專利名稱：以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷芯片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學與物理科學，特別提供了一種以水凝膠平面微圖案化
為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧垸(PDMS)芯片的技術(shù)。
背景技術(shù)：
微流控芯片領(lǐng)域的快速發(fā)展顯然得益于日益簡化并且靈活多樣的微流 控芯片技術(shù)。典型的微流控芯片的制備過程主要涉及在各種材料中制備出 具有所需微通道幾何結(jié)構(gòu)的微溝槽，繼之以打孔、封接等步驟，最終形成 閉合的微流路系統(tǒng)。早期所用方法多是借用微電子行業(yè)和微機電系統(tǒng) (MEMS)領(lǐng)域已有微加工技術(shù)和材料[Science. 1993， 261(5123): 895-897, Science. 1998,280(5366): 1046-1048， Trac墨Trends in Analytical Chemistry.2000,19(6):364-378]，如 制作玻璃、石英或硅芯片所涉及的濺射、沉積、光刻、干法或濕法刻蝕、 高溫或陽極健合等，此類技術(shù)雖能確保制備出高質(zhì)量或具有精細通道結(jié)構(gòu) 的微流控芯片，但過程繁瑣，成本高，可加工材料種類有限，因而難于普 及；針對熱塑性材料的注塑、熱壓等技術(shù)亦有采用[Electrophoresis. 2000,21(1): 12-26， Lab on a Chip. 2004， 4(1): 28-37，Analytical Chemistry. 2005， 77(22): 7122-7130，]，雖 可實現(xiàn)芯片的批量化制備，但前段工藝復雜、成本高，所制芯片結(jié)構(gòu)也較 單一；利用軟刻蝕基本技術(shù)，通過簡易的澆塑復形工藝，輔之以簡單、靈 活的封接方法，制備聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，是目前廣為采用的微 流控芯片制作技術(shù)[Science. 2000， 290(5496): 153&1540， Electrophoresis. 2003， 24(21):3563-3576， Analytical Chemistry. 2002， 74(7): 1537-1545〗。PDMS所具有的諸如彈 性、透氣性、低表面自由能等理化性質(zhì)賦予其在芯片設(shè)計、制作和應用方 面以更多的靈活性，因而亦是應用最為普遍的芯片材料。但，原則上，制備 PDMS芯片所需的復形模板仍需通過傳統(tǒng)的光刻工藝制得，其中(以SU-8 膜板制作為例)所涉及的諸如基片處理、勻膠、軟烘、曝光、后烘、顯影、 硬烘等步驟使得整個芯片制作過程仍顯繁瑣，非專業(yè)實驗室亦難于掌握。 進一步簡化芯片技術(shù)，對于微流控片研究和應用的深入普及應當有所幫助。
另一方面，日益多樣化的應用，對于微流控芯片結(jié)構(gòu)的復雜性亦有更
高的要求，其中多涉及如構(gòu)建三維流路網(wǎng)絡(luò)[Analytical Chemistry. 2000,72(14):
3158-3164,]，以實現(xiàn)多維分離分析[Analytical Chemistry. 2002， 74(8): 1772-1778]、
模擬計算[Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America. 2001， 98(6): 2961-2966]、樣品混合[Lab on a Chip. 2004， 4(4): 342-350]等功
能；制備弧形截面通道，用于制作微閥微泵[Science. 2000， 288(5463): 113-116,
Science. 2002， 298(5593): 580-584， Lab on a Chip. 2006， 6(7): 849-856];或者在同一芯
片中構(gòu)建多尺度微流路已實現(xiàn)顆粒填充[Analytical Chemistry. 2006， 78(5): 1444-1451， Analytical Chemistry. 2007， 79(16): 6135-6142， Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006， 103(51): 19272-19277〗、細胞
的定位[Lab on a Chip. 2005， 5(6): 628-633， Lab on a Chip. 2005， 5(1): 49-55〗，微液滴的
生成過程。制作此類芯片，通常需通過多步曝光、多層對準等光刻工藝或
采用特殊掩模和專門設(shè)備方能實現(xiàn)，對于專業(yè)實驗室也非易事。芯片制備
技術(shù)上的高門檻，無疑限制了微流控芯片在這些重要應用領(lǐng)域深入發(fā)展。
針對PDMS芯片的簡易制備技術(shù)，曾多有研究，如設(shè)計簡易的光刻設(shè)備[Advanced Materials. 2004， 16(22): 1997-+]、以市售UV膠代替SU-8光刻膠 [Sensors and Actuators B-ChemicaL 2005， 107(2》632-639， Sensors and Actuators B-Chemical. 2004， 98(2-3): 337-346.]，用金屬絲、打印油墨圖形、甚至兒童玩具 [LabonaChip.2008，8:170-172]作為PDMS復形模板。這些技術(shù)雖然簡單，但多 以犧牲所制芯片質(zhì)量為代價，對芯片性能的提升亦無貢獻。
技術(shù)簡化并兼顧質(zhì)量和性能，應是當前對微流控芯片制備技術(shù)發(fā)展的 基本要求。基于這一認識，本發(fā)明的目的在于建立了一種以水凝膠平面微圖 案化為基礎(chǔ)的"液塑法"制備PDMS芯片的新技術(shù)通過水凝膠平面圖案化 構(gòu)建化學異質(zhì)性表面；并于其上制備出立體液態(tài)微條紋；以此為復形模板， 通過澆塑復形法制備PDMS微流控芯片。復形模板僅通過簡單的試劑、材 料和過程即可制得，因而這種芯片制作過程較SU-8為復形模板的常規(guī)芯片 制作過程更為簡單、經(jīng)濟、靈活；以化學異質(zhì)性表面自組織生成的結(jié)構(gòu)化 液體為復形結(jié)構(gòu)，所制微通道表面具有三維曲面幾何結(jié)構(gòu)，通過對這一結(jié) 構(gòu)特性的靈活運用，亦可賦予芯片設(shè)計和應用以特有的簡易性和靈活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于簡單的PDMS復型模版制作方法，具體 而言，本發(fā)明提供了一種以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的"液塑法"制備聚 二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的方法。
本發(fā)明以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷 (PDMS)芯片的方法，其特征在于采用光刻技術(shù)建立了以液態(tài)單體溶液 為感光材料，通過"夾液式"光刻方法制備水凝膠立體微圖案，并在此微圖案表面制備液體微條紋，并以之為復形模板，通過澆塑復形法制備出具有三
維曲面通道結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧垸(PDMS)芯片。
本發(fā)明所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧 垸芯片的方法的具體過程是
其一，首先將玻璃表面硅垸化，制得表面疏水且富含雙鍵基團的玻璃
蓋片；然后制備水凝膠光敏反應液，借助于水凝膠光敏反應液制得附著于 玻璃蓋片表面的水凝膠立體微圖案；所制得的蓋片具有親水的水凝膠立體 微圖案區(qū)域和疏水區(qū)域；
其二，將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片浸沒于丙三醇水溶液中，沿垂直 方向緩慢、勻速提拉出液面，通過浸涂法在玻璃蓋片的微圖案化表面制備 出立體液態(tài)微條紋；
其三，以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在聚二 甲基硅氧烷(PDMS)表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽，并繼以制孔、封 接操作，最終制備出完整的聚二甲基硅氧垸(PDMS)芯片。
本發(fā)明所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧 垸芯片的方法的優(yōu)選內(nèi)容如下
1)將玻璃表面硅垸化的過程具體是
首先將載玻片在濃硫酸與雙氧水混合溶液Piranha液(濃硫酸/雙氧水 =3/1， v/v)中煮沸5 40分鐘，待冷卻后用大量純凈水清洗，除去殘余硫 酸；隨后轉(zhuǎn)入濃度為0.15 lM的NaOH溶液中，浸泡3 60分鐘，再以大 量水清洗，除去殘余的NaOH;然后吹干備用；選用質(zhì)量濃度為80 98%的乙醇水溶液(進一步優(yōu)選是95%的乙醇水 溶液)作為硅垸化反應液，向其中加入適量體積的硅烷化試劑3— (三甲 基甲硅烷基)丙基-甲基丙烯酸酯和醋酸(TPM);將清洗干凈的載玻片浸于 硅垸化反應液中孵育2 15分鐘；再用無水乙醇洗凈吹干，于105 200。C 真空烘箱中脫水1 10小時，制得表面疏水且富含雙鍵基團的玻片；
上述l)的進一步優(yōu)選內(nèi)容是在將玻璃表面硅烷化的過程中，硅垸化
反應液為中加入1 10PL/mL體積的硅烷化試劑3-(三甲基甲硅垸基)丙基-甲基丙烯酸酯(TPM)和20 50WVmL體積醋酸。
2)借助于水凝膠光敏反應液制得附著于玻璃蓋片表面的水凝膠立體微 圖案的過程具體是
以丙烯酰胺(AAM)和N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)為單體溶液， 以2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMAP)為引發(fā)劑，制備水凝膠光敏反應液;
以所制得的表面疏水且富含雙鍵基團的硅烷化玻片作為蓋片，底片為 同尺寸的聚氨酯模；將蓋片與底片對合，兩端以生料帶隔開，形成一定的 空腔；吸取一定體積的光敏反應液從蓋片與底片間隙注入反應腔；將掩模 平鋪于蓋片上方，以紫外光曝光1 30秒；再將底片與蓋片剝離；相繼以 丙酮、去離子水清洗蓋片以除去未反應的單體、引發(fā)劑和溶劑，至此制得 附著于蓋片表面的水凝膠立體微圖案。
上述2)的進一步優(yōu)選內(nèi)容是借助于水凝膠光敏反應液制得附著于玻 璃蓋片表面的水凝膠立體微圖案的過程中
制備聚丙烯酰胺水凝膠的要求是以丙烯酰胺(AAM)和N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)為單體，其質(zhì)量濃度比為19: 1，單體總濃度范圍是 5 15%;
將150 350mg/ml 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMAP)溶于N-甲基 吡咯垸酮中為引發(fā)劑儲液；
以硅垸化玻片作為蓋片，底片為同尺寸的厚度為50 400微米的聚氨 酯模；將蓋片與底片對合，兩端以生料帶隔開，形成高度為100-200微米的 空腔；
將一定體積的光敏反應液從蓋片與底片間隙注入反應腔；將掩膜平鋪 于蓋片上方，以紫外光曝光2 20秒；曝光強度為100 500mW，再將底 片與蓋片剝離；相繼以丙酮、去離子水清洗蓋片以除去未反應的單體、引 發(fā)劑和溶劑，至此制得附著于蓋片表面的水凝膠立體微圖案。
3)通過浸涂法在玻璃蓋片的微圖案化表面制備出立體液態(tài)微條紋的具 體過程是
將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片浸沒于20 80%丙三醇水溶液中，沿基 本垂直液面的方向緩慢、勻速拉出液面，在此微圖案化表面制備出立體液 態(tài)微條紋；將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片從丙三醇水溶液中提拉出來的提 拉速度為200 500微米/秒。
通過浸涂法在此微圖案化表面制備出立體液態(tài)微條紋，是通過界面張 力驅(qū)動液體在化學異質(zhì)性表面的自組織所制取的液體微條紋，其表面具有 三維曲面結(jié)構(gòu)；
通過浸涂法制備出立體液態(tài)微條紋其三維曲面結(jié)構(gòu)，其曲面上各點的高度是其水平位置的函數(shù)，其曲面高度與掩膜的寬度的比值為0.05 2;
4)所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧垸芯 片的方法中，以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在聚 二甲基硅氧烷(PDMS)表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽，并繼以制孔、 封接操作，最終制備出完整的聚二甲基硅氧垸(PDMS)芯片的具體過程是:
其一，將Sylgard184聚二甲基硅氧烷(PDMS)預聚體和引發(fā)劑按比 例充分混合；將混合產(chǎn)物緩慢澆注于水平放置的液體復形模板表面；靜置； 然后轉(zhuǎn)入烘箱中在50 95'C條件下烘烤；
其二，將此已初步聚合的聚二甲基硅氧垸從模板上揭下，于65°C 160'C繼續(xù)加熱直至聚二甲基硅氧烷完全聚合；
其三，在各通道末端位置打出穿孔，作為進出口樣品池；
其四，連同一塊空白玻片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片轉(zhuǎn)入等離子 體清洗器中，抽真空，氧氛圍下等離子體氧化，然后將聚二甲基硅氧烷 (PDMS)基片通道面與載玻片對合并于50'C 1200'C加熱15 150分鐘， 以使兩者不可逆封接到一起，形成閉合的微通道，至此，制得液塑聚二甲 基硅氧烷(PDMS)微流控芯片。
上述的4)的進一步優(yōu)選內(nèi)容是
以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在聚二甲基硅 氧烷(PDMS)表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽，并繼以制孔、封接操作， 最終制備出完整的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的具體過程是其一，將按比例充分混合并進行真空脫氣處理后的Sylgard184聚二甲 基硅氧垸(PDMS)預聚體和引發(fā)劑澆注于水平放置的液體復形模板表面; 制后靜置10 100分鐘；轉(zhuǎn)入烘箱中，在6(TC 8(TC烘烤20 60分鐘；
其二，將此已初步聚合的聚二甲基硅氧垸(PDMS)從模板上揭下，于 8(TC 12(TC繼續(xù)加熱2 3小時，以使聚二甲基硅氧烷(PDMS)完全聚合；
其三，用內(nèi)徑3毫米不銹鋼管在各通道末端位置打出穿孔，作為進出 口樣品池；
其四，連同一塊清洗干凈的空白玻片和聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片 轉(zhuǎn)入等離子體清洗器中，抽真空，氧氛圍下等離子體氧化30 卯秒；之后 迅速將聚二甲基硅氧烷(PDMS)基片通道面與載玻片對合并于6(TC 8(TC 加熱30 90分鐘，以使兩者不可逆封接到一起，形成閉合的微通道，至此， 制得液塑聚二甲基硅氧垸(PDMS)微流控芯片。
在4)所述的內(nèi)容中，以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑 復形法在聚二甲基硅氧烷(PDMS)表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽的過 程中，制得的聚二甲基硅氧垸(PDMS)通道的型態(tài)為曲面結(jié)構(gòu)，其通道深 度能夠通過掩膜中二維圖形形狀和尺寸的調(diào)節(jié)；通過控制復形微結(jié)構(gòu)的三 維形狀，實現(xiàn)對所制微通道表面幾何結(jié)構(gòu)的三維調(diào)控。
總之，上述液塑法制備聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的技術(shù)，較之于 傳統(tǒng)方法，顯然更為簡易，這種簡易性源于其模板制備過程的簡單。傳統(tǒng) 方法中，復形模板多是以SU-8負膠通過平面光刻技術(shù)制得，其中涉及基片處理、勻膠、軟烘、曝光、后烘、顯影、硬烘等基本步驟，需耗時數(shù)小時
方能完成。并且，相比于一般光刻膠，SU-8的光刻質(zhì)量對各步驟的操作條 件更為敏感，因而SU-8模板的制備，對工藝條件、儀器設(shè)備以及工作環(huán)境 均有相對較高的要求。而液塑模板僅需通過基片清洗和硅垸化、光刻、以 及浸涂三個基本步驟即可制得，其中所涉及的操作也更為簡單，制備此類 模板的簡易性顯而易見。由此，亦使得整個芯片制作過程大大簡化。另一 方面，通過界面張力驅(qū)動液體在化學異質(zhì)性表面的自組織所制取的液體微 條紋，其表面具有三維曲面結(jié)構(gòu)，而非常規(guī)的臺階或柱面結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu) 上的特殊性亦被復制于所制微通道的表面結(jié)構(gòu)中，這是液塑法與常規(guī)芯片 制備方法之間較為直觀的區(qū)別。本發(fā)明具有可以預見的巨大的經(jīng)濟價值和 社會價值。
下面結(jié)合附圖及實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明

圖1為"液塑法"制備PDMS芯片示意圖，其中的A部分得1、 2、 3 為工藝流程示意圖；B部分中的a、 c為以水凝膠微圖案化表面制備出立體 液態(tài)模版照片；B部分中的b、 d為所制得PDMS芯片照片；
圖2為液塑微通道幾何結(jié)構(gòu)測量示意圖所制微通道100 500微米微 通道；
圖3為液塑微通道幾何結(jié)構(gòu)測量示意圖表面輪廓儀測定微通道截面 形狀和尺寸；
圖4為液塑微通道幾何結(jié)構(gòu)測量示意圖通道峰值高度與寬度相關(guān)性曲線；
圖5為"液塑法"制備的PDMS細胞捕獲芯片芯片設(shè)計與結(jié)構(gòu)考察; 圖6為"液塑法"制備的PDMS細胞捕獲芯片細胞捕集工作原理； 圖7為"液塑法"制備的PDMS細胞捕獲芯片細胞捕集過程示例； 圖8為細胞在捕獲芯片上染色示意圖細胞染色過程照片； 圖9為細胞以吖啶橙/溴化乙啶雙重染色的結(jié)果照片； 圖IO為細胞在捕獲芯片上染色示意圖單細胞捕獲及染色過程之一； 圖11為細胞在捕獲芯片上染色示意圖單細胞捕獲及染色過程之二； 圖12為捕獲的單細胞染色過程中熒光強度隨時間變化曲線。
具體實施例方式
首先將玻璃表面硅垸化載玻片在Piranha液中(濃硫酸/雙氧水=3/1 ， v/v)煮沸約20分鐘，待冷卻后用大量純凈水清洗，除去殘余硫酸；隨后轉(zhuǎn) 入0.5MNaOH溶液中，浸泡約30分鐘，再以大量水清洗，除去殘余的NaOH; 吹干，備用。
將清洗干凈的載玻片浸于硅烷化反應液中孵育數(shù)分鐘；再用無水乙醇 洗凈吹干，于12(TC真空烘箱中脫水4小時，制得表面疏水且富含雙鍵基團 的玻片。以硅烷化玻片作為蓋片，底片為同尺寸的聚氨酯模(厚度 400微 米)；將蓋片與底片對合，兩端以生料帶隔開，形成高度為100-200微米的 空腔；吸取一定體積的光敏反應液從蓋片與底片間隙注入反應腔；將掩模 平鋪于蓋片上方，以紫外光曝光數(shù)秒;再將底片與蓋片剝離；相繼以丙酮、 去離子水清洗蓋片以除去未反應的單體、引發(fā)劑和溶劑，制得附著于蓋片表面的水凝膠立體微圖案。
將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片浸沒于丙三醇水溶液中，沿垂直方向緩 慢、勻速提拉出液面，通過浸涂法在此微圖案化表面制備出立體液態(tài)微條
紋；以制有液體微條紋的基片為復形模板。將Sylgardl84PDMS預聚體和 引發(fā)劑按比例充分混合；真空脫氣；緩慢澆注于水平放置的液體復形模板 表面；靜置數(shù)十分鐘；轉(zhuǎn)入烘箱中，6(TC烘烤約30分鐘；將此已初步聚合 的PDMS從模板上揭下，于80。C繼續(xù)加熱2小時，以使PDMS完全聚合；用 內(nèi)徑3毫米不銹鋼管在各通道末端位置打出穿孔，作為進出口樣品池；連同 一塊清洗干凈的空白玻片和PDMS芯片轉(zhuǎn)入等離子體清洗器中，抽真空，氧 氛圍下等離子體氧化30秒后，迅速將PDMS基片通道面與載玻片對合并于 6(TC加熱30分鐘，以使兩者不可逆封接到一起，形成閉合的微通道，至此， 制得液塑PDMS微流控芯片。
實施例l "液塑法"制備PDMS芯片
圖1A展示了由該技術(shù)制備PDMS芯片的整個過程①首先按所需微通 道的二維幾何結(jié)構(gòu)設(shè)計負片掩模，并制備出相應的PAAM水凝膠平面微圖 案；②通過浸涂法在此微圖案化表面制備出立體液態(tài)微條紋；③以制有液 體微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在PDMS表面復制出結(jié)構(gòu)與之 互補的微凹槽，并繼以制孔、封接等操作步驟，最終制備出完整的PDMS芯 片。相比于一般PDMS芯片制作方法，此技術(shù)的首要特點在于其所用的復形 結(jié)構(gòu)系液態(tài)微條紋，而非一般的固體條紋，因而稱之為"液塑法"，而由此所 制PDMS芯片稱為"液塑芯片"。
圖l B中的兩組顯微照片展示了兩種通過浸涂法在凝膠微圖案化表面上制備的液體微條紋及由其所作制出的液塑PDMS微通道。圖l B (d)中 的"Y"形通道的兩條支道中分別灌注不同顏色的染料，貝ij，主通道中形成界 面清晰的兩股不同顏色的并行流，這反映了低雷諾準數(shù)下流體的層流特性， 此亦是微流控芯片中經(jīng)常用到的技術(shù)，因而亦反映出此類芯片與傳統(tǒng)新片 之間的共性。通過不同的掩模設(shè)計，靈活制備各種形狀的平面微條紋及其 對應的液體模板，盡而制得幾何結(jié)構(gòu)各異的微通道，該技術(shù)的靈活性亦由 此得以反映。
實施例2 "液塑"微通道幾何結(jié)構(gòu)測量
本實施例實施過程與實施例1基本一致，區(qū)別在于掩膜設(shè)計上的差異。 掩模中設(shè)計寬度為50至500微米的微線條，由此制得一系列相應寬度的 微通道結(jié)構(gòu)(圖2)。通過觸針式表面輪廓儀測定其截面形狀和尺寸結(jié)構(gòu)， 結(jié)果如圖3:通道截面形狀為圓弧形，而通道的高度顯然與其寬度有關(guān)。確 定通道的峰值高度與其寬度的相關(guān)性，得圖4。由圖4可知，通道寬度為 50至500微米時，其峰值高度在約幾微米至50微米之間。通過設(shè)計掩模中 的線條寬度，可同時控制通道寬度和高度，液塑法的實用特性由此驗證。
實施例3 "液塑法"制備的PDMS細胞捕獲芯片
設(shè)計出如圖5 7所示的細胞捕集芯片。其捕集單元為"T'形流路，總 體通道寬度為500微米，而在'T'形交匯處有一段局部變窄的通道，其寬度 可為50至100微米，此處即為芯片的細胞捕集區(qū)域。圖5 (c)為對通道結(jié) 構(gòu)定性考察結(jié)果，由沿支路方向的截面輪廓曲線可知，在捕集區(qū)，通道的 高度由整體的約50微米，降至數(shù)微米，其阻擋細胞流過的功能由此實現(xiàn)。 圖6展示了此種芯片的工作原理由主通道中灌入細胞，貝ij，在交叉區(qū)域，部分細胞由流向支路的流體牽引移至捕集區(qū)，并被阻隔于窄通道前端，
而通道的曲線截面使其不至于完全被細胞阻塞，貝u，通過通道空隙和細胞 間隙的持續(xù)流動，亦使支路的上下游產(chǎn)生足夠的壓力差，以阻止捕集的細
胞重新流走。圖7為該種芯片捕集細胞過程的時序照片(15s間隔)，其捕獲細 胞的功能由此證實。通常情況下，以此類芯片可成功捕獲數(shù)十至數(shù)百個細 胞。
能夠使細胞較為穩(wěn)定地固定于捕集區(qū)，亦使得對所捕集細胞的進一步物 理或化學操控成為可能。如圖8所示，細胞捕集完成后，清洗通道，除去 主通道中殘余細胞，再于主道一端樣品池中加入熒光染料(吖啶橙)對捕 集的細胞熒光染色的時序照片(間隔ls)。由此，亦可通過標準的細胞染色 方法確定所捕集細胞的存活狀態(tài)。圖9為對細胞以吖啶橙/溴化乙啶雙重染 色的結(jié)果，多數(shù)細胞仍顯綠色，說明此亦為一種較為溫和的細胞捕集方法。 當然通道的光滑曲面結(jié)構(gòu)對此亦有貢獻。
制備較窄的捕集通道(如50微米)，并適當調(diào)低細胞懸液的密度，亦 可實現(xiàn)單細胞捕獲(圖10 U)，采用熒光實時成像技術(shù)亦可實現(xiàn)對單細胞 染色過程的檢測(圖11 12)，因而此方法亦可潛在用于細胞生理學過程動 態(tài)實時觀察。
權(quán)利要求
1、以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于采用光刻技術(shù)建立了以液態(tài)單體溶液為感光材料，通過“夾液式”光刻方法制備水凝膠立體微圖案，并在此微圖案表面制備液體微條紋，并以之為復形模板，通過澆塑復形法制備出具有三維曲面通道結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷芯片。
2、 按照權(quán)利要求1所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于所述以水凝膠平面微圖案化為基 礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷芯片的方法的具體過程是其一，首先將玻璃表面硅烷化，制得表面疏水且富含雙鍵基團的玻璃 蓋片；然后制備水凝膠光敏反應液，借助于水凝膠光敏反應液制得附著于 玻璃蓋片表面的水凝膠立體微圖案；其二，將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片浸沒于丙三醇水溶液中，沿垂直 方向緩慢、勻速提拉出液面，通過浸涂法在玻璃蓋片的微圖案化表面制備 出立體液態(tài)微條紋；其三，以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在聚二 甲基硅氧烷表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽，并繼以制孔、封接操作，最 終制備出完整的聚二甲基硅氧烷芯片。
3、 按照權(quán)利要求2所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧垸芯片的方法，其特征在于將玻璃表面硅垸化的過程具體是首先將載玻片在濃硫酸與雙氧水混合溶液中煮沸5 40分鐘，待冷卻 后用大量純凈水清洗，除去殘余硫酸；隨后轉(zhuǎn)入濃度為0.15 lM的NaOH溶液中，浸泡3 60分鐘，再以大量水清洗，除去殘余的NaOH;然后吹干 備用；選用質(zhì)量濃度為80 98%的乙醇水溶液作為硅烷化反應液，向其中加 入硅烷化試劑3-(三甲基甲硅垸基)丙基-甲基丙烯酸酯和醋酸；將清洗 干凈的載玻片浸于硅烷化反應液中孵育2 15分鐘；再用無水乙醇洗凈吹 干，于105 20(TC真空烘箱中脫水1 10小時，制得表面疏水且富含雙鍵 基團的玻片。
4、 按照權(quán)利要求3所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于將玻璃表面硅烷化的過程中，用來將載玻片在其中煮沸處理的濃硫酸與雙氧水混合溶液具體是濃 硫酸與雙氧水的體積比為3: 1;硅垸化反應液為95%乙醇的水溶液中加入1 1(mL/mL體積的硅烷化 試劑3-(三甲基甲硅烷基)丙基-甲基丙烯酸酯和20 50ML/mL體積醋酸。
5、 按照權(quán)利要求2所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧垸芯片的方法，其特征在于借助于水凝膠光敏反應液制得附 著于玻璃蓋片表面的水凝膠立體微圖案的過程具體是以丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺為單體溶液，以2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮為引發(fā)劑，制備水凝膠光敏反應液；以所制得的表面疏水且富含雙鍵基團的硅烷化玻片作為蓋片，底片為 同尺寸的聚氨酯模；將蓋片與底片對合，兩端以生料帶隔開，形成空腔； 吸取光敏反應液從蓋片與底片間隙注入反應腔；將掩模平鋪于蓋片上方， 以紫外光曝光1 30秒；再將底片與蓋片剝離；相繼以丙酮、去離子水清洗蓋片以除去未反應的單體、引發(fā)劑和溶劑，至此制得附著于蓋片表面的 水凝膠立體微圖案。
6、 按照權(quán)利要求5所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于借助于水凝膠光敏反應液制得附 著于玻璃蓋片表面的水凝膠立體微圖案的過程中制備聚丙烯酰胺水凝膠的要求是以丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰 胺為單體，其質(zhì)量濃度比為19: 1,單體總濃度范圍是5 15。/。；將150 350mg/ml 2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮溶于N-甲基吡咯烷酮 中為引發(fā)劑儲液；以硅烷化玻片作為蓋片，底片為同尺寸的厚度為50 400微米的聚氨 酯模；將蓋片與底片對合，兩端以生料帶隔開，形成高度為100-200微米的 空腔；將一定體積的光敏反應液從蓋片與底片間隙注入反應腔；將掩膜平鋪 于蓋片上方，以紫外光曝光2 20秒；曝光強度為100 500mW，再將底 片與蓋片剝離；相繼以丙酮、去離子水清洗蓋片以除去未反應的單體、引 發(fā)劑和溶劑，至此制得附著于蓋片表面的水凝膠立體微圖案。
7、 按照權(quán)利要求2所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于通過浸涂法在玻璃蓋片的微圖案 化表面制備出立體液態(tài)微條紋的具體過程是將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片浸沒于20 80%丙三醇水溶液中，沿基 本垂直液面的方向緩慢、勻速拉出液面，在此微圖案化表面制備出立體液 態(tài)微條紋；將聚丙烯酰胺凝膠圖案化基片從丙三醇水溶液中提拉出來的提拉速度為200 500微米/秒。
8、 按照權(quán)利要求2所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧垸芯片的方法，其特征在于以制有液態(tài)微條紋的基片為復形 模板，通過澆塑復形法在聚二甲基硅氧垸表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹 槽，并繼以制 L、封接操作，最終制備出完整的聚二甲基硅氧垸芯片的具體 過程是其一，將Sylgard 184聚二甲基硅氧烷預聚體和引發(fā)劑按比例充分混 合；將混合產(chǎn)物澆注于水平放置的液體復形模板表面；靜置；然后轉(zhuǎn)入烘 箱中在50 95'C條件下烘烤；其二，將此已初步聚合的聚二甲基硅氧烷從模板上揭下，于65'C 160'C繼續(xù)加熱直至聚二甲基硅氧烷完全聚合；其三，在各通道末端位置打出穿孔，作為進出口樣品池；其四，連同一塊空白玻片和聚二甲基硅氧烷芯片轉(zhuǎn)入等離子體清洗器 中，抽真空，氧氛圍下等離子體氧化，然后將聚二甲基硅氧垸基片通道面與載玻片對合并于5(TC 1200'C加熱15 150分鐘，以使兩者不可逆封接 到一起，形成閉合的微通道，至此，制得液塑聚二甲基硅氧烷微流控芯片。
9、 按照權(quán)利要求8所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚 二甲基硅氧垸芯片的方法，其特征在于以制有液態(tài)微條紋的基片為復形 模板，通過澆塑復形法在聚二甲基硅氧烷表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹 槽，并繼以制孔、封接操作，最終制備出完整的聚二甲基硅氧烷芯片的具體 過程是其一，將按比例充分混合并進行真空脫氣處理后的Sylgard184聚二甲基硅氧垸預聚體和引發(fā)劑澆注于水平放置的液體復形模板表面；制后靜置 10 100分鐘；轉(zhuǎn)入烘箱中，在6(TC 80。C烘烤20 60分鐘；其二，將此已初步聚合的聚二甲基硅氧烷從模板上揭下，于80°C 120'C繼續(xù)加熱2 3小時，以使聚二甲基硅氧垸完全聚合；其三，用內(nèi)徑3毫米不銹鋼管在各通道末端位置打出穿孔，作為進出 口樣品池；其四，連同一塊清洗干凈的空白玻片和聚二甲基硅氧垸芯片轉(zhuǎn)入等離 子體清洗器中，抽真空，氧氛圍下等離子體氧化30 90秒；之后迅速將聚 二甲基硅氧烷基片通道面與載玻片對合并于6(TC 80'C加熱30 卯分鐘， 以使兩者不可逆封接到一起，形成閉合的微通道，至此，制得液塑聚二甲 基硅氧烷微流控芯片。
10、按照權(quán)利要求9所述以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備 聚二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于以制有液態(tài)微條紋的基片為復形模板，通過澆塑復形法在聚二甲基硅 氧烷表面復制出結(jié)構(gòu)與之互補的微凹槽的過程中，制得的聚二甲基硅氧垸 通道的型態(tài)為曲面結(jié)構(gòu)，其通道深度能夠通過掩膜中二維圖形形狀和尺寸 的調(diào)節(jié)；通過控制復形微結(jié)構(gòu)的三維形狀，實現(xiàn)對所制微通道表面幾何結(jié) 構(gòu)的三維調(diào)控。
全文摘要
以水凝膠平面微圖案化為基礎(chǔ)的液塑法制備聚二甲基硅氧烷芯片的方法，其特征在于采用光刻技術(shù)建立了以液態(tài)單體溶液為感光材料，通過“夾液式”光刻方法制備水凝膠立體微圖案，并在此微圖案表面制備液體微條紋，并以之為復形模板，通過澆塑復形法制備出具有三維曲面通道結(jié)構(gòu)的聚二甲基硅氧烷芯片。本發(fā)明較之于傳統(tǒng)方法，操作明顯簡單，使得整個芯片制作過程大大簡化；本發(fā)明通過界面張力驅(qū)動液體在化學異質(zhì)性表面的自組織所制取的液體微條紋，其表面具有三維曲面結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)上的特殊性亦被復制于所制微通道的表面結(jié)構(gòu)中，因此可能具備廣闊的發(fā)展前景。本發(fā)明具有可以預見的巨大的經(jīng)濟價值和社會價值。
文檔編號G01N35/00GK101598717SQ20081001142
公開日2009年12月9日 申請日期2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者欣 劉, 戴忠鵬, 於林芬, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所