專利名稱：測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群的方法。所述方法適于濃縮和定量測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血中；用于平行地測定多種細胞結(jié)合分析物，并且因此可在胎母輸血情形或嵌合體情形中(beichimaren)用于在輸血之后測定混合場及應(yīng)(Mischfeldreaktionen)中的細胞群；用于檢測以低濃度存在于細胞上的分析物；和/或用于測定血細胞比容值。本發(fā)明還提供適于所述方法的裝置。
背景技術(shù)：
FMH
在妊娠過程中，血液有規(guī)律地從胎兒循環(huán)流入母體循環(huán)(胎母輸血(fetomaternal hemorrhage), FMH)。根據(jù)文獻資料記載，這一輸血量為0.1ml至大約30ml;在大約96_98%的妊娠中，F(xiàn)MH小于2ml，但是在0.3%的妊娠中，超過30ml。估計母體血液量為5000ml，這就意味著有0.002%至0.6%抗原性質(zhì)與母體不同的另一種紅細胞進入母體循環(huán)，如果由此產(chǎn)生免疫反應(yīng)則可能變成臨床問題。最為顯著的例子是一個D型母親懷有一個D+型胎兒。如果母親產(chǎn)生抗-D抗體，那么再次懷上D+型胎兒時可能產(chǎn)生致命的結(jié)果(新生兒溶血病，HDN)。由于這一原因，在這些情況下需對母親實施"抗-D預(yù)防"。盡管如此，人們對能夠由此估計FMH量仍有極大的興趣，因為，例如在FMH〉30ml時，標準的抗-D療法無法提供足夠的保護。因此，在美國，標準免疫包括250至300嗎的抗-D(IgG)，這足以為自身母體循環(huán)接收15ml的胎兒紅細胞也就是25至30mi的胎兒血液的妊娠婦女提供足夠保護。歐洲的標準劑量通常低些，即100至150叱抗-D(IgG)，這能為FMH為8 —10ml的妊娠婦女提供保護。每個實施抗-D預(yù)防的機構(gòu)都必須設(shè)法檢測超過標準的FMH(Issitt PD禾a AnsteeDJ.在應(yīng)用血型血清(Applied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥馬利科學(xué)出版社(Montgomery Scientific Publication),第41章新生兒溶血病(HemoIyticdisease of the newborn)， 第1045-1050頁)。傳統(tǒng)的血型一血清分析，例如用于檢測D抗原的分析，根本不能檢測如上所述如此小量的異質(zhì)細胞群。
因此，曾開發(fā)了許多專門用于檢測FMH的不同的分析方法。這些分析方法檢測胎兒紅細胞，血型抗原D或血紅蛋白F。
FMH檢測測試 FMH檢測限
Rosette測試 大約10ml
這一測試方法基于對紅細胞聚集的檢測及顯微鑒定。胎兒D抗原檢測。(Jones A.R.,SliverS. Blood 1958; 13: 763
SebringE.S.，Polesky H.F,Transfusion 1982; 22: 468Sebring E.S.in: Hemolytic disease of the newborn.Arlington,VA; Am Assoc Blood Banks 1984: 87.)
Kleihauer-Betke測試 大約5ml
這一測試方法基于胎兒紅細胞對酸性洗提的較高的抵抗力及對其進行的顯微鑒定。胎兒細胞檢測。
(KleihauerE,，BraunH,，BetkeK.Klein Wschr 1957; 35: 637.)
流式細胞儀 大約1ml
D抗原或血紅蛋白F用相應(yīng)的抗體標記，用發(fā)熒光的第二抗體檢測。胎兒D抗原/血紅蛋白檢測。
Garratty G.,ArndtP.Transfusion 1995; 35: 157.David B,H.Clin Lab Med 2001; 21: 829.
抗體消耗測試 大約15ml
這一測試方法是一種基于常規(guī)血型測定方法(凝膠技術(shù))的FMH測定法。它是基于胎兒紅細胞對抗-D試劑的消耗。反應(yīng)上清液用D-陽性測試細胞孵育，然后象在凝膠測試中那樣離心。胎兒D抗原檢測。
Lapierre Y.,Rigal D,，Adam J.,Josef D.,Meyer F.,Greber S.,Drot C. Transfusion1990; 30: 109.David M.,Stelzer A.,Wittmann G.，Dudenhausen J.W.,Salama A.Z.GeburtshilfeNeonatol 1999; 203: 241.
這些方法用于檢測紅細胞抗原、胎兒紅細胞或者胎兒紅細胞的特征性血紅蛋白F。所有這些方法的共同點在于這些方法需要大量試劑，且費時費事。而且，這些方法都需要諸多儀器來實施，其中的一些儀器是非常昂貴的(例如顯微鏡，離心分離機，流式細胞儀)。這些方法的共同點還在于需要經(jīng)特別培訓(xùn)的人員才能實施。此外，Kleihauer-Betke法的缺點還在于鑒定結(jié)果非常主觀。
弱D(Dweak〗特征表達，特別是DEL
供血者和接受者血清的另一個挑戰(zhàn)是D抗原的微弱或部分表達(不完全表達)。依賴于單克隆抗體和間接Coomb試驗確認，即使是對這樣弱的血型進行的鑒定曾一度被視為是可靠的，直到發(fā)現(xiàn)DEL表型，該表型具有特別弱的D型表達("常規(guī)"D:每紅細胞10 — 30000抗原(RBC);弱D型400至1000; DEL:
<30)。
在血清學(xué)上，DEL僅能通過使用可多達10個清洗步驟的極復(fù)雜的吸收一洗提測試間接測定。輸血需要考慮DEL，因為一個接受DEL型庫存血的D型受血者會形成抗-D抗體。這一問題如此嚴重以致于目前專家間就是否應(yīng)當(dāng)對所有(血清學(xué))D型供血者的D型狀況用分子學(xué)方法進行確認存在爭論。
Wagner T.，K6rm6czi G.F.,Buchta C.，Vadon M.,Lanzer G.，Mayr W.R"LeglerT丄Transfusion 2005; 45: 520
混合場反應(yīng)，異體輸血，血液回輸
輸血應(yīng)當(dāng)總是在相同的或相容的ABO型和相容的D型之間進行。在某些情況下，例如對于輸過血的患者(vortransfimdierten)，臨床要求輸就其它抗原而言亦為同型的同型血。然而，尚不可能做到所有血型全同的同型血(自體輸血除外)。這常會導(dǎo)致這樣的輸血后現(xiàn)象，即，患者被診斷為對某些血型特征即有陽性又有陰性。在診斷中，"混合場反應(yīng)"是存在的，就像采用高靈敏度方法-特別是能夠在檢測過程中空間分離單個紅細胞和紅細胞凝聚體的那些方法-也能看到的那樣。例如，將300ml(67。/。)的紅細胞濃縮液輸給一個K-陰性的人(血型kk)，他的血液循環(huán)量為5000ml(45。/c)的血細胞比容)，所述濃縮液為K+(血型Kk或KK)，于是，此人大約8n/。(公稱值)的紅細胞是K+， 92。/。的紅細胞是K-。
這種情況也可用例如現(xiàn)在被廣泛使用的DiaMed和Bio-Rad的凝膠系統(tǒng)檢測到。這一技術(shù)包括離心被檢者的紅細胞稀釋懸浮液，令其通過一凝膠-層析柱，該層析柱底部封閉，并且可包含不同特性的抗體試劑。未凝集游離細胞能夠通過凝膠并在反應(yīng)容器的底部形成沉淀物，而紅細胞凝集體則被截留在凝膠上或凝膠內(nèi)(Lapierre Y., Rigal D., Adam J., Josef D., Meyer F.， Greber S,, Drot C.,Transfusion 1990; 30: 109)。如果前述示例中的紅細胞通過一個包含抗-K的柱離心，與前文所述混合場檢測結(jié)果相對應(yīng)，大多數(shù)細胞將沉淀在底部，因為它們是K-， 一小部分會被截留在凝膠上和凝膠內(nèi)(K+)。如果將上述紅細胞上樣在MDmulticard(Medion診斷)上，同樣可檢測到一條位于抗-K處的弱帶。然而，與凝膠技術(shù)相比，W02005005991所述的方法不能同時顯現(xiàn)反應(yīng)陰性的細胞群。
背景技術(shù)：
中所有其它方法，就檢測混合場反應(yīng)而言，不具有任何可與凝膠系統(tǒng)和MDmulticard相比的特性。
異體輸血和血液回輸
Nelson M., Popp H., Sharpe K.， Ashenden M.Haematologica 2003; 88: 1284
輸血后的混合場反應(yīng)
IssittPD禾Q AnsteeDJ.在應(yīng)用血型血清(A卯lied Blood Group Serology)[第4版]，蒙哥馬利科學(xué)出版社(Montgomery Scientific Publication),第41章新生J L溶血疾病(Hemolytic disease of the newborn)，第1045-1050頁。
血細胞比容
紅細胞的血細胞比容或總?cè)萘恐讣t細胞的容量和全血的總?cè)萘康谋嚷剩园俜直缺磉_。紅細胞與全血的容量比率受到紅細胞的容量和數(shù)量影響。
血細胞比容 一 般可通過離心裝有血液的毛細管來測定(StrumiaM,M.,Samble A.B.,Hart E.D.,1954; Am J Clin Path; 24: 1016)，離心后就可得出沉淀細胞成分與總?cè)萘康谋嚷?。血細胞比容的測定也可以借助于電阻抗方法。該方法中，電解溶液中陽極和陰極之間的電流受到引入其中的不同傳導(dǎo)率的顆粒的影響。電流的變化以脈沖記錄。因此，根據(jù)特定的脈沖幅度可推斷出 特定的顆粒尺寸，由此推定特定的血清學(xué)細胞類型，例如紅細胞。細胞數(shù)量和
血細胞比容可通過單位測定量的脈沖量累加推導(dǎo)得出(Sysmex KX-21N Operator's, 1999)。
因此，本發(fā)明的一個目標是提供簡單、經(jīng)濟、可自動化的方法，該方法能 夠快速檢定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血或嵌合體情形中。本 發(fā)明還意在提供用于檢測以低濃度存在于細胞上的分析物，用于測定血細胞比 容值和/或用于平行測定混合場反應(yīng)中的多種細胞結(jié)合分析物的簡單、快速、靈 敏的方法。與現(xiàn)有方法相比，這些方法具有更高的靈敏度。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種用于測定液體樣品中一種或多種細胞結(jié)合分析物的方
法，由此實現(xiàn)了上述目標，實施所述方法使用的裝置包括 -至少一個進樣區(qū)域(5)，用于施加液體樣品，
-適于各種細胞成分透過的多孔膜(2)，膜上包括至少一個指示劑區(qū)域，所
述指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物相互作用并含有至少一種針對細胞結(jié)合 分析物的結(jié)合元素，以及
一至少一個位于膜上的吸收區(qū)域(3)，該區(qū)在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液
體，
其中，所述至少一個指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間，并且， 所述方法被用于濃縮和定量測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血 或嵌合體情形中，用于檢測以低濃度存在于細胞上的分析物，用于測定血細胞 比容值和/或用于平行測定混合場反應(yīng)中的多種細胞結(jié)合分析物。
在一個優(yōu)選實施方式中，該方法包括以下步驟
a) 將包含細胞的液體樣品加至進樣區(qū)域；
b) 施加稀釋劑；
C)進行測試；并且
d)通過檢測細胞是否結(jié)合于指示劑區(qū)域來評定測試。 根據(jù)這一優(yōu)選實施方式的方法優(yōu)選用于濃縮和用于定量測定異質(zhì)性細胞 群中的小細胞群，例如在胎母輸血中，或者用于檢測以低濃度存在于細胞上的分析物。
所述實施方式在下文亦稱"孵育法"。
DE10330982A1和WO2005/005986已經(jīng)披露了 一種橫向流動裝置 (Lateral-Fluss-Vorrichtung)。本文中，后者被用于同時測定紅細胞抗原和血清成 分例如抗體。在這一已出版公開中披露的橫向流動裝置適用于本發(fā)明的方法。 本文在此納入DE10330982A1和WO2005/005986的全部內(nèi)容。
在本發(fā)明中，所述橫向流動裝置被用作流式細胞計，為的是能夠最大限度 濃縮少量存在于異質(zhì)性細胞混合物中的另一種(或第二)細胞群。所述濃縮優(yōu)選 大量地進行，這可以通過使用最大總量的血液來實施，還可以利用容量增加引 起的孵育效應(yīng)。所述橫向流動裝置的讀數(shù)域(Ablesefeld)與流動式細胞計中的流 量池(Durch-flusszelle)類似。通過洗清高濃度存在的細胞類型和在讀數(shù)窗固定低 濃度細胞類型保持低背景。
結(jié)果，即使是一個低比例群也有足夠大的數(shù)量通過抗體帶，從而使這一群 得以顯現(xiàn)。這是通過洗去大量顯著高比例群來實現(xiàn)的。
用于測定FMH的本方法高度靈敏，并且能夠檢出母體血液中大約0.1%至 0.2。/。的胎兒D+細胞。
根據(jù)另一個優(yōu)選實施例，方法中使用的裝置包括至少兩個在流動方向上依 次前后設(shè)置的指示劑區(qū)域，設(shè)置的方式使得樣品液體在每一條流動路徑上通過 超過一個指示劑區(qū)域，其中，所述指示劑區(qū)域含有針對細胞結(jié)合分析物的結(jié)合 劑，并且該方法包括
a) 將包含紅細胞的血液樣品加至進樣區(qū)域；
b) 將稀釋劑施加至進樣區(qū)域；
c) 進行所述測試；
d) 通過檢測紅細胞是否被結(jié)合至指示劑區(qū)域來評定測試； 其中，所述方法被用于在胎母輸血(FMH)中平行測定多種細胞結(jié)合分析物，
用于混合場反應(yīng)中的測定，用于檢測異體輸血或者用于測定血細胞比容值。 該實施例在下文中亦稱"兩-指示劑區(qū)域法"。
根據(jù)本發(fā)明的另一項內(nèi)容，本發(fā)明提供一種用于直接測定液體樣品中的細 胞結(jié)合分析物的裝置，該裝置包括.-
一用于施加液體樣品的進樣區(qū)域(5)，一適于被細胞成分透過的多孔膜，該膜上具有至少兩個指示劑區(qū)域，所述 指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物相互作用并且含有針對細胞結(jié)合分析物的 結(jié)合劑，以及
-至少一個在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液體的吸收區(qū)域(3)，
其中，所述指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間，其中所述至少 兩個指示劑區(qū)域沿流動方向依次前后設(shè)置，設(shè)置方式使得樣品液體能夠在每一 條流動路徑上通過至少一個指示劑區(qū)域。
本發(fā)明的橫向流動裝置不同于WO2005/005991的，根據(jù)本發(fā)明，在此所 述的優(yōu)選實施方式中，兩個指示劑區(qū)域依次前后設(shè)置，為的是能夠使得混合場 (Mischfelder)中的兩個細胞群能同時顯現(xiàn)。用于檢測混合場的靈敏度高于此前 檢測混合場的僅有的常規(guī)方法，即凝膠技術(shù)(DiaMed)。本發(fā)明方法的靈敏度能 夠檢出約占總?cè)?-2%的小細胞群。
該方法和裝置能夠高靈敏度地檢出混合場凝集。這一用途也是出人意料 的，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員原本會假定第一指示劑區(qū)域在分析物-結(jié)合細胞與之 結(jié)合之后會成為結(jié)合至第二指示劑區(qū)域的擴散障礙。
所述橫向流動裝置能夠作為一個流動細胞計用于血細胞比容測定，該裝置 具有至少兩個被依次前后設(shè)置的指示位置，目的是能夠檢測血液樣品中的紅細 胞濃度。所述的濃度越高，線上越多點給出正信號。該方法可通過設(shè)置多條流 動路徑而被擴展為一個2D陣列，例如，每次，5個抗-紅細胞點并列，每條流 動路徑的紅細胞濃度依次遞增或遞減。
橫向流動裝置的使用還能夠平行地測定血型和血細胞比容。


圖1所示為適于實施前述孵育法的裝置的圖解。附圖標記具有下述含義
(l)支持層；(2)多孔膜；(3)吸收區(qū)域；(4)密封部件；(5)進樣區(qū)域；(6)指示劑區(qū)域。
圖2所示為用于檢測混合-場反應(yīng)的可能的應(yīng)用模式。 圖3所示為適于檢測混合-場反應(yīng)的圖2所示應(yīng)用模式在膜上的可能尺寸。 圖4A和4B所示為借助本發(fā)明所述兩-指示劑區(qū)域法進行的混和-場反應(yīng)檢 領(lǐng)ij。圖4A顯示含有100%A CC D.ee和0% B CC D.EE的血液樣品的檢查結(jié)果。圖4B顯示含有98%A CC D.ee和2% B CC D.EE的血液樣品的檢査結(jié)果。 圖5所示為借助于根據(jù)本發(fā)明的方法進行的血細胞比容值測定。
發(fā)明詳述 定義
在本發(fā)明中，下述術(shù)語應(yīng)當(dāng)按照下面闡述的內(nèi)容理解。
術(shù)語"異質(zhì)性細胞群中的小細胞群"是指相比存在于該異質(zhì)性細胞群中的一 個或多個其它細胞群以低數(shù)量或低濃度存在的細胞群?；诋愘|(zhì)性細胞群全 體，小細胞群的濃度在此小于50%，優(yōu)選小于10%，特別優(yōu)選小于1%，尤其 是小于0.1%。
術(shù)語"異體輸血(homologe transfusion)，，是指必要特征相容的輸血；這樣輸血 后核査的特征越多，越可能通過混合場測出進行過輸血。測出的概率可通過選 擇被測特征來盡可能提高。這種測定可用于認定通過異體輸血進行的非法血液回輸。
術(shù)語"自體輸血"是指自捐血液，捐獻者和接受者在所有特征上相同。 術(shù)語"混合場"因為除自體輸血外的輸血不可能做到在所有抗原上的全部
同型，于是在血清學(xué)上產(chǎn)生了儲存血液與接受者血液之間存在抗原差異的混合場。
術(shù)語"DEL":這是一個表達特別弱的D特征，小于30抗原/細胞。不能通 過市售血清學(xué)方法測出。
術(shù)語"血細胞比容"是指總血量中的紅細胞比例[。/。]。下面的平均值為測得
值男性44-52%;女性37-47%。
術(shù)語"嵌合體(chimare)"指這樣的有機體，其細胞代表兩個或更多的合子。 橫向流動裝置的準備
從原則上說，在DE10330982A1和WO2005/005986中所述的各種橫向流 動裝置都是合適的。
根據(jù)本發(fā)明使用的裝置的膜是多孔膜。膜材料優(yōu)選的示例是硝化纖維(例如 Sartorius 生產(chǎn)的 UniSart ， Millipore ， Whatman 生產(chǎn)白勺 HiFlow ， WhatmanSchleicher—Schuell生產(chǎn)的AE99和FF85/100 )，聚乙烯(Porex公司生產(chǎn)的Lateral Flo)或者尼龍(CUNO生產(chǎn)的Novylon)。膜以具有非常大孔徑的為 佳，因為膜的高多孔性有益于向多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)的滲透，特別是待測樣品中的細胞 成分(例如紅細胞)向多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)的滲透。特別好的是使用吸收性膜。然而，本 發(fā)明的裝置并不局限于這些特性。優(yōu)選各種具有高毛細流動速度(毛細作用速度) 的膜，毛細流動速度是指染料溶液在給定的膜上移行40mm所需的時間。特別 優(yōu)選的是毛細流動速度<100的膜。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，在多孔膜上，沿流動方向，在該裝置的 進樣區(qū)域的下游設(shè)置密封部件。使用兩維或三維密封部件，將它們放置于多孔 膜上，用于形成與多孔膜的其余表面隔開的樣品進樣區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，密封 部件的主要作用是作為液體屏障和使得樣品液體和測試試劑以制導(dǎo)方式分散 到多孔膜內(nèi)。而且，根據(jù)本發(fā)明，密封部件將樣品進樣區(qū)域封阻隔開，從而防 止不希望發(fā)生的液體進入橫向流動裝置的其它區(qū)域。
在優(yōu)選的實施方式中，密封部件是網(wǎng)狀或槽狀和/或漏斗形狀的。密封部件 由用于制造密封部件的材料切割而成。如果是漏斗和槽狀，密封部件具有內(nèi)部 開口，該開口的性狀不限，優(yōu)選圓型，正方形或矩形，在漏斗形密封部件中， 該開口向密封部件的底部(膜接觸一側(cè))逐漸收窄。
密封部件的優(yōu)選材料是不吸水的材料(疏水材料)。在一特定實施方式中， 材料的一面涂有一層膠粘膜，例如壓敏性或自粘性丙烯酸酯膠粘劑。這樣，密 封部件能夠直接粘合到多孔膜的表面?；蛘?，密封部件可連接至例如結(jié)合 (verklebt sein)在橫向流動罩殼上(Lateral-Fluss-Gehause)，在這一實施方式中，
橫向流動罩殼將密封部件壓在多孔膜的表面上，從而實現(xiàn)密封部件的功能。
制造二維密封部件的優(yōu)選材料是各種形式的膠粘帶或膠粘膜(例如 Beiersdorf AG生產(chǎn)的Tesa， Adhesives Research生產(chǎn)的ARcare 7815)。
用于制造三維密封部件的優(yōu)選材料是具有不同的材料厚度的柔性、閉孔彈 性體材料或柔性硅酮材料(sUikon-matedaUen)，優(yōu)選厚度為3-5mm(例如Pitzner 生產(chǎn)的閉孔橡膠EPDM140， Castan生產(chǎn)的硅橡膠或密實橡膠(Vollkautschuk)， Castan硬度40°或以下)。
在另一個優(yōu)選實施方式中，在膜上設(shè)置多個連成一體的多個密封部件，多 個密封部件連成的整體具有例如20個單獨的腔體(槽狀)。
由于本發(fā)明的這一設(shè)計，本發(fā)明的裝置能夠接收包含細胞的液體樣品，例如全血，所述細胞不會在處理過程中被濾掉。密閉部件還允許將大量的樣品施 加至多孔膜(進樣區(qū)域)而不至于溢出。密封部件因此支持多孔膜的吸收屬性的 功用。密封部件還確保樣品的定向流動。然而，不論有或沒有密封部件，本發(fā) 明的裝置都能夠有效工作。
至于本發(fā)明裝置的吸收區(qū)域(吸收墊)，優(yōu)選機械性能穩(wěn)定的材料，優(yōu)選水
吸收容量為20-30g/100cm2的那些(例如Whatman Schleicher和Schull生產(chǎn)的 WickingPaper， 300型)。本發(fā)明裝置的吸收墊和橫向流動膜之間的接觸是通過 下壓并疊合在多孔膜上實現(xiàn)的。吸收墊在膜上的精確定位是通過將吸收墊粘結(jié) (Verkleben)到支持橫向流動膜的支持層(背襯片)上來實現(xiàn)。
在另一個實施方式中，本發(fā)明裝置的部件安裝在背襯片或支持層上，目的 在于機械加固。然而，不論有或沒有支持層，本發(fā)明裝置都能夠有效運作。優(yōu) 選這樣的材料機械性能穩(wěn)定，不吸水，厚度以10(^m或以上為佳，并在一面 或兩面覆蓋有粘結(jié)膜(例如壓敏性或自粘性丙烯酸酯膠粘劑，例如， 0.005"Polyester W/GL-187，G & L)。多孔膜和吸收墊被固定在支持層。在采用 雙面膠粘支持層的情形中，第二膠粘面用于將該多層組件固定到其它表面上， 例如固定到橫向流動罩殼內(nèi)的表明上。
在另一個實施方式中，本發(fā)明裝置，有或沒有支持層，在裝配了本發(fā)明的 各部件后，被整合到一罩殼內(nèi)，于是，所述膜部件相互擠壓，所述罩殼支持密 封部件功能。然而，不論有或沒有所述罩殼，本發(fā)明的裝置都能良好的發(fā)揮其 功能。
孵育法
優(yōu)選實施方式之一中，本發(fā)明方法被用于測定胎母輸血(FMH)，其中，樣 品包含紅細胞，指示劑區(qū)域優(yōu)選包含抗體或抗體混合物。
含細胞的樣品可以是各種樣品。細胞優(yōu)選血液中的細胞，例如紅細胞，白 血球或血小板。優(yōu)選細胞是紅細胞的樣品。本發(fā)明中，包含紅細胞的樣品可以 選自全血或者血細胞濃縮液。本發(fā)明中，血液細胞濃縮液可以是紅細胞沉淀物 的重懸液。
優(yōu)選使用超過200pl的全血，這顯著超過了橫向流動裝置的常規(guī)細胞添加 量。由于進入系統(tǒng)的細胞數(shù)量大，通過流式細胞計的小細胞群的總數(shù)也增加，由此提高了檢測能力。
稀釋劑原則上可以是現(xiàn)有技術(shù)中的各種已知稀釋劑。稀釋劑優(yōu)選生理鹽
水，稀釋劑l，稀釋劑2(DiaMed),稀釋劑F(Medion Diagnostics)。稀釋劑用于稀 釋細胞，優(yōu)選用lOOpl至200M1。與以前公開的方法不同，總懸浮液中稀釋劑 的比例以低于使用的全血或紅細胞沉淀物中的稀釋劑的比例為佳，從而形成較 高的細胞濃度和較低的紅細胞流量。
測試的進行包括孵育足夠長的時間段，為的是讓所加的樣品從進樣區(qū)域經(jīng) 過指示劑區(qū)域遷移至吸收區(qū)域。
該測試可以通過肉眼評定，也可以用自動化方法進行評定。
本發(fā)明裝置的指示劑區(qū)域被設(shè)置于膜上并且包含捕獲或者結(jié)合樣品中待 測分析物的結(jié)合元素。分析物和結(jié)合元素之間的結(jié)合反應(yīng)在指示劑區(qū)域檢測。 較好的是，附著于多孔膜上的結(jié)合元素是抗體或抗體片斷或[外源]凝集素。較 好的是，指示劑區(qū)域在各種情形下含有針對待研究分析物的結(jié)合元素。指示劑 區(qū)域可以是點狀，線狀和/或楔狀。優(yōu)選沿流動方向的線狀設(shè)計。較好的是，小 細胞群用楔狀設(shè)計的指示劑區(qū)域檢測，這能夠獲得更高的識別率。
根據(jù)另一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明方法被用于測定以低濃度存在于細胞上 的分析物，優(yōu)選血型DEL，指示劑區(qū)域優(yōu)選包含抗體或抗體混合物。
本發(fā)明方法還可以在步驟a)之前包括通過離心血液樣品來預(yù)備紅細胞沉 淀物的步驟.，通過菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶或無花果蛋白酶溶液孵育沉淀物的 步驟以及將經(jīng)酶處理的沉淀物重懸的步驟(參見AABB技術(shù)手冊(Technical Manual),第14版，2003， 693ff)。孵育時間為5分鐘至60分鐘的。所使用的 酶通常是可購得的。酶預(yù)處理的優(yōu)點之一是D抗體更多地曝露出來與紅細胞相 互作用，由此提高了檢測的靈敏度。
本發(fā)明方法(不同的孵育方法)中，優(yōu)選的是，在步驟a)中施加大約lOOpl 至500|al的血液樣品或紅細胞沉淀物重懸液。這顯著超過了通常向橫向流動裝 置施加的顆粒數(shù)量及容量。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的是，在步驟b)中施加100W至20(^l的稀釋劑。 擴大的液體總量減慢了流速，由此形成分析物在指示劑區(qū)域的準-孵育。
如果指示劑區(qū)域包含抗-D抗體，則后者以選自RUM-1， LDM-3， ESD1M， TH-28, MS-201, MS-26和LDM-1為佳，這些抗體能夠從Millpore或AlbaBioscoence購得。但是，也可以使用抗體混合物或經(jīng)親合純化的多克隆抗血清。 兩-指示劑區(qū)域法和裝置
以上關(guān)于孵育法的說明也適用于兩-指示劑區(qū)域法，除了下面特別說明的不 同之處。
在一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明方法被用于測定血細胞比容值，所述指示劑 區(qū)域優(yōu)選包括抗體或抗體混合物，紅細胞結(jié)合于指示劑區(qū)域的總體模式在步驟 d)中測定。
在本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方式中，所述裝置包括至少兩個設(shè)置在一 條流動路徑上的指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域包含針對同一細胞結(jié)合分析物的 相同結(jié)合元素。
本發(fā)明的這一實施方式包括超過一個這樣的指示劑區(qū)域系列。指示劑區(qū)域 可以是點狀，線狀和/或楔狀。優(yōu)選在流動方向上的線狀設(shè)計。有利的是，小細 胞群采用楔狀設(shè)計的指示劑區(qū)域檢測，這能夠獲得超高的識別率。兩指示劑區(qū) 域法能夠在顯示主細胞群之外也顯示小細胞群，小細胞群顯示在針對小細胞群
的指示劑區(qū)域內(nèi)相對靠近進樣區(qū)域的位置。特別優(yōu)選的設(shè)置是各種情形下， 一條流動路徑上的兩個指示劑區(qū)域中的近端指示劑區(qū)域是流動方向上的線狀， 而遠端指示劑區(qū)域為點狀。
在一優(yōu)選實施方式中，膜上有至少兩個流動路徑，所述流動路徑在各種情 形下有至少兩個含不同結(jié)合元素的指示劑區(qū)域。
在本方法的另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明裝置具有至少兩個流動路徑， 所述流動路徑包括至少兩個指示劑區(qū)域，結(jié)合元素的濃度從相對于進樣區(qū)域而 言的近端至遠端遞增或遞減。由此可以定量檢測樣品中的相比總?cè)萘康募t細胞 的數(shù)量，由此可估算出血細胞比容。
此外，優(yōu)選這樣的裝置其具有至少兩個流動路徑，所述流動路徑包含至 少兩個指示劑區(qū)域，并且，第一條流動路徑上抗體點的濃度不同于第二條流動 路徑中抗體點的濃度。
另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法被用于平行地測定混合-場反應(yīng)中的 多種細胞結(jié)合分析物，或者用于檢測異體輸血，其中，所用裝置包含至少兩個 指示劑區(qū)域，它們在流動方向上依次前后設(shè)置，設(shè)置方式使得樣品液體在每一條流動路徑中能夠通過超過一個指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域包含針對不同細 胞結(jié)合分析物的結(jié)合元素。
較好的是，細胞結(jié)合分析物選自血型抗原，例如A， B， AB， D， C， c， E， e， Cw， K， k, Jka和/或Jkb。特別優(yōu)選的是能夠通過反應(yīng)對A， B; D+， D-; K， k; C， c和/或E， e測定的血型抗原。
針對分析物的結(jié)合元素，如前文在孵育法中所述，優(yōu)選抗體，抗體片斷， [外源]凝集素，[外源]凝集素片斷，或其它們的混合物。
本發(fā)明還提供用于實施上述兩-指示劑區(qū)域法的裝置。
實施例
實施例1:混合場反應(yīng)的測定
測試條的準備每次采用兩種不同抗體為一系列。
測試條由中心進樣區(qū)域，兩個指示劑區(qū)域和兩個吸收區(qū)域構(gòu)成。將Millpore HiFlow Plus 075型膜被切割成19x75mm(寬/長；y/x)的條狀，用于10-對的設(shè)計 方案，將它們粘在支持層(背襯片，例如用G&L的產(chǎn)品)上。采用中心進樣區(qū)域 (雙向流動)，用分送器(例如AD3200(Biodot))將不同血型特異性單克隆抗體溶 液按照0.3^x1的線和O.lpl的點以平行排列的形式加到進樣區(qū)域兩側(cè)的指示劑區(qū) 域，每次采用兩種不同的抗體為一系列， 一種呈點狀，另一種呈線形，它們是。
抗一A —克隆Birma-l(Millipore， TL);抗一B-克隆LB-2(Millpore， TN); 抗-D—克隆 LDM3(Alba Bioscience, Z780100);抗一C一克隆MS — 24(Millipore， KN);抗一E—克隆MS — 80 + MS — 258(Millpore， TA);抗一e 克隆MS — 21+MS — 63(Millpore， FFMU, KL + KQ);抗一K—克隆MS — 56， (Millpore， KO);抗一k(Albalone， Alba Bioscience)?？挂籖BC(Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC,Rockland， 209—4139)。
點狀加樣的抗體位于x二22mm的位置(距離進樣區(qū)域的左邊)或者在x= 53mm的位置(距離進樣區(qū)域的右邊)，從距離膜上緣3.5mm處開始，各點之間 沿y軸以3mm為間隔。線狀加樣的抗體位于x二25 — 28mm的位置(距離進樣區(qū) 域的左邊)或者在x^37 — 50mm的位置(距離進樣區(qū)域的右邊)，從距離膜上緣 3.5mm處開始，各線之間沿y軸以3mm為間隔?？贵w以15mM PH 7.5含10% (v/V)甲醇的鉀磷酸鹽緩沖液如下稀釋抗一A抗體1: 3，抗一B抗體h 2，抗一AB抗體1: 4，抗一D抗體1: 4，抗一RBC抗體1: 3。其它抗體溶液 都不預(yù)先稀釋，而是與甲醇混合至10%(V/V)。
在分注抗體之后，膜在40。C中干燥20分鐘，然后儲存在恒濕環(huán)境中直至 進行測試。將一個19x20mm的吸收墊(Whatman Schleicher &Schiil, 300)粘貼 至遠離進樣區(qū)域的兩端，與膜交疊3mm。在y二32.5—37.5mm處粘貼槽形密封 部件(Pitzner生產(chǎn)的閉孔橡膠EPDM140)，由此將進樣區(qū)域在膜的整個寬度上與 其余膜隔開。
近段(線)遠端(點)
在進樣區(qū)域的左邊
抗一A —抗一B
抗一B —抗一A
抗一D —抗一RBC
抗一RBC —抗一D
抗一K —抗一k
在進樣區(qū)域的右邊
抗一c —抗一c
抗一c —抗一c
抗一E —抗一c
抗一e —抗一E
抗一k —抗一K
圖2和3圖示適用于檢測混合-場反應(yīng)的橫向流動裝置設(shè)計。合適的尺寸能 夠在圖3中找到，但是這些應(yīng)理解為僅僅是舉例。
全血測試混合
5(^1的抗凝全血或新鮮采集自然血液(Nativblut)與200W稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將100^1的所得懸浮液加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡 (trockengelaufen ist)"，施加300^1稀釋劑F。
紅細胞沉淀物測試混合50pl紅細胞沉淀物(抗凝全血以1500rpm離心5分鐘；紅細胞沉淀物位于 下部紅色相)與400^1稀釋劑F混合。將100^1所得懸浮液施加至進樣區(qū)域。當(dāng) 進樣區(qū)域"走盡"時，施加300(il稀釋劑F。
結(jié)果可在大約5分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
圖4A和4B圖示借助本發(fā)明兩一指示劑區(qū)域法進行的混合一場反應(yīng)檢測。 圖4A顯示含100^AccD.ee和0% B CC D.EE.的血液樣品的檢查結(jié)果。圖4B 顯示含98%A cc D.ee和2% B CC D.EE.的血液樣品的檢查結(jié)果。
圖4B顯示，在主細胞群之上，檢測到了小細胞群，呈淺楔形(半月)
實施例2:異體輸血(血液回輸) 測試條比照實施例1的方式準備。
近段(線) 遠端(點)
抗一D — 抗一RBC
抗一RBC — 抗—D
抗一K — 抗一k
抗一k — 抗一K
抗一C — 抗一c
抗一E — 抗一e
抗一e — 抗一E
抗一Jka — 抗一Jkb
抗一Jkb — 抗一Jka
抗一Cw — 抗一RBC
抗一RBC — 抗一Cw
全血測試混合
50^1的抗凝血劑全血或新鮮釆集的自然血液與200^x1稀釋劑F混合。將 100jal所得懸浮液加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"時，加30(Hil稀釋劑F。
紅細胞沉淀物測試混合50|al紅細胞沉淀物與400|_d稀釋劑F混合。將100^1所得懸浮液加至進樣 區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"時，加300^1稀釋劑F。
結(jié)果可在大約5分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
實施例3:胎母輸血檢測(FMH)
測試條以比照實施例1的方式準備，僅加抗一D。優(yōu)選施加單獨的各抗體 而不是抗體混合物。優(yōu)選抗體RUM-l(Millpore); LDM-3(Alba Bioscience); 或者ESDlM(AlbaBioscience); TH-28; MS-201; MS隱26(Millpore); LDM-l(Alba Bioscience) o
測試混合a):
400W的抗凝全血或新鮮采集的自然血液與lOOpl稀釋劑F混合。將300^1 所得懸浮液加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"時，加400nl稀釋劑F。
結(jié)果可在大約20分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形("半月"一小細胞群)直至 深紅色帶或深紅色點(主細胞群)。
測試混合b):類似于a)，但是血液經(jīng)過Bromdase預(yù)處理。 3ml的抗凝全血或新鮮采集的自然血液以1500rpm離心3分鐘。此后，將 600^1的細胞沉淀物轉(zhuǎn)移至另一個容器中與600^1購得的菠蘿蛋白酶溶液(例如 來自Medion Diagnostics的Bromelase)混合，在37。C下孵育15分鐘。然后用 0.9X的NaCl清洗3次。
為進行實際測試，以這種方式經(jīng)菠蘿蛋白酶處理并經(jīng)清洗的100pl紅細胞 沉淀物與200)id AB —血漿和200(J稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將300|al
所得懸浮液加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"，加45(^1稀釋劑F。
結(jié)果可在大約15分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)。
實施例4:以極低的抗原密度存在的紅細胞特征的檢測DEL測試條以與實施例3中相似的方式準備
優(yōu)選施加單個的各抗體而不是混合物。優(yōu)選抗體RUM-l(Millpore); LDM-3(Alba Bioscience)。
測試混合a):
400|il的抗凝全血或新鮮采集的自然血液與lOOpl稀釋劑F混合。將300(il 所得懸浮液被加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"時，加400nl稀釋劑F。
結(jié)果可在大約20分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)來指示
測試混合b):類似于a)，但是血液經(jīng)過Bromelase預(yù)處理。 3ml的抗凝全血或新鮮采集的自然血液以1500rpm離心3分鐘。然后，將 600^1的細胞沉淀物轉(zhuǎn)移至另一個容器中與600^1購得的菠蘿蛋白酶混合(例如 來自Medion Diagnostics的Bromelase)，在37。C下孵育15分鐘。然后用0.9% 的NaCl清洗3次。
為了進行實際測試，以這種方式經(jīng)菠蘿蛋白酶處理并清洗的lOO(il紅細胞 沉淀物與200pl AB —血漿和200)ul稀釋劑F(Medion Diagnostics)混合。將300^1 所得懸浮液被加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"，加45(^1稀釋劑F。
結(jié)果可在大約15分鐘后讀出，顯示為微紅色楔形(小細胞群)直至深紅色帶 (主細胞群)。
實施例5:血細胞比容
測試條的準備如實施例1 ，每種情形下系列應(yīng)用至少2(優(yōu)選5)等份(Aliqote) 的相同抗體(抗一RBC)。變化l:抗體濃度從近端至遠端遞減；變化2:每種情 況下有2(5)個抗體點的多條流動路徑，抗體濃度按流動路徑排列遞減；變化3: 變化1和變化2的結(jié)合；變化4:近端抗體加樣成線形，其后為多個點。
變化2的應(yīng)用舉例
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗一RBC 抗一RBC(c = "1.0")
流動路徑1抗一RBC抗—RBC抗一RBC 抗—RBC 抗—RBC(c ="0.8")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗—RBC 抗—RBC(c = "0.6")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗一RBC 抗一RBC(c二 "0.4")
流動路徑1抗一RBC抗一RBC抗一RBC 抗—RBC 抗一RBC(c二 "0.2")
全血測試混合
5(^1的抗凝全血或新鮮采集自然血液與200|_il稀釋劑F混合。將100^1所 得懸浮液加至進樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"，加30C^1稀釋劑F。 結(jié)果可在大約5分鐘后讀出(cf.圖5)。
紅細胞沉淀物測試混合
5(^1的紅細胞沉淀物與400|il稀釋劑F混合。將lOOpl所得懸浮液加至進 樣區(qū)域。當(dāng)進樣區(qū)域"走盡"，加300(il稀釋劑F。 結(jié)果可在大約5分鐘后讀出(cf.圖5)。
權(quán)利要求
1.一種用于測定液體樣品中的一種或多種細胞結(jié)合分析物的方法，所述方法使用包括以下部件的裝置進行-至少一個用于施加液體樣品的進樣區(qū)域(5)，-適于細胞成分透過的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一個指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物相互作用并且包含至少一個針對細胞結(jié)合分析物的結(jié)合元素，以及-至少一個位于膜上的吸收區(qū)域(3)，在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液體，其中，所述至少一個指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間，所述方法用于在例如母嬰輸血或嵌合體等情形中濃縮和定量測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群，用于檢測以低濃度存在于細胞上的分析物，用于測定血細胞比容值和/或用于測定混合-場反應(yīng)中的細胞結(jié)合分析物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括以下步驟a) 將包含細胞的樣品加至進樣區(qū)域；b) 施加稀釋劑； C)進行測試；d)通過測定細胞是否結(jié)合于指示劑區(qū)域來評定測試。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述方法用于測定胎母輸血(FMH)，其中， 樣品包含紅細胞，指示劑區(qū)域以包含抗體或抗體混合物為佳。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述方法用于測定以低濃度存在于細胞 上的分析物，優(yōu)選弱D血型，特別是DEL，其中指示劑區(qū)域以包含抗體或抗 體混合物為佳。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一項所述的方法，進一步包括，在步驟a)之前， 通過離心血液樣品制備紅細胞沉淀物；用菠蘿蛋白酶，木瓜蛋白酶或無花果蛋 白酶孵育沉淀物和重懸經(jīng)酶處理的沉淀物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2 — 5中任一項所述的方法，在步驟a)中加大約100(il至 500|al的血液樣品或重懸的紅細胞沉淀物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2 — 6中任一項所述的方法，其中，步驟b)中加大約lOO)il 至200^1的稀釋劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2 — 6中任一項所述的方法，其中，抗一D抗體選自RUM-1 ， LDM-3, ESD1M， TH-28， MS匿201， MS — 26和LDM-1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述裝置包括至少兩個在流動方 向上依次前后設(shè)置的指示劑區(qū)域，設(shè)置的方式使得樣品液體在每一條流動路徑 上通過超過一個指示劑區(qū)域，其中，指示劑區(qū)域包含針對細胞結(jié)合分析物的結(jié)合元素，并且所述方法包括a) 將包含紅細胞的血液樣品加至進樣區(qū)域；b) 將稀釋劑加至進樣區(qū)域； C) 進行測試；d) 通過測定紅細胞是否結(jié)合于指示劑區(qū)域來評定測試； 其中，所述方法用于在胎母輸血(FMH)情形中平行測定多種細胞結(jié)合分析 物，用于混合場反應(yīng)中的測定，用于檢測異體輸血或者用于測定血細胞比容值。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法用于測定血細胞比容值，其中， 所述指示劑區(qū)域以包括抗體或抗體混合物為佳，在步驟d)中測定紅細胞與指示劑區(qū)域的整體結(jié)合模式。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，所述裝置包括至少兩個設(shè)置在單條流動路徑中的指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域包含針對相同細胞結(jié)合分析物的相同 結(jié)合元素。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，所述裝置具有至少兩條流動路徑， 所述流動路徑包含至少兩個指示劑區(qū)域，并且結(jié)合元素的濃度從相對于進樣區(qū) 域的近端至遠端遞增或遞減。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，所述裝置具有至少兩條 流動路徑，所述流動路徑包含至少兩個指示劑區(qū)域，并且， 一條流動路徑中抗 體的濃度不同于另 一 條流動路徑中抗體的濃度。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法用于在混合一場反應(yīng)中平行測 定多種細胞結(jié)合分析物，或者用于檢測異體輸血，所述裝置包括至少兩個在流 動方向上依次前后設(shè)置的指示劑區(qū)域，設(shè)置的方式使得樣品液體在每一條流動 路徑中通過超過一個指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域包含針對細胞結(jié)合分析物的 結(jié)合元素。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法，所述細胞結(jié)合分析物選自血型抗原，所述血型抗原例如A， B， AB， D， C， c， E， e， Cw， K， k， Jka禾口/或Jkb。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，用反應(yīng)對A， B; D+， D—； K， k; C， c禾口/或E， e來測定血型抗原。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，其中，針對分析物的結(jié) 合元素選自抗體，抗體片段，[外源]凝集素，[外源]凝集素片段，或它們的混合 物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的方法，其中， 一張或多張膜(2) 以聚乙烯，硝化纖維或尼龍構(gòu)成的為佳。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法，其中，膜(2)上設(shè)置至少 一個位于進樣區(qū)域(5)下游和指示劑區(qū)域上游的密封部件(4)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，所述裝置的部件安裝于 支持層(l)上以進行機械加固。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項所述的方法，所述裝置的部件整合在 一個罩殼內(nèi)。
22. 以下定義的裝置用于測定胎母輸血或嵌合體，用于測定以低濃度存在 于細胞上的分析物，用于測定血細胞比容值和/或用于在液體樣品中在混合一場 反應(yīng)中平行測定多種細胞結(jié)合分析物的用途，所述裝置包括一至少一個用于施加液體樣品的進樣區(qū)域(5)，一適于細胞成分透過的多孔膜(2)，所述膜上具有至少一個指示劑區(qū)域， 所述指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物相互作用并且包含至少一個針對細胞 結(jié)合分析物的結(jié)合元素，以及一至少一個位于膜上的吸收區(qū)域(3)，在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液體， 其中，所述指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，所述裝置被用于測定FMH。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，所述裝置被用于測定以低濃度存在于 細胞上的分析物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，所述分析物是弱D血型，特別是DEL。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，所述裝置被用于測定血細胞比容值。
27. 用于直接測定液體樣品中的細胞結(jié)合分析物的裝置，包括一用于施加液體樣品的進樣區(qū)域(5)，一適于細胞成分透過的多孔膜，所述膜上具有至少兩個指示劑區(qū)域，所述 指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物相互作用并且包含針對細胞結(jié)合分析物的 結(jié)合元素，以及一至少一個吸收區(qū)域(3)，在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液體，所述指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間。 其中，所述至少兩個指示劑區(qū)域前后依次設(shè)置在流動方向上，設(shè)置的方式 使得樣品液體在每一條流動路徑中通過超過一個指示劑區(qū)域。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，所述細胞結(jié)合分析物選自血型抗原， 所述血型抗原例如A， B， AB， C， c， E， e， Cw， K， k， Jka和/或Jkb。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的裝置，其中，用反應(yīng)對A， B; D+， D—； K， k; C， c和/或E， e來測定血型抗原。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的裝置，所述膜包括至少兩條流動路徑，所述 流動路徑在每種情形下有至少兩個含不同結(jié)合元素的指示劑區(qū)域。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項所述的裝置，其中指示劑區(qū)域是點狀，線狀和/或楔狀的。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定液體樣品中的一種或多種細胞結(jié)合分析物的方法，實施所述方法使用的裝置包括至少一個用于施加液體樣品的進樣區(qū)域(5)；適于使得細胞組分滲透的多孔膜(2)，膜上具有至少一個指示劑區(qū)域，所述指示劑區(qū)域能夠與細胞結(jié)合分析物反應(yīng)并且包含至少一種針對細胞結(jié)合分析物的粘結(jié)劑；至少一個位于膜上的吸收區(qū)域(3)，在液體通過指示劑區(qū)域后吸收液體。所述至少一個指示劑區(qū)域位于進樣區(qū)域(5)和吸收區(qū)域(3)之間。本方法用于濃縮和定量測定異質(zhì)性細胞群中的小細胞群，例如在胎母輸血或嵌合體等情形中，檢測以低濃度存在于細胞上的分析物，測定血細胞比容值，和/或在混合—場反應(yīng)中平行測定多種細胞結(jié)合分析物。
文檔編號G01N33/558GK101606065SQ200780048573
公開日2009年12月16日 申請日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者I·阿比斯西爾, P·施溫特 申請人:麥迪奧診斷產(chǎn)品股份公司