質(zhì)。通常，用于在人中靜脈內(nèi)注射的材料應(yīng)符合食品藥品管理局(FoodandDrugAdministration)所確立的規(guī)定，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的。所述藥物組合物還可以是水溶液的形式，其含有與上面對凍干產(chǎn)品的重建所描述相同的物質(zhì)。這些化合物還可以作為藥物可以接受的酸或堿加成鹽施用，其是通過與無機酸例如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，以及有機酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和延胡素酸的反應(yīng)，或者通過與無機-咸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀，和有機堿例如單烷基-、二烷基-、三烷基和芳基胺和取代乙醇胺的反應(yīng)所制備的。正如上面所述的，本發(fā)明的化合物可以被摻入到可以用于治療目的的藥物制劑中。然而，術(shù)語"藥物制劑"在本文中在更寬的意義上意欲包括含有根據(jù)本發(fā)明的糖硫肽(glycosulfopeptide)組合物的制劑，不僅用于治療目的，而且用于本領(lǐng)域已知的試劑或診斷目的，或者用于組織培養(yǎng)。意欲用于治療用途的藥物制劑應(yīng)含有"藥物可以接受的"或"治療有效量"的本文所限定的分子。已知本文所提供的教導(dǎo)，本文所列出的所有的測定方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。本文所引用的所有參考文件、專利和專利申請在此整體并入本文作為參考。特別的，美國序列號10/774,242、60/445,774、60/811,568和60/836,365被明確地整體并入本文作為參考。盡管已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明及其優(yōu)點，但應(yīng)理解可以在不離開后附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的情況下在本文中進行各種變化、替代和改變。而且，本申請的范圍不意欲限于說明書中所描述的工藝、制造、物質(zhì)的組合物、手段、方法和步驟的特定實施方案。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將從本發(fā)明的公開內(nèi)容容易理解的，根據(jù)本發(fā)明可以利用目前存在或者之后開發(fā)的發(fā)揮與本文所描述的相應(yīng)實施方案達到基本相同結(jié)果的工藝、制造、物質(zhì)組合物、手段、方法或步驟。因此，所附的權(quán)利要求被認(rèn)為在其范圍內(nèi)包括這種工藝、制造、物質(zhì)組合物、手段、方法或步驟。參考文獻CollenD.Theplasminogen(fibrinolytic)system.Thromb.Haemost.1999;82:259-270.MullertzS,ClemmensenI.Theprimaryinhibitorofplasmininhumanplasma..Biochem丄1976;159:545-553.0149]CollenD.Identificationandsomepropertiesofanewfast-reactingplasmininhibitorinhumanplasma.Eur.J.Biochem.1976;69:209-216.Bang.ertK,JohnsenAH,ChristensenU,ThorsenS.DifferentN-terminalformsofalpha2-plasmininhibitorinhumanplasma.Biochem丄1993;291(Pt2):623-625,KoyamaT,KoikeY,ToyotaSetal.DifferentNH2-terminalformwithli2additionalresiduesofalpha2-plasmirinhibitorfromhumanplasmaandculturemediaofHepG2cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.1994;200:417-422.LeeKN,JacksonKW,ChristiansenVJ,ChungKH,McKeePA.Anovelplasmaproteinasepotentiatesalpha2-antiplasmininhibitionoffibrindigestion.Blood2004;103:3783-3788.LeeKN,JacksonKW,ChristiansenVJetal.Antiplasmin-deavingenzymeisasolubleformoffibroblastactivationprotein.Blood2006;107:1397-1404.HirosawaS,NakamuraY,MiuraO,SumiY,Aoki'N.Organizationofthehumanalpha2-plasmininhib比orgene.Proc.Natl.Acad.Sci-U,S.A1988;85:6836-6840.0155]HolmesWE,NellesL,LijnenHR,CollenD，Primarystructureofhumanalpha2-antiplasmin,aserineproteaseinhibitor(serpin).J.Biol.Chem.1987;262:1659-1664.ToneM,KikunoR,Kume-IwakiA,.Hashimoto-GotohT.Structureofhumanalpha2-plasmininhibitordeducedfrom,thecDNAsequence.J.Biochem.(Tokyo)1987;102:1033-1041.0157]LindB,ThorsenS.Anovelm;ssensemutationinthehumanplasmininhibitor(alpha2-antiplasmir0geneassociatedwithableedingtendency.Br丄Haematol.1999;107:317-322.WimanB.Affinity-chromatographicpurificationofhumanalpha2-antip，asmin.Biochem丄1980;191:229-232.BeebeDP,AronsonDL.Anautomatedfibrinolyticassayperformedinmicrotiterplates.Thromb.Res.1987;47:123-128.JonesAJ,MeunierAM.Aprecise.andrapidmicrot汰replatedotlysisassay:methodology,kineticmodelingandmeasurementofcatalyticconstantsforplasminogenactivationduringfibrinolysis.Thromb.Haemost.1990:64:455-463.LeeKN,LeeSC,JacksonKWetal.Effectofphenylglyoxa卜modifiedaipha2-antiplasminonurokinase-induced行brinolysis.Thromb.Haemost.1998;80:637-644*0162]TamJP.Syntheticpeptidevaccinedesign:synthesisandpropertiesofahigh-densitymultipleantigenicpeptidesystem.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S,A1988;85:5409-5413.vonRok汰anskyC.Abnormalconditionsofthearteries.AManualofPatho，ogfcalAnatomy.London:SydenhamSociety;1852:261-275.VirchowR.PhlogoseundThrombose著mGefasssystem.In:VirchowR,ed,Gesamme，teAbhandlungenzurWissenschatflichenMedizin.FrankfUrt:MeidingerSohn&Co.;1856:458-636.Schwartz。，ValenteAJ,KelleyJL,SpragueEA,EdwardsEH.Thrombosisandthedevelopmentofatherosclerosis:Rokltanskyrevisited.Semin.Thromb.Hemost.1988;14:189-195.FusterV,Badimonl_,Bad，monJJ,ChesebroJH.ThepathogenesisofcoronaryarterydiseaseandtheacutecoronarysyndromesU).N.Engl丄Med.1992;326:242-250.SmithEB,ThompsonWD.Rbrinasafactorinatherogenesis.Thromb.Res.1994;73:1-19.MarutsykaK,HatakeyamaK,YamashitaA,AsadaY.Roleofthrombogenicfactorsinthedevelopmentofatherosclerosis.J.Atheroscler.Thromb.2005;12:1-8.KathiresanS,YangQ,LarsonMGetal.Commongeneticvariationinfivethrombosisgenesandrelationstoplasmahemostaticproteinlevelandcardiovasculardiseaserisk.Arterloscler.Thromb.Vasc.Blol.2006;26:1405-1412.SpurlockBO,ChandlerAB.Adherentplateletsandsurfacemicrothrombiofthehumanaortaandleftcoronaryartery:ascanningelectronmicroscopyfeasibilitystudy.ScanningMicrosc.1987;1:1359-1365.TanakaK,SueishlK.Thecoagulationandfibrinolysissystemsandatherosclerosis.LabInvest1993;69:5-18.FavierR,AokiN,deMP.Congenitalalpha(2)-plasmininhibitordeficiencies:areview.Br丄Haematol.2001;114:4-10,EdaK,OhtsukaS,SeoYetal.Conservativetreatmentofhemolyticcompncationfollowingcoilembolizationintwoadultcasesofpatentductusarteriosus.Jpn.Circ丄2001;65:834-836.LeviM,RoemD,KampAMetal.Assessmentoftherelativecontributionofdifferentproteaseinhibitorstotheinhibitionofplasmininvivo.Thromb.Haemost.1993j69:141-146.HarpelPC,MosessonMW.Degradationofhumanfibrinogenbyplasmsalpha2-macroglobulin-enzymecomplexes.J.CHn.Invest1973;52:2175-2184.[0189AokiN,HarpelPC.Inhibitorsofthefibrinolyticenzymesystem.Semin.Thromb.Hemost.1984;10:24-41.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>(3-氟-芐基)-脯氨酸(4-氟-千基)-脯氨酸(2-氯-千基)-脯氨酸(3-氯-千基)-脯氨酸(4-氯-千基)-脯氨酸(2-溴-千基)-脯氨酸(3-溴-節(jié)基)-脯氨酸(4-溴-千基)-脯氨酸苯乙基-脯氨酸_(2-甲基-芐基)-脯氨酸(3-甲基-節(jié)基)-脯氨酸(4-甲基-節(jié)基)-脯氨酸(2-硝基-辛基)-脯氨酸(3-硝基-千基)-脯氨酸(4-硝基-節(jié)基)-脯氨酸(l-萘基曱基)-脯氨酸(2-萘基甲基)-脯氨酸(2,4-二氯-千基)-脯氨酸(3,4-二氯-卡基)-脯氨酸(3,4-二氟-千基)-脯氨酸(2-三氟甲基-千基)-脯氨酸P-三氟甲基-千基)-脯氨酸(4-三氟甲基-千基)-脯氨酸(2-氰基-千基)-脯氨酸(3-氰基-節(jié)基)-脯氨酸(4-氰基-節(jié)基)-脯氨酸(4-碘代-千基)-脯氨酸(3-苯基-烯丙基)-脯氨酸(3-苯基-烯丙基)-脯氨酸(3-苯基-丙基)-脯氨酸(4-叔丁基-節(jié)基)-脯氨酸<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>2-羧基-2,3-脫氬吲哚__乙?；?甘氨酉菱-valboropro(acetyl陽gly陽valboropro)環(huán)戊基_N-取代環(huán)戊基衍生物_環(huán)己基__N-取代環(huán)己基衍生物_val-boroproglu-boropro_哺唑烷_^_以及在美國專利No.4,428,939;6,890,904;4,762,821和公開的申請2003/0158114;20050272703;和2006/0287245中限定的脯氨酸類似物和^^生物。權(quán)利要求1.一種改變受試者中血漿α2-抗纖維蛋白溶酶比率的方法，其中所述受試者具有處理前的血漿Met-α2-抗纖維蛋白溶酶水平和處理前的血漿Asn-α2-抗纖維蛋白溶酶水平，所述方法包括使用抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑處理受試者，其中所述抑制劑特異性地抑制抗纖維蛋白溶酶切割酶切割Met-α2-抗纖維蛋白溶酶的Pro-Asn切割位點，其中在處理后，所述受試者的處理后血漿Met-α2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-α2-抗纖維蛋白溶酶水平高至少5％，并且處理后血漿Asn-α2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的Asn-α2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少5％，從而改變了受試者中的血漿α2-抗纖維蛋白溶酶比率。2.權(quán)利要求1的方法，其中受試者中012-抗纖維蛋白溶酶比率的改變增強了受試者中的纖維蛋白溶解。3.權(quán)利要求1的方法，其中使用抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑處理受試者是用于抑制或治療動脈粥樣硬化、動脈血栓形成、靜脈血栓形成、中風(fēng)或肺栓塞的處理。4.權(quán)利要求1的方法，其中處理后血漿Met-ot2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-a2-抗纖維蛋白溶酶水平高至少10%，并且處理后血漿Asn-a2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-oi2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少10%。5.權(quán)利要求1的方法，其中處理后血漿Met-ot2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平高至少15%,并且處理后血漿Asn-ct2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ot2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少15%。6.權(quán)利要求1的方法，其中處理后血漿Met-(X2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-a2-抗纖維蛋白溶酶水平高至少20%,并且處理后血漿Asn-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-oi2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少20%。7.權(quán)利要求1的方法，其中處理后血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Met-ar抗纖維蛋白溶酶水平高至少25%,并且處理后血漿Asn-oi2-抗纖維蛋白溶酶水平比處理前的血漿Asn-ct2-抗纖維蛋白溶酶水平低至少25%。8.—種化合物，其具有下式Xaa1-Sp廣Gly-Cyc-Xaa2-Sp2-Xaa3其中Xaa!是精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Sp是間隔基，其包含8-,11-或14-氨基-3,6,9,12-四氧雜十四烷酸，PEGn或PPGn其中n=l-6，Y-氨基丁酸，s-氨基己酸，絲氨酸，甘氨酸，丙氨酸或P-丙氨酸或其組合的至少一種，其中的長度為.3nm-2.1nm;Gly是甘氨酸；Cyc是碳環(huán)或雜環(huán)化合物；Xaa2是谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、組氨酸、酪氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；Sp2是間隔基，其包含PEGn或PPGn其中n=l-5,8-,11-或14-氨基-3,6，9,12-四氧雜十四烷酸，y-氨基丁酸，s-氨基己酸，絲氨酸，甘氨酸，丙氨酸，|3-丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸或其組合的至少一種，或者不存在；且Xaa3是谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸。9.權(quán)利要求8的化合物，其中Cyc是4、5、6或7-元碳碳環(huán)。10.權(quán)利要求8的化合物，其中Cyc是4、5、6或7-元碳雜環(huán)。11.權(quán)利要求10的化合物，其中所述碳雜環(huán)包含氮雜原子。12.權(quán)利要求8的化合物，其中Sp!是PEGn，且其中11=2-5。13.權(quán)利要求8的化合物，其中Spi的長度為.6nm17.5nm。14.權(quán)利要求8的化合物，其包含從Xaa!沿著N-末端方向延長的18聚體寡肽。15.權(quán)利要求8的化合物，其包含從Xaa3沿著C-末端方向延長的210聚體寡肽。16.權(quán)利要求8的化合物，其被設(shè)置在藥物可以接受的載體中。17.權(quán)利要求8的化合物，其通過氨基酸殘基連接到聚乙二醇載體分子。18.—種篩選抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑的方法，其包括提供熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽，其可以被012-抗纖維蛋白溶酶切割酶切割，并且其包含P廣Pi，鍵，并且包含被P廣P!，隔開的熒光團和猝滅基團，其中Pi包含月甫氨酸，Pi，包含asn、phe、gln、ser、tyr、his或ala,并且具有包含gly的P2殘基；提供一定量的012-抗纖維蛋白溶酶切割酶；將012-抗纖維蛋白溶酶切割酶暴露到012-抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑候選物以形成測試混合物；將所述測試混合物與熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽組合；以及在ar抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑候選物抑制ar抗纖維蛋白溶酶切割酶的活性時測量從所述測試混合物的焚光發(fā)射以進行鑒定。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽在脯氨酸-天冬酰胺鍵的上游包含猝滅基團，且在P!-Pr鍵的下游包含熒光團。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽在P廣P!，鍵的下游包含猝滅基團，且在PrP!，鍵的上游包含熒光團。21.權(quán)利要求18的方法，其中所述熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽包含SEQIDNO:9。22.通過權(quán)利要求18的篩選方法鑒定的ct2-抗纖維蛋白溶酶切割酶抑制劑。23.ar抗纖維蛋白溶酶切割酶的寡肽底物，其包含X廣X2-X3-X4-X5-Gly-Pro-Xs(SEQIDNO:9),其中Xi選自arg、his、lys、thr、ser、trp、gly、ala、gln、asn、ile、leu、met、phe、val、pro和tyr;X2選自arg、his、lys、thr、ser、trp、gly、ala、gln、asn、ile、leu、met、phe、val、pro和tyr;X3選自arg、his、lys、thr、ser、trp、gly、ala、gln、asn、ile、leu、met、phe、val、pro和tyr;X4選自thr、ser、trp、gly、ala、gln、ile、leu、met、phe、val、pro、tyr、asn和his;X5選自thr、ser、trp、gly、ala、gln、ile、leu、met、phe、val、pro、tyr、asn和his;Xs選自asn、ser、his、tyr、ala、phe、gln;以及其中X!、X2和X3的至少一個選自arg、his和lys;和其中X^X2和X3的一個或者兩個可以不存在，且其中所述寡肽由最高達到28個氨基酸組成。24.權(quán)利要求23的寡肽，其還包含從X!以N-末端方向延長的18聚體寡肽。25.權(quán)利要求23的寡肽，其還包含從Xg以C-末端方向延長的2~10聚體寡肽。26.權(quán)利要求23的寡肽，其還包含在Gly-Pro鍵相對側(cè)的猝滅基團和熒光團。全文摘要本發(fā)明涉及抗纖維蛋白溶酶切割酶的抑制劑，其用于各種涉及纖維蛋白和α₂-抗纖維蛋白溶酶的治療，且涉及APCE的底物，其可以用于例如鑒定這種抑制劑的篩選方法。本發(fā)明進一步涉及治療或抑制動脈粥樣硬化和血栓病癥的方法，其通過改變血漿α₂-抗纖維蛋白溶酶類型的比率實現(xiàn)。文檔編號G01N33/53GK101512338SQ200780029416公開日2009年8月19日申請日期2007年6月6日優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日發(fā)明者京·N·李,帕特里克·A·麥基,維多利亞·J·克里斯琴森,肯尼思·W·杰克遜申請人:帕特里克·A·麥基;京·N·李;肯尼思·W·杰克遜;維多利亞·J·克里斯琴森