專利名稱：：惡病質(zhì)的治療的制作方法惡病質(zhì)的治療本發(fā)明涉及惡病質(zhì)的治療。多數(shù)癌癥患者(約50%)都承受著自身去脂體重和脂肪組織的嚴(yán)重耗竭，人們已經(jīng)將這一現(xiàn)象與存活期的縮短關(guān)聯(lián)起來。當(dāng)喪失體重達(dá)30%時，可以導(dǎo)致死亡，超過20%的癌癥患者死因可以歸結(jié)于此類體重肆毛竭。這種癥候是名為癌癥惡病質(zhì)的復(fù)雜的代謝綜合征的一部分，在這種綜合征中，骨骼肌的蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的損失，但是內(nèi)臟例如肝臟和腎臟則相對不受影響，從而將該癥候與單純的饑餓區(qū)分開。雖然人們已經(jīng)將多種細(xì)胞因子與惡病質(zhì)中的蛋白質(zhì)耗竭相關(guān)聯(lián)，包括腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，但是，少有研究報道對退行性過程的直接作用。發(fā)明人已經(jīng)從惡病質(zhì)誘導(dǎo)性小鼠腫瘤中以及患有惡病質(zhì)的癌癥患者的尿中分離出一種能夠在正常小鼠中誘導(dǎo)體重喪失的腫瘤因子，所述因子可以特異性地耗竭非脂肪胴體量(Todorov，P.,Cariuk，P.,McDevitt，T.，Coles，B"Fearon,K.andTisdale，M.Characterizationofacancercachecticfactor.Nature,379:739-742，1996)。上述機體蛋白質(zhì)的喪失被解釋為骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)降解的增加和蛋白質(zhì)合成的下降所致。該物質(zhì)被發(fā)明人命名為蛋白水解誘導(dǎo)因子(PIF)，它還可以減少分離的腓腸肌中的蛋白降解。PIF對正常小鼠中器官重量的影響與惡病質(zhì)中所見的相似比目魚肌和腓腸肌的重量減少，心臟或腎臟的重量不變，而肝臟的重量增加。PIF是分子量24,000的石克酸化糖蛋白，含有N-連接和O-連接的寡糖鏈，所述寡糖鏈已被顯示對于生物學(xué)活性是關(guān)鍵性的(Todorov,P.T.，Deacon，M.andTisdale,M.J.Structuralanalysisofatumor-producedsulfatedglycoproteincapableofinitiatingmuscleproteindegradation.J.Biol.Chem.,272:12279-12288,1997)。通過它們與針對寡糖殘基的小鼠單克隆抗體的反應(yīng)性來鑒定，小鼠和人的PIF二者似乎含有相同的碳水化合物組件。此外，N-端殘基的氨基酸序列分析顯示了兩個物種之間的同源性(Cariuk，P.，Lorite，M丄，Todorov,RT.,Field,W.N.，Wigmore，S.J.andTisdale,M.J.Inductionofcachexiainmicebyaproductisolatedfromtheurineofcachecticcancerpatients.Br.J.Cancer,76:606-613，1997)，提示在小鼠和人中，癌癥惡病質(zhì)中的蛋白質(zhì)降解可能是相同的。發(fā)明人認(rèn)為，PIF要對骨骼肌產(chǎn)生分解作用，必須存在這樣的特異性細(xì)胞表面受體，所述受體能夠?qū)⑸飳W(xué)應(yīng)答傳遞給細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解機構(gòu)。本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供PIF的高親和力受體；提供通過與此類受體相互作用而有效調(diào)節(jié)惡病質(zhì)的作用劑；并提供鑒別此類試劑的篩選法。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種分離的蛋白水解誘導(dǎo)因子(PIF)受體，其特征是成熟的天然受體的N末端具有以下氨基酸序列n-DINGGGATLPQPLYQTAAVLTAGFA.(SEQIDNo.1)或n-DINGGGATLPQKLYLIPNVL.(SEQIDNo.13)及任一者的功能性衍生物。本發(fā)明系基于發(fā)明人探討PIF結(jié)合活性而進(jìn)行的研究。這些實驗在附隨的實施例中有更詳細(xì)的描述。簡而言之，通過與放射性標(biāo)記的PIF孵育，發(fā)明人已經(jīng)從小鼠肌管(myotubule)的可溶化(1°/。Triton)的膜中分離了所述受體。在能夠結(jié)合PIF的麥胚凝集素-瓊脂糖柱上純化了PIF-受體復(fù)合體，并用0.1MN-乙酰氨基葡萄糖洗脫游離的受體。利用15%SDS-PAGE和SephadexG-50排阻色譜發(fā)現(xiàn)，該受體是約分子量40,000的單體蛋白質(zhì)。發(fā)明人對PIF受體先后實施了胰蛋白酶消化和序列分析(Edman),證明了成熟受體的N-端始于SEQIDNO:l的氨基酸序列。該序列與來自滑膜液蛋白p205的一種肽片段具有同源性，并具有T-細(xì)胞刺激活性(J.Immnuol.;(1996)157;1773-80)。所獲得的另一個N-端序列被認(rèn)為是多態(tài)形式(SEQIDNo.13)。該序列與SEQIDNO:l具有5個氨基酸的差異，比SEQIDNO:l堿性更強。雖然不意在用機理來約束，但是，由于PIF是酸性的，可以認(rèn)為包含SEQIDNO:13的受體與它的相互作用更強。對包含SEQIDNO:l的受體的進(jìn)一步分析還鑒定了具有下列氨基酸序列的內(nèi)部肽片^a:TAINDTFLNADSNLSIGKXATVAGVSPAPANVSAAIGA…1IPATTAGE…...TYMSPDYAAATLAG...(SEQIDNo.2)(SEQIDNo.3)(SEQIDNo.4)(SEQIDNo.5)TELSNYVTAXGTxxGFVPLPT(SEQIDNo.6)(SEQIDNo.7)VTTAGSDS(SEQIDNo.8)(SEQIDNo.9)DVNGGLTTWDLIADSGR(SEQIDNo.10)發(fā)明人未能找出這些內(nèi)部肽與公共數(shù)據(jù)庫中其它蛋白質(zhì)的任何序列同源性。因此，根據(jù)本發(fā)明的PIF受體是一種新的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述根據(jù)發(fā)明的第一方面的PIF受體還包括至少一個SEQIDNO:2-10的內(nèi)部肽序列。更優(yōu)選地，該受體還包括至少兩個這樣的內(nèi)部肽，最優(yōu)選地，該受體包括所有這些內(nèi)部肽。PIF受體的優(yōu)選的功能衍生物包括這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可以包含突變(相對于野生型)但不改變受體的活性。根據(jù)本發(fā)明，受體的其它優(yōu)選的改變通常被稱為"保守的"或"安全的"取代。保守的氨基酸取代是使用具有足夠相似的化學(xué)性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行的取代，以保持受體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。很明顯，也可以在上面定義的序列中進(jìn)行插入和缺失，同時不改變其功能，特別是如果這樣的插入或缺失僅涉及少數(shù)氨基酸(例如少于十個，優(yōu)選少于五個)，并且不去除或移動對受體的功能構(gòu)象(fUnctionalconfirmation)有關(guān)鍵意義的氨基酸的話。文獻(xiàn)提供了許多模型，根據(jù)這些模型，可以在對天然蛋白質(zhì)的序列和/或結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計學(xué)和物理-化學(xué)研究的基礎(chǔ)上，實施保守氨基酸取代的選擇。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了編碼根據(jù)發(fā)明的第一個方面的受體的核酸。所述的核酸可以是DNA分子或RNA分子(例如mRNA)。優(yōu)選地，核酸具有基本如SEQIDNO:ll所示的核苷酸序列(基于最常見的密碼子用法的、人N-端片段SEQIDNO:l的預(yù)測序列)，或其衍生物或功能變體。DINGGGATLP(SEQIDNO.1)GACATCAACGGCGGCGGCGCCACCCTGCCC(SEQIDNO.11)QPLYQTAAVLCAGCCCCTGTACCAGACCGCCGCCGTGCTGTAGFAACCGCCGGCTTCGCC或者，所述核酸具有基本如SEQIDNO:14所示的核芬酸序列(基于最常見的密碼子用法的、人N-端片段SEQIDNO:13的預(yù)測序列)，或其衍生物或功能變體。DINGGGATLP(SEQIDNO.13)GACATCAACGGCGGCGGCGCCACCCTGCCC(SEQIDNO.14)GKLYLIPNVLCAGAAGCTGTACCTGATCCCCAACGTGCTG所述核酸可以包含在合適的載體中，形成重組載體。因此，根據(jù)發(fā)明的第三個方面，提供了包含根據(jù)第二個方面的核酸的載體。載體可以是例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w。此類重組載體對于用DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以生產(chǎn)根據(jù)發(fā)明的第一個方面的受體，是非常有用的。重組載體還可以包括其它的功能元件。例如，可以設(shè)計重組載體，使載體將在細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。在此情況下，重組載體中可能需要誘導(dǎo)DNA復(fù)制的元件?；蛘?，可以設(shè)計重組載體，使載體和核酸分子整合到細(xì)胞的基因組中。在此情況下，有利于靶向性整合(例如通過同源重組)的DNA序列是理想的。重組載體還可以具有編碼可在克隆過程中作為選擇性標(biāo)志物使用的基因的DNA。重組載體還可以包括啟動子或調(diào)控子，以便根據(jù)需要調(diào)控核酸的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本文中公開的氨基酸和核酸序列的功能衍生物，可以與本文中述及的任何序列的氨基酸/多肽/核酸序列具有至少30%、優(yōu)選40%、更優(yōu)選50%，甚至更優(yōu)選60%的同一性。與述及的任何序列具有大于優(yōu)選65%，更優(yōu)選75%，更優(yōu)選85%，乃至更優(yōu)選90%同一性的氨基酸/多肽/核酸序列也在考慮之內(nèi)。優(yōu)選地，所述氨基酸/多肽/核酸序列與述及的任何序列具有92%的同一性，甚至更優(yōu)選95%的同一性，乃至更優(yōu)選97%的同一性，進(jìn)一步更優(yōu)選98°/。的同一性，最優(yōu)選99°/。的同一性。不同的氨基酸/多肽/核酸序列之間的百分比同一性的計算可以如下進(jìn)行。首先，通過ClustalX程序產(chǎn)生多重比對(成對(pairwise)參數(shù)空位開》文(gapopening)10.0,空位延伸(gapextension)0.1,蛋白質(zhì)矩陣Gonnet250，DNA矩陣IUB;多重參數(shù)空位開放10.0,空位延伸0.2，延遲發(fā)散序歹'J(delaydivergentsequences)30%,DNA移位權(quán)重(DNAtransitionweight)0.5,負(fù)矩陣關(guān)閉(negativematrix)關(guān)閉，蛋白質(zhì)矩陣go皿etseries,DNA權(quán)重IUB;蛋白質(zhì)空位參數(shù)，殘基-特異性罰分開啟，親水性罰分開啟，親水性殘基GPSNDQERK,空位間隔距離(gapseparationdistance)4,末端空位間P鬲(endgapseparation)關(guān)閉)。然后，根據(jù)多重比對計算同一性為(N/T)*100,其中，N是兩條序列共享相同殘基的位置數(shù)，T是所比較的位置的總數(shù)?；蛘撸梢杂嬎?N/S)*100作為百分比同一性，其中S是被比較的序列中較短者的長度。氨基S交/多肽/核酸序列可以是從頭合成的，或者可以是天然的氨基酸/多肽/核酸序列，或其衍生物?；蛘?，基本相似的核苷酸序列可以由這樣的序列來編碼該序列在嚴(yán)格條件下，與本文中提及的任何核酸序列或其互補序列雜交。所謂嚴(yán)格條件，意指在45。C下，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，核苷酸與結(jié)合在濾膜上的DNA或RNA雜交，然后在約5-65。C用0.2xSSC/0.1%SDS至少洗滌一次。或者，基本相似的多肽與根據(jù)本發(fā)明的肽序列可以具有至少1個，j旦少于5個、10個、20個、50個或100個氨基酸的差異。由于密碼子的簡并性，很明顯可以在基本不影響其編碼的受體蛋白質(zhì)的序列的條件下，變化或改變?nèi)魏魏怂嵝蛄?，從而提供其功能變體。合適的核香酸變體具有這樣的序列，所述序列通過序列中編碼相同氨基酸的不同密碼子的取代而改變，從而產(chǎn)生沉默突變。其它合適的變體是這樣的變體，它們具有同源核苷酸序列，但所含的全部或部分序列被不同密碼子的取代所改變，這些密碼子編碼的氨基酸的側(cè)鏈與其所取代的氨基酸具有相似的生物物理學(xué)性質(zhì)，從而產(chǎn)生保守性改變。例如，小的非極性、疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸和曱硫氨酸。大的非極性、疏水性氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。蛋白質(zhì)或DNA序列的精確比對是復(fù)雜的過程，大量研究人員已對此進(jìn)行了深入的研究。具有特別重要意義的是在序列的最優(yōu)匹配和引入空位從而獲得所述匹配之間的平衡。在蛋白質(zhì)的情況下，匹配的評分方式也是重要的。PAM頭巨陣(例長口Dayhoff，M.等人，1978,Atlasofproteinsequenceandstructure,Natl.Biomed.Res.Found.)和BLOSUM矩陣家族對保守取代的性質(zhì)和可能性加以定量，用于多重比對算法中，但是，其它同等適用的矩陣也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。流行的多重算法程序ClustalW,及其windows版ClustalX(Thompson等人，1994,NucleicAcidsResearch,22,4673-4680;Thompson等人，1997，NucleicAcidsResearch,24,4876-4882)是產(chǎn)生蛋白質(zhì)和DNA的多重比對的有效方法。自動生成的算法往往需要人工比對，從而用到了熟練用戶對所研究的蛋白質(zhì)家族的知識，例如對關(guān)鍵保守位點的生物學(xué)知識。此類比對編輯程序之一是Align(http:〃www.gwdg.de/dhepper/download/;Hepperle，D,，2001:MulticolorSequenceAlignmentEditor.InstituteofFreshwaterEcologyandInlandFisheries,16775Stechlin,Germany),{旦是，其它程序例如JalView或Cinema也是合適的。蛋白質(zhì)之間百分比同一性的計算在Clustal產(chǎn)生多重比對的過程中發(fā)生。然而，如果比對經(jīng)過了人為改進(jìn)，或者為了對兩種序列加以謹(jǐn)慎的比較，則需要重新計算這些值。計算比對中成對蛋白質(zhì)序列的該值的程序包括PHYLIP系統(tǒng)發(fā)生軟件包中的PROTDIST(Felsenstein;http:Vevolution.gs.washington.edu/phylip.html)，4吏用"相4以性表才各"選項作為用于氨基酸取代(P)的模型。對于DNA/RNA,PHYLIP的DNADIST程序中存在相同的選項。發(fā)明要求保護(hù)的范圍也設(shè)想并包含了蛋白質(zhì)序列的其他修飾，即，在翻譯過程中或翻譯后發(fā)生的，例如，通過乙酰化、酰胺化、羧基化、磷酸化、蛋白水解切割或與配基的連接。應(yīng)當(dāng)理解，對根據(jù)發(fā)明的第一個方面的受體的知識使得發(fā)明人能夠開發(fā)調(diào)節(jié)受體活性的作用劑，從而在臨床上控制惡病質(zhì)。本發(fā)明還提供了此類作用劑的醫(yī)學(xué)用途。因此，根據(jù)發(fā)明^j第四個方面，提供了作為藥物使用的作用劑，所述作用劑降低根據(jù)發(fā)明的第一個方面的PIF受體的生物學(xué)活性。根據(jù)發(fā)明的第五個方面，提供了可降低PIF受體的生物學(xué)活性的作用劑在生產(chǎn)用于治療惡病質(zhì)的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供了治療惡病質(zhì)的方法，包括向需要此類治療的受試者施用治療有效量的作用劑，所述作用劑降低PIF受體的生物學(xué)活性。能夠降低PIF的生物學(xué)活性的作用劑可以通過多種方式實現(xiàn)其效果。例如，此類試劑可以(a)降低PIF受體的表達(dá)；(b)i曾力口受體脫每文(desensitization)或受體P爭解(breakdown);(c)降低PIF及其內(nèi)源性受體之間的相互作用；(d)降低PIF受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號；(e)與內(nèi)源性PIF受體竟?fàn)嶱IF結(jié)合；(f)與PIF受體結(jié)合從而阻斷PIF結(jié)合；或(g)結(jié)合PIF從而阻止其與受體相互作用。優(yōu)選地，作用劑與PIF的受體直接相互作用(即，上述(e)和(f)),或者通過抑制PIF受體的轉(zhuǎn)錄或翻譯起作用(上述(a))。應(yīng)當(dāng)理解，此類作用劑只能在考慮根據(jù)發(fā)明第一個方面的PIF受體的序列的知識的條件下來設(shè)計。根據(jù)本發(fā)明的第四、五或六個方面使用的優(yōu)選的作用劑是針對PIF受體的中和抗體。此類抗體是本發(fā)明的一個重要的特色。因此，根據(jù)發(fā)明的第七個方面，提供了針對根據(jù)發(fā)明的第一個方面的PIF受體的抗體，或其功能衍生物。所述抗體優(yōu)選地阻斷PIF受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。這可以通過阻斷受體上的配體結(jié)合位點，或者可以通過一些變構(gòu)手段，使所述受體與其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路脫離?？梢酝ㄟ^向動物注射抗原，以多克隆血清的形式生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)，用抗原接種動物(例如兔)來產(chǎn)生優(yōu)選的多克隆抗體?？乖梢允峭暾腜IF受體(糖基化或非糖基化的形式)或其片段。用于產(chǎn)生抗體的優(yōu)選的片段是具有SEQIDNO:1-10或13的肽。一種優(yōu)選的多克隆抗體是如實施例描述的針對SEQIDNO:l產(chǎn)生的肽。另一種優(yōu)選的多克隆抗體是針對SEQIDNO:13產(chǎn)生的肽?；蛘?，抗體可以是單克隆的，且在小鼠中產(chǎn)生?？梢允褂贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗體。用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的抗原可以是完整的PIF受體(糖基化或非糖基化的形式)或其片段。用于產(chǎn)生抗體的優(yōu)選片段是具有SEQIDNO:1-10或13的肽。優(yōu)選的抗體是y-免疫球蛋白(IgG)。應(yīng)當(dāng)理解，抗體的可變區(qū)決定抗體的特異性，因此，該區(qū)域在根據(jù)發(fā)明的該抗體的功能衍生物中應(yīng)該是保守的?？勺兘Y(jié)構(gòu)域之外的區(qū)域(C-結(jié)構(gòu)域)的序列是相對恒定的。可以理解，根據(jù)本發(fā)明的抗體的定性特征(characterizingfeature)是Vh和Vl結(jié)枸域。還可以理解，Ch和CL結(jié)構(gòu)域的確切性質(zhì)就整體而言對本發(fā)明不是關(guān)鍵的。實際上，根據(jù)發(fā)明的優(yōu)選的抗體可以具有非常不同的Ch和Cl結(jié)枸域。此外，如下文更詳細(xì)地討論的，優(yōu)選的抗體功能衍生物可以包括缺失C-結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域(例如scFv抗體)。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)發(fā)明的第七個方面的抗體或其功能衍生物對于阻止癌癥患者中的惡病質(zhì)發(fā)展，具有令人驚訝的功效?？贵w衍生物與單克隆抗體或多克隆混合物中的特定抗體可以具有75%的序列同一性，更優(yōu)選90%的序列同一性，更優(yōu)選的具有至少95%序列同一性。應(yīng)當(dāng)理解，大部分序列變化可能發(fā)生在框架區(qū)(FR),而抗體及其功能衍生物的CDR序列是最保守的。本發(fā)明第七個方面的多個優(yōu)選實施方案涉及同時具有可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的分子。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還涵蓋了這樣的抗體片段(例如scFv抗體)，所述抗體片,殳主要包4舌(compriseessentially)抗體的可變區(qū)，但沒有任何恒定區(qū)。已知在一種物種中產(chǎn)生的抗體，當(dāng)用于不同的物種時，有若千嚴(yán)重缺陷。例如，當(dāng)鼠抗體用于人時，往往具有較短的血清循環(huán)半衰期，并被受治患者識別為外源蛋白。這會導(dǎo)致出現(xiàn)不理想的人抗小鼠(或大鼠)抗體反應(yīng)。特別是當(dāng)需要頻繁施用抗體時，這是令人棘手的，因為這可能加快抗體的清除，阻斷抗體的治療效果，誘導(dǎo)超敏反應(yīng)。因此，在人體療法中使用的優(yōu)選抗體(如果是非人來源的)是人源化的?？梢酝ㄟ^雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，該技術(shù)通常涉及非人單抗的產(chǎn)生。該技術(shù)能夠生產(chǎn)具有幾乎任何特異性的嚙齒類單克隆抗體。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案可以使用此類技術(shù)來產(chǎn)生抗受體的單克隆抗體。雖然此類抗體是治療上有用的，但是可以理解，此類抗體不是用于人的理想治療劑(討論如上)。理想的是，治療應(yīng)用的優(yōu)先選擇應(yīng)該是人的單克隆抗體。然而，到目前為止，利用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)生產(chǎn)人單抗尚未十分成功。人源化的難題至少可以部分地通過工程化抗體來解決，所述抗體4吏用的是來自非人(例如嚙齒類)單抗的V區(qū)序列，和來自人抗體的C區(qū)(理想地，來自V區(qū)的FR)序列。獲得的"工程化"單抗，與其來源的嚙齒類單抗相比，在人體中的免疫原性更低，因此更適合臨床應(yīng)用。人源化抗體可以是嵌合的單克隆抗體，其中，利用重組DNA技術(shù)，將嚙齒類的免疫球蛋白恒定區(qū)替換為人抗體的恒定區(qū)。然后，可以將嵌合的H鏈和L鏈基因克隆到含有合適的調(diào)控元件的表達(dá)載體中，并導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生完全糖基化的抗體。通過為該過程選擇適合的人H鏈C區(qū)基因，可以預(yù)先確定抗體的生物學(xué)活性。與非人單克隆抗體相比，此類嵌合抗體的優(yōu)勢在于，可以調(diào)節(jié)所述嵌合抗體活化效應(yīng)子功能的能力，使其適應(yīng)特定的治療用途，并可降低其誘導(dǎo)的抗球蛋白反應(yīng)。此類嵌合分子是用于根據(jù)本發(fā)明治療惡病質(zhì)的優(yōu)選作用劑?？梢允褂肦T-PCR從優(yōu)選的單抗中分離Vh和Vl基因，克隆并用于構(gòu)建具有人結(jié)構(gòu)域的嵌合型單抗?？贵w的其他人源化作用可以涉及CDR移植或抗體再造(reshaping)。此類抗體是通過將嚙齒類單抗的重鏈CDR和輕鏈CDR(它們形成抗體的抗原結(jié)合位點)移植到人抗體的相應(yīng)框架區(qū)上產(chǎn)生的。其他用于本發(fā)明的第四、第五或第六方面的優(yōu)選作用劑是根據(jù)本發(fā)明的第一方面的可溶性PIF受體或它的功能衍生物或片段。PIF受體是原生質(zhì)膜的整合蛋白。本發(fā)明人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的可溶性受體可以引入耙組織中，并將竟?fàn)巸?nèi)源性PIF。由于可溶性受體沒有連接到胞內(nèi)信號通路，因此，PIF與可溶性受體的結(jié)合不會產(chǎn)生生理學(xué)效應(yīng)。因此，這樣的作用劑可以有效降低PIF受體介導(dǎo)的惡病質(zhì)。PIF受體的肽片段也可以作為根據(jù)本發(fā)明的作用劑使用。發(fā)明人認(rèn)為，受體上的PIF結(jié)合位點可能位于末端部分。因此，優(yōu)選地，作用劑是PIF受體的N末端片段，例如，作用劑可以是SEQIDNO:l(參見實施例3)或SEQIDNO:13的肽。根據(jù)本發(fā)明使用的肽作用劑衍生物包括在體內(nèi)增加作用劑半衰期的衍生物。能夠增加本發(fā)明多肽的半衰期的衍生物實例包括類肽衍生物、D-氨基酸衍生物和肽-類肽雜合體。根據(jù)本發(fā)明的諸蛋白質(zhì)和肽作用劑可以經(jīng)受多種方式的降解(例如在耙位點上的蛋白酶活性)。此類降解作用可以限制所述作用劑的生物利用度，從而限制它們的治療效用。存在多種已確立的技術(shù)可以用來設(shè)計和生產(chǎn)在生物學(xué)環(huán)境中具有更高穩(wěn)定性的肽衍生物。由于蛋白酶介導(dǎo)的降解耐受性增加，此類肽衍生物可以具有改善的生物利用度。優(yōu)選地，適合根據(jù)發(fā)明使用的衍生物比其來源的蛋白質(zhì)或肽更加耐受蛋白酶?？梢酝ㄟ^公知的蛋白質(zhì)降解分析來評估肽衍生物及其來源的蛋白質(zhì)或肽的蛋白酶耐受性。然后，可以比較肽衍生物和肽的蛋白酶耐受的相對值。根據(jù)本發(fā)明第一方面受體的結(jié)構(gòu)的相關(guān)知識或本發(fā)明第四、五或六方面的作用劑的結(jié)構(gòu)的相關(guān)知識，可以容易地設(shè)計出根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽的類肽(peptoid)衍生物?？梢岳每缮藤彽能浖鶕?jù)已確立的流程，來開發(fā)類肽衍生物。逆類肽(retropeptoid)(其中，所有的氨基酸都用類肽殘基按相反順序取代)也能夠模擬本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽。與肽或含有一個類肽殘基的類肽-肽雜合體相比，預(yù)期逆類肽以相反的方向結(jié)合配體-結(jié)合溝。結(jié)果，類肽殘基的側(cè)鏈能夠指向與原始肽側(cè)鏈相同的方向。本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的修飾形態(tài)的另一種實施方案包括D-氨基酸形態(tài)。在此情況下，氨基酸殘基的順序是顛倒的。利用D-氨基酸而非L-氨基(breakdown),減少書f生物需要施用的量，同時降〗氐它的施用頻率。另一類根據(jù)本發(fā)明的第四、五或六方面的優(yōu)選作用劑是可以結(jié)合內(nèi)源性PIF受體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的反義DNA或RNA分子。此類反義分子可降低PIF受體表達(dá)，從而降低PIF介導(dǎo)的活性。優(yōu)選的反義分子代表本發(fā)明的第二方面的核酸的反義。作為示例，抗受體的反義分子的序列可以是5，GGCGAAGCCGGCGGTCAGCACGGCGGCGGTCTGGTACAGGGGCTGGGGCAGGGTGGCGCCGCCGCCGTTGATGTC...3，(SEQIDNO.12)SEQIDNO:12的反向互補分子可以作為SEQIDNO:l的N末端25個氨基酸的反義。5'CAGCACGTTGGGGATCAGGTACAGCTTCTGGGGCAGGGTGGCGCCGCCGCCGTTGATGTC…3，(SEQIDNO.15)SEQIDNO:15的反向互補分子可以作為SEQIDNO:13的N末端25個氨基酸的反義。siRNA還可以作為發(fā)明的作用劑使用。SiRNA構(gòu)成部分的基因沉默才幾制，#皮稱為RNA干擾(RNAi)，其導(dǎo)致mRNA的序列特異性-皮壞，并為靶向敲除基因表達(dá)提供了可能。在基因沉默中使用的siRNA可以包括21個核苷酸長度的雙鏈RNA，一般在每個3，端有2個核苷酸的突出。或者，可以使用短發(fā)夾RNA(shRNA),它使用通過發(fā)夾環(huán)連4妄的正義和反義序列。siRNA和shRNA都可以化學(xué)合成再引入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時RNAi,或者由啟動子控制來內(nèi)源性表達(dá)以進(jìn)行基因表達(dá)的長期抑制。作為本發(fā)明的作用劑使用的siRNA分子可以包括10-50個核香酸的雙鏈RNA。優(yōu)選地，作為本發(fā)明的作用劑使用的siRNA包括18-30個核苷酸。更優(yōu)選地，作為本發(fā)明的作用劑使用的siRNA包括21-25個核苷酸。最優(yōu)選地，作為本發(fā)明的作用劑使用的siRNA包括21個核苷酸?？梢岳斫猓瑂iRNA需要以本發(fā)明的第二方面的序列為基礎(chǔ)。優(yōu)選的雙鏈siRNA分子包括來自SEQIDNO:ll的21-25個連續(xù)核苷酸的有義鏈，其結(jié)合于互補的反義鏈(例如，SEQIDNO:12中定義的)。或者，使用有義和反義序列的shRNA可用作本發(fā)明的作用劑。優(yōu)選地，可以作為本發(fā)明的作用劑使用的shRNA,所述shRNA使用有義和反義序列，包括20-100個核苷酸。更優(yōu)選地，可以作為本發(fā)明的作用劑4吏用的、使用有義和反義序列的shRNA，包括42個核苷酸，并可以包括來自SEQIDNO:ll的21個核苷酸，和與之相連的來自SEQIDNO:12的互補的21個核苷酸(或者相互連接的SEQIDNO:14和15)。與siRNA類似，可以理解shRNA需要以本發(fā)明的第二個方面的序列為基礎(chǔ)。發(fā)明人認(rèn)識到PIF通過寡糖鏈與其受體相連。因此，其它優(yōu)選的作用劑具有與PIF和/或其受體上發(fā)現(xiàn)的寡糖相似的寡糖構(gòu)象(例如硫酸軟骨素或其他磺基(sulphoid)寡糖)。此類作用劑與PIF竟?fàn)幨荏w結(jié)合，從而可用于降低惡病質(zhì)。本發(fā)明的第四、五或六方面的作用劑可以釆取多種不同的形態(tài)，這具體取決于組合物的使用方式。因此，例如，包括作用劑的組合物的形態(tài)可以是粉末、片劑、膠嚢、液體、軟膏、乳膏、凝膠、水凝膠、氣霧劑、噴霧、微膠束、透皮貼劑、脂質(zhì)體或任何其它可以向人或動物施用的合適形態(tài)?？梢岳斫猓景l(fā)明的組合物的載體應(yīng)該是其施用對象可以良好耐受的，并且能夠?qū)⒒衔镞f送至腦部。發(fā)明的組合物可以通過多種方式使用。例如，可能要求全身性給藥，在此情況下作用劑包含在組合物中，該組合物可以以例如片劑、膠嚢或液體的形態(tài)口服攝取。或者，可以通過向血流注射來施用組合物。注射可以是靜脈內(nèi)(推注或輸注)或皮下(推注或輸注)或肌肉內(nèi)的?？梢酝ㄟ^吸入(例如鼻內(nèi))施用作用劑。還可以通過腦內(nèi)、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)遞送的方式，向中樞施用作用劑。作用劑還可以摻入到緩釋或延遲釋放裝置中。此類裝置可以，例如，插入皮上或皮下(insertedonorundertheskin),并可以在數(shù)周甚至數(shù)月內(nèi)釋放作用劑。此類裝置對于慢性病患者特別有效。在通常需要頻繁施用所用的作用劑時(例如至少每天一次攝入片劑或每天一次進(jìn)行注射)，所述裝置可能是特別有利的?？梢岳斫?，所需作用劑的量是由生物學(xué)活性和生物利用度確定的，而生物學(xué)活性和生物利用度則依賴于給藥模式、所采用的作用劑的物理化學(xué)性質(zhì)、以及作用劑是作為單一療法還是在組合療法中使用。給藥的頻率也可能受到上述因素，特別是作用劑在治療對象體內(nèi)的半衰期的影響。給藥的最佳劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定，所述劑量可能隨4吏用的具體作用劑、制劑的濃度(strengthofthepreparation)、給藥才莫式以及病情的發(fā)展而變化(例如惡病質(zhì)的嚴(yán)重程度，或癌癥發(fā)展階段的事件)?；谔囟ㄖ委煂ο蟮钠渌蛩匾部梢詫?dǎo)致需要調(diào)整劑量，包括對象的年齡、體重、性別、飲食和給藥時間。可以利用已知的程序，如制藥行業(yè)常規(guī)使用的程序(例如體內(nèi)實驗、臨床實驗等)，來確定組合物的具體配方，和確切的治療方案(例如組合物的每日劑量和給藥頻率)，。通常，惡病質(zhì)治療使用的作用劑(例如基于SEQIDNO:l的可溶性受體)的日劑量可以在0.01嗎/kg體重和1.0g/kg體重之間。4吏用量將基于所使用的特定作用劑而定。更優(yōu)選地，日劑量在0.01mg/kg體重和100mg/kg體重之間。日劑量可以作為單次施用來給藥(例如每日供口服的用片劑(dailytabletfororalconsumption)或每曰單次注射(singledailyinjection))。或者，使用的作用劑可要求一天中施用兩次或多次，例如，，作用劑可以作為兩個(或多個，根據(jù)惡病質(zhì)的嚴(yán)重程度)25mg和5000mg之間的日劑量，以片劑形態(tài)施用。接受治療的患者可以在睡醒后攝入第1劑，然后在晚上攝入第2劑(如果是兩個劑量的方案)，或者在第1劑后以3或4小時的間隔攝入?；蛘撸梢允褂镁忈屟b置向患者提供最優(yōu)的劑量，而不需要重復(fù)施用劑量。周一次劑量(weekly)、每周兩次(twiceweekly)劑量或每周三次(thriceweekly)劑量(或更多次，根據(jù)惡病質(zhì)的嚴(yán)重程度)的給藥，所述劑量是在25mg和5000mg之間的可注射形態(tài)?；蛘撸梢允褂镁忈屟b置向患者提供優(yōu)化劑量，不需要重復(fù)施用劑量。本發(fā)明還提供了藥物組合物，包括治療有效量的本發(fā)明的作用劑，和可藥用載體。在一個實施方案中，作用劑(例如可溶性受體)的量是從約0.01mg至約800mg。在另一個實施方案中，所述量是從約0.01mg至約500mg。在另一個實施方案中，載體是液體，組合物是溶液。在另一個實施方案中，載體是固體，組合物是片劑。在其它實施方案中，載體是凝膠，組合物是栓劑。作用劑優(yōu)選的在施用前與可藥用載體組合。在主題發(fā)明中，"治療有效量"是作用劑的任何如下所述的量，當(dāng)向罹患了所述作用劑可生效的疾病的對象施用該量的作用劑時，可以通過維持去脂體重，導(dǎo)致惡病質(zhì)的降低、減輕或消退。"對象"是脊推動物、哺乳動物、家畜，或優(yōu)選人。在本發(fā)明的實踐中，"可藥用載體，，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何可用于配制藥物組合物的生理學(xué)載體。在一個實施方案中，藥物載體可以是液體，藥物組合物可以是溶液的形態(tài)。在另一個實施方案中，可藥用載體是固體，組合物是粉末或片劑的形態(tài)。在其它一個實施方案中，藥物載體是凝膠，組合物是栓劑或乳膏的形態(tài)。在其它一個實施方案中，作用劑或組合物可以配制成可藥用透皮貼劑的一部分。固體載體可以包括一種或多種物質(zhì)，所述物質(zhì)還可以作為增味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮輔助劑、粘合劑或片劑崩解劑；其還可以是包嚢材料。在粉末劑中，載體是細(xì)碎的(finelydivided)固體，與細(xì)碎的活性成分混合。在片劑中，活性成分與具有必需的壓縮性質(zhì)的載體以合適的比例混合，壓縮成理想的形狀和尺寸。粉末和片劑優(yōu)選的含有最多達(dá)99%的活性成分。合適的固體載體包括，例如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、葡聚糖、淀粉、明膠、纖維素、聚乙烯吡咯烷、低熔點蠟和離子交換樹脂。液體載體用于制備'溶液、懸浮液、乳化液、糖漿、酏劑和加壓組合物。活性成分可以溶解或懸浮在可藥用的液體載體中，例如水、有^/L溶劑、兩者的混合物或可藥用油或脂。液體載體可以包含其它合適的藥物添加劑，例如增溶劑、乳化劑、緩沖劑、防腐劑、甜味劑、增味劑、懸浮劑、增稠劑、著色劑、粘度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑。用于口服和非腸胃給藥的液體載體的合適實例包括水(部分含有上述添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧曱基纖維素鈉溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如甘油)及其衍生物，和油(例如分餾椰子油和花生油)。對于非腸胃給藥，載體還可以是油性酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯。無菌的液體載體可用于非腸胃給藥的無菌液體形態(tài)的組合物。用于加壓組合物的液體載體可以是卣代烴或其它可藥用推進(jìn)劑。以無菌溶液或懸浮液形式存在的液體藥物組合物可以通過例如以下方式使用肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外、腹膜內(nèi)或皮下注射。還可以靜脈內(nèi)施用無菌溶液。作用劑可以制備成無菌固體組合物，在給藥時可用無菌水、生理鹽水或其他合適的無菌可注射基質(zhì)加以溶解或懸浮。載體意在包括必需的和惰性的粘合劑、懸浮劑、潤滑劑、香味劑、增甜劑、防腐劑、染料和包衣。作用劑可以以無菌溶液或懸浮液的形態(tài)口服，所述溶液或懸浮液含有其它溶質(zhì)或懸浮劑(例如，使溶液等滲的足夠的鹽水(saline)或葡萄糖)、膽汁鹽、阿拉伯膠、明膠、失水山梨糖醇單油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇及其酐的油酸酯與環(huán)氧乙烷的共聚物)等。還可以以液體或固體組合物的形態(tài)口服施用作用劑。適合口服給藥的組合物包括固體形態(tài)，例如藥丸、膠嚢、顆粒、片劑和粉末，以及液體形態(tài)，例如溶液、糖漿、酏劑和懸浮液。可用于非腸胃給藥的形態(tài)包括無菌溶液、乳化劑和懸浮液。在施用前，作用劑可以和可藥用載體和其它治療活性劑組合。所述的其它治療活性劑可以是用于治療癌癥或惡病質(zhì)的。PIF受體的知識使發(fā)明人得以開發(fā)了篩選法，用于鑒別受試化合物是否是用于本發(fā)明的第四、五或六方面的推定作用劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了篩選化合物的方法，以測試化合物是否具有治療惡病質(zhì)的功歲支，包才舌(i)將包含根據(jù)發(fā)明第一方面的PIF受體的細(xì)胞或膜暴露于受試化合物經(jīng)過預(yù)定的時長；(ii)檢測PIF受體的活性或表達(dá)；和(iii)比較用化合物處理過的細(xì)胞或膜中PIF受體的活性或表達(dá)，和在未用化合物處理過的對照細(xì)胞或膜中發(fā)現(xiàn)的PIF受體的活性或表達(dá)其中，具有治療惡病質(zhì)的功效的化合物相對于對照，降低了PIF受體的活性或降低了它的表達(dá)?？梢岳斫?，可以對根據(jù)發(fā)明第八方面的方法進(jìn)行改造，^吏其用于測試化合物是否導(dǎo)致惡病質(zhì)。因此，本發(fā)明的第九方面提供了篩選化合物的方法，以測試化合物是否導(dǎo)致惡病質(zhì)，包括(i)將包含根據(jù)發(fā)明第一方面的PIF受體的細(xì)胞或膜暴露于測試化合物經(jīng)過預(yù)定的時長；(ii)檢測PIF受體的活性或表達(dá)；和(iii)比較用化合物處理過的細(xì)胞或膜中PIF受體的活性或表達(dá)，和在未用化合物處理過的對照細(xì)胞或膜中發(fā)現(xiàn)的PIF受體的活性或表達(dá)其中，導(dǎo)致惡病質(zhì)的化合物相對于對照，增加了PIF受體的活性或增加了它的表達(dá)。關(guān)于本發(fā)明的第八和第九方面的，企測PIF受體的活性或表達(dá)"，PIF受體的"活性，，意指配體-受體結(jié)合的檢出(detection);受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的檢出(detection);或終點生理學(xué)效應(yīng)的確定(determination)。對于"表達(dá)"，意指細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中的受體蛋白質(zhì)的檢出；或者編碼所述受體蛋白質(zhì)的mRNA的檢出。本發(fā)明的篩選方法是基于發(fā)明人這樣的認(rèn)識PIF受體表達(dá)和/或活性的程度可能與惡病質(zhì)的發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)所述方法是體內(nèi)測試時，根據(jù)本發(fā)明的第八或第九方面使用的細(xì)胞可以包含在實驗動物(例如小鼠或大鼠)體內(nèi)。或者，細(xì)胞可以是在組織樣品內(nèi)(對于離體檢測)或可以使細(xì)胞在培養(yǎng)中生長?？梢岳斫猓祟惣?xì)胞應(yīng)該表達(dá)，或可以被誘導(dǎo)表達(dá)功能性PIF受體。還可以使用不是天然傾向于表達(dá)PIF受體的細(xì)胞來表達(dá)PIF受體，條件是此類細(xì)胞用根據(jù)本發(fā)明的第三方面的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。此類細(xì)胞是根據(jù)發(fā)明使用的優(yōu)選的受試細(xì)胞。這是因為動物細(xì)胞，乃至原核細(xì)胞都可以經(jīng)轉(zhuǎn)化而表達(dá)人PIF受體，從而是用于人類治療用候選藥物的功效測試的良好細(xì)胞模型。根據(jù)本發(fā)明第八和九方面的方法還可以基于包含PIF受體的細(xì)胞膜或分離的可溶性PIF受體的使用。此類膜優(yōu)選源自上述細(xì)胞。此類膜可以不包括功能性PIF受體，但可以制備此類膜使所述膜可以在基于受體結(jié)合的方法中使用?？梢岳枚喾N常規(guī)技術(shù)測量PIF受體的活性或表達(dá)。測試可以是基于免疫測定的測試。例如，可以在免疫測定中4吏用標(biāo)記的抗體(優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明第七方面的標(biāo)記抗體)，評估細(xì)胞或細(xì)胞膜內(nèi)的受體水平。當(dāng)評估作用劑是否調(diào)節(jié)PIF受體表達(dá)、降解或脫敏(即受體再循環(huán))時，此類測試是特別有效的。還可以使用抗配體結(jié)合位點的抗體，來評估受試化合物是否是PIF受體的激動劑或拮抗劑?；蛘?，可以使用常規(guī)的受體結(jié)合測定(例如利用放射性標(biāo)記的PIF配體和/或;^t射性標(biāo)記的受試化合物)。此類測定可以涉及在缺失或存在竟?fàn)幮允茉嚮衔锏那闆r下，將包含PIF受體的膜暴露在不同濃度的["S]—PIF中。通過離心或濾器收獲膜，使膜與緩沖液分離，可以對結(jié)合的和游離的放射性計數(shù)。實施例中描述了一種優(yōu)選的受體結(jié)合測定法?；蛘撸梢允褂霉δ芑钚詠砹慷萈IF活性。例如，可以監(jiān)控試驗動物中的惡病質(zhì)發(fā)展。進(jìn)一步地，可以利用分子生物學(xué)技術(shù)來檢測PIF受體。例如，可以從提取自測試細(xì)胞或?qū)ο蟮膍RNA來產(chǎn)生cDNA，并且設(shè)計用于在定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增測試序列的引物，來從cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)使用了對象時(例如動物模型或者甚至經(jīng)過改造而表達(dá)人PIF受體的動物模型)，應(yīng)該向?qū)ο笫┯脺y試化合物經(jīng)過預(yù)定的時間長度，然后從對象取得樣品，用于測定PIF受體的活性或表達(dá)。例如，樣品可以是血液或活體組織。然而，測定法可以是功能性的，在此情況下，終點可以是對測試對象中的惡病質(zhì)的監(jiān)測。本發(fā)明將通過實施例，并參照下列附圖，而得到進(jìn)一步示例說明，所述附圖中圖l顯示，在未處理(*)的情況下，或者在與PNGaseF(■)或O-糖苷酶孵育24小時后，^H]肽PIF與C2d2膜的結(jié)合；圖2A顯示，C2d2膜的電泳結(jié)果，所述膜溶解在1%Triton中，在15%SDS聚丙烯酰胺凝膠的每個孔中上樣50嗎蛋白質(zhì)。樣品經(jīng)電泳后，電泳轉(zhuǎn)移到已經(jīng)用封閉緩沖液(5%Marvel,在含有0.1%Tween-20的PBS中)預(yù)封閉過夜的硝化纖維素濾膜上。用含有遞增濃度的["S]PIF的封閉緩沖液，在室溫下對濾膜印跡2小時。[35S]PIF的濃度是第l道5nM;第2道10nM;第3道15nM;第4道30nM;第5道60nM;第6道80nM;第7道100nM。用含有0.1%Tween-20的PBS洗滌濾膜2次，空氣干燥，進(jìn)行放射自顯影處理。從每條道切出40kDa的條帶，直接計數(shù)放射性(19);圖B顯示硝化纖維素濾膜的記錄結(jié)果，其中將膜蛋白電泳轉(zhuǎn)移到所述膜上，并用["S]PIF(30nM)以及含下列各濃度的未標(biāo)記PIF的封閉緩沖液共同在室溫下印跡第1道僅[35S]PIF;第2道10nM;第3道20nM;第4道40nM;第5道80nM;第6道160nM;和第7道320nM,并進(jìn)行放射自顯影處理；圖3顯示了在15%SDS-PAGE上電泳分離的02(:12膜的放射性級分，其中受體表現(xiàn)為表觀分子量40kDa(1-分子量標(biāo)記，2、3、4-來自柱的級分)的單一蛋白質(zhì)；圖4顯示了，在缺失(國)和存在(^)PIF受體的N-末端片段(10)iM)時，C2d2肌管中應(yīng)答于PIF的蛋白質(zhì)降解的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析(one-wayANOVA)，然后通過圖基氏后檢驗(Tukey，spost-test),來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a，p<0.05;b,p<0.01和c,p<0.001。⑧肽組和對照組之間的差異表示為d，pO.05;e,pO.Ol和f,p〈0.001;圖5顯示了缺失(□)和存在(■)PIF受體的N-末端片段(10pM)時，C2d2肌管中應(yīng)答于PIF的胰凝乳蛋白酶樣酶活性的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析(one-wayANOVA)，然后通過圖基氏后檢-險(Tukey，spost-test),來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a,p<0.05;⑧肽組和對照之間的差異表示為d，p<0.05;圖6A顯示了在應(yīng)答于PIF和PIF受體肽時，C2d2肌管中20S蛋白酶體a-亞基的表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM，3PIF4.2nM，4PIF10.5nM，5PIF16,8nM，6⑧對照，7和PIF2.1nM，8⑧和PIF4.2nM,9⑧和PIF10.5nM,10和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a，p<0.05。⑧肽組和對照組之間的差異表示為d,pO.05和e，p<0.01;圖6B顯示了在應(yīng)答于PIF和PIF受體肽時，C2d2肌管中MSS1表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM，3PIF4.2nM，4PIF10.5nM,5PIF16.8nM，6⑧對照，7⑧和PIF2.1nM，8和PIF4.2nM,9⑧和PIF10.5nM，10和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b,p<0.05。⑧肽組和對照組之間的差異表示為e,p〈0.01和f，p〈0.001;圖6C顯示了在應(yīng)答于PIF和PIF受體肽時，C2d2肌管中p42表達(dá)的圖示(各道圖例lPBS^j"照，2PIF2.1nM,3PIF4.2nM,4PIF10.5nM，5PIF16.8nM，6⑧對照，7⑧和PIF2.1nM,8⑧和PIF4.2nM，9⑧和PIF10.5nM，10和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a，p<0.05。⑧肽組和對照組之間的差異表示為d,p〈0.05和e,p〈0.01;圖6D顯示了在應(yīng)答于PIF和PIF受體肽時，C2d2肌管中E2她表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS只于照，2PIF2,lnM,3PIF4.2nM,4PIF10.5nM，5PIF16.8nM，6⑧對照，7⑧和PIF2.1nM，8和PIF4.2nM,9⑧和PIF10.5nM,10和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b，pO.Ol。⑧肽組和對照組之間的差異表示為e，pO.01;圖6E顯示了在應(yīng)答于PIF和PIF受體肽時，C2d2肌管中肌球蛋白表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM，3PIF4.2nM,4PIF10.5nM，5PIF16.8nM,6對照，7⑧和PIF2.1nM,8⑧和PIF4.2nM，9和PIF10.5nM，10和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a,p<0.05。⑧肽組和對照組之間的差異表示為d,pO.05和e,p<0.01。圖7顯示了使用抗受體抗血清實施的Western印跡圖，Western印跡是在通過添加50%飽和硫酸銨再過蛋白-A柱色鐠純化抗體后實施的。1純化的受體5pg蛋白質(zhì)2純化的受體10pg蛋白質(zhì)3純化的受體20ng蛋白質(zhì)4粗制膜級分20嗎蛋白質(zhì)5粗制膜級分30ng蛋白質(zhì)6粗制膜級分40)iig蛋白質(zhì)圖8顯示了濃度在5和15^ig/ml之間的抗PIF受體抗體對PIF在體外誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的影響的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組之間的均值差異。與對照的差異表示為b，p<0.01。⑧肽組和對照組之間的差異表示為d,pO.05和e，pO.01;圖9顯示了抗PIF受體抗體對PIF誘導(dǎo)的胰凝乳蛋白酶樣酶活性的增加的影響的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為c，p<0.001。對照和抗-受體之間的差異表示為d,pO.05和e，pO.01;圖10A顯示了在應(yīng)答于PIF和抗PIF受體抗體(10pg/ml)時，C2C12肌管中20S蛋白酶a亞基的表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM，3PIF4.2nM,4PIF10.5nM，5PIF16.8nM,6aPIF抗體》t照，7aPIF4元體和PIF2.1nM，8aPIF抗體和PIF4.2nM，9aPIF抗體和PIF10.5nM，10aPIF抗體⑧和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為c，pO.OOl。在抗受體10mg/ml和PIF之間的差異表示為f,pO.001;圖10B顯示了在應(yīng)答于PIF和抗PIF受體抗體(10jig/ml)時，C2C12肌管中MSS1的表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM，3PIF4.2nM，4PIF10.5nM，5PIF16.8nM,6aPIF抗體對照，7aPIF抗體和PIF2.1nM,8aPIF抗體和PIF4.2nM，9aPIF抗體和PIF10.5nM,10aPIF抗體⑧和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b,p<0.01;c,p<0.001。在抗受體10mg/ml和PIF之間的差異表示為d，pO.05;e，pO.Ol和f，pO.001;圖10C顯示了在應(yīng)答于PIF和抗PIF受體抗體(10|ag/ml)時，C2C12肌管中p42的表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM,3PIF4.2nM,4PIF10.5nM,5PIF16.8nM,6aPIF抗體對照，7aPIF抗體和PIF2.1nM,8aPIF抗體和PIF4.2nM，9aPIF抗體和PIF10.5nM,10aPIF抗體⑧和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為c,p<0.001。在抗受體10mg/ml和PIF之間的差異表示為f，p<0.001;圖10D顯示了在應(yīng)答于PIF和抗PIF受體抗體(l(Vg/ml)時，C2C12肌管中E2w的表達(dá)的圖示(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM,3PIF4.2nM,4PIF10.5nM,5PIF16.8nM,6aPIF抗體對照，7aPIF抗體和PIF2.1nM,8aPIF抗體和PIF4.2nM,9aPIF抗體和PIF10.5nM,10aPIF抗體⑧和PIF16.8nM);統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析，然后通過圖基氏后檢驗，來確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a,p<0.05;b,p<0.01。在抗受體10mg/ml和PIF之間的差異表示為d,p<0.05和e，p<0.01;圖IOE顯示了作為上樣對照的肌動蛋白印跡，顯示圖A至D中上樣了等量的蛋白質(zhì)(PIF和抗受體抗體，10嗎/ml)。(各道圖例1PBS對照，2PIF2.1nM,3PIF4.2nM,4PIF10.5nM,5PIF16.8nM,6aPIF抗體對照，7aPIF4元體和PIF2.1nM，8aPIF抗體和PIF4.2nM，9aPIF4元體和PIF10.5nM,10aPIF抗體⑧和PIF16.8nM);圖11A,用或不用抗-PIFIgG每日i.p.處理的MAC16荷瘤小鼠的體重改變；通過單向方差分析和圖基氏后檢驗后，與對照的統(tǒng)計學(xué)顯著性c，pO.001;B.用或不用抗-PIFIgG處理的MAC16荷瘤小鼠的腫瘤體積的改變；圖12A,用或不用抗-PIFIgG處理的MAC16荷瘤小鼠的比目魚肌中的蛋白質(zhì)合成；通過單向方差分析和圖基氏后檢驗后，與對照的統(tǒng)計學(xué)顯著性a,pO.05;圖12B顯示了與用溶劑處理的對照相比，比目魚肌重量占體重的比例；統(tǒng)計分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與溶劑的差異表示為b,p<0.01;圖12C是在體內(nèi)由PIF受體抗體(3.47mg/kg)導(dǎo)致的酪氨酸釋放測定結(jié)果的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與溶劑的差異表示為c，pO.001;圖12D顯示了抗受體抗體(3.47mg/kg)對I^腸^L中的胰凝乳蛋白酶樣酶活性的影響；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與溶劑的差異表示為a,PO.05和b，PO.01;圖13A顯示了在應(yīng)答于抗受體抗體(3.47mg/kg)時，用^腸肌中的20S蛋白酶體a-亞基的表達(dá)的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為c，PO.OOl?？故荏w和MAC16組之間的差異表示為f，pO.001;圖13B顯示了在應(yīng)答于抗受體抗體(3.47mg/kg)時，腓腸肌中的MSS1的表達(dá)的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b，PO.Ol。抗受體和MAC16組之間的差異表示為d,p<0.05;圖13C顯示了在應(yīng)答于抗受體抗體(3.47mg/kg)時，腓腸肌中的p42的表達(dá)的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為a,P<0.05。抗受體和MAC16組之間的差異表示為e，pO.001;圖13D顯示了在應(yīng)答于抗受體抗體(3.47mg/kg)時，E2她的表達(dá)的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b，PO.Ol?？故荏w和MAC16組之間的差異表示為e,pO.001;圖13E顯示了在應(yīng)答于抗受體抗體(3.47mg/kg)時，腓腸肌中的肌球蛋白的表達(dá)的圖示；統(tǒng)計學(xué)分析通過單向方差分析和隨后的圖基氏后檢驗，確定組與組之間的均值差異。與對照的差異表示為b,p<0.01?？故荏w和MAC16組之間的差異表示為d，pO.05;圖13F展示在應(yīng)答于抗受體(3.47mg/kg)時，腓腸肌中的肌動蛋白對照上樣印跡表達(dá)，顯示圖A至E中上樣了等量的蛋白質(zhì)。實施例1本發(fā)明基于下列實驗，進(jìn)行這些實驗是為了對不同組織中的PIF結(jié)合位點進(jìn)行研究和表征。1.1材料和方法化學(xué)試劑:胎牛血清、RPMI1640和Dulbecco，sModifiedEagles培養(yǎng)基(DMEM)系從GIBCO-BRL(Scotland,UnitedKingdom)購買。MAC16單克隆抗體是利用蛋白A-瓊脂糖柱，從雜交瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)基中分離的(Todorov，RT.,McDevitt，T.M.，Cariuk,P.，Coles,B.，Deacon,M.andTisdale，M丄Inductionofmuscleproteindegradationandweightlossbyatumorproduct.CancerRes.，56:1256-1261,1996.)。L-[2，6-3H]苯丙氨酸(比活54Ci匪or1)和Na235S04(比活10-100mCimmol陽1)是從AmershamInt.,(Buckinghamshire,UnitedKingdom)購買的。所有化學(xué)試劑都是從SigmaChemicalCo.,(Dorset,UnitedKingdom)購買的。OptiphaseHisafe3閃爍'液由Fisons(Loughborough,UnitedKingdom)提供。細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤增殖在60x15mmpetri培養(yǎng)皿中培養(yǎng)C2C12小鼠成肌細(xì)胞細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為在添加了12%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青霉素-鏈霉素的3mlDMEM中，5%C02空氣的濕潤氣氛和37。C。所有4吏用成肌細(xì)胞的實驗都是對亞匯合狀態(tài)的細(xì)胞實施的。在37。C下和含有5%C02的空氣的氣氛下，將MAC16細(xì)胞維持在含有5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。從歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Wiltshire,UnitedKingdom)獲得了普通人肌細(xì)胞Hs94MU,并在含5°/。C02的空氣的氣氛下、在含有2mM谷氨酰胺和10%胎牛血清的Dulbecco，sModifiedEagles培養(yǎng)基中維持。為了生物合成標(biāo)記，在含有1.5%經(jīng)透析胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞懸浮液含有Na235S04(liuCimr1)48小時。針對由發(fā)明人自己的群體繁殖的純種NMRI小鼠，從具有已確證的體重減少的供體動物中切除MAC16腫瘤，將所述腫瘤的碎片植入純種NMRI小鼠的脅下。在移植后10-12天時，腫瘤始可觸及，此時有明顯的體重減輕。通過相同的程序植入MAC13腫瘤的碎片。該肺瘤在生長過程中不導(dǎo)致體重減輕。經(jīng)標(biāo)記的PIF細(xì)胞的純化:通過^f氐速離心(在實-險臺式離心機上1500rpm,5min)沉降。將細(xì)胞沉淀重懸在含有0.5mM苯曱磺酰氟(PMSF)、0.5mMEGTA和lmM二硫蘇糖醇的lml的10mMTris-HCl，pH8.0中，并用超聲振蕩器解離。在離心后(15,000rpm，20min),向上清液中邊攪拌邊緩慢添加固體硫酸銨(38%w/v)，混合液在4。C儲存過夜。使用具有截留分子量為10,000的濾膜的Amicon過濾室對超聲緩沖液進(jìn)行透析，來從樣品中除鹽。將濃縮后的樣品上樣至含有MAC16單克隆抗體的親和柱(Todorov等人，CancerRes.)上，所述親和柱中MAC16單克隆抗體偶聯(lián)于Affi-GelHz(Bio隱Rad，HemelHempstead,UnitedKingdom),并用10mMTris-HCl,pH8.0平衡。在以5mlh"的流速循環(huán)過夜后，用1OmMTris-HCl,pH8.0洗滌柱，并用lOOmM甘氨酸HCl，pH2.5洗脫保留物。在用1MTris-HCl，pH8.0中和后，通過對水進(jìn)行Amicon過濾來濃縮含有力文射性的級分，再通過疏水色語進(jìn)一步純化，所述疏水色譜使用BrownleeAquoporeRP-300C8柱，以及乙腈和水梯度，如前人所述(Todorov等人，CancerRes.Sw/ra和Todorov等人，Nature,w/ra)。利用Amicon濾室，將在55%乙腈處洗脫的物料對水進(jìn)行濃縮，所述濾室含有截留分子量為10,000的濾膜。膜分離基本如前人所述(Ohlendieck,K.，Ervasti，J.M.,Snook,J.B.和Campbell,K.RDystrophin-glycoproteincomplexishighlyenrichedinisolatedskeletalmusclesarcolemma.J.CellBiol"112:135-148,1991)，從帶MAC16或MAC13腫瘤的荷瘤小鼠的腓腸肌制備肌膜。簡而言之，切下腓腸肌(5g),并在含有蛋白酶抑制劑的20mM焦磷酸鈉、20mM磷酸鈉、ImMMgCl2、0.303M蔗糖、0.5mMEDTA,pH7.0中將肌肉勻漿，所述抑制劑是抑肽酶(76.8nM)、亮肽素(l.lnM)、胃酶抑素A(0.7|iM)、苯曱酰胺(0.83mM)、碘乙酰胺(ImM)和PMSF(0.23mM)。將勻漿在30,000xg離心30min。在添加固體KC1至終濃度0.6M,然后在142,000g離心35min后，從上清液中獲得輕的微粒體(mucrosome)。將離心沉淀懸浮在0.303M蔗糖、20mMTris-馬來酸，pH7.0(緩沖液B)中，再次用KC1處理，然后如上述離心。將最終的輕微粒體離心沉淀重懸在含有0.6MKC1的緩沖液B(6ml)中，將lml等份試樣裝至含有7ml的0.878M蔗糖、0.6MKC1、20MmTris-馬來酸，pH7.0的離心管中，在112,000g離心17h。收集在0.303M/0.878M蔗糖界面處的粗制表面膜級分，重懸在緩沖液B中，并冷凍儲存在-80。C。通過相同的程序制備來自豬肌肉的肌膜。對于C—Ca細(xì)胞膜:在4°C的20mMHEPES,pH7.4、ImMEDTA、0.5mMPMSF和ImMDTT中進(jìn)行組織勻漿。將勻漿在20,000rpm離心30min，用相同的緩沖液洗滌。將細(xì)胞離心沉淀用于結(jié)合研究。通過經(jīng)修改的Belsham等人的規(guī)程(Belsham，G.J,，Denton，R.M.和Tanner,M丄A.Useofanovelrapidpreparationoffat-cellplasmamembranesemployingpercolltoinvestigatetheeffectsofinsulinandadrenalineonmembraneproteinphosphorylationwithinintactfatcells.Biochem.J.，192:457-467，1980.)，從分離自雄性BKW小鼠附睪脂肪組織的脂肪細(xì)胞中制備脂肪細(xì)胞質(zhì)膜。大體上說，利用自動形成的Percoll梯度將細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞勻漿的其他組分分離的。在NaCl緩沖液中洗滌膜級分，在10mMTris-HCl,pH7.4、250mM蔗糖、2mMEGTA和4|aMPMSF中稀釋至l-2mgml",在液氮中速凍，并在-70。C儲存直至使用。肝細(xì)胞質(zhì)膜是通過與脂肪細(xì)胞相似的(Belsham等人，S甲ra),且經(jīng)過修改適用于肝纟田胞(Nakamura,T.，Tomomura，A.,Noda，C.,Shimoji，M.andIchihara,A.Acquisitionofa(3-adrenergicresponsebyadultrathepatocytesduringprimaryculture.J.Biol.Chem.,258:9283-9289,1983)的技術(shù)方案來純化的。結(jié)合研究:膜(200嗎蛋白質(zhì)懸浮在200(ilPBS中)在4。C與含不同濃度的["S]PIF的50|ilPBS孵育24h，所述濃度如附例中詳述。通過13,000g離心5min,將結(jié)合的和游離的放射活性分離。PIF和單克隆抗體的親和常數(shù)(Kaff)的測定:當(dāng)讓固定的痕量抗原與系列稀釋的抗體結(jié)合時，如果可以測量結(jié)合的和游離的抗原，就可以計算抗體與其抗原的親和力。半最大結(jié)合處的抗體濃度是親和力的量度。利用蛋白A柱，從如前人所述(Todorov等人，CancerRes.wpra)的雜交瘤的組織培養(yǎng)上清中純化單克隆抗體。在含有2%小牛血清和1%Tween-20的稀釋劑0.25MTris-HCl，pH8.5中產(chǎn)生系列稀釋的抗體，至最終稀釋因數(shù)為104-105。如前人所述(Todorov等人，Nature,sw;ra)碘化PIF,并在上述稀釋劑中稀釋，使含有2x104cpm。將稀釋后的單克隆抗體(lOO(il)分裝至管中，再分裝125IPIF(50^1),在室溫孵育2h。然后，添加蛋白A-sepharose(100|Lil)，再將各管振蕩2h。添加稀釋劑(3ml),將各管離心，傾析出液體，再用另外3ml稀釋劑洗滌。在Y計數(shù)器中對最終沉降的固相進(jìn)行計數(shù)?！?5S1PIF的竟?fàn)幮越Y(jié)合:將含(22<:12膜(200|iig)的PBS(250|il)與1、5、10、50、100、500或lOOOng的單克隆抗體、疏酸軟骨素、硫酸皮膚素或石危酉臾乙酰肝素(chodroitin,dermatanorheparansulfate),以及20nM(480ng)的["S]PIF，在4。C孵育過夜。根據(jù)在13,000g離心5min獲得的細(xì)胞離心沉淀中的放射性來確定結(jié)合放射性。才艮寺居j'務(wù)文的Muller方法(Muller,R.Calculationofaverageantibodyaffinityinanti-haptenserafromdataobtainedbycompetitiveradioimmunoassay.J,Immunol.Methods,34:345-352，1980.)確定Kaff(Clark，B.R.和Todd,C.W.Avidinasaprecipitantforbiotin國labelledantibodyinaradioimmunoassayforcarcinoembryonicantigen.Anal.Biochem.,121:257-262，1982.)。Kaff=V(It-Tt)(l-1.56+0.5b2)其中It是在PIF結(jié)合50%抑制時的抑制劑濃度；Tt是總PIF濃度；b是在缺少抑制劑時，結(jié)合的PIF的分?jǐn)?shù)。蛋白質(zhì)降解的測量:用L-[2,6-3H]苯丙氨酸(0.5pCi比活0.72Cimmol")標(biāo)記C2d2成肌細(xì)胞24h。在標(biāo)記后，在存在PIF和i文線菌酮(l(iM)的條件下，在新鮮培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞并孵育要求的時間，測量釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中的放射性的量。用水冷的PBS(1ml,pH7.4)洗滌細(xì)胞3次，在去除任何殘留的PBS后，繼續(xù)在4。C用0.2M高氯酸(lml)孵育20min，確定結(jié)合于蛋白質(zhì)的放射性。在4。C用30min時間去除高氯酸并用lml的0.3MNaOH代替，然后進(jìn)一步在37。C孵育20min。將含有溶解的細(xì)胞蛋白質(zhì)的NaOH溶液轉(zhuǎn)移到干凈管中，用另外lml的0.3MNaOH洗滌培養(yǎng)皿。通過用釋放進(jìn)入孵育培養(yǎng)基中的放射性，除以結(jié)合于蛋白質(zhì)的放射性，來計算蛋白水解率。1.2結(jié)果利用生物合成標(biāo)記的MAC16細(xì)胞獲得["S]PIF,實施結(jié)合研究。利用親和色語和隨后的Q柱反相HPLC的組合來從細(xì)胞上清液中純化放射性配基。利用從小鼠成肌細(xì)胞細(xì)胞系C2C12(結(jié)果未顯示)和人肌細(xì)胞細(xì)胞系Hs94MU(結(jié)果未顯示)中分離的膜實施了配體結(jié)合研究。兩個物種的結(jié)合反應(yīng)的Scatchard分析都提供了存在兩個Kd為10"GM和10^M的結(jié)合位點的證據(jù)(表1)。在從豬分離的肌膜(結(jié)果未顯示)中也觀察到了類似的結(jié)合位點。在從攜帶MAC16腫瘤(結(jié)果未顯示)和攜帶MAC13腫瘤(結(jié)果未顯示)的NMRI小鼠的腓腸肌分離的肌膜中，以及肝細(xì)胞質(zhì)膜中(表1)，也觀察到兩個結(jié)合位點，其中親和力較低的結(jié)合位點的Kd從1(T9M降低至10"。M(beingreducedfroml(T9Mto10"。M)。沒有證據(jù)表明在攜帶MAC16腫瘤的小鼠中的受體數(shù)量與從攜帶不引發(fā)惡病質(zhì)的MAC13腫瘤的小鼠的肌膜中所見的受體數(shù)量相比有所上調(diào)。來自比目魚肌和心臟的細(xì)胞質(zhì)膜也顯示了兩個PIF結(jié)合位點的證據(jù)(表1)，而在腎臟或脂肪組織上沒有檢測到受體。表l.PIF與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的親和力常數(shù)組織來源Kaffx10-10MKaff2x10-9Mc2c121.41.2Hs94MU1.11.7豬4.78.2小鼠腓腸肌5.20.1小鼠肝臟6.90.2小鼠比目魚肌0.10.12小鼠心臟3.02.3小鼠脂肪-nd-ndnd:不可檢測的當(dāng)通過與下迷肽孵育N-糖苷酶F(PNGaseF)或內(nèi)切-a-N-乙?；肴樘窍忝?O-糖苦酶)而去除N-和O-連接寡糖鏈時，可以破壞PIF的生物學(xué)活性。為了確定PIF去糖基化對受體結(jié)合的影響，利用MAC16細(xì)胞與L-[2,5JH]組氨酸孵育產(chǎn)生的肽標(biāo)記的PIF進(jìn)行實驗。在用PNGaseF或O-糖香酶孵育24h后，與卩H]PIF的結(jié)合顯著降低了(圖1)，標(biāo)記的多肽鏈與膜只有非特異性結(jié)合。發(fā)現(xiàn)PIF與單克隆抗體的結(jié)合親和力(Kaff108M")低于它與肌肉受體上的高或低親和力位點的結(jié)合(結(jié)果未顯示)。然而，當(dāng)向C2d2膜添加濃度在1和1000ng/250|xl之間的單克隆抗體時，可以有效地抑制與受體的結(jié)合(Kd1.4x1(T8M)。當(dāng)在PIF之后添加單克隆抗體時，單克隆抗體與膜受體竟?fàn)幗Y(jié)合PIF的效率要低一些(Kd5.8x10-7M)。雖然PIF是硫酸化糖蛋白，但寡糖鏈與蛋白聚糖具有若干相似性，因為軟骨素酶(chondroitinase)ABC可破壞抗原決定簇，并降低分子量，盡管沒有獲得與寡糖相應(yīng)的低分子量物質(zhì)。這提示，PIF與受體的結(jié)合可以被蛋白聚糖所弱化。為了研究這一點，測定了濃度在5和5000ng/次測定的硫酸軟骨素、硫酸皮膚素和石克酸乙酰肝素(chodroitin，dermatanandheparansulfate)對PIF與C2C!2膜上的受體結(jié)合的影響。在這三種蛋白聚糖中，只有石危酸軟骨素顯示了對結(jié)合的竟?fàn)幮砸种?，Kd為l.lxl(T7M(結(jié)果未顯示)。將用Triton溶解的C2C12細(xì)胞膜在15%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，再電泳轉(zhuǎn)移至硝化纖維素濾膜上，利用["S]PIF對其進(jìn)行配體印跡，該印跡提供了表觀分子量40，000的結(jié)合蛋白的證據(jù)(圖2A)。遞增濃度的非標(biāo)記PIF能夠從結(jié)合的蛋白質(zhì)中置換出放射性(圖2B)(displacingradioactivityfromthebindingproteins)，這確證了與受體的結(jié)合是特異的。由于C2d2成肌細(xì)胞具有PIF的受體，在該細(xì)胞系中驗證功能活性具有重要意義。借助在放線菌酮的存在下24h的時間段內(nèi)L-[2，6^H]苯丙氨酸從預(yù)標(biāo)記的細(xì)胞中的釋放，來度量PIF對蛋白質(zhì)降解的影響。在加入PIF后6h內(nèi)，觀察到蛋白質(zhì)降解速率增加，蛋白質(zhì)降解速率在0.98和1.4nM之間的濃度下最大(結(jié)果未顯示)，與PIF和該細(xì)胞系的結(jié)合親和力接近。增加的PIF濃度導(dǎo)致苯丙氨酸釋放的減少，提示兩個結(jié)合位點之間的負(fù)相互作用。在0.14和1.4nM之間的PIF濃度下，在更長的時間段內(nèi)(24和48h)觀察到了增加的蛋白質(zhì)降解。1.3討論為了使PIF能夠在骨骼肌中誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，必須存在與能夠?qū)⑿畔⑥D(zhuǎn)化成胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的激活的肌肉蛋白質(zhì)受體的特異性相互作用。由于PIF是高度糖基化和硫酸化的糖蛋白，它很可能是膜結(jié)合的。該研究的為肌肉細(xì)胞內(nèi)的特異性、高親和力的PIF結(jié)合位點提供了證據(jù)。結(jié)合的親和力與胰島素的相當(dāng)，表現(xiàn)出的親和力比對用于純化PIF的單克隆抗體的結(jié)合高10-100倍。然而，高濃度的該抗體能夠從膜受體上置換PIF。這可以解釋為什么中和PIF的生物學(xué)效應(yīng)需要高濃度的抗體。結(jié)合受到硫酸軟骨素的特異性抑制，而不受相關(guān)的蛋白聚糖硫酸皮膚素和硫酸乙酰肝素的抑制，因此，PIF與受體的結(jié)合與PIF和抗體的結(jié)合一樣，可能是通過石克酸化寡糖鏈介導(dǎo)的。此外，酶促去糖基化導(dǎo)致了PIF與受體的特異性結(jié)合喪失。高親和力結(jié)合可能是PIF和受體之間的靜電相互作用的結(jié)果。PIF與來自小鼠、豬和人的肌肉膜結(jié)合的Scatchard作圖是非線性的，提示或者是兩個分離的位點，或者是結(jié)合位點之間的協(xié)同相互作用。在15%SDS-PAGE中電泳Triton溶解的02(:12細(xì)胞膜，再進(jìn)行["S]PIF配體印跡的結(jié)果，提供了表觀分子量40,000的結(jié)合蛋白的證據(jù)。已經(jīng)描述過多種激素和非激素系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)結(jié)合的曲線(curvilinear)Scatchard作圖。對于胰島素，已經(jīng)證明這種作圖代表了結(jié)合位點之間的負(fù)協(xié)同性。它提供了一種機制，其中，在低濃度激素時，有利于受體的結(jié)合，隨著激素濃度增加，結(jié)合變得越來越困難。對于PIF誘導(dǎo)的C2C!2細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解，此效應(yīng)是明顯的，可以觀察到鐘形的劑量-反應(yīng)曲線。之前的研究已經(jīng)提示，在分離的比目魚肌和腓腸肌中，PIF誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解存在相似的劑量-反應(yīng)曲線。此外已經(jīng)有報道稱，荷瘤動物中蛋白質(zhì)降解的增加，隨著肺瘤尺寸的增加而降低。這些結(jié)果提示了PIF結(jié)合位點之間的負(fù)協(xié)同相互作用。最近，我們已證明PIF對患惡病質(zhì)的MAC16腫瘤荷瘤小鼠中的骨骼肌喪失負(fù)責(zé)。然而，在MAC16腫瘤和MAC13腫瘤的荷瘤小鼠中，骨骼肌的PIF的結(jié)合位點數(shù)量相當(dāng)，而后一種小鼠不發(fā)生惡病質(zhì)，這提示惡病質(zhì)病程中的肌肉蛋白質(zhì)降解不是受體上調(diào)導(dǎo)致的。所述降解似乎是與胂瘤的PIF生產(chǎn)相關(guān)，因為尿樣分析顯示，PIF僅存在于具有體重喪失的癌癥患者中，而不存在于體重穩(wěn)定的癌癥患者或非癌癥患者中。因此，胂瘤的PIF生產(chǎn)導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)降解的組成型激活。PIF受體在組織中的分布，與PIF在介導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝中的角色是相稱的。在應(yīng)答于PIF時，C2C!2肌管中的蛋白質(zhì)降解速率表現(xiàn)出增加50-90%,其中最大刺激出現(xiàn)在0.98-1.4nM濃度下，這與PIF對受體的結(jié)合親和力相近。PIF受體在肝臟中的角色尚屬未知，因為肝臟對PIF的應(yīng)答是重量增加，而不是如在骨骼肌中觀察到的蛋白水解作用。該現(xiàn)象提示，肝臟中的PIF受體沒有偶聯(lián)第二信使系統(tǒng)，后者可導(dǎo)致蛋白水解作用的活化。受體可以用于從循環(huán)中去除PIF，或者可以導(dǎo)致其他系統(tǒng)的活化，例如肝細(xì)胞中的急性期反應(yīng)。我們迄今為止的研究只鑒別了PIF與癌癥惡病質(zhì)而非其他體重減輕癥候之間的聯(lián)系。因此，肌肉即使沒有先前暴露于PIF也仍擁有該因子的受體的這一發(fā)現(xiàn)是令人感興趣的。該受體的結(jié)合親和力和分子量在小鼠、豬和人之間表現(xiàn)出相似性，提示在物種之間功能的普遍性。調(diào)節(jié)骨骼肌分解代謝(例如在飲食缺陷或TNF-a誘導(dǎo)的分解代謝改變的過程中)的天然激動劑仍然是未知的，但就受體交叉反應(yīng)性而言可能與PIF相似。關(guān)于對骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝進(jìn)行控制的胞內(nèi)過程知之甚少，但是，其最終結(jié)果似乎是ATP-遍在蛋白依賴性蛋白水解系統(tǒng)的活化。實施例2在表征了PIF結(jié)合位點(參見實施例1)后，發(fā)明人繼續(xù)分離并測序本發(fā)明的第一方面的PIF受體。從QC二肌管中分離PIF受體發(fā)明人已證明了麥胚凝集素(WGA)(當(dāng)連接了交聯(lián)葡聚糖時)可以結(jié)合PIF的寡糖鏈。這就使得他們能夠在與PIF孵育后，通過WGA上的凝集素層析，有效地分離PIF受體。通過在受體緩沖液(20mMHEPESpH7.4、lmMEDTA、0.5mMPMSF、lmMDTT，4。C)中超聲，然后在20,000rpm離心20min來制備(^:12膜樣品。細(xì)胞離心沉淀經(jīng)洗滌后，在1%Triton中溶解30min。然后，將樣品在4。C對PBS透析過夜。在存在蛋白酶抑制劑的條件下，將200(xl經(jīng)溶解、透析的樣品在4。C與35SPIF孵育24h，然后利用WGA柱純化PIF受體。將樣品上樣到柱(lml柱床，10mgWGA/ml)上，用20倍體積的洗滌緩沖液(含有0.02%NaN3的10mMTrispH7.4)洗滌。用含有O.IMN-乙酰葡糖胺的洗滌緩沖液洗脫受體。收集IO個級分(lml),并在存在蛋白酶抑制劑的條件下在4。C儲存。利用Microcon離心機濃縮放射性級分，其中該離心機的膜可以截去(cutoff)分子量小于10kDa的蛋白質(zhì)，并將所述級分在15%SDS-PAGE上電泳(圖3)。受體表現(xiàn)為表觀分子量40kDa的單一蛋白質(zhì)。在利用SephadexG-50的排阻色譜中明顯可見類似的分子量(結(jié)果未顯示)。PIF-受體復(fù)合體作為單一級分運行。利用戊二醛將PIF和受體交聯(lián)后，獲得了類似的結(jié)果(結(jié)果未顯示)。對照的孵育一其中將從C2d2肌管分離的經(jīng)溶解的膜在不預(yù)先與PIF孵育的條件下進(jìn)行WGA凝聚素色譜一顯示沒有洗脫蛋白質(zhì)，證實了所述40kDa的物質(zhì)不是內(nèi)源糖蛋白。PIF受體的序列分析(Edman)N誦端DINGGGATLPQPLYQTAAVLTAGFA(SEQIDNo.1)該序列與來自滑液蛋白p205的具有T-細(xì)胞刺激活性的肽片段相匹配(J.Imm畫l.;(1996)157;1773-80)。DINGGGATLPQKLYLIPNVL(SEQIDNo.13)認(rèn)為該另一序列代表了受體的一種多態(tài)變體。內(nèi)部肽片段:TA歸TFLNADSNLSIGK(SEQIDNo.2)XATVAGVSPAPANVSAAIGA(SEQIDNo.3)…1IPATTAGE…(SEQIDNo.4)...TYMSPDYAAATLAG.(SEQIDNo.5)FVPLPT(SEQIDNo.6)TELSNYVTAXGTxxG(SEQIDNo.7)VTTAGSDS(SEQIDNo.8)DVNGG(SEQIDNo.9)LTTWDLIADSGR(SEQIDNo.10)各內(nèi)部肽與數(shù)據(jù)庫中的其它蛋白質(zhì)均沒有序列同源性。實施例3在測序PIF受體后，發(fā)明人繼續(xù)開發(fā)了用于本發(fā)明的第四、五或六方面的作用劑。發(fā)明人證明了SEQIDNO:l的肽能夠阻斷PIF對PIF受體的結(jié)合，從而^t明肽可以作為4艮據(jù)發(fā)明第四、五或六方面的作用劑。3.1方法在PIF純化和蛋白質(zhì)降解測定中使用的技術(shù)，"胰凝乳蛋白酶-樣"酶活性和Western印跡參見上文描述，且也包含在下列出版物中1.Gomes-Marcondes等人，Br.J.Cancer(2002)86,1628-1633.2.Whitehouse和Tisdale，Br.J.Cancer(2003)89，1116-1122.3.Smith和Tisdale，Br.J.Cancer(2003)89,1783-1788.3.2結(jié)果PIF誘導(dǎo)了小鼠肌管中的蛋白質(zhì)降解，且具有如已報道過的鐘形的劑量-反應(yīng)曲線(Gomes-Marcondes等人，w/ra)(圖4)。濃度為10pM的N端合成肽可以完全弱化該效應(yīng)。在該濃度下，所述肽還阻斷了PIFi秀導(dǎo)的胰凝乳蛋白酶樣酶活性的增加(圖5),后者是主要的蛋白酶體蛋白水解活性。Western印跡顯示，所述肽還完全阻止了PIF誘導(dǎo)的下列蛋白的表達(dá)增加20S蛋白酶體a-亞基(圖6A)、蛋白酶體MSSl的19S調(diào)節(jié)子的兩個ATPase亞基(圖6B)、p42(圖6C)以及遍在蛋白綴合酶E214k(圖6D)。所述肽對遍在蛋白-蛋白酶體蛋白水解通路誘導(dǎo)作用的抑制，導(dǎo)致肌纖維蛋白質(zhì)月幾球蛋白的PIF-i秀導(dǎo)性表達(dá)降j氐(PIF-induceddecreaseinexpression)的弱化(圖6E)。這些結(jié)果提示，PIF與受體肽的N端區(qū)域結(jié)合，阻止其與肌管中的受體的相互作用。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示，SEQIDNO:l的肽可用作根據(jù)本發(fā)明的作用劑。實施例4還研究了用于本發(fā)明的第四、五或六方面的用途的抗體作用劑。4.1方法產(chǎn)生了源自N-端肽片段(SEQIDNO:l)的前19個氨基酸的19mer的多克隆抗血清?？寡迨怯蒘evernBiotechLtd.,Worcs，UK根據(jù)保密協(xié)議，利用兔子生產(chǎn)的。更詳細(xì)地說，多克隆抗血清的生產(chǎn)是通過用硫代-SMCC將19mer肽(5mg)與5mgPPD(作為載體蛋白)通過C-末端半胱氨酸綴合，然后，通過皮下注射含抗原(50-200mg)的弗氏佐劑免疫兩只兔子，在四個部位各注射0.25ml。通過試取血、生產(chǎn)取血和終末取血來提供血清?？寡逶诩尤?0%飽和硫酸銨，再用蛋白A柱色語(PURE1A試劑盒，SigmaAldridge，Dorset,UK)純化抗體后，通過Western印跡4企出了PIF受體(圖7)。此外使用實施例1-3中使用的方法。4.2結(jié)果圖8顯示了濃度在5和15|ig/ml之間的PIF受體抗體對PIF"i秀導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解的影響。在5嗎/ml的濃度，觀察到了PIF效應(yīng)的部分弱化，在10嗎/ml或更高的濃度，觀察到了完全弱化。還觀察到對PIF-誘導(dǎo)的胰凝乳蛋白酶-樣酶活性的類似的影響(圖9)。Western印跡顯示，在02(:12肌管中，抗受體抗體還完全阻止了以下蛋白的PIF誘導(dǎo)的表達(dá)增加20S蛋白酶體a-亞基(圖10A),蛋白酶體MSS1的19S調(diào)節(jié)子的兩個ATPase亞基(圖IOB)、p42(圖10C)以及遍在蛋白綴合酶E2他(圖IOD)。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示，針對SEQIDNO:l的肽的抗體，可用作根據(jù)本發(fā)明的作用劑。為了評估抗受體抗體在體內(nèi)阻斷PIF的肌肉蛋白質(zhì)降解的能力，每天通過i.p.施用抗PIF受體多克隆抗血清(3.47mg/kg)來處理攜帶有惡病質(zhì)誘導(dǎo)性MAC16結(jié)腸癌的小鼠，已經(jīng)顯示在所述小鼠中PIF對骨骼肌的喪失負(fù)責(zé)(Lorite等人，Br.J.Cancer(1998)78,850-856)。在處理3天后，接受抗受體抗體的小鼠的體重減輕顯著低于溶劑對照(圖IIA)。圖11B中顯示了對腫瘤體積的影響。與溶劑處理的對照相比，對蛋白質(zhì)合成有顯著的影響(圖12A)，且比目魚肌重量有顯著增加，而與體重匹配的無瘤NMRI小鼠沒有顯著性差異(圖12B)。抗受體抗體處理使比目魚肌中的蛋白質(zhì)降解(圖12C)，以及功能性蛋白酶體活性(以胰凝乳蛋白酶-樣酶活性來衡量)，都減弱至非荷瘤小鼠的水平(圖12D)。在用抗受體抗體治療惡病質(zhì)小鼠后，20S蛋白酶體a-亞基(圖13A)、MSS1(圖13B)、p42(圖13C)和E214k(圖13D)的表達(dá)也都降低至非荷瘤小鼠中發(fā)現(xiàn)的水平。圖13E的結(jié)果顯示，抗受體抗體將攜帶MAC16肺瘤的小鼠中觀察到的腓腸肌肌動蛋白缺失逆轉(zhuǎn)到了非荷瘤小鼠中發(fā)現(xiàn)的水平。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示，針對SEQIDNO:l的肽的抗體可用作^4居本發(fā)明的作用劑。權(quán)利要求1、一種分離的蛋白水解誘導(dǎo)因子(PIF)受體，其特征在于成熟的天然受體的N末端具有這樣的氨基酸序列n-DINGGGATLPQPLYQTAAVLTAGFA(SEQIDNo.1)或n-DINGGGATLPQKLYLIPNVL(SEQIDNo.13)2、權(quán)利要求l要求保護(hù)的受體，可通過這樣的方法獲得，所述方法包括(i)通過在1%Triton中與放射性標(biāo)記的PIF孵育，使鼠肌管的膜溶解；(ii)在能夠結(jié)合PIF的麥胚凝集素-瓊脂糖柱上純化PIF受體，和(iii)用O.lMN-乙酰氨基葡萄糖洗脫游離的受體，其中利用15%SDS-PAGE和SephadexG-50排阻色語，該受體具有約40,000的分子量。3、權(quán)利要求1或2要求保護(hù)的受體，還包括選自下組的內(nèi)部氨基酸序列中的至少一個、兩個或全部TAINDTFLNADSNLSIGK(SEQIDNo.2)XATVAGVSPAPANVSAAIGA(SEQIDNo.3)…1IPATTAGE…(SEQIDNo.4)...TYMSPDYAAATLAG...(SEQIDNo.5)FVPLPT(SEQIDNo.6)TELSNYVTAXGTxxG(SEQIDNo.7)VTTAGSDS(SEQIDNo.8)DVNGG(SEQIDNo.9)LTTWDLIADSGR(SEQIDNo.10)4、蛋白水解誘導(dǎo)因子(PIF)的突變受體，其特征是它是前述權(quán)利要求中任一項要求保護(hù)的受體的功能衍生物。5、編碼前述權(quán)利要求中任一項要求保護(hù)的受體的核酸。6、權(quán)利要求5要求保護(hù)的核酸，其具有基本上如SEQIDNO:ll所示的核苷酸序列GACATCAACGGCGGCGGCGCCACCCTGCCCCAGCCCCTGTACCAGACCGCCGCCGTGCTGACCGCCGGCTTCGCC7、權(quán)利要求5要求保護(hù)的核酸，其具有基本上如SEQIDNO:14所示的核苷酸序列GACATCAACGGCGGCGGCGCCACCCTGCCCCAGAAGCTGTACCTGATCCCCAACGTGCTG8、一種載體，其包含權(quán)利要求5-7中任一項要求保護(hù)的核酸，并任選地包括下組中的一個或多個誘導(dǎo)DNA復(fù)制的元件；有利于靶向整合到細(xì)胞的基因組中的元件；選擇標(biāo)記；啟動子。9、一種降低權(quán)利要求1-3中任一項要求保護(hù)的受體的生物學(xué)活性的作用劑，其作為治療惡病質(zhì)的藥物使用。10、權(quán)利要求9要求保護(hù)的作用劑，其通過下述方式降低所述受體的生物學(xué)活性(h)降低受體的表達(dá)；(i)增加受體脫敏或受體降解；(j)減少PIF和受體之間的相互作用，所述受體是內(nèi)源受體；(k)減少受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；(1)與內(nèi)源受體竟?fàn)嶱IF結(jié)合；(m)結(jié)合受體從而阻斷PIF結(jié)合；或(n)結(jié)合PIF從而阻止與受體的相互作用。11、一種抗體，其能夠特異性結(jié)合權(quán)利要求1-3中任一項要求保護(hù)的受體。12、權(quán)利要求ll要求保護(hù)的抗體，其阻斷受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。13、權(quán)利要求11或12要求保護(hù)的抗體，其是針對SEQIDNO:1-10或13中的任一種肽產(chǎn)生的。14、權(quán)利要求11-13中任一項要求保護(hù)的抗體，其是多克隆的。15、權(quán)利要求11-13中任一項要求保護(hù)的抗體，其是單克隆的。16、權(quán)利要求11-15中任一項要求保護(hù)的抗體，其是？免疫球蛋白(IgG)。17、權(quán)利要求11-16中任一項的抗體的功能衍生物，其至少具有所述抗體的可變結(jié)構(gòu)域。18、權(quán)利要求17要求保護(hù)的功能衍生物，其是抗體片段，任選地是scFv抗體。19、權(quán)利要求11或12要求保護(hù)的抗體，其是人源化抗體。20、權(quán)利要求9或IO要求保護(hù)的作用劑，其是權(quán)利要求11-19中任一項要求保護(hù)的抗體或功能衍生物。21、權(quán)利要求9或IO要求保護(hù)的作用劑，其是權(quán)利要求1-4中任一項的可溶性受體或其片段。22、權(quán)利要求21要求保護(hù)的作用劑，其是受體的N端片段，任選地選自或包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:13。23、權(quán)利要求22要求保護(hù)的作用劑，其是肽衍生物，所述肽衍生物與其來源的受體片段相比具有增加的體內(nèi)半衰期。24、權(quán)利要求9或10要求保護(hù)的作用劑，其是反義DNA或RNA分子，所述分子可以結(jié)合內(nèi)源受體RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而降低受體表達(dá)。25、權(quán)利要求24要求保護(hù)的作用劑，其是選自下述的反義分子5，GGCGAAGCCGGCGGTCAGCACGGCGGCGGTCTGGTACAGGGGCTGGGGCAGGGTGGCGCCGCCGCCGTTGATGTC...3,(SEQIDNO.12)5，CAGCACGTTGGGGATCAGGTACAGCTTCTGGGGCAGGGTGGCGCCGCCGCCGTTGATGTC..3,(SEQIDNO.15)26、權(quán)利要求9或IO要求保護(hù)的作用劑，其是siRNA分子或shRNA。27、一種篩選化合物以測試化合物是否具有治療惡病質(zhì)的功效的方法，包括(iv)將包含權(quán)利要求1-3中任一項要求保護(hù)的受體的細(xì)胞或膜暴露于受試化合物經(jīng)過預(yù)定的時長；(v)檢測所述受體的活性或表達(dá)；和(vi)比較用所述化合物處理的細(xì)胞或膜中所述受體的活性或表達(dá)，與未用所述化合物處理的對照細(xì)胞或膜中發(fā)現(xiàn)的活性或表達(dá)其中，具有治療惡病質(zhì)功效的化合物相對于對照降低所述受體的活性或降低所述受體的表達(dá)。28、一種篩選化合物以測試該化合物是否導(dǎo)致惡病質(zhì)的方法，包括(iv)將包含權(quán)利要求1-3中任一項要求保護(hù)的受體的細(xì)胞或膜暴露于受試化合物經(jīng)過預(yù)定的時長；(v)檢測所述受體的活性或表達(dá)；和(Vi)比較用所述化合物處理的細(xì)胞或膜中所述受體的活性或表達(dá)，與未用所述化合物處理的對照細(xì)胞或膜中發(fā)現(xiàn)的活性或表達(dá)其中，導(dǎo)致惡病質(zhì)的化合物相對于對照增加所述受體的活性或增加所述受，的^達(dá)。29、如權(quán)利要求27或28要求保護(hù)的體內(nèi)方法，其中，將任何實驗動物中存在的細(xì)胞暴露于受試化合物。30、權(quán)利要求27-29中任一項要求保護(hù)的方法，其中，將細(xì)胞用權(quán)利要求8要求保護(hù)的載體轉(zhuǎn)化，以在所述細(xì)胞中表達(dá)所述受體。31、權(quán)利要求27-30中任一項要求保護(hù)的方法，其中，利用標(biāo)記的抗體、放射性標(biāo)記的PIF配體或放射性標(biāo)記的受試化合物來評估所述細(xì)胞或膜中的受體水平，所述抗體是權(quán)利要求ll要求保護(hù)的抗體。32、降低權(quán)利要求1-3的任一項要求保護(hù)的受體的生物學(xué)活性的作用劑在制造用于治療惡病質(zhì)的藥物中的用途。33、權(quán)利要求32要求保護(hù)的用途，其中，所述作用劑是權(quán)利要求9、10或20-26中任一項要求保護(hù)的作用劑。34、用于治療惡病質(zhì)的方法，包括向需要此類治療的對象施用治療有效量的作用劑，所述作用劑降低權(quán)利要求1-3的任一項要求保護(hù)的受體的生物學(xué)活性。35、權(quán)利要求34要求保護(hù)的方法，其中所述作用劑是權(quán)利要求9、10或20-26中任一項要求保護(hù)的作用劑。全文摘要本發(fā)明表征和提供了蛋白水解誘導(dǎo)因子(PIF)的受體，以及使用所述受體的相關(guān)方法和材料。它們可用于例如提供惡病質(zhì)的治療。文檔編號G01N33/68GK101605811SQ200780051196公開日2009年12月16日申請日期2007年12月11日優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日發(fā)明者佩尼奧·托多羅夫,斯泰西·M·威克,邁克爾·J·蒂斯代爾申請人:阿斯頓大學(xué)