專利名稱：制備雙分子修飾的納米探針的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物分子檢測領域，利用納米技術和分子自組裝技術，制備同時攜帶 識別分子和編碼分子的納米探針，采用質(zhì)譜儀器檢測編碼分子，從而快速地定性和定量 檢測鑒定樣品中的生物分子。
背景技術：
生物分子檢測指的是對核酸、蛋白質(zhì)和糖類等生物大分子的檢測。舉例說明，比
如在分子診斷領域。隨著80年代中期聚合酶鏈反應(PCR)技術的問世以及90年代初 人類基因組計劃的啟動，到目前人類基因組計劃的初步完成和其他組學研究的進行，使 在疾病診斷方面，目前已經(jīng)發(fā)展了一個比較成熟的學科——分子診斷學。目前，分子診 斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達產(chǎn)物(mRNA、蛋白質(zhì))的全面診斷。 分子診斷已經(jīng)從定性診斷發(fā)展到半定量和定量診斷，核酸標記技術，特別是熒光標記技 術的發(fā)展，熒光定量PCR技術等方法日益成熟是實現(xiàn)這，發(fā)展的技術保證。但是，在 分子診斷領域，真正應用臨床使患者受益，開展的還比較局限。因此建立費用低廉、結(jié) 果可靠的、操作方便、能同時進行多種疾病診斷的高通量分子診斷技術是迫切需要解決 的問題。材料學、方法學、傳感器和裝置等成為分子診斷發(fā)展的制約因素。其他，比如 在抗體、抗原檢測方面也有這方面的要求。
生物分子由于本身可供檢測分析的性質(zhì)較弱，要獲得高靈敏度和精確度的檢測， 就需要借助生物分子標記技術和檢測標記物的技術。生物分子標記技術常用的方法有放 ltt示記T熒光標記—、論學發(fā)光標記、生物發(fā)光標記和氧化還原活性分子標記等技術，而 檢測技術通常有熒光檢測、同位素檢測和電化學檢測等。生物分子標記技術和檢測標記 物的技術決定了生物分子檢測結(jié)果的優(yōu)劣。而目前的這些標記、檢測手段在解決高通量 分析方面還是有明顯的不足。例如熒光標記系統(tǒng)受限于熒光物質(zhì)的數(shù)量和熒光檢測的波 長范圍，目前至多四種熒光探針能夠同時檢測；雜交酶法至多能同時檢測9種病原體， 但是它需要麻煩的后置放大處理[GrondahI B, Puppe W， Hoppe A， Kuhne I, Weigl JA, Schmitt HJ. Rapid identification of nine microorgaidsms causing acute respiratory tract infections by single-tube multiplex reverse transcription-PCR: feasibility study[J]. J Clin Microbiol. 1999,37, 1-7]。生物分子標記技術隨著高通量檢測的需要，要求有一個與之 配套的標記庫和快速檢測技術。近年來，納米科技正逐漸成為生命科學研究的工具，在 生物分子的標記和檢測、納米生物傳感器、納米生物芯片等技術的開發(fā)和運用方面已取 得了重要的進展，顯示出光明的發(fā)展前景。
納米粒子是指顆茅立尺寸在1 100nm范圍內(nèi)助超微粒子，由于其處于微觀區(qū)域， 具有許多與同質(zhì)分子不同的物理化學性質(zhì)，是一種優(yōu)良的生物分子標記物。在最近的十 年里,將納米探針用于檢驗DNA的方法引起了分子診斷學領域的廣泛關注[NathanidL. Rosi & Chad A. Mirkir^ Nanostructures in Biodiagnostics. Chem. Rev. 2005, 105， 1547-1562]。納米金是研究較早的一種納米材料，具有優(yōu)良的生物相容性。近10多年來納米金 探針在生物分析領域的研究得到迅速發(fā)展,并越來越受到相關研究領域的重視,成為生 物分析化學的有為工具[Nathaniel L. Rosi & Chad A. Mirkin, Nanostructures in Biodiagnostics[J]. Chem. Rev. 2005, 105, 1547-1562和Daniel M.C" Astrac D. Gold nanoparticles: assembly, supramolecular chemistry, quantum-size -related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology[J].Chem. Rev. 2004， 104, 293-346]。 20世紀末美國西北大學Mirkin等在用納米金做標記物檢測核酸分子方面取 得了一系列重要進展，開發(fā)了金納米粒子DNA探針技術[Thaxton C. S., Georganopoulou D. G., Mirkin C. A. Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets[J].Clinica Chimica Acta 2006, 363, 120 _ 126; Elghanian， R., Storhoff， J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L. & Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science ,1997, 277, 1078-1081; Storhoff, J. J., Elghanian, R., Mucic, R. C., Mirkin， C. A. & Letsinger, R. L. One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes[J]. J. Am. Chem. Soc. 1998， 120, 1959-1964.]該技術利用了金納 米表面巰基分子自組裝的特性，通過使用在直徑十幾納米的均勻金納米粒子上結(jié)合 DNA探針，來檢測DNA分子是否有檢測的堿基排列。與普通的DNA探針相比，采用 金納米粒子，檢測靈敏度得到了飛躍性提高。同時對DNA堿基排列中單堿基不同的SNP (單核苷酸多態(tài)性，也稱作SNPs)的檢測靈敏度也很高fTaton, T. A., Mirkin, C. A. & Letsinger, R. L. Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science 289, 1757-1760 (2000)1。與普通使用的PCR (聚合酶鏈反應、Polymerase Chain Reaction)法 相同，金納米粒子DNA探針技術的目的在于提高檢測精度，這是一種能夠?qū)z測對象 的DNA分子放大到幾百萬倍的技術，采用的是bio-bar-code方法進行DNA的檢測和信 號放大[11]，擁有與PCR法相同或更高的的放大能力，而且在整個過程中無需象PCR法 那樣升降溫度，因而效率更高。但在高通量檢測方面，需要借助于芯片陣列技術，很難 達到實際的高通量檢測要求.[Vet JA, Majhhia AR, Marras SA, Tyagi S, Dube S, Poiesz BJ, et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons[J]. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96' 6394~6399. Verweij JJ, Blange RA, Templeton K, Schinkel J, Brienen EA, van Rooyen MA, et al. Simultaneous detection of Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, and Cryptosporidium parvum in fecal sam-ples by using multiplex real-time PCR[J]. J Clin Microbiol. 2004,42,1220—1223.]
近年來，質(zhì)譜技術得到迅速發(fā)展，已被廣泛應用于化工、石油、醫(yī)藥、生物等領 域，成為科研和生產(chǎn)中十分重要的工具。特別是軟電離技術的發(fā)展，在20世紀80年代 中期出現(xiàn)的兩種新的電離技術電噴霧電離(ElectrospmyIonization, ESI)和基質(zhì)輔助激 光解吸電離(Matrix—assisted Laser Desorption Ionization, MALDI)，這兩種技術具有檢 測范圍廣、靈敏度高、速度快、操作簡便、自動化程度高等特點，目前，這兩種技術廣 泛用于生物學、生物醫(yī)學、生物化學等科學領域的研究。目前，德國Qiagen公司開發(fā) 了一套有機分子編碼核酸的編碼技術，制備了64個編碼核酸的標記庫，利用質(zhì)譜技術能同時檢測22禾中病原體[Thomas Briese, et al. Diagnostic system for rapid and sensitive differential detection of pathogens. [J] .Emerging inferctious diseases, 2005,11(2)，310-313. Kokoris, Mark, et al. High-throughput SNP genotyping with the Masscode system. [J].Molecular Diagnosis, 2000, 5(4)， 329-340.]。該方法把小分子標記物通過可控的光切斷的 連接臂連接到核酸上，然后經(jīng)過聚合酶鏈式反應擴增，進行生物方面的識別，最后通過 光照把標記物釋放出來，通過質(zhì)譜檢測標記物從而判斷生物分子的情況。但是該方法需 要把標記物通過化學的方法連接到生物分子上，而且檢測時還需要通過化學反應釋放出 來才能檢測，不僅繁瑣而且費時、費力。
目前，納米材料用于生物分子檢測，主要還是利用納米材料本身做標記，通過檢 測納米材料的情況得到生物分子檢測的結(jié)果。而在利用納米材料做載體，通過攜帶便于 檢測的小分子編碼生物分子，利用質(zhì)譜來檢測的方法還沒有報道。
根據(jù)以上的現(xiàn)狀，本發(fā)明將現(xiàn)代生物技術、納米技術、質(zhì)譜技術等有機的結(jié)合在 一起，制備質(zhì)量編碼的納米生物探針將不同分子量的有機分子和相應的生物探針同時 修飾到納米材料表面。并且通過夾心式雜交的方法，不同擬檢測生物分子就與不同編碼 的納米探針結(jié)合，利用負載捕獲探針的固相支持物分離樣品，然后采用質(zhì)譜檢測編碼分 子，即而實現(xiàn)對生物分子快速的定性和定量檢測。本發(fā)明滿足了這一需要及這一技術領 域的其它需要。[Nam, J. M.， Stoeva, S. I. & Mirkin， C. A. Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity[J]. J. Am. Chem. Soc. 2004， 126, 5932-5933 . Stoeva S. I.， Lee J.-S.， Thaxton C. S., Mirkin C. A.Multiplexed DNA detection with biobarcoded nanoparticle probes[J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2006,45， 3303 —3306]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了獲得對生物分子的檢測，滿足了這一需要及這一技術領域的 其它需要。把現(xiàn)代生物技術、納米技術、表面化學技術、質(zhì)譜檢測技術等有機的結(jié)合在 一起，克服現(xiàn)有技術的不足。制備了雙分子修飾納米探針，其中一種分子特異性地識別 擬檢測的生物分子，另一種分子用于編碼，采用質(zhì)譜儀器檢測編碼分子，從而快速地定 性和定量檢測鑒定樣品中的生物分子。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的 一種制備雙分子修飾納米探針的方法，其中一種分子是識 別分子， 一種分子是編碼分子，識別分子是能特異識別并與擬檢測生物分子結(jié)合在一起； 同時識別分子含有或修飾有與納米材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團。識別分子可以 是核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽等生物分子。
編碼分子，指的是與識別分子相對應的，編碼識別分子的分子。主要是有機分子， 含有與納米材料表面結(jié)合或組裝的官能團，同時能被質(zhì)譜儀器檢測。
檢測生物分子所述夾心式結(jié)合指的是核酸夾心式雜交法、雙抗體夾心法或雙抗 原夾心法等構(gòu)成的夾心式結(jié)合。夾心式結(jié)合由三種不同作用的成分組成(l)產(chǎn)生信號 的檢測探針，這里指識別分子和編碼分子修飾的納米探針；(2)與固相支持物連接的捕 獲探針，指含有與擬檢測生物分子特異識別并結(jié)合的除識別分子以外的另外一部分結(jié)構(gòu) 的固體支持物；(3)靶部分，即擬檢測生物分子；
當檢測樣品中存在的擬檢測生物分子，通過加入能與該生物分子形成夾心式結(jié)合的檢測探針和捕獲探針，擬檢測生物分子與捕獲探針、檢測探針形成夾心式結(jié)構(gòu)，洗脫 去除雜質(zhì)后通過檢測能得到一個清晰的檢測信號;所述識別分子可以是核酸、寡核苷酸、 蛋白質(zhì)、多肽等生物分子，含有或修飾有與納米材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團； 所述編碼分子是與識別分子相對應的編碼識別分子的編碼分子:具體指的是含有與納米 材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團的有機分子，同時能被質(zhì)譜儀器檢測。
本發(fā)明通過表面自組裝反應(技術)，把兩種不同的分子修飾到同一種納米材料 上，使每一個納米材料同時攜帶有兩種不同的分子， 一種分子是識別分子；另一種分子 是編碼分子。同時，編碼分子的數(shù)量遠遠多于識別分子的數(shù)量，起到信號放大的作用。 另外，可以根據(jù)識別分子和編碼分子的組合得到納米探針庫。
通過現(xiàn)代生物技術，使用納米探針標記，利用納米探針中的識別分子特異性地與 檢測樣品中的生物分子識別，通過夾心式結(jié)合把與樣品中生物分子特異性識別的納米探 針固定到含有與靶部分另一部分特異識別結(jié)構(gòu)的固相支持物上，然后通過這種固相支持 物把與樣品中生物分子特異性識別的納米探針從檢測溶液中分離出來。
將上述步驟分離出來的納米探針進行檢測。根據(jù)編碼分子的檢測要求，采用不同 質(zhì)譜儀器的進行檢測，得到編碼分子信號，進而判斷檢測樣品中的生物分子情況。
本發(fā)明的制備方法中，識別分子可以是核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽等生物分 子，含有或修飾有與納米材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團。編碼分子指的是與識別 分子相對應的編碼識別分子的分子。主要是有機分子，具有與納米材料表面修飾的官能 團，同時能被質(zhì)譜儀器檢測。編碼分子尤其是硫醇、硫醚或二硫化物。利用該納米探針， 通過質(zhì)譜儀器檢測編碼分子，通過質(zhì)譜信號的測定值對擬檢測生物分子進行定性和定量 分析。樣品可以是人為設計的結(jié)構(gòu)，也可以是從動物或人體上采集的樣本。
所述質(zhì)譜儀器指的軟電離質(zhì)譜，尤指基質(zhì)輔助激光解析一飛行時間質(zhì)譜，電噴霧 質(zhì)譜等。
在檢測編碼分子時，可以直接在捕獲探針的固相支持物上檢測，也可以釋放納米 探針到溶液中再檢測，或者把編碼分子從納米探針上釋放到溶液中檢測。
納米材料指的是納米粒子，尤其指的是金納米粒子；納米粒子粒徑在l-1000nm， 尤其指10-100nm。溶劑包括各種緩沖鹽溶液、有機溶劑和水，尤其指水，檸檬酸鈉溶 液和磷酸緩沖鹽溶液。(在說明書實施例中多有選擇)。
所述捕獲探針的固相支持物，尤其指的是硅片和各種磁珠。固相支持物上負載了 與擬檢測生物分子特異識別的捕獲探針，能夠把檢測樣品中與擬檢測的生物分子特異性 識別并結(jié)合的納米材料從溶液中分離出來,達到分離和純化的目的，然后進行質(zhì)譜檢測。
本發(fā)明的特點及有益效果是通過編碼的納米探針，得到編碼庫，實現(xiàn)信號的編 碼和放大;檢測時可以直接檢測整個探針，不需把編碼分子從整個納米探針上釋放出來， 方便了操作；質(zhì)譜檢測編碼分子，靈敏度高、速度快、操作簡便、自動化程度高，進而 靈敏、精確和高通量地檢測鑒定樣品中的生物分子。


圖l雙分子修飾納米探針的制備示意圖
圖2納米探針1中識別分子的檢測斑點試驗(Spot test)圖3納米探針1中編碼分子的檢測質(zhì)譜圖
圖4硅片作固相支持物制備捕獲探針過程
圖5硅片作固相支持物夾心式雜交和質(zhì)譜檢測示意圖
圖6寡核苷酸3量為lxlO—6M (a)和空白(b)時，雜交后硅片的掃描電鏡圖
圖7寡核苷酸3量為lxlO—6M時，雜交后直接在硅片上質(zhì)譜檢測時得到的質(zhì)譜圖
圖8寡核苷酸7量為lxl(T6M時，雜交后直接在硅片上質(zhì)譜檢測時得到的質(zhì)譜圖
圖9寡核苷酸3和寡核苷酸7的兩重雜交檢測的情況
圖10硅片作固相支持物時寡核苷酸3的質(zhì)譜檢測限圖
圖11磁性粒子作固相支持物夾心式雜交和質(zhì)譜檢測示意圖
圖12磁性粒子作固相支持物時寡核苷酸3的質(zhì)譜檢測限圖
具體實施例方式
提供以下實施例是為了闡述而不是限制本申請的發(fā)明范圍。 1、雙分子修飾納米探針的制備。(見附圖l) 第一步，13nm左右的金納米溶液的制備
精確稱量氯金酸133.1mg，加入320ml超純水，加熱，回流?？焖偌尤?2ml含 368.6mg檸檬酸鈉的水溶液，繼續(xù)回流15分鐘，降到室溫，備用。 第二步，雙分子修飾金納米探針的制備
A) 、納米探針1的制備
寡核苷酸2: (5' HS(CH2)6-Ak) ATC CTT ATC AAT ATT 3')和編碼分子4 ([S(CH2)u(OCH2CH2)5OH]2,分子量846)修飾的金納米粒子的制備
取識別分子10D寡核苷酸2用200pl超純水溶解，加入到2ml第一步制備的金 納米溶液中，24小時后加入磷酸鹽緩沖溶液，使整個溶液為0.1M NaCl。繼續(xù)反應36 小時后加入10mM的編碼分子4，反應12小時后15000rpm離心25分鐘，吸去上層清 液后用磷酸鹽緩沖溶液2ml分散，再15000rpm離心25分鐘，重復3次。最后分散于 磷酸鹽緩沖溶液。fC條件下保存。
B) 、納米探針2的制備
寡核苷酸6 : (5， HS(CH2)6-A1() TAA CTA TTC CTA TAT 3，)和編碼分子8 ([S(CH2) (OCH2CH2)6OH]2，分子量934)修飾的金納米粒子的制備
取識別分子IOD寡核苷酸6用20(Hil超純水溶解，加入到2ml第一步制備的金 納米溶液中，24小時后加入磷酸鹽緩沖溶液，使整個溶液為0.1M NaCl。繼續(xù)反應36 小時后15000rpm離心25分鐘，吸去上層清液后用磷酸鹽緩沖溶液2ml分散，再 15000rpm離心25分鐘，重復3次。最后分散于磷酸鹽緩沖溶液。加入10mM的編碼 分子8，反應12小時后15000ipm離心25分鐘，吸去上層清液后用磷酸鹽緩沖溶液2ml 分散，再15000rpm離心25分鐘，重復3次。最后分散于磷酸鹽緩沖溶液。4"C條件下 保存。
第三步，雙分子修飾納米探針的檢測 首先，納米探針1中識別分子的檢測
采用斑點試驗(spot-test)來檢測。用寡核苷酸1 (5' TAA CAA TAA TCCA10-(CH2)3SH 3')修飾金納米粒子，得到捕抓探針，加入或不加入目標寡核苷酸3 (5' GGA TTATTGTTAAATATTGATAAGGAT3')，進行雜交。取少量得到的溶液，點在薄層 硅膠板上，如果沒有加入寡核苷酸3，則可以看到紅色的斑點a，說明沒有形成夾心式 結(jié)構(gòu)，也就是沒有雜交。如果加入寡核苷酸3，則可以看到藍色的斑點b，說明夾心式 雜交發(fā)生了，引起金納米粒子的集聚，所以發(fā)生顏色變化。把加入寡核苷酸3的溶液加 熱到75。C， 5分鐘，趁熱點在薄層板上，得到紅色斑點c，說明解雜交了。冷卻后再點， 則重新得到藍色斑點d。證明識別分子已經(jīng)組裝到了金納米粒子上，而且性質(zhì)保持，同 時證明雙分子修飾金納米粒子在高溫下(75°C)也保持不變，說明納米探針比較穩(wěn)定。 見附圖2。
其次，納米探針1中編碼分子的檢測
采用激光解析飛行時間質(zhì)譜檢測。取納米粒子溶液，直接點在質(zhì)譜儀的樣品盤上， 晾干后用質(zhì)譜儀檢測。結(jié)果得到編碼分子的質(zhì)譜信號，有(869, [4+Na]+; 837, [4+Na-Sf; 825, [4+Na-CH2CH20]+)的峰，證明了分子4的存在，證明編碼分子已經(jīng)組裝到納米探 針上了，見附圖3。
2、 以硅片為固相支持物的捕獲探針的制備(見附圖4)
A) 、寡核苷酸l (5'TAACAATAATCCA1G-(CH2)3SH3')修飾的硅片
具體操作如下硅片用濃硫酸雙氧水二3: l處理，純水清洗，用N- (20_胺基
乙基)-3-胺基丙基三甲氧基硅烷修飾硅羥基，再用偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-[馬來酰亞胺
苯基]叔丁酸酯修飾胺基，最后通過巰基和馬來酰亞胺雙鍵的化學反應把寡核苷酸l固 定在硅片上。得到以硅片為固相支持物的捕獲探針。
B) 、寡核苷酸5 (5，CATACTAACATAA10-(CH2)3SH3')修飾的硅片 方法同寡核苷酸l修飾的硅片制備
C) 、寡核苷酸1和寡核苷酸5同時修飾的硅片
方法同上，只是最后固定寡核苷酸的時候，把兩種寡核苷酸一起加到硅片上反應。
3、 夾心式雜交(見附圖5)
A) 、寡核苷酸3 (5'GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT3')的雜交 先把寡核苷酸3 (lxl(T6M)的溶液加到寡核苷酸1修飾的硅片上，雜交3小時，磷
酸鹽緩沖溶液洗滌一次，吹干。然后把制備的納米探針1加到該硅片上，雜交2小時。 磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次。這樣就雜交好了，把雜交好的硅片進行下一步質(zhì)譜檢測。同 時，作對比試驗，不加入寡核苷酸3，進行同樣操作，得到空白的硅片， 一起進行檢測。
B) 、寡核苷酸7 (5'TATGTTAGTATGATATAGGAATAGTTA3')的雜交 操作同上，得到雜交好的硅片進行下一步質(zhì)譜檢測。同時，作對比試驗，不加入
寡核苷酸7，進行同樣的操作，得到空白的硅片， 一起進行檢測。
C) 、寡核苷酸3和寡核苷酸7的兩重雜交
操作同上，分為單獨加入寡核苷酸3或寡核苷酸7或同時加入寡核苷酸3和寡核 苷酸7時三種情況，但是納米探針1和納米探針2則均是一起加入。并作對比試驗，不 加入寡核苷酸3和寡核苷酸7，進行同樣的操作，得到空白的硅片， 一起進行檢測。
4、 檢測A) 、通過掃描電鏡檢測寡核苷酸3雜交的情況，見圖6?？梢钥吹?jīng)]有寡核苷酸 3的硅片表面幾乎沒有金納米粒子(圖6a)，而有寡核苷酸3條件下捕抓硅片表面金納 米粒子密度非常大(圖6b)。證明識別分子已經(jīng)識別了擬檢測的分子，通過固相支持物 把形成夾心式雜交的探針從溶液中分離出來，從而進行下一步檢測，檢測編碼分子。
B) 、通過基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜檢測(見附圖5)。
① 寡核苷酸3的檢測
通過基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀檢測。結(jié)果，沒有寡核苷酸3的硅片沒有 檢測到編碼分子4的離子信號，有寡核苷酸3的硅片則得到強度很大的編碼分子4的 離子信號(885，[4+K]+;869，[4+Na]+)，結(jié)果見附圖7。
② 寡核苷酸7的檢測
結(jié)果類似寡核苷酸3的結(jié)果,得到強度很大的編碼分子8的離子信號(957, [8+Na]+; 925, [8+Na-S]+)，見附圖8。
③ 寡核苷酸3和寡核苷酸7的兩重雜交檢測(見附圖9)
單獨加入寡核苷酸3或寡核苷酸7時，分別只得到對應的編碼分子4 (圖9b, 869, [4+Na]十；837, [4+Na-S〗+; 825， [4+Na-CH2CH20]+)或8 (圖9c, 957, [8+Na]+; 925, [8+Na-S]+)的離子信號。
同時加入寡核苷酸3和寡核苷酸7時，同時得到編碼分子4和8的離子信號(圖 9d, 957， [8+Na]+; 925, [8+Na-S]+; 913, [4+8+2Na〗2+; 869, [4+Na〗+; 837, [4+Na-S]+)
對比試驗，不加入寡核苷酸3和寡核苷酸7，則沒有相應的離子信號(圖9a)。
5、 考察了不同濃度的寡核苷酸3條件下編碼分子4的檢測信號情況，檢測限可 以達到100pM。見附圖10。
6、 以磁性粒子為固相支持物的捕獲探針的制備
表面胺基官能化的磁性粒子(2.8nm，聚苯乙烯包裹)，用偶聯(lián)劑琥珀酰亞胺-4-[馬來酰亞胺苯基]叔丁酸酯修飾胺基，然后通過巰基和馬來酰亞胺雙鍵的化學反應把 寡核苷酸1固定在磁性粒子上。得到以磁性粒子為固相支持物的捕獲探針3。
7、 以磁性粒子為固相支持物的雜交,見附圖11
把不同濃度的寡核苷酸3 (lxl(T6M， 1.0xl0-8M， 1.0xl0'^M， 1.0x10,， 1.0xlO'14M)的溶液加到以磁性粒子為固相支持物的捕獲探針溶液中，雜交3小時，磷 酸鹽緩沖溶液洗滌一次。然后把1中制備的納米探針1加到磁性粒子溶液上，雜交2 小時。磷酸鹽緩沖溶液洗滌6次。得到雜交后的磁性粒子等進行下一步檢測。同時，作 對比試驗，不加入寡核苷酸3，進行同樣的操作，得到空白的磁性粒子。
8、 質(zhì)譜檢測
把雜交后的磁性粒子，通過堿性和加熱的方法解離出雜交的納米探針1，分離除 去磁性粒子，剩下的溶液用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜檢測，檢測編碼分子，加基 質(zhì)2,4,6-三羥基苯乙酮或不加，從檢測得到的編碼分子4離子信號(869， [4+Na]+; 837， [4+Na-S]+)存在與否及信號強弱，從而判斷寡核苷酸3的存在與否和數(shù)量。在1.0fM的 寡核苷酸3存在下，還能檢測到編碼分子4的信號，見圖12。沒有加入寡核苷酸3的 沒有檢測到編碼分子的信號。
權(quán)利要求
1、一種制備雙分子修飾納米探針的方法，其特征是其中一種分子是識別分子，另一種分子是編碼分子；得到的兩種分子修飾的納米探針通過夾心式結(jié)合的方式檢測的生物分子；所述夾心式結(jié)合指的是核酸夾心式雜交法、雙抗體夾心法或雙抗原夾心法等構(gòu)成的夾心式結(jié)合。夾心式結(jié)合由三種不同作用的成分組成(1)產(chǎn)生信號的檢測探針，這里指識別分子和編碼分子修飾的納米探針；(2)與固相支持物連接的捕獲探針，指含有與擬檢測生物分子特異識別并結(jié)合的除識別分子以外的另外一部分結(jié)構(gòu)的固體支持物；(3)靶部分，即擬檢測生物分子；當檢測樣品中存在的擬檢測生物分子，通過加入能與該生物分子形成夾心式結(jié)合的檢測探針和捕獲探針，擬檢測生物分子與捕獲探針、檢測探針形成夾心式結(jié)構(gòu)，洗脫去除雜質(zhì)后通過檢測能得到一個清晰的檢測信號；所述識別分子可以是核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽等生物分子，含有或修飾有與納米材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團；所述編碼分子是與識別分子相對應的編碼識別分子的編碼分子具體指的是含有與納米材料表面結(jié)合、組裝或修飾的官能團的有機分子，同時能被質(zhì)譜儀器檢測。
2、 如權(quán)利要求1中所述制備雙分子修飾納米探針的方法，其特征是編碼分子是 硫醇、硫醚或二硫化物。
3、 如權(quán)利要求l中所述制備雙分子修飾納米探針的方法，其特征是質(zhì)譜檢測的方 法指的軟電離質(zhì)譜，尤指基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜或電噴霧質(zhì)譜。
4、 如權(quán)利要求1中所述制備雙分子修飾納米探針的方法，其特征是檢測編碼分 子時，可以直接通過捕獲探針的固相支持物檢測，也可以釋放納米探針到溶液中再檢測， 或者把編碼分子從納米探針上釋放到溶液中檢測。
5、 如權(quán)利要求1中所述制備雙分子修飾納米探針的方法，其特征是納米材料指 的是納米粒子，尤其指的是金納米粒子；納米粒子粒徑在l-1000nm，尤其指10-100nm。 溶劑包括各種緩沖鹽溶液、有機溶劑和水，尤其指水，檸檬酸鈉溶液和磷酸緩沖鹽溶液。
6、 如權(quán)利要求1所述制備方法，其特征是捕獲探針的固相支持物是硅片和各種 磁珠，固相支持物上負載了能擬檢測生物分子特異識別的捕獲探針，這樣，就可以利用 固體支持物把形成了夾心結(jié)構(gòu)的納米探針從溶液中分離出來，達到分離和純化的目的， 進行質(zhì)譜檢測。
全文摘要
制備雙分子修飾納米探針的方法，其中一種分子是識別分子，另一種分子是編碼分子；得到的兩種分子修飾的納米探針通過夾心式結(jié)合的方式檢測的生物分子；夾心式結(jié)合由三種不同作用的成分組成(1)產(chǎn)生信號的檢測探針，(2)與固相支持物連接的捕獲探針，(3)靶部分，通過加入能與該生物分子形成夾心式結(jié)合的檢測探針和捕獲探針，擬檢測生物分子與捕獲探針、檢測探針形成夾心式結(jié)構(gòu)，洗脫去除雜質(zhì)后通過檢測能得到一個清晰的檢測信號；通過夾心式雜交的方法，擬檢測的生物分子就與能識別它的納米探針結(jié)合，分離樣品，然后采用質(zhì)譜檢測編碼分子，從而快速地定性和定量檢測鑒定樣品中的生物分子。
文檔編號G01N27/64GK101281164SQ20081002078
公開日2008年10月8日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者丁一冰, 姜大煒, 進 朱, 飛 邱, 黃樂群 申請人:南京大學