專利名稱：借助酶測量生物化合物的電化學系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于確定體液樣本中生物化合物含量的電化學系統(tǒng)， 該電化學系統(tǒng)借助所述生物化合物的特異酶，但這種酶可干涉其它的 生物化合物。本發(fā)明將通過借助萄葡糖脫氬酶對血液中的葡萄糖進行
定量電;危測量(dosage amp6rom6trique)而更i羊纟田i也"i兌明。
背景技術：
血液中葡萄糖含量的精確控制對于患糖尿病的諸多患者而言是 至關重要的預防，這些患者由于其它健康問題在同 一時間也不得不接 受其它治療。
為了了解葡萄糖含量，已經存在許多微型裝置，該葡萄糖含量確 定應該使用的胰島素的量，并使得這些患者的日常生活更方便。這些 裝置通常依靠借助電流測量的電化學測量，在特異于葡萄糖的酶存在 時，血液樣本沉積在用后即棄型傳感器上。
當前使用最多的酶是葡萄糖氧化酶(GOD)，因為除其它寡糖 (oligosaccharide)以外，這種酶對葡萄糖特別有效，并且在信號高度方 面對溫度的變化不敏感。然而葡萄糖氧化酶具有對氧的存在非常敏感 的缺點，氧的濃度可以變化，這就會使葡萄糖含量的精確測量出錯。 為了減少或消除該缺點，已有人建議使用會加速電子轉移且使得可以 忽略氧的影響的介質。在使用最多的介質中，可舉出二茂鐵及其衍生 物，以及鋨絡合物，例如美國第5393903號專利所公開的。
也可使用諸如葡萄糖脫氫酶(GDH),其具有對氧的存在不敏感的 優(yōu)點。然而，葡萄糖脫氫酶的缺點在于具有4交低的葡萄糖特異性并千 擾其它糖類、寡糖和寡多糖，例如麥芽糖，這會導致過高估計的葡萄 糖含量，進而導致不適當?shù)厥褂靡葝u素。這對糖尿病患者構成了嚴重例如通過吸收艾考糊精(icodextrine) 進行持續(xù)流動腹膜透析(CAPD)，該艾考糊精由a-淀粉酶以寡糖例如 麥芽糖、麥芽三糖或麥芽四糖的形式水解。
發(fā)明內容
因而本發(fā)明的目標是提供一種用于測量體液中確定的生物化合 物的可靠的測量電化學系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用所述化合物的特異酶，根據(jù) 治療方案能將要測量的生物化合物的信號與其它生物化合物的信號 區(qū)分開來。該區(qū)分主要依賴于要測量的生物化合物和干擾生物化合物 由溫度決定的靈敏度，該靈敏度引起的不同動力學允許區(qū)分各生物化 合物的信號。
本發(fā)明將更詳細地通過一種系統(tǒng)進行說明，該系統(tǒng)通過使用葡萄 糖脫氫酶的電化學測量法測量血液樣本中的葡萄糖含量。
為此該系統(tǒng)包括電子測量儀，該電子測量儀用于容納電化學傳感 器并允許在測量電極上施加至少兩個確定的溫度，以便能夠區(qū)分要測 量的生物化合物特有的信號和來自另 一種生物化合物的信號。傳感器 由支承集流器的襯底以已知方式形成，該集流器用來將測量儀連接到 傳感器的至少 一個測量電極和參考電極上。
沉積在測量電極上的試劑至少包括酶，而且也可混合酶的輔因子 和介質，例如二茂鐵衍生物或鋨絡合物，以促進電子在酶和測量電極 之間轉移。
根據(jù)第一實施例，用于使測量電極達到至少兩個不同溫度的器件 由加熱蛇管形成，加熱蛇管埋入在傳感器襯底中且布置在測量電^L 下，但與測量電極電絕緣。蛇管連接到測量儀上，該測量儀發(fā)送例如 可預先校準的脈沖電流，允許施加至少兩個確定的溫度。通過對所述 溫度下接收的信號進行數(shù)學處理，就使得能夠將要測量的生物化合物 固有的信號與來自另 一生物化合物的信號區(qū)分開。
才艮據(jù)第二實施例，蛇管結合在測量儀中，使得引入傳感器時，測
6量區(qū)域位于所述蛇管上方。
為了在測量電極上得到至少.兩個不同的溫度，在不脫離本發(fā)明范 圍的情況下，本領域技術人員可設計另一種裝置，該裝置允許使所述 測量電4及達到兩個不同的溫度，例如通過對所述電極進行恒溫限制。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將出現(xiàn)在參考附圖以非限制性示例進 行描述的以下具體實施方式
中，該具體實施方式
用來通過以葡萄糖脫 氬酶作為酶測量血液中的葡萄糖，其中
圖1為在本發(fā)明范圍內使用的實驗裝置的示意圖； 圖2為在測量電極處的反應簡圖； 圖3為用于傳感器的溫度校準圖4和圖5分別示出了不同溫度下作為葡萄糖或麥芽糖濃度的函 數(shù)的傳感器響應；
圖6和圖7示出了不同溫度下有/無麥芽糖的情況下作為葡萄糖不 同濃度的函數(shù)的傳感器響應；
圖8和圖9分別示出了對于葡萄糖和麥芽糖的作為溫度的函數(shù)的 傳感器響應，其分別涉及表，見最大強度(l'intensit6 maximum apparente) 和表觀米氏常數(shù)(la constante de Michaelis apparente);
圖10為顯示有/無麥芽糖存在的情況下對于葡萄糖測量的實際測 量值和理論值之間相互關系的曲線圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的用于測量葡萄糖含量的便攜裝置；
圖12為根據(jù)第一實施例的傳感器的放大圖13為根據(jù)第二實施例的傳感器的放大圖；以及
圖14是根據(jù)又一個實施例的測量儀的一部分的放大圖。
具體實施例方式
圖1示意性地示出了用于實施在下文說明的測量和實驗的實驗室
7裝置。該系統(tǒng)包括具有穩(wěn)壓器3的電子控制箱1,該電子控制箱1分
別通過連接器5a、連接器7a和連接器9a連接到Ag/AgCI/3M KCI制 成的參考電極5、測量電極7和反電極9上，測量電極7和反電極9 均由鉑制成。控制箱1包括第二穩(wěn)壓器13,穩(wěn)壓器13的接線電纜lla、 接線電纜lib能對埋入在支承測量電極7的陶瓷襯底17內的加熱蛇 管11施加脈沖或非脈沖電流，該測量電極7由直徑為2毫米的柏盤 形成，該鉑盤在所述襯底17的表面上通過絲網印刷而形成。
加熱裝置11的設計使測量電極7的表面溫度能夠在不顯著地影 響介質溫度的情況下變化，優(yōu)選地是不影響布置在電極上的待測樣本 滴的團塊(masse)的溫度。因此該團塊最好保持在環(huán)境溫度。因而，在 加熱區(qū)域發(fā)生的樣本和電極之間的電化學反應最好是局部化的且是 快速的。
穩(wěn)壓器13與關聯(lián)控制裝置協(xié)作，能根據(jù)脈沖電流的特征施加幾 個不同的溫度，典型地兩個至八個溫度，這將在下面得到說明。該裝 置還包括實施測量的可^L顯示器15和/或用于電子裝置(未示出)的連 接裝置19，其例如比較先前測量而以曲線圖的形式顯示測量結果。
該系統(tǒng)也包括槽21，其以更大比例示出且包括電解液23,能夠 容納測量或測試樣本。在實施的所有測量中，該電解液具有如下組成 20 mM的HEPES、 20mM的KC1和lmM的CaCl2。
應當注意的是，根據(jù)一種變型，可省略槽21，在此情況下，樣本 由直接放置在測量電極上的滴形成，如下文所述。
在該示例中，測量電極7覆蓋有試劑，該試劑包括PQQ-sGDH(以 吡咯喹啉作為輔因子的葡萄糖脫氬酶)和鋨絡合物，該鋨絡合物用作介 質以促進電子在酶和電極之間的轉移。
優(yōu)選地是，該試劑按照已知的技術以陽極電極沉積水凝膠(EDP) 的形式沉積。任何其它沉積方法也是適當?shù)?，例如沉積能通過簡單的 吸取得到。
圖2為待分析的介質含有葡萄糖和麥芽糖時測量電極表面的反應
8筒圖，該介質是葡萄糖的二聚物(dim6re)。在該圖中，Dm表示葡萄糖 的擴散系數(shù)、D。表示麥芽糖的擴散系數(shù)、D亂表示葡萄糖酸內酯的擴 散系數(shù)，而DDL是麥芽糖酸內酯(maltolactone)的擴散系數(shù)。Ketm是在 酶活性部位的吡咯并喹啉醌(PQQ)和聚合物結構的鋨絡合物之間的電
子轉移系數(shù)，KETn是鋨聚合物中的電子躍遷系數(shù)，KETE表示測量電極
7表面的Os^電化氧化成Os^+的系數(shù)。
當然，本領域技術人員可設想使用能與帶有其它輔因子的葡萄糖 脫氬酶以及其它介質合作的其它酶來獲得表示期望化學反應的電流，
圖2特別示出了其中一個反應。典型地，介質可選自鋨化合物、釕化 合物或二茂鐵化合物。
圖3對應于溫度校準圖，即從該圖可了解傳感器的測量電極的表 面溫度，該溫度為已知時間段其間施加的確定電流的函數(shù)。通過 DC/AC或類似轉換器將脈沖模式的確定電壓應用到加熱蛇管上，從而 在本圖中使用已知的電勢校準方法。
根據(jù)傳感器的結構特征，將電極之間的電壓設置在0和750mV 之間，優(yōu)選地是300mV，就能通過電流分析實現(xiàn)電化學測量。
圖3的實例示出了當應用8個脈沖(每個脈沖持續(xù)40秒)時在測量 電極表面所測得的遞增溫度的測量結果，同時，用電流計持續(xù)地記錄 浸入到包含0.15mM葡萄糖的緩沖介質的傳感器的電流。能夠看到， 這使得溫度在2(TC和50.5。C之間變化。如插圖所示，應用強度與特定 溫度相關。最后，將限制到低于5(TC的溫度，因為已經觀察到，超過 這個值時PQQ輔因子的活性就會下降。實際上，在下面的實驗中， 使用了每30秒7個脈沖的電流，以施加在圖4至圖7中以括號內的 符號表示的7個不同的溫度相應于環(huán)境溫度的23。C(口)、 28°C(〇)、 30。C(A)、 34°C(+)、 38°C(C>)、 43。C(星形)、48°C(*)。
圖4和圖5以曲線形式分別示出了對于葡萄糖和麥芽糖的曲線 組，該曲線組示出了在前面提及的對于不同溫度下增加待分析化合物 的濃度時傳感器的響應。能夠看到，在同樣的濃度下，對于葡萄糖傳威緊口A點由,、)希,曰月爲t匕乂十千去芽4條的富.
現(xiàn)在參考圖6和圖7,單獨增加葡萄糖的濃度重復先前的實驗(見 圖6)，然后在存在0.04mM的麥芽糖的情況下進行實驗(見圖7)。能夠 看到，在存在麥芽糖的情況下，傳感器響應升高較低，這可通過葡萄 糖氧化的竟爭性抑制得到解釋，因為酶的活化部位被麥芽糖阻斷。
由于自動加熱實驗方案和溫度變化極好地僅局限于傳感器表面
上的一個狹小區(qū)域，這就實際上不改變電解液的溫度。在不同溫度條 件下，得到了對于待分析化合物的不同濃度的許多測量結果。
如圖8和圖9所示，已通過表觀最大電流/r(圖8)和表觀米氏常 數(shù)AT(圖9)保持對傳感器的性能的估計，其中，葡萄糖以(*)表示， 麥芽糖以(A)表示。在圖8中，能夠觀察到，對于兩種化合物，作為 溫度增加的函數(shù)的近似線性增加的/:,但是，葡萄糖的信號略微高 一些。
相反地，圖9在尺;7上清楚地示出了作為溫度增加的函數(shù)的葡萄 糖和麥芽糖的明顯不同的特性。能夠看到，葡萄糖的尺7值實際上未 受溫度增加的影響。相反地，麥芽糖的《7值非常清楚地示出了為溫 度函數(shù)的近似線性增加，這就使葡萄糖信號與麥芽糖信號區(qū)分開來。
假定為溫度函數(shù)的葡萄糖和麥芽糖的《J的不同變化，即是它們 不同動力學的函數(shù)，就有可能經由多線性回歸通過數(shù)學處理區(qū)分信號 并對信號進行分離。在該多線性回歸中，使用不同溫度下的電流強度 作為輸入值，以葡萄糖濃度作為輸出值。
在葡萄糖/麥芽糖混合物所獲結果的基礎上完成實驗，該葡萄糖/ 麥芽糖混合物具有的葡萄糖濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1 mM; 麥芽糖的濃度分別為0mM(國)和0.04mM。)。在圖IO所示的曲線中， 橫坐標表示被測葡萄糖的含量，縱坐標表示計算葡萄糖含量。能夠看 到，無論麥芽糖存在與否，在確定葡萄糖含量時具有高精度。根據(jù)本 發(fā)明提議的高性能模型一方面由確定系數(shù)112=0.968的高值，另一方面 由均方才艮誤差值RMSE=0.0018mM的<氐<直和平均相對誤差MRE=8.8%
10確認。
現(xiàn)在參考圖11至圖14,示出了根據(jù)不同實施例的便攜型裝置， 該裝置具有圖l所描述系統(tǒng)的所有功能，但是這種系統(tǒng)的微型化使糖 尿病患者無論去哪里都可以攜帶。
該裝置包括測量儀2,該測量儀用來將電化學傳感器10容納在殼 體6上制成的槽4中，該殼體由兩個外殼6a和6b形成。殼體6包括 用來顯示測量結果的顯示屏8。該殼體6包含電源或連接到電源和電 子電路上(未示出)，電源或電路同時允許在傳感器10的電極之間施加 確定電壓，并為測量電極的加熱電路供電，參考圖12將更會對此有 更清楚的了解。圖12示出了根據(jù)本發(fā)明第一實施例的以更大比例表 示的傳感器12。
在第一實施例中，傳感器12由襯底14制成，該襯底14例如由 多層燒結陶覺或類似材料制造，以已知方式，傳感器還包括顯露測量 電極16a和參考電極16b的測量孔16和顯示連接區(qū)域18a、 18b的連 接孔18。電極16a、 16b和連接區(qū)域18a、 18b通過埋入陶資材料中的 導電跡線20a、 20b連接。例如，測量電極涂有具有上述組成的試劑， 也就是說，試劑包含PQQ-sGDH和鋨絡合物中的至少一種，其通過水 凝膠(EDP)或類似物的陽極電極沉積涂覆在所述電極上。
傳感器還包括由鉑制成的加熱蛇管24，該加熱蛇管布置在測量電 極16a的下面且埋在陶乾材料中。蛇管24通過導體26a、 26b連接到 接觸區(qū)域28a、 28b上，在這個示例中，接觸區(qū)域28a、 28b位于連接 區(qū)域18a、 18b的下面。顯然，加熱電路與對電極供電的電路完全電絕 緣。剛才描述過的傳感器12僅具有兩個電極，但是很清楚它也可包 括反電極。
圖13對應于第二實施例，該實施例本質上不同于先前的實施例 之處在于襯底14由塑料制造。在所示的實例中，通過堆疊PET舌狀 物形式的三個襯底14a、 14b、 14c而得到襯底14，這使得可輕易地經 受住不超過5(TC的溫度。在該示例中，下襯底14a支^^加熱蛇管24和通向接觸區(qū)域28a、 28b的導體26a、 26b,在此實例中接觸區(qū)域28a、 28b布置在傳感器的一個邊緣上。中間襯底14b的頂面支承電極16a、 16b、導電跡線20a、 20b和連接區(qū)域18a、 18b，連接區(qū)域18a、 18b 從而與加熱蛇管24完全地電絕緣。上襯底包括測量孔16和連接孔18。
在已經描述過的兩個實施例中，加熱蛇管24結合在傳感器中。 根據(jù)圖14所示的一個變型，蛇管14與布置在板4a內的傳感器隔離， 該板4a伸出測量儀2的槽4 ，以便測量電極16a位于所述蛇管24下， 同時使傳感器接合在槽4中。在這些條件下，當用葡萄糖氧化酶測量 葡萄糖含量時，傳感器可具有完整的普通形狀(在圖11中以參考數(shù)字 IO表示)。
在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，本領域技術人員可根據(jù)已經描述 的實例進行更改，例如，通過使測量電極和加熱蛇管之間的襯底的絕 緣部分變薄，或通過使用另 一裝置以在測量電極上施加至少兩個不同 的溫度。
權利要求
1.一種用于通過電化學測量來測量體液樣本中的確定生物化合物的系統(tǒng)，該電化學測量使用所述生物化合物的特異酶，但該特異酶能干擾其它生物化合物，其特征在于，所述系統(tǒng)包括-電化學傳感器，其包括支承集流器的襯底，該集流器用來將測量儀連接到至少一個測量電極和參考電極上，所述測量電極涂敷有至少包括該特異酶的試劑；-用來使所述測量電極達到至少兩個確定溫度的器件；-測量儀，其用來容納連接到電源上的該傳感器，并包括電子電路和使用由所述傳感器供給的信號的裝置；該電子電路用來控制所述器件以使測量電極達到至少兩個不同的溫度，并在所述電極之間施加可變或不可變的電流強度，或可變或不可變的電壓；該裝置配置用來將所述確定生物化合物特有的信號與其它生物化合物引起的干擾信號區(qū)分開來。
2. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，用來使測量 電極達到至少兩個確定溫度的器件由埋入所述傳感器厚度內并在所 述測量電極下方延伸的加熱蛇管形成。
3. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，當所述傳感 器插入到所述測量儀時，該加熱器件由結合在所述測量儀中并置于所 述測量電極下的加熱蛇管形成。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述加 熱器件由脈沖電流或非脈沖電流供電，以使所述測量電極達到至少兩 個不同的溫度。
5. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述襯底由 陶瓷或類似材料制成。
6. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述襯底由 經受不超過5CTC的溫度的塑料制成。
7. 根據(jù)權利要求2所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述襯底由如下部件形成-絕緣的下襯底，其支承所述加熱器件和到所述測量儀的所述加熱器件的連接器件；-絕緣的中間襯底，其表面上支承所述電極和到所述測量儀的所 述電極的連接器件；-絕緣的上村底，其留有對于所述電極和所述連接區(qū)域敞開的孔。
8. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述試劑通 過陽極電極沉積而沉積在傳感器的所述測量電極上。
9. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述特異酶 進入到由輔因子結合起來的所述試劑的組成中。
10. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述試劑還 包括介質，該介質促進電子在所述特異酶和所述測量電極之間的傳 遞。
11. 根據(jù)權利要求1所述的用于測量血液葡萄糖含量的測量系統(tǒng)， 其特征在于，所述特異酶為葡萄糖脫氫酶。
12. 根據(jù)權利要求11所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，葡萄糖脫 氫酶存在于以吡咯喹啉醌作為輔因子的試劑(PQQ-sGDH)中。
13. 根據(jù)權利要求10和11所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，進入 試劑的組成的介質從二茂鐵衍生物和鋨絡合物之中選出。
14. 根據(jù)權利要求ll、 12和13中任一項所述的測量系統(tǒng)，其特 征在于，所述測量系統(tǒng)能將葡萄糖特有的信號與來自其它糖類、寡糖、 例如麥芽糖的寡多糖的干擾信號區(qū)分開來。
15. 根椐權利要求i所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，根據(jù)所迷傳 感器的構造特征，將0至500mv的電壓施加在所述電極之間，通過電 流計實施所述電化學測量。
16. 根據(jù)權利要求1所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述測量儀 還包括用來顯示葡萄糖含量的顯示器。
17. 根據(jù)權利要求16所述的測量系統(tǒng)，其特征在于，所述測量 儀還包括存儲器，該存儲器能與先前的測量結果比較而顯示正在進行 的測量的結果，該顯示例如能以曲線圖的形式進行。
18. —種用來通過電化學測量來測量體液中確定生物化合物的方法，該電化學測量使用所述生物化合物的特異酶，但該特異酶能干擾其它生物化合物，該方法包括如下步驟-將所述體液中的樣品沉積在電化學傳感器的測量區(qū)域上，該傳 感器包括參考電極和涂敷有至少包括該特異酶的試劑的測量電極；-將所述傳感器引入連接到電源的測量儀，該測量儀包括電子電 路和器件；該電子電路在所述電極之間施加可變或不可變的電流強 度，或可變或不可變的電壓；該器件用來使所述測量電極達到至少兩 個不同的溫度；-將在至少兩個不同溫度下獲得的信號提交到使用裝置上，以將開來。 、 — 、，
19. 根據(jù)權利要求18所述的方法，其特征在于，用來使測量電 極達到兩個不同溫度的所述器件由結合在所述傳感器或所述測量儀 中的加熱蛇管形成。
20. 根據(jù)權利要求18所述的方法，其特征在于，所述使用裝置 包括用來通過多線性回歸處理信號的程序。
21. —種用來使用所述生物化合物的特異酶測量血液中的確定生 物化合物的電化學傳感器，該傳感器包括至少一個參考電極和涂敷有 至少包括所述特異酶的試劑的測量電極，其特征在于所述傳感器還 包括置于所述測量電極下并與所述測量電極電絕緣的加熱蛇管；在所 述測量區(qū)域中，至少兩個不同的溫度使得能夠將確定生物化合物特有 的信號與來自其它生物化合物的干擾信號區(qū)分開來。
全文摘要
系統(tǒng)包括用于容納電化學傳感器的電子測量儀，該電化學傳感器包括襯底，該襯底支承用來將測量電極和參考電極連接到測量儀上的集流器。該測量電極涂敷有試劑，該試劑至少包括要進行分析的體液中的生物化合物的特異酶；該測量儀可施加至少兩個不同的溫度，以使得能夠將來自待分析化合物的信號與來自其它生物化合物的干擾信號區(qū)分開來。還公開了以葡萄糖脫氫酶作為酶測量血液中的葡萄糖而不干擾麥芽糖的應用。
文檔編號G01N33/487GK101517094SQ200780035323
公開日2009年8月26日 申請日期2007年7月10日 優(yōu)先權日2006年7月25日
發(fā)明者S·博格曼, W·舒曼 申請人:斯沃奇集團研究及開發(fā)有限公司