專利名稱：用于核酸定量分析的反應(yīng)器的制作方法
用于核酸定量分析的反應(yīng)器
背景技術(shù)：
當(dāng)前用于生物分析和新出現(xiàn)的基因組學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)是DNA的聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增。由于這個(gè)有力的工具，從否則不能檢測量的DNA開始，并為隨后的分析產(chǎn)生足 夠量的材料成為可能。PCR使用重復(fù)性的一系列步驟，以產(chǎn)生位于兩個(gè)起始(“引物”)序列 之間的多核苷酸序列的拷貝。開始用模板、兩個(gè)引物序列(長度通常約15-30個(gè)核苷酸)、 PCR緩沖劑、游離的三磷酸脫氧核苷(dNTP)和熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(通常來自嗜熱水生菌 (Thermus aquaticus)的TAQ聚合酶)，將這些成分混合，并加熱以分開雙鏈DNA。隨后的冷 卻步驟允許引物退火至單鏈DNA分子上的互補(bǔ)序列，該單鏈DNA分子含待擴(kuò)增的序列。通 過DNA聚合酶完成靶序列的復(fù)制，這產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的DNA鏈。重復(fù)該過程，使目標(biāo)序列的 拷貝數(shù)加倍，且多個(gè)循環(huán)使拷貝數(shù)呈指數(shù)增加。因?yàn)镻CR需要在高溫和低溫之間反復(fù)循環(huán)，所以PCR裝置必須由能夠經(jīng)得起此類 溫度變化的材料制備。此類材料必須在高溫下機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定，并能夠經(jīng)得起反復(fù)的溫度 變化，而沒有機(jī)械性降解。此外，材料必須與PCR反應(yīng)本身相容，且不抑制聚合酶或與DNA
纟口口。常規(guī)的PCR典型地在試管、微量培養(yǎng)板和毛細(xì)管中進(jìn)行，它們均可以被方便地密 封。然而，這些試管、微量培養(yǎng)板和毛細(xì)管的幾何形狀使它們不適用于衰減波檢測方法。附圖簡述通過參考闡述此類實(shí)施方案的以下描述和附圖，可最好地理解本發(fā)明的實(shí)施方 案。在圖中

圖1舉例說明了筒狀體(cartridge)的視圖，該筒狀體能夠按照微陣列的PCR方 法，衰減波檢測熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。圖2舉例說明了筒狀體的側(cè)視圖，該筒狀體能夠按照微陣列的PCR方法，衰減波檢 測熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。圖3舉例說明了另一個(gè)筒狀體的視圖，該筒狀體能夠按照微陣列的PCR方法，衰減 波檢測熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。圖4舉例說明了另一個(gè)筒狀體的側(cè)視圖，該筒狀體能夠按照微陣列的PCR方法，衰 減波檢測熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。定義當(dāng)用于本文時(shí)，某些術(shù)語具有以下含義。用于本說明書的所有其它術(shù)語和短語具 有本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的其通常含義。此類通常含義可通過參考技術(shù)詞典獲得，技術(shù) 詞典為例如 Hawley，s CondensedChemical Dictionary 第 11 版，Sax 和 Lewis 編輯，Van Nostrand Reinhold, New York, N. Y.，1987 和 The Merck Index，第 11 版，Merck & Co.， Rahway N. J. 1989。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“和/或”是指與該術(shù)語相關(guān)的任何一個(gè)項(xiàng)目、項(xiàng)目的任何組 合或所有的項(xiàng)目。當(dāng)用于本文時(shí)，單數(shù)形式“一”和“該”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外清楚地說明。因此，例如，涉及“一種制劑”包括此類制劑中的許多，以致于一種化合物X的制劑包括 化合物X的多個(gè)制劑。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“約”是指指定值10 %的變化，例如，約50 %含有從45 %至 55%的變化。對于整數(shù)范圍，術(shù)語約可以包括大于和小于所述整數(shù)的一個(gè)或兩個(gè)整數(shù)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“擴(kuò)增子”是指聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物。擴(kuò)增子是已經(jīng)使 用擴(kuò)增技術(shù)合成的DNA片段(例如有兩個(gè)引物的雙鏈DNA)。擴(kuò)增子可包含例如用熒光分子 在5’端標(biāo)記的引物。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“陣列”和“微陣列”是指元件(即實(shí)體)在材料或裝置內(nèi)的 排列。按照另一種含義，術(shù)語“陣列”是指兩個(gè)或多個(gè)測定區(qū)域在基體(substrate)上的有 序排列(例如行和列)。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“衰減”是指隨距離呈指數(shù)式衰減的近場駐波(nearfield standing wave)。當(dāng)用于光學(xué)時(shí)，當(dāng)正弦波按大于臨界角的角度內(nèi)反射離開界面，以使總內(nèi) 反射發(fā)生時(shí)，形成衰減波。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“雜交”是指互補(bǔ)核酸的配對。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“動(dòng)力”用于表示誘導(dǎo)樣品在反應(yīng)器內(nèi)沿流動(dòng)通路移動(dòng)的任何 手段，并包括跨越反應(yīng)器任何部分的電勢施加、跨越反應(yīng)器任何部分的壓力差施加或其任 何組合。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或 RNA。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“光學(xué)檢測通路”是指形成通路的檢測工具的構(gòu)型或排列，由 此電磁輻射能夠從外部來源傳輸至用于接收輻射的工具，其中輻射橫穿反應(yīng)室。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)是指K.B.Mullis，美國專利號(hào) 4，683，195,4, 683，202 和 4，965，188 中的方法。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“反應(yīng)器”是指裝置，該裝置可以用于涉及流體的任何數(shù)量的 化學(xué)過程。主要的目標(biāo)方法是使用聚合酶鏈反應(yīng)的DNA擴(kuò)增。任選，DNA擴(kuò)增可與一種或 多種其它類型的操作一起進(jìn)行。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“穩(wěn)定性”是指材料經(jīng)受變質(zhì)或置換，并提供可信度和可靠性 的能力。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“基體”是指能夠支撐相關(guān)測定組分(例如測定區(qū)域、細(xì)胞、測 試化合物等)的材料。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“靶核酸”是指待檢測病原體固有的多核苷酸。多核苷酸是遺 傳物質(zhì)包括例如DNA/RNA、線粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA和質(zhì)粒DNA。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“不透水的”是指材料，其中水不會(huì)通過該材料。發(fā)明詳述本發(fā)明提供使用衰減波檢測技術(shù)，定量分析靶核酸的反應(yīng)器及其使用方法。該反 應(yīng)器包括有腔的基體、排列在基體上的緩沖層、排列在緩沖層上的蓋板以及入口和出口。該 反應(yīng)器對于PCR處理來講是熱和化學(xué)穩(wěn)定的，并適用于衰減波檢測技術(shù)。發(fā)生在反應(yīng)器內(nèi)的PCR過程需要特別的溫度條件，例如高溫和低溫的循環(huán)周期。 液體和反應(yīng)室的溫度變化由加熱和冷卻系統(tǒng)調(diào)節(jié)。
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在高溫下，樣品液體膨脹并增加反應(yīng)室內(nèi)的壓力。相反，在低溫下，樣品液體收縮 并減少反應(yīng)室內(nèi)的壓力。反應(yīng)室的任何變形將在蓋層與基體之間引起不完全的粘附，并導(dǎo) 致泄漏。在PCR擴(kuò)增的情況下，甚至少量的小泄漏可能導(dǎo)致假陽性。為了防止該泄漏，使用 緩沖層。對于靶核酸的實(shí)時(shí)定量分析，已經(jīng)公開了利用衰減波檢測技術(shù)的幾種方法，包括 例如在以下文獻(xiàn)中描述的技術(shù)Xu(美國專利申請公布號(hào)2006/0088844)和2007年11月5 日提交的標(biāo)題為“寡核苷酸微陣列的定量方法”的PCT專利申請序號(hào)PCT/CN2007/003124。在描述靶核酸實(shí)時(shí)定量分析的這些方法中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增樣品中 的靶核酸。通過將靶核酸置于含核苷酸腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G) (總稱為dNTP)、DNA聚合酶和引物的緩沖劑中，開始PCR。引物是短鏈的DNA，具有與靶核 酸特定區(qū)域互補(bǔ)的序列。引物引發(fā)靶核酸的復(fù)制?？捎脽晒夥肿釉?’端熒光標(biāo)記引物，或 熒光標(biāo)記dNTP。該類PCR方法具有三個(gè)主要步驟變性、退火和延伸。在變性步驟中，將混合物加 熱至約94°C (攝氏度)，在該點(diǎn)靶DNA分開成為單鏈。使混合物快速冷卻。當(dāng)溫度降至約 60°C時(shí)，退火步驟發(fā)生，其中熒光標(biāo)記的引物雜交或結(jié)合至其在靶核酸上的互補(bǔ)序列。延 伸步驟可在約60°C進(jìn)行或可升至72-78°C的范圍。在該步驟中，DNA聚合酶在溶液中使用 dNTP,以延伸熒光標(biāo)記的退火引物，并形成稱為擴(kuò)增子的新DNA鏈。將混合物簡單地再加熱 回到約94°C，以分開新產(chǎn)生的雙螺旋鏈，形成單鏈的核酸，該單鏈核酸開始PCR過程的另一 個(gè)循環(huán)。通過PCR過程的每個(gè)循環(huán)，原始靶核酸的拷貝數(shù)大致成倍。PCR緩沖劑可另外包含熒光標(biāo)記的引物，即熒光染料分子與它們連接，以便在每個(gè) PCR循環(huán)完成之后，所產(chǎn)生的擴(kuò)增子被熒光標(biāo)記的引物。使用稱為靶核酸探針的探針DNA 鏈，使靶核酸的擴(kuò)增子局部化。靶核酸探針具有與靶核酸相同的互補(bǔ)核苷酸序列。按已知 的二維圖案將靶核酸探針固定至基體表面，且基體表面形成含PCR成分的反應(yīng)池(cell)的 一部分。PCR緩沖劑也可包括涂覆劑或表面活性劑，以通過修飾反應(yīng)器內(nèi)表面來防止非特 異性結(jié)合。此類涂覆劑的實(shí)例包括聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物、分子量約200-約8000的聚 乙二醇(PEG)、天然聚合物例如牛血清白蛋白(BSA)或提供期望的表面特征，尤其是減少生 物分子例如蛋白質(zhì)和核酸吸附的那些特征的任何其它部分。典型地通過任何合適的方法，將含待擴(kuò)增的樣品和合適緩沖劑與試劑的溶液引入 反應(yīng)器內(nèi)。樣品的引入可使用任何常規(guī)方法來實(shí)現(xiàn)，此類方法包括電動(dòng)力學(xué)注射、水力注 射、自發(fā)的流體置換等。對于大部分來說，使用的具體方法將取決于通道的構(gòu)型以及引入精 確體積樣品的需要。在PCR方法的退火和延伸階段期間，將靶擴(kuò)增子雜交至其相應(yīng)的靶核酸探針。用 合適波長的光的衰減波照射雜交的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，以激活熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記 的dNTP的熒光染料分子。該衰減波在通過靶核酸探針固定至其上的基體表面進(jìn)入反應(yīng)池 之后，功率呈指數(shù)式衰減，有約300nm的有效穿透范圍。這表示衰減波穿透很遠(yuǎn)，足于進(jìn)入 反應(yīng)池，以激活雜交至那些靶核酸探針的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，但是在反應(yīng)池的主體中，它不 激活溶液內(nèi)的熒光標(biāo)記分子(例如熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的dNTP)。通過在基體表面 上的各種位置監(jiān)測熒光強(qiáng)度，可以測定相應(yīng)靶核酸的擴(kuò)增子的當(dāng)前豐度。結(jié)果用于按類似于實(shí)時(shí)PCR計(jì)算的方式，獲得在原始樣品中特定靶的豐度的定量測量。反應(yīng)器在一個(gè)實(shí)施方案中，圖1圖示闡述了可以用于進(jìn)行化學(xué)過程例如PCR的反應(yīng)器。裝 置一般表示為11，包含基體13，基體13具有平的表面15并包含腔17。緩沖層19顯示排列 在基體13的平的表面15之上。蓋板21顯示排列在緩沖層19的上表面23之上。在使用裝置之前，在基體13的平的表面15上，將蓋板21的下面25與緩沖層19 的上表面23對齊，并相對放置(見例如圖2)。蓋板21與緩沖層19和腔17聯(lián)合形成反應(yīng) 室，在該反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行期望的化學(xué)過程。將流體例如待分析的樣品、分析試劑、反應(yīng)物等，從 外部來源通過入口 27，引入反應(yīng)室。出口 29確保流體的通道從反應(yīng)室到外部容器。因此， 通過在基體13上將蓋板21與緩沖層19對齊，形成密封，來關(guān)閉反應(yīng)器。在一些實(shí)施方案 中，緩沖層19不固化。在其它實(shí)施方案中，緩沖層19固化。該密封導(dǎo)致反應(yīng)室的形成，流 體可通過入口 27引入該反應(yīng)室內(nèi)，并通過出口 29除去。具有合適大小、硬度和化學(xué)抗性的 一組塞子(例如橡膠)可用于密封反應(yīng)室的入口 27和出口 29。在另一個(gè)實(shí)施方案中，圖3圖示闡述了可以用于進(jìn)行化學(xué)過程例如PCR的反應(yīng)器。 裝置一般表示為11，包含基體13，基體13具有平的表面15并包含腔17。緩沖層19顯示排 列在基體13的平的表面15之上。蓋板21顯示排列在緩沖層19的上表面23之上。在使用裝置之前，在基體13的平的表面15上，將蓋板21的下面25與緩沖層19 的上表面23對齊，并相對放置(見例如圖4)。蓋板21與緩沖層19和腔17聯(lián)合形成反應(yīng) 室，在該反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行期望的化學(xué)過程。將流體例如待分析的樣品、分析試劑、反應(yīng)物等從 外部來源通過入口 27，引入反應(yīng)室。出口 29確保流體的通道從反應(yīng)室到外部容器。因此， 通過在基體13上將蓋板21與緩沖層19對齊，形成密封，來關(guān)閉反應(yīng)器。在某些實(shí)施方案 中，緩沖層19不固化。在其它實(shí)施方案中，緩沖層19固化。該密封導(dǎo)致反應(yīng)室的形成，流 體可通過入口 27引入該反應(yīng)室內(nèi)，并通過出口 29除去。具有合適大小、硬度和化學(xué)抗性的 一組塞子(例如橡膠)可用于密封反應(yīng)室的入口 27和出口 29?；w和蓋板按照期望用于特定應(yīng)用的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)，來選擇在實(shí)施方案中用于形成基 體和蓋板的材料。關(guān)于與它們接觸的任何試劑，在使用的反應(yīng)條件下(例如關(guān)于PH、電場 等)，基體和蓋板應(yīng)該是化學(xué)惰性的和物理穩(wěn)定的。因?yàn)镻CR涉及相對高的溫度，所以在使 用的溫度范圍內(nèi)所有的材料均為化學(xué)和物理穩(wěn)定的很重要。為了用于光學(xué)檢測方法，使用 的材料應(yīng)該透光，典型地對于在約150nm-800nm范圍波長的光可以透過。例如，在某些實(shí)施方案中，基體包括平的(即二維的)玻璃、金屬、復(fù)合材料、塑料、 二氧化硅或其它生物相容性或生物惰性復(fù)合材料?？墒褂迷S多基體?；w可以是生物的、 非生物的、有機(jī)的、無機(jī)的或其中任何基體的組合，作為顆粒、鏈、沉淀物、凝膠、片、管狀物、 球、容器、毛細(xì)管、墊、薄片、膜、板、載片等存在?；w可具有任何便利的形狀例如圓盤形、 正方形、球形、環(huán)形等?；w一般是平的，但可采用各種備選的表面構(gòu)型。例如，基體可包 含提高或降低合成發(fā)生的區(qū)域。基體及其表面可以形成在其上進(jìn)行本文所述反應(yīng)的剛性載 體。也選擇基體及其表面，以提供合適的光吸收性質(zhì)。例如，基體可以是聚合的Langmuir Blodgett膜、玻璃、官能化的玻璃、Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4、改性硅或各種凝膠或聚合 物中的任何一種，例如聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其組合。
用于形成本發(fā)明反應(yīng)器的合適材料包括但不限于聚合物材料、陶瓷(包括氧化鋁 等)、玻璃、石英、金屬、復(fù)合材料及其層壓材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，基體是玻璃。在其它實(shí)施方案中，基體是聚合物材料。聚合物材料將通常為有機(jī)聚合物，是天然存在或合成、交聯(lián)或非交聯(lián)的均聚物或 共聚物。具體的目標(biāo)聚合物包括但不限于聚烯烴例如聚丙烯、聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚酯、聚 酰胺、聚醚、聚氨酯、多氟烴、聚苯乙烯、丙烯腈_ 丁二烯_苯乙烯聚合物(ABS)、丙烯酸酯和 丙烯酸聚合物例如聚甲基丙烯酸甲酯和其它取代的和未取代的聚烯烴及其共聚物?；w和蓋板也可由“復(fù)合材料”即由不同的材料組成的組合物制備。復(fù)合材料可 以是嵌段復(fù)合材料例如A-B-A嵌段復(fù)合材料、A-B-C嵌段復(fù)合材料等?；蛘?，復(fù)合材料可以 是不均勻的材料組合，即其中材料不同于分離相或不同材料的均勻組合。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù) 語“復(fù)合材料”用于包括“層壓”復(fù)合材料。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“層壓材料”是指由相同或 不同材料的幾個(gè)不同粘合層形成的復(fù)合材料。其它復(fù)合材料基體包括聚合物層壓材料、聚 合物_金屬層壓材料例如用銅涂覆的聚合物、陶瓷_金屬或聚合物_金屬復(fù)合材料?？蓪⒒w和蓋板的表面化學(xué)改性，以提供期望的化學(xué)或物理性質(zhì)，例如，以減少分 子部分吸附至反應(yīng)室的內(nèi)壁，并減少電滲流動(dòng)。例如，玻璃、聚合物或陶瓷基體和/或蓋板 的表面可涂覆有或官能化以包含電中性分子類物質(zhì)、兩性離子基團(tuán)、親水性或疏水性低聚 物或聚合物等。通過具有活性位點(diǎn)或官能團(tuán)例如羧基、羥基、氨基和鹵代烷基的聚酰亞胺、 聚酰胺和聚烯烴(例如聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈等)，或用可修飾以便 包含此類活性位點(diǎn)或官能團(tuán)的聚合物，將這些基團(tuán)化學(xué)鍵合至可以提供各種期望表面性質(zhì) 的表面是可能的。改性的基體是官能化以便包含表面結(jié)合的水溶性聚合物例如聚環(huán)氧乙烷 (PEO)的聚酰亞胺，這趨向于在DNA擴(kuò)增和涉及雜交技術(shù)的其它方法中減少不需要的吸附 并使非特異性結(jié)合最小化。也可使用表面活性劑(例如聚環(huán)氧乙烷三嵌段共聚物，例如可 按商品名“普盧蘭尼克”、聚氧乙烯脫水山梨糖醇或“吐溫”得到的那些)、天然聚合物(例 如牛血清白蛋白或“BSA”)或提供期望表面性質(zhì)尤其是減少生物分子例如核酸或蛋白質(zhì)吸 附的其它部分，使基體表面有利地改性。也應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，單一基體的不同區(qū)域可具有化學(xué)不同的表面。例如，反應(yīng)室可具有一 個(gè)例如用聚環(huán)氧乙烷等涂覆或官能化的內(nèi)表面，而反應(yīng)室的另一個(gè)內(nèi)表面可不涂覆或官能 化。以這種方式，存在于相同基體的不同組件和特征可用于進(jìn)行不同的化學(xué)或生物化學(xué)過 程，或在單一化學(xué)或生物化學(xué)過程中的不同步驟。基體可以是導(dǎo)熱率大于約0. Iff/mK,或大于約0. 5ff/mK,或大于約lW/mK的導(dǎo)熱性 材料。這允許在快速加熱和冷卻循環(huán)期間快速的熱傳遞。在一個(gè)實(shí)施方案中，基體是導(dǎo)熱率大于約lW/mK的導(dǎo)熱性聚丙烯。導(dǎo)熱性聚丙烯 通常包括用作加熱元件的材料。合適的導(dǎo)熱性材料可包括例如鐵、鎳、鈷、鉻；碳鋼纖維、磁 性不銹鋼纖維、鎳?yán)w維、鐵磁性涂覆的導(dǎo)電纖維、鐵磁性涂覆的非導(dǎo)電纖維及其合金。在一個(gè)實(shí)施方案中，加熱基體，以提高反應(yīng)器的溫度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，冷卻 基體，以降低反應(yīng)器的溫度。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，將基體加熱，且然后冷卻，以調(diào)節(jié)反應(yīng) 器的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，蓋板是玻璃。緩沖層
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在反應(yīng)器中，在基體與蓋板之間使用緩沖層。緩沖層應(yīng)該對基體和蓋板具有良好 的粘附。緩沖層應(yīng)該也不能被樣品中使用的液體透過。緩沖層應(yīng)該能夠經(jīng)得起4°C-95°C 延長時(shí)間(例如1-2小時(shí))的反復(fù)循環(huán)。緩沖層也應(yīng)該不干擾PCR過程和檢測系統(tǒng)?？墒褂酶鞣N緩沖層，雖然所選擇的任何緩沖層應(yīng)該能夠經(jīng)得起在置于反應(yīng)室內(nèi)的 任何樣品材料的處理期間產(chǎn)生的力，例如，在樣品材料的分布期間發(fā)生的力、在樣品材料的 熱處理期間發(fā)生的力等。在例如涉及熱循環(huán)的處理的地方，那些力可能很大。在一個(gè)實(shí)施 方案中，用于與樣品處理裝置連接的緩沖層應(yīng)該顯示低熒光，并與用于與PCR連接的過程 和材料相容。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可顯示密封劑和/或粘合劑的性質(zhì)。此類緩沖層可更 適用樣品處理裝置的高體積生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈兺ǔ２簧婕坝糜谌廴谡澈系母邷亟Y(jié)合過程，它 們也不存在在液體粘合劑、溶劑粘合、超聲粘合等的使用中固有的操作問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可包括確保緩沖層的性質(zhì)不受水的不利影響的材料。 例如，緩沖層不應(yīng)該喪失粘附、喪失粘合強(qiáng)度、軟化、膨脹、或響應(yīng)在樣品裝載和處理期間暴 露至水而變得不透明。并且，緩沖層不應(yīng)該包含可在樣品處理期間被提取至水中，因此可能 損害裝置性能的任何組分。此外，緩沖層可以是單一材料或兩種或多種材料的組合或摻混物。緩沖層可由例 如溶劑涂覆、絲網(wǎng)印刷、輥印刷、熔融擠出涂覆、熔融噴涂、罐頭接縫補(bǔ)涂(stripe coating) 或?qū)訅悍椒ǖ玫?。緩沖層可以具有各種厚度，只要它滿足顯示以上的性質(zhì)和特性。為了達(dá) 到最大的粘合精確度，且如果需要，為了用作鈍化層，緩沖層應(yīng)該是連續(xù)的且無小孔或多孔 性。可以施加在本領(lǐng)域中已知的任何粘合劑組合物作為緩沖層。在例如以下的文獻(xiàn) 中描述了合適的粘合劑組合物“粘附和粘合”，聚合物科學(xué)與工程的百科全書，第1卷，第 476-546頁，Interscience出版社，第二版，1985年。在一個(gè)實(shí)施方案中，粘合劑組合物是不 透水的。合適的不透水的粘合劑包括例如天然橡膠膠乳基粘合劑、合成橡膠基粘合劑、硅基 粘合劑和熱熔粘合劑。對于本發(fā)明的目的，也可以使用許多其它粘合劑，具體的選擇取決于 互相粘合的兩個(gè)表面的性質(zhì)、完成粘合的環(huán)境和所得產(chǎn)品的預(yù)定用途。在以下文獻(xiàn)中可以 找到粘合劑的徹底討論“Ullmann氏工業(yè)化學(xué)百科全書”，VCH VerlagsgesellschaftGmbH, 德國，1985年，Al卷，第221-267頁和“化學(xué)技術(shù)百科全書”，第4版，John Wiley & Sons, NYC，1991年，第1卷，第445-466頁。也使用可固化的粘合劑。然而，也可使用接觸粘合劑、 壓敏粘合劑、橡膠基粘合劑、乳液粘合劑、熱熔粘合劑、天然產(chǎn)物粘合劑、聚氨酯粘合劑、丙 烯酸粘合劑、環(huán)氧樹脂粘合劑、苯酚粘合劑和聚酰亞胺粘合劑。合適的密封劑組合物類別也可包括例如聚氨酯、聚異丁烯、丁基橡膠、彈性體、環(huán) 氧化物(印oxys)、天然橡膠和合成橡膠、聚硅氧烷、聚硫化物、丙烯酸酯及其組合。密封劑組 合物可包括極性基因和/或反應(yīng)基團(tuán)(例如硅烷、氨酯、酯、疏基及其組合)，以提供足夠的 與靶基體(例如玻璃和塑料)的共價(jià)和/或極性(例如氫鍵)鍵合。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可由疏水性材料組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可由 聚硅氧烷材料組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用硅密封劑。聚硅氧烷密封劑通常包括聚硅氧烷聚合物、一 種或多種填充劑、交聯(lián)組分例如反應(yīng)性硅烷和催化劑的混合物。聚硅氧烷聚合物具有 硅氧烷主鏈，并包括側(cè)鏈烷基、烷氧基或乙酰氧基。此類基團(tuán)水解至硅烷醇基，其通過縮合形成 更大的鏈。聚硅氧烷密封劑可通過塞縫槍、鏟或其它合適的方法來施加，并通過暴露于潮濕 的空氣中固化。聚硅氧烷密封劑具有低收縮性質(zhì)，并可在寬溫度范圍內(nèi)施加和使用。由于 其溫和的固化條件，室溫硫化(RTV)硅橡膠密封劑尤其有用。合適的室溫硫化(RTV)硅橡 膠密封劑包括例如一種組分的RTV橡膠(KE3475，Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.，日本) 和一部分濕固化的 RTV (SE 9120, Dow Corning Corporation，Midland，MI，美國)。除濕固化硅密封劑材料之外，也可使用可輻射固化的硅密封劑。合適的可紫外輻 射固化的聚硅氧烷密封劑組合物通常包含(i)含輻射敏感性官能團(tuán)的有機(jī)聚硅氧烷，和 (ii)光引發(fā)劑。輻射敏感性官能團(tuán)的實(shí)例包括丙烯?；?、異丁烯酰基、疏基、環(huán)氧基和烯基 醚基團(tuán)。光引發(fā)劑的類型取決于在有機(jī)聚硅氧烷中輻射敏感性基團(tuán)的性質(zhì)。光引發(fā)劑的實(shí) 例可包括二芳基碘錯(cuò)鹽、锍鹽、苯乙酮、二苯甲酮和苯偶姻及其衍生物。尤其有用的不飽和 有機(jī)硅化合物類型每分子具有至少一個(gè)連接至硅的脂族不飽和有機(jī)基團(tuán)。脂族不飽和有機(jī) 硅化合物包括硅烷、聚硅烷、硅氧烷、硅氮烷、以及通過亞甲基或聚亞甲基或亞苯基連接在 一起的含硅原子的單體材料或聚合物材料。緩沖層也可選自聚硅氧烷類材料，該聚硅氧烷類材料基于聚硅氧烷聚合物與增粘 性樹脂的組合，如例如“聚硅氧烷壓敏粘合劑”，壓敏粘合劑技術(shù)手冊，第3版，第508-517頁 所述。聚硅氧烷壓敏粘合劑的疏水性、其經(jīng)受高溫的能力及其結(jié)合至各種不同表面的能力 是已知的?？赡茉赑CT專利申請公布號(hào)WO 00/68336中描述了一些合適的組合物。其它合適 的組合物可基于聚硅氧烷-聚脲基壓敏粘合劑家族。在以下專利中描述了此類組合物美 國專利號(hào)5,461, 134 ；美國專利號(hào)6,007,914 ；PCT專利申請公布號(hào)WO 96/35458 ；PCT專利 申請公布號(hào)WO 96/34028 ；和PCT專利申請公布號(hào)WO 96/34029。此類壓敏粘合劑基于聚 硅氧烷-聚脲聚合物與增粘劑的組合。需要時(shí)，增粘劑可以選自官能(反應(yīng)性)和非官能 增粘劑類增粘劑。需要時(shí)，可以改變一種或多種增粘劑的水平，以便將期望的粘性賦予粘合 劑組合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，壓敏粘合劑組合物可以是增粘的聚二有機(jī)硅氧烷寡脲 (oligurea)鏈段共聚物，包括(a)軟聚二有機(jī)硅氧烷單元、硬聚異氰酸酯殘基單元，其中聚 異氰酸酯殘基是聚異氰酸酯減去-NCO基團(tuán)，任選軟和/或硬的有機(jī)聚胺單元，其中異氰酸 酯單元和胺單元的殘基通過脲鍵連接；和(b) 一種或多種增粘劑(例如硅酸酯樹脂等)。在一些實(shí)施方案中，阻擋層可以是例如單側(cè)面或雙側(cè)面的不透水粘合帶。在其它 實(shí)施方案中，阻擋層可以是例如用不透水的粘合劑涂在一個(gè)側(cè)面或兩個(gè)側(cè)面的墊圈。在其 它實(shí)施方案中，阻擋層可以是例如不透水的層壓材料。制備可以使用任何常規(guī)方法制備基體，該方法包括但不限于微模塑和鑄造技術(shù)、壓花 法、表面顯微機(jī)械加工和主體顯微機(jī)械加工。后一種技術(shù)涉及通過直接蝕刻入主體材料內(nèi) 形成微觀結(jié)構(gòu)，通常使用濕化學(xué)蝕刻或活性離子蝕刻。表面顯微機(jī)械加工涉及由沉積在基 體表面上的膜制備。雖然前述討論已經(jīng)將DNA用作核酸，但是將本文公開的方法應(yīng)用至其它核酸，包 括RNA序列或RNA序列與DNA序列的組合，對本領(lǐng)域的合格技術(shù)人員來說將是顯而易見的。應(yīng)該理解，本發(fā)明的某些描述已經(jīng)進(jìn)行了簡化，以僅舉例說明與清楚理解本發(fā)明有關(guān)的那些元件和限制，同時(shí)為了清楚的目的刪除了其它元件。本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人 員在考慮本發(fā)明的描述之后，將認(rèn)識(shí)到為了實(shí)施本發(fā)明，可能需要其它元件和/或限制。然 而，因?yàn)槠胀夹g(shù)人員在考慮了本發(fā)明的描述之后，就可容易地確定此類其它元件和/或 限制，并不必完全理解本發(fā)明，所以本文中不提供此類元件和限制的討論。
實(shí)施例以下實(shí)施例舉例說明上述發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，在實(shí)施例中 所述的技術(shù)和試劑提示可以實(shí)施本發(fā)明的許多其它方法。實(shí)施例1該實(shí)施例舉例說明微陣列反應(yīng)器的制備，該反應(yīng)器用于使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 方法和衰減波檢測技術(shù)，定量分析核酸。反應(yīng)室由玻璃蓋板和導(dǎo)熱性聚丙烯基體制成。使玻璃蓋板的內(nèi)表面化學(xué)改性，以 減少熒光物質(zhì)和其它污染物的吸附。按已知的二維圖案，將靶核酸探針固定至玻璃蓋板的 內(nèi)表面。玻璃蓋板也是透明的且適用于衰減波檢測技術(shù)。使用模塑法制備具有內(nèi)腔的導(dǎo)熱性聚丙烯基體。將入口和出口整合至基體內(nèi)。將 玻璃蓋板和聚丙烯基體裝配，并通過緩沖層密封在一起，形成反應(yīng)器。在裝載樣品之后，用 橡膠塞密封入口和出口。為了防止熱循環(huán)反應(yīng)器的液體泄漏，在基體與蓋板之間使用緩沖層。將可固化的 硅橡膠(得自Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.，Japan的KE3475)用作緩沖層。該硅橡膠不 透水，且能夠經(jīng)得起4°C _95°C的溫度。在固化之后，該硅橡膠也不會(huì)干擾PCR過程或顯示 低熒光。為了防止損傷玻璃蓋板、聚丙烯基體和固定化的靶探針，硅橡膠是室溫硫化(RTV) 材料。將樣品和各種分析試劑及反應(yīng)物從外部來源通過入口弓丨入反應(yīng)室內(nèi)。當(dāng)通過入口 引入液體時(shí)，出口用作氣孔。在樣品和各種分析試劑及反應(yīng)物加入之后，將合適大小、硬度 和化學(xué)抗性的一組橡膠塞用于密封反應(yīng)室的入口和出口。當(dāng)使用反應(yīng)器用于核酸檢測時(shí)，通過PCR溫度循環(huán)程序加熱和冷卻反應(yīng)器及其內(nèi) 部試劑。例如，將半導(dǎo)體冷卻器用于加熱/冷卻由導(dǎo)熱性聚丙烯材料制成的基體。在PCR過 程期間，在每一擴(kuò)增循環(huán)中的退火/延伸步驟，使室內(nèi)的靶DNA呈指數(shù)式擴(kuò)增，并使擴(kuò)增的 DNA產(chǎn)物雜交至固定在玻璃蓋板內(nèi)表面上的靶探針。玻璃蓋板適用于通過衰減波進(jìn)行熒光 檢測。玻璃蓋板可由例如K9光學(xué)玻璃制成，該K9光學(xué)玻璃的折光指數(shù)大于在反應(yīng)器內(nèi)的 PCR/雜交緩沖劑的折光指數(shù)。熒光分子例如CY5可用于PCR引物標(biāo)記。CY5在649nm激發(fā) 最大并在670nm發(fā)射最大。已經(jīng)參考各種具體的實(shí)施方案和技術(shù)描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解可進(jìn)行許多 變化和修改，而仍然在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器，所述反應(yīng)器包括基體，所述基體具有第一個(gè)平的相對表面和第二個(gè)平的相對表面，所述基體具有腔；緩沖層，所述緩沖層排列在所述基體的第一個(gè)平的表面之上；蓋板，所述蓋板排列在所述緩沖層之上，所述蓋板與所述腔和緩沖層聯(lián)合限定反應(yīng)室；和至少一個(gè)入口和至少一個(gè)出口，它們通過所述基體與反應(yīng)室相通，確保來自外部來源的流體通道進(jìn)入并穿過所述反應(yīng)室，并因此限定流體流動(dòng)通路；其中所述靶核酸定量分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法和衰減波檢測技術(shù)。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)器，其中所述基體、緩沖層和蓋板各自獨(dú)立地由化學(xué)惰性材料組 成，所述化學(xué)惰性材料是熱穩(wěn)定的并抗污染。
3.權(quán)利要求1的反應(yīng)器，其中所述基體和蓋板各自獨(dú)立為玻璃、金屬、陶瓷、復(fù)合材料、 聚合物材料或其組合或?qū)訅翰牧稀?br> 4.權(quán)利要求3的反應(yīng)器，其中所述聚合物材料是聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、聚 醚、聚氨酯、多氟烴、聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴 或其共聚物。
5.權(quán)利要求3的反應(yīng)器，其中基體為導(dǎo)熱性聚丙烯。
6.權(quán)利要求1的反應(yīng)器，其中基體的導(dǎo)熱率大于約lW/mK。
7.權(quán)利要求1的反應(yīng)器，其中所述緩沖層為不透水的密封劑。
8.權(quán)利要求7的反應(yīng)器，其中所述不透水的密封劑是室溫硫化的硅橡膠。
9.權(quán)利要求3的反應(yīng)器，其中所述蓋板是玻璃板。
10.一種用于靶核酸定量分析的方法，所述方法包括(a)將樣品流體引入反應(yīng)器內(nèi)，所述樣品流體包含一種或多種靶核酸、一種或多種熒光 標(biāo)記的引物、一種或多種任選熒光標(biāo)記的dNTP、熱穩(wěn)定性核酸聚合酶和緩沖劑，所述反應(yīng)器 包括基體，所述基體具有第一個(gè)平的相對表面和第二個(gè)平的相對表面，所述基體具有腔；緩沖層，所述緩沖層排列在所述基體的第一個(gè)平的表面之上；蓋板，所述蓋板排列在所述緩沖層之上，所述蓋板與所述腔和緩沖層聯(lián)合限定反應(yīng)室；和至少一個(gè)入口和至少一個(gè)出口，它們通過所述基體與反應(yīng)室相通，確保來自外部來源 的流體通道進(jìn)入并穿過所述反應(yīng)室，并因此限定流體流動(dòng)通路；(b)施加動(dòng)力，以使樣品流體沿流動(dòng)通路移動(dòng)進(jìn)入所述反應(yīng)室；(c)密封至少一個(gè)入口和至少一個(gè)出口；(d)在所述反應(yīng)室中加熱樣品流體，以將一種或多種雙鏈靶核酸分離為單鏈靶核酸；(e)冷卻樣品，以允許一種或多種熒光標(biāo)記的引物雜交至所述單鏈靶核酸，且所述單鏈 靶核酸通過熱穩(wěn)定性核酸聚合酶進(jìn)行復(fù)制；和(f)重復(fù)步驟(d)和(e)，以達(dá)到期望的擴(kuò)增程度；(g)由雜交至一種或多種靶核酸的一種或多種熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子激活一種或多種熒光 反應(yīng)；和(h)檢測用于定量分析一種或多種靶核酸的所述一種或多種熒光反應(yīng)，其中通過使用預(yù)定波長的衰減波激活所述一種或多種熒光反應(yīng)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述核酸的定量分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述動(dòng)力包含施加電壓差或壓力差的工具。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述基體和蓋板各自獨(dú)立為玻璃、金屬、陶瓷、復(fù)合材料、 聚合物材料或其組合或?qū)訅翰牧稀?br> 14.權(quán)利要求13的方法，其中所述聚合物材料是聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、聚 醚、聚氨酯、多氟烴、聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯聚合物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴 或其共聚物。
15.權(quán)利要求13的方法，其中基體是導(dǎo)熱性聚丙烯。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述基體的導(dǎo)熱率大于約lW/mK。
17.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖層是不透水的密封劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述不透水的密封劑是室溫硫化的硅橡膠。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述蓋板是玻璃板。
20.一種用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器，所述反應(yīng)器包括基體，所述基體具有第一個(gè)平的相對表面和第二個(gè)平的相對表面，所述基體具有腔；緩沖層，所述緩沖層排列在所述基體的第一個(gè)平的表面之上；蓋板，所述蓋板排列在所述緩沖層之上，所述蓋板與所述腔和緩沖層聯(lián)合限定反應(yīng)室；和至少一個(gè)入口和至少一個(gè)出口，它們通過所述基體與反應(yīng)室相通，確保來自外部來源 的流體通道進(jìn)入并穿過所述反應(yīng)室，并因此限定流體流動(dòng)通路；其中所述靶核酸的定量分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法和衰減波檢測技術(shù)，其中所 述基體是聚合物材料，所述緩沖層是不透水的密封劑，所述蓋板是玻璃板，且其中所述基體 的導(dǎo)熱率大于約lW/mK。
全文摘要
提供使用衰減波檢測技術(shù)，定量分析靶核酸的反應(yīng)器及其使用方法。該反應(yīng)器包括有腔的基體、排列在基體上的緩沖層、排列在緩沖層上的蓋板以及入口和出口。該反應(yīng)器對于PCR處理來講是熱和化學(xué)穩(wěn)定的并適用于衰減波檢測技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/533GK101952411SQ200780102406
公開日2011年1月19日 申請日期2007年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日
發(fā)明者H·廖, W·王, Z·H·孫 申請人:霍尼韋爾國際公司