專利名稱：一種海參皂苷含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性物質(zhì)的測定方法，特別是涉及一種海參 皂苷含量的測定方法。
技術(shù)背景海參皂苷是海參中一種重要的生物活性物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)的海參皂苷有100多種。海參中皂苷類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且因海參種類和生長環(huán)境的不同而有差別。不同種類的海參中的皂苷結(jié)構(gòu)不同，同一種 海參中通常含有幾種甚至幾十種結(jié)構(gòu)相似、差別細(xì)微的皂苷類成分。 另外，海參中還含有大量的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、微量元素等復(fù)雜成 分，這必然會給海參中皂苷含量的測定帶來很多困難。申請?zhí)枮?00510014471.9的專利中公開了 一種苦瓜皂甙的測定 方法，該方法對目標(biāo)測定物的選擇性不強(qiáng)，樣品中的雜質(zhì)成分易引起 較大的測定誤差，通常需要比較復(fù)雜的樣品前處理過程，而大孔樹脂、 硅膠等柱層析過程必然會造成樣品的損失，易給測定結(jié)果帶來進(jìn)一步 的誤差。申請?zhí)枮?00510013275. X的專利中公開了中藥中人參皂苷 Rbl含量的測定方法"，該方法靈敏準(zhǔn)確，但同時也存在著前處理復(fù)雜 的問題，..而且該方法通常適用于一種或者少數(shù)幾種皂苷組分的定量， 海參中通常含有十幾種甚至幾十種皂苷組分，它們結(jié)構(gòu)復(fù)雜且差別極 小，用高效液相色譜分離也比較困難。另外，海參皂苷在不同種海參 間差異大，無法確定一種合適的皂苷單體作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分光光度或 者液相色譜測定海參中各種皂苷的含量。隨著人們生活水平的提高， 與海參相關(guān)的食品、保健品和藥品日益成為市場消費的熱點和主流， 海參皂苷作為主要的活性成分，其含量對其食用及藥用價值影響很大， 是不可少的海參營養(yǎng)評價指標(biāo)，因此迫切需要建立一種簡便可行的海 參皂苷含量的測定方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種海參皂苷含量的測定方法，它借助海參 皂苷中特有的喹諾糖作為定量標(biāo)準(zhǔn)，無需復(fù)雜的前處理過程，能準(zhǔn)確 定量各種海參中皂苷的含量。一種海參皂苷含量的測定方法，其^征在于有下列步驟(1)稱取海參樣品，將樣品粉碎或切成小塊，置于濃度為2mol/L-2.5mol/L 的三氟乙酸水溶液中，在110。C-12(TC下水解2-3小時，將水解液中 和，過濾，定容，作為供試液；(2)稱取喹諾糖，配制成6-8個濃度 在0.01mmol/L-lmmol/L之間成濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液；(3)分別吸 取相同體積的上述標(biāo)準(zhǔn)水溶液、l-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生劑和 0.3mol/L-0.35mol/L氫氧化鈉水溶液，在65-7(TC下衍生反應(yīng)25-35min， 冷卻8-10min，用鹽酸水溶液中和；用氯仿萃取，吸棄下層，重復(fù)3次， 將水層過濾，進(jìn)行液相色譜分析，以喹諾糖衍生物的峰面積對喹諾糖 的濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)取上述供試液進(jìn)行衍生反 應(yīng)和液相色譜分析，以喹諾糖衍生物的峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中求 出樣品中喹諾糖的含量；喹諾糖的含量乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)即得海參樣品中 皂苷的含量。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)操作簡便，無需對樣品進(jìn)行提取純化等 預(yù)處理，可以直接進(jìn)行水解。(2)靈敏度高，喹諾糖衍生物在250nm 有很強(qiáng)的吸收，檢測限可以達(dá)到0.804iiM。 (3)取樣少，所需海參樣 品僅為小于l克干重。(4)檢測時間短，單個測定耗時僅為3h左右； 由于可同時進(jìn)行水解、衍生等步驟，因此也適用于大批量測定。(5) 穩(wěn)定性好，24小時內(nèi)喹諾糖衍生物峰面積穩(wěn)定，RSD〈3.5%。 (6)本方 法適用于多種海參中皂苷含量的測定。
具體實施方式
下面通過實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。 實施例一(1)稱取市售干海參A(刺參)500. 8mg，粉碎，加入lmL濃度為2mol/L的三氟乙酸水溶液，于12(TC水解2小時，所得水解液以5mol/L氫氧 化鈉水溶液中和，過濾，定容至5mL作為供試液。(2) 稱取喹諾糖用水配成lmmol/L的溶液作為儲備液。進(jìn)一步依次 稀釋成0. 01mmol/L、 0. 05mmol/L、 0. lmmol/L、 0. 2mmol/L、 0. 4mmol/L、 0. 6mmol/L、 0. 8mmol/L、 1. 0mmol/L，制^爭8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液。(3) 分別吸取上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液各250 y L，加入濃度為 0. 5mol/L的1-苯基_3-甲基_5-吡唑啉酮的甲醇溶液250 u L和250 u L 的0. 3mol/L的氫氧化鈉水溶液，7(TC下衍生反應(yīng)30min，冷卻10min， 用250 u L 0. 3mol/L鹽酸水溶液中和；加入lmL氯仿萃取，充分震蕩， 吸棄下層，重復(fù)3次，水層過濾后作高效液相色譜分析。所采用的液相 色譜條件為Agilent 1100 HPLC(美國Agilent公司)，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4. 6X150mm， 5 u m)色譜柱，柱溫25。C，以22% 乙腈-O. 05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液作為流動相，流速1. 0 mL / min， 檢測波長為250nm。上述8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液的衍生液經(jīng)液相 色譜分析，得到喹諾糖的出峰時間為19. 86min，以喹諾糖峰面積對喹 諾糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 10219x + 9.0095(R2 = 0.9995)，其中x為喹諾糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，y為喹諾糖峰 面積。(4) 吸取海參A樣品供試液250 li L，進(jìn)行衍生反應(yīng)，所得衍生液按 上述條件進(jìn)行液相色譜分析，得到其中喹諾糖的峰面積為360.02，將 喹諾糖峰面積帶入工作曲線算得樣品中喹諾糖的含量為0.00562%，乘 以海參A (刺參)的轉(zhuǎn)化系數(shù)，得海參A中皂苷的含量。由于海參A 為刺參(5Yic力o/7iA J'a^O/ iciAS ),文獻(xiàn)報道其皂苷成分主要為 holotoxin Aj分子量1392) ， holotoxin B！(分子量1378)， holotoxin A (分子量1422)和holotoxinB (分子量1408)，其平均分子量約為 1400，因此皂苷平均分子量1400與喹諾糖分子量164的比值為8. 5， 即轉(zhuǎn)化系數(shù)為8.5;計算得海參A(剌參)皂苷含量0.0477%。實施例二(1) 稱取市售干海參B (革皮氏海參)75.4mg，粉碎，加入0.2mL 2mol/L三氟乙酸水溶液，于120'C水解2小時，水解液以5mol/L氫氧 化鈉溶液中和，定容至IOidL作為供試液。(2) 按與實施例一相同的方法得到工作曲線y= 10219x + 9.0095 (R2 =0.9995)，其中x為喹諾糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，，為喹諾糖峰面積。(3) 吸取海參B的樣品供試液250 u'L，'按照與實施例一相同的方法 進(jìn)行衍生反應(yīng)及液相色譜分析，測得喹諾糖峰面積為2784.27，帶入 工作曲線算得樣品中喹諾糖的含量為0.591%，乘以海參B (革皮氏海 參)的轉(zhuǎn)化系數(shù)，可得海參B中皂苷含量。海參B為革皮氏海參(尸esrsw (9z^wr/a《rae/Te2')尚無關(guān)于此種海參皂苷成分的報道，而 海參皂苷為一系列結(jié)構(gòu)十分相似的化合物，其平均分子量在1200左 右，因此皂苷平均分子量(1200)與喹諾糖分子量(164)的比值為 7.3，因此其轉(zhuǎn)化系數(shù)可按7.3計算。海參B (革皮氏海參)皂苷含量 算得為4.312%。本發(fā)明中所述的海參皂苷為羊毛甾烷型三萜皂苷，苷元為18(20) 內(nèi)酯環(huán)，苷元的C-3通過0 -0-糖苷鍵與寡糖鏈相連，喹諾糖是組成 寡糖鏈的單糖之一。所述的海參樣品重量為0.05g-lg，加入三氟乙酸 水溶液的量為2-3mL/g海參。所述的衍生劑為0.45mol/L-0.5mol/L 的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液。
權(quán)利要求
1、一種海參皂苷含量的測定方法，其特征在于有下列步驟(1)稱取海參樣品，將樣品粉碎或切成小塊，置于濃度為2mol/L-2.5mol/L的三氟乙酸水溶液中，在110℃-120℃下水解2-3小時，將水解液中和，過濾，定容，作為供試液；(2)稱取喹諾糖，配制成6-8個濃度在0.01mmol/L-1mmol/L之間成濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)水溶液；(3)分別吸取相同體積的上述標(biāo)準(zhǔn)水溶液、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生劑和0.3mol/L-0.35mol/L氫氧化鈉水溶液，在65-70℃下衍生反應(yīng)25-35min，冷卻8-10min，用鹽酸水溶液中和；用氯仿萃取，吸棄下層，重復(fù)3次，將水層過濾，進(jìn)行液相色譜分析，以喹諾糖衍生物的峰面積對喹諾糖的濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)取上述供試液進(jìn)行衍生反應(yīng)和液相色譜分析，以喹諾糖衍生物的峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品中喹諾糖的含量；喹諾糖的含量乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)即得海參樣品中皂苷的含量。
2、 按權(quán)利要求 1所述的海參皂苷含量的測定方法，其特征在于所述 的海參皂苷為羊毛甾垸型三萜皂苷，苷元為18(20)內(nèi)酯環(huán)，苷元的C-3 通過卩-O-糖苷鍵與寡糖鏈相連，喹諾糖是組成寡糖鏈的單糖之一。
3、 按權(quán)利要求 1所述的海參皂苷含量的測定方法，其特征在于所述 的海參樣品重量為0.05g-lg，加入三氟乙酸水溶液的量為2-3mL/g海參。
4、 按權(quán)利要求 1所述的海參皂苷含量的測定方法，其特征在于所述 的衍生劑為0.45mol/L-0.5mol/L的1-苯基-3-甲基_5-吡唑啉酮甲醇溶液。
5、 按權(quán)利要求 1所述的海參皂苷含量的測定方法，其特征在于所述 的液相色譜的分離條件為ZORBAX Eclipse XDB-C18型色譜柱；22% 乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液作為流動相；柱溫25。C ;流速1.0 mL /min，檢測波長為250nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海參皂苷含量的測定方法，其特征在于先用三氟乙酸水溶液水解樣品，將水解液中和、過濾、定容，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生物經(jīng)高效液相色譜分析測定其中喹諾糖的含量，以喹諾糖的含量乘以轉(zhuǎn)化系數(shù)計算得到樣品中海參皂苷的含量。本發(fā)明操作簡便、靈敏度高、取樣少、穩(wěn)定性好、適用于多種海參中皂苷含量的測定。
文檔編號G01N30/02GK101216463SQ20081001364
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者于林芳, 杰 徐, 李兆杰, 平 董, 薛長湖 申請人:中國海洋大學(xué)