專利名稱：一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法
一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法技術(shù)領域一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，涉及一種農(nóng)藥代謝物殘留檢測方法，更具體的說是用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測紡織品原料棉花中的甲基對氧磷的殘留，屬于免疫分析技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
上世紀60年代以來的研究進一步發(fā)現(xiàn)，除了農(nóng)藥本身以外，它的代謝產(chǎn)物 也會出現(xiàn)殘留毒性問題，且毒性比農(nóng)藥母體還要強。這一發(fā)現(xiàn)不僅促使加強了 對農(nóng)藥殘留降解的研究，還引發(fā)了對農(nóng)藥降解過程中代謝產(chǎn)物毒性的研究。甲 基對硫磷(M 1605)是常見的有機磷農(nóng)藥，而甲基對氧磷(M 1600)為其代謝產(chǎn)物。 甲基對氧磷的毒性，比原母體甲基對硫磷毒性更大。甲基對硫磷在噴灑作物上 消失很快，在短期內(nèi)，少量的甲基對硫磷己轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆鶎ρ趿锥黾佣拘?。?而檢測甲基對氧磷的殘留成為一種必要，而且還可以作為甲基對硫磷的接觸生 物標志物。<formula>formula see original document page 3</formula>甲基對硫磷(Parathion-methyl) 甲基對氧磷(Paraoxon-methyl)既往甲基對氧磷檢測多用液相色譜法，儀器昂貴，純化費時，且需要專門人 員操作。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)提供了一種痕量甲基對氧磷檢測的快速、 靈敏、選擇性的檢測方法。張衛(wèi)國，馬兆揚合成了甲基對氧磷的人工抗原并進 行了鑒定，得到了較好的多克隆抗體。但只對抗體的效價、特異性進行了測定。 目前還缺少對實際樣本中的甲基對氧磷殘留檢測建立ELISA方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，是一種快速 檢測紡織品中甲基對氧磷農(nóng)藥代謝物殘留的免疫學檢測方法，使樣品無需經(jīng)過 繁瑣的提純或濃縮步驟，并且保證較高的敏感性和特異性。本發(fā)明的技術(shù)方案利用尹麗梅、胥傳來、袁媛等(一種二甲氧基磷酸酯類農(nóng)藥通用半抗原的合成方法[P].中國專利CN101172984A)合成的0， O-二甲 基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯為半抗原，此半抗原與BSA偶聯(lián)作為免疫原免疫 健康新西蘭大白兔得到多克隆抗體，半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了紡織品中甲基對氧磷農(nóng)藥殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫方法。 一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，步驟如下(1) 抗原的包被以半抗原O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)復合物作為包被抗原，以0.05M、 pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原 1:32000 1:64000，濃度為0.625 1.25^ig/mL作為包被液，在酶標板的每孔中 加入100pL， 4t:孵育過夜，然后用含0.1%明膠的上述碳酸鹽緩沖液作為封 閉液，封閉2h;(2) 競爭反應將免疫制備的甲基對氧磷多克隆抗體用抗體稀釋液含0.1%明膠、含 0.05%吐溫-20、 pH7.4、 O.OIM的磷酸鹽緩沖溶液PBST，按1:2000 1:4000 比例稀釋后，加入酶標板中，每孔加5(HiL，同時每孔分別加入標準品稀釋 液PBST稀釋的0.01嗎/mL、 0.1jig/mL、 0.5嗎/mL、 l嗎/mL、 5嗎/mL、 10嗎/mL、 20嗎/mL系列濃度之一的甲基對氧磷標準品50jiL， 37'C孵育lh后以PBST 洗滌液洗滌3~5次；(3) 加酶標二抗加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，以抗體稀釋液稀釋為1:5000， 每孔加100fiL， 37'C溫育lh后以PBST洗滌液洗滌3 5次；(4) 顯色每孔加入100jiL顯色液，暗處37'C反應15min，取出后每孔加入100 (iL、 2mol/L的硫酸終止液，用酶標儀測定吸光值A450，與所作的標準曲線對比算出 待測樣品的甲基對氧磷濃度。顯色液配方A液0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 nL30%H2O2 用超純水定容至lOOmL; B液60mg3,3^5^-四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二 醇中；使用前將A液與B液以5:1體積混合。標準品稀釋液PBST為含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的O.01mol/L、 pH7.4 PBST溶液。1、主要溶液配制1) 配制0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS):Na2HP04.12H20 3,62 g， KH2P04 0.2 g，KC1 0.2g，NaCl 8.0g，加超純水稀釋至lOOOmL。2) 配置0.05M、 pH9.6碳酸鹽緩沖溶液(CBS)Na2C03 1.59g， NaHC03 2.93g，加超純水稀釋至1000 mL。3) 配制PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。4) 配制封閉液含0.lQ/^明膠的碳酸鹽緩沖液5) 配制抗體稀釋液含0.1W明膠的PBST溶液。6) 配制標準品稀釋液含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的O.01mol/L、 pH 7.4PBST溶液。7) 顯色液A液0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 [xL30%H2O2,用超純水 定容至100 mL;B液60mg3，3;5，5Z-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前將A液與B液以5:1體積混合。8) 終止液2M的H2S04。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了紡織品中甲基對氧磷農(nóng)藥的間接ELISA 方法，為紡織品中甲基對氧磷農(nóng)藥殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于 采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩(wěn)定性和重復性較好。靈敏度為O.Olppm， 線性范圍為0.1 20ppm，半數(shù)抑制量(ICs。)為1.27pg/mL，回收率為78.9%，與 其他有機磷農(nóng)藥幾乎無交叉反應。免疫反應的高特異性和高親和性使ELISA具 有極高的選擇性和靈敏性，樣本前處理過程簡單。


圖1甲基對氧磷的標準抑制曲線。 具體實施方案以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。儀器TGL — 40B臺式低速離心機上海安亭科學儀器廠，KFLO純水機凱佛隆公司，ZD-9556水平搖床太倉科教器材廠，Costar96孔8xl2可拆酶標板上海吉泰生物科技有限公司， MuLtiska Mks酶標儀 Thermo Labsystems公司， 可調(diào)試移液器 Thermo Labsystems公司，渦旋混合器上海滬西儀器分析廠。 試劑-辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司， 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)華美生物工程公司， 其他試劑均為分析純試劑實施例l、間接競爭ELISA實驗方法的步驟如下預先將甲基對氧磷標準品配制成lOOOpg/mL的甲醇溶液作為工作母液，在4。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4, 0.15mol/L NaCl, 0. 5%Tween-20)，以此為基礎配制系列反應液，用以稀釋競爭物標準液和抗血清。a、 包被:用設定濃度的包被原包被酶聯(lián)反應板，100pL/ L， 4"C過夜。b、 洗滌:用PBST洗滌反應板三次，每次3min， 200jiL/ L然后甩干反應板。c、 封閉:含0.1。/。明膠的CBS， 200(iL/孔.37-C封閉2h。d、 洗滌:同be、 競爭:用標準品稀釋液PBST將甲基對氧磷母液稀釋成0.01pg/mL， 0.1pg/mL， 0.5嗎/mL, l嗎/mL， 5昭/mL， 10嗎/mL, 20嗎/mL系列濃度，另設一個標準 品稀釋液PBST空白對照，50pL /孔。然后每孔加入50pL稀釋4000倍的抗血 清，于37。C溫育lh。f、 洗滌:同bg、 加酶標二抗(羊抗兔HRP-IgG， 1:5000), lOOiaL/孔，37 C反應lh。h、 洗滌:同bi、 顯色加底物TMB100pL/ L,顯色15min。 j、終止:加終止液100pL/孔。k、測定:用酶標儀檢測OD450nm。實施例2、實際樣本檢測取陰性樣本(棉花)為代表性樣品，將其剪碎至5mmx5mm—下，混勻。 分別稱取1.0g試樣置于lOOmL具塞錐形瓶中，然后將一定濃度的甲基對氧磷標 準品的丙酮溶液加入其中，使甲基對氧磷在棉花中的終濃度分別為0.1pg/g、 l嗎/g、 10pg/g，室溫靜置15min。在錐形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超聲波 發(fā)生器中提取20min，將提取液濾出。殘渣再用10mL乙酸乙酯超聲提取5min， 將兩次濾液合并。將濾液在4(TC水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，用丙酮溶解并 定容至lmL，然后用氮氣吹干，以含10%-20%甲醇的PBS溶解，用于ELISA 檢測；由于甲基對氧磷具有一定的疏水性及非極性，極易吸附于玻璃器皿壁上， 溶解時要充分振蕩。實施例3、回收率及樣品提取方法的確定取陰性樣本(棉花)為代表性樣品，將其剪碎至5mmx5mm—下，混勻。 分別稱取1.0g試樣置于lOOmL具塞錐形瓶中，然后將一定濃度的甲基對氧磷標 準品的丙酮溶液加入其中，使甲基對氧磷在棉花中的終濃度分別為0.1pg/g、 l|ig/g、 10pg/g，室溫靜置15min。在錐形瓶中加入20mL乙酸乙酯，于超聲波發(fā)生器中提取20min，將提取液 濾出。殘渣再用10mL乙酸乙酯超聲提取5min，將兩次濾液合并。將濾液在4(TC水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至近干，用丙酮溶解并定容至lmL， 然后用氮氣吹干，以含10—20X甲醇的PBS溶解。移取50pL樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定。 回收率的計算根據(jù)不同添加濃度的樣品OD值計算相應的抑制率，再根據(jù)相應的抑制率從標準曲線上查到各自的濃度。檢測濃度與真實濃度之比為對應濃度的回收率。試驗結(jié)果如下標準曲線本方法所獲得的抗原檢測的線性范圍是為0.1 20pg/mL，具體請見 說明書附圖。靈敏度靈敏度是所得90%空白孔吸光值所對應的標準品的濃度，即1<:90為 0.01pg/mL。交叉反應率(Cross Reactive, C.R%)將幾種結(jié)構(gòu)相近的有機磷農(nóng)藥進行交叉反應研究。C50(甲基對氧磷) ，_n/CR =-1-^~ x 100%lCso(其他有機磷農(nóng)藥)ICso是抑制率為50%時各有機磷農(nóng)藥標準品的濃度。從下表數(shù)據(jù)可知與其他類 似結(jié)構(gòu)有機磷農(nóng)藥的交叉反應率很低，說明此抗體具有較好的特異性。表1交叉反應率測定結(jié)果名稱(name)IC50(pg/mL)C.R%甲基對氧磷(paraoxon-methyl)1.27100甲基對硫磷(parathion-methyl)139.7對氧磷(paraoxon)10.711.8對硫磷(parathion)〉100<1敵敵畏(dichlorvos)245.3速滅磷(mevinphos)>1000一回收率測定加標棉花樣品后進行ELISA測定，結(jié)果見下表。回收率在78% 117%之間。表2 ELISA檢測加標樣品回收率結(jié)果甲基對氧磷添加量(pg/g)檢出量(pg/g)回收率(％)0. 10. 11711710. 91491. 4107. 88478. 8權(quán)利要求
1、一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于步驟如下(1)抗原的包被以半抗原O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)復合物作為包被抗原，以0.05M、pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被抗原1∶32000～1∶64000，濃度為0.625～1.25μg/mL作為包被液，在酶標板的每孔中加入100μL，4℃孵育過夜，然后用含0.1％明膠的上述碳酸鹽緩沖液作為封閉液，封閉2h；(2)競爭反應將免疫制備的甲基對氧磷多克隆抗體用抗體稀釋液含0.1％明膠、含0.05％吐溫-20、pH 7.4、0.01M的磷酸鹽緩沖溶液PBST，按1∶2000～1∶4000比例稀釋后，加入酶標板中，每孔加50μL，同時每孔分別加入標準品稀釋液PBST稀釋的0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL系列濃度之一的甲基對氧磷標準品50μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)加酶標二抗加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，以抗體稀釋液稀釋為1∶5000，每孔加100μL，37℃溫育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)顯色每孔加入100μL顯色液，暗處37℃反應15min，取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸終止液，用酶標儀測定吸光值A450，與所作的標準曲線對比算出待測樣品的甲基對氧磷濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于顯 色液配方A液:0.933 g檸檬酸，3.68 gNa2HP04'12H20， 18 |iL30°/0H2O2用 超純水定容至100 mL; B液60 mg 3，3^^-四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mL乙二醇 中；使用前將A液與B液以5:1體積混合。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于標 準品稀釋液PBST為含0.15mol/LNaCl、含0. 5%Tween-20的0.01mol/L、pH 7.4 PBST溶液。
全文摘要
一種甲基對氧磷的酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于免疫分析技術(shù)領域。本發(fā)明利用合成的甲基對氧磷免疫原免疫獲得到多克隆抗體，以甲基對氧磷為標準品，以甲基對氧磷半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被抗原，建立了紡織品(棉花)中甲基對氧磷的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。本發(fā)明建立了紡織品中甲基對氧磷農(nóng)藥代謝物的間接ELISA方法，為甲基對氧磷在紡織品中的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩(wěn)定性和重復性較好。靈敏度為0.01ppm，線性范圍為0.1-20ppm。免疫反應的高特異性和親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏度。
文檔編號G01N33/543GK101334409SQ20081002122
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者尹麗梅, 彭池方, 徐一平, 殷祥剛, 胥傳來, 媛 袁, 偉 馬 申請人:江南大學