專利名稱：：用于檢測黃曲霉毒素B₁的生物傳感器電極及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物傳感器領(lǐng)域，涉及一種用于檢測黃曲霉毒素B,的生物傳感器電極及其制備方法。技術(shù)背景黃曲霉毒素Bi(AFB。是目前已知的強(qiáng)致癌物之一，它們常污染動物飼料和人類的食品，1988年國際月中瘤研究機(jī)構(gòu)(IntemationalAgencyforResearchonCancer,IARC)將黃曲霉毒素AFBl列為人類致癌物。用污染的飼料喂養(yǎng)禽畜會導(dǎo)致肉、乳及其制品的污染。人們?nèi)绻秤帽晃廴镜氖称罚瑫?dǎo)致急性中毒，引起肝臟壞死出血，慢性中毒可引起肝癌、肺癌。同時，用被污染的詞料飼養(yǎng)禽畜會使禽畜生產(chǎn)率降低，增重減侵，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。各國對食品及飼料中的黃曲霉毒素均有嚴(yán)格的限量規(guī)定。目前，對食品及飼料中黃曲霉毒素BJ勺檢測方法大致有TLC(薄層色譜法)、HPLC(高效液相色譜)、免疫化學(xué)(酶標(biāo)儀法)法等幾種(黃曲霉毒素B,檢測方法的分析，食品與發(fā)酵工業(yè)2003年10期)，以及酶生物傳感器。TLC法較為簡單，不需要價格高昂的儀器設(shè)備，但樣品的前處理繁瑣，耗時，準(zhǔn)確性差，且使用的大量有毒有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)人員危害大。HPLC法需要高昂的設(shè)備費(fèi)用，技術(shù)水平要求高，樣品處理仍是繁瑣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度易受試劑差異的影響，不適合快速檢測；免疫化學(xué)(酶標(biāo)儀法，包括酶聯(lián)免疫吸附法，放射免疫法，親合層析法)(1)酶聯(lián)免疫吸附法，特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低，適于批量檢測，食品和飼料，但是，酶本身的不穩(wěn)定性，復(fù)雜樣品受干擾,檢測準(zhǔn)確度不高；(2)放射免疫法，放射免疫法與酶免疫法類似，但放射免疫法存在放射污染，已被淘汰；(3)親合層析法，近年發(fā)展較快的檢測方法，但是價格昂貴，難以推廣。已報道的酶生物傳感器法，如中國專利ZL200410028018.9(本專利發(fā)明人申請的另一專利)，用黃曲霉毒素解毒酶通過共價固定在金電極表面制備傳感器檢測黃曲霉毒素Bp檢測范圍在lppm10ppb，檢測靈敏度不夠高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測黃曲霉毒素Bi的生物傳感器電極，該'電極能在pH^7，2(TC55"C的檢測體系中檢測AFB,，靈敏度更高，檢測范圍擴(kuò)大到1.5ppm0.125ppb，檢測速度快且操作簡單方便。本發(fā)明所述的用于檢測霉菌毒素的酶修飾電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體，溶膠凝膠薄膜和黃曲霉毒素解氧化酶，電子介體固定在基底層上，溶膠凝膠將黃曲霉毒素氧化酶包埋于電子介體修飾基底上，形成黃曲霉毒素氧化酶修飾的生物傳感器電極。所述的電子介體可選用有機(jī)分子電子介體和高分子電子介體。有機(jī)分子電子介體主要有二茂鐵^其衍生物、有機(jī)染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯；高分子介體主要包括變價過渡金屬離子型和有機(jī)氧化還原型等氧化還原聚合物。高分子介體化合物通常是由低分子介體化合物與高分子鏈所帶的活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)固載生成的。本發(fā)明優(yōu)選的電子介體由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成，其通過溶膠凝膠形成的網(wǎng)絡(luò)狀三維空間微環(huán)境將黃曲霉毒氧化S每包埋固定起來?；罨蟮亩啾谔技{米管起了一個增敏的作用，即增強(qiáng)電極的靈敏性，同時，活化后的多壁碳納米管具有較大量的羧基，也十分有利于對蛋白質(zhì)的固定。所述的多壁碳納米管優(yōu)選是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管，也可以是其他強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。所述的溶膠凝敏Sol-gd灘液的前驅(qū)體為TEOS(tetraethylorthosilicate，正硅酸乙酯)，前驅(qū)體還可選用低相對分子質(zhì)量的硅酸甲酯(TMOS)，鈦酸丁酯等金屬或半金屬醇鹽前驅(qū)體。當(dāng)選用其他不同的電子介體時，可選用適合該電子介體的不同的聯(lián)結(jié)方法。例如，選用二茂鐵衍生物作為電子介體時，先利用雙異硫氰酸酯與酶分子進(jìn)行交替共聚制成酶膜，然后再將帶有羧基的二茂鐵衍生物通過與酶分子上的氨基反應(yīng)鍵合到酶分子上去。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于檢測黃曲霉毒素B,的生物傳感器電極的制備方法。本發(fā)明所述的一種用于檢測黃曲霉毒素Bt的生物傳感器電極的制備方法，包括以下步驟A、將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化的活化處理后，加入到含0.05%~0.15%表面活性劑的純水中混勻，即得羧基化多壁碳納米管溶液；B、制備黃曲霉毒素氧化酶；c、在酸性環(huán)境下,正硅酸乙酯作為前驅(qū)體，被催化水解成為的羥基化的產(chǎn)物和相應(yīng)的醇，即得到A溶液.D、以羧基化多壁碳納米管溶液對工作電極進(jìn)行修飾成膜，黃曲霉毒素氧化酶的酶液與上述A溶液混合，用還原劑調(diào)混合液pH至7.2，混勻后，滴加于電極表面，溶膠凝膠縮聚陳化成膜后，即得黃曲霉毒素氧化酶修飾的生物傳感器電極。所述的步驟C中，還可以在滴加于電極表面的IEOS溶膠凝膠溶液中加入適量的防裂劑，如Triton-100、聚乙二烯等。優(yōu)選的制備方法包括以下步驟-A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流812小時，離心，棄上清，干燥后為羧基化多壁碳納米管；稱取羧基化多壁碳納米管溶于含有0.05°/^.15%表面活性劑的純水中，攪拌均勻后，配成0.01~1.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液；B、黃曲霉毒素氧化酶的制備(l)^w///^7'e//ato^scew真菌培養(yǎng)4周后收集菌體，加入提取緩沖液(每1000ml含pH6.0，PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTT0.1mM，NaCl50mM，其余為二次蒸餾水，pH6.0)，于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，離心，去除菌體碎片，留取上清，向上清中加入固體硫酸銨,使之形成40%的硫酸銨飽和度，靜置，離心，棄沉淀；在上清中，緩慢加入固體硫酸銨，使其形成75%硫酸銨飽和度，靜置，離心，棄上清，保存沉淀。將沉淀以1:4(重量體積)溶于pH6.5，0.02MPBS中，混勻后作為下一步色譜分離的上樣樣品。(2)用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)(苯基瓊脂糖,疏水層析介質(zhì)6FastFlow型號)進(jìn)行進(jìn)一部的純化取上述上樣樣品，以0.5ml/min的流速上樣。以平衡緩沖液(pH5.5，0.02MPBS，含30%飽和度硫酸銨)進(jìn)行洗脫，然后再依次換用含10%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH6.3，0.02MPBS)，以及含0%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH7.0，0.02MPBS)，分別洗脫，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后得黃曲霉毒素氧化酶。(3)酶活測定按表1所示加好各種試劑后，3(TC水浴反應(yīng)30分鐘，其中滅活對照組的操作是酶液在140。C沸水浴中滅活10分鐘后，再加入與反應(yīng)組相同的反應(yīng)體系中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述各組均作3個平行管，反應(yīng)完成后，各管加入lml預(yù)冷色譜甲醇，12000rpm/分鐘，離心10分鐘，取上清在435nm的波長下進(jìn)行熒光掃描。酶活力單位的定義每分鐘使底物AFB!的熒光值(435nm)下降一個單位值所需要的酶量定義為一個酶活單位。C、正硅酸乙酯為前驅(qū)體在酸性條件下讓其催化水解，并在該水解體系中加入防裂劑，使防裂劑體積分?jǐn)?shù)為2.5°/W7.5%(如Triton-lOO、聚乙二烯等)，混勻，超聲均勻。D、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以鉑電極為基底層，打磨至拋光，并依次在丙酮，強(qiáng)堿溶液，強(qiáng)酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗，將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，烘干成膜；再將步驟B中制備的酶液與步驟C制備的A溶液，以l:ll(體稅體積)的比例混勻，并用低濃度堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.2,然后滴加于電極表面，_4"放置24小時以上，陳化；直至溶膠凝膠薄膜縮聚陳化完全,即得黃曲霉毒素氧化酶修飾的生物傳感器電極。更為優(yōu)選的制備方法包括以下步驟A、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流810小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀，重復(fù)此步驟兩次；將沉淀置于烘箱中烘干，為羧基化多壁碳納米管；稱取上述lmg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的加入0.05°/".15%表面活性劑的純水中，攪拌均勻后，配成0.1mg/ml的溶液；B、黃曲霉毒素氧化酶的制備:(1)^7^7/^^//^^^^"真菌培養(yǎng)4周后收集菌體，按w:f12:1的比例加入提取緩沖液(每1000ml含pH6.0的PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTTO.lmM，NaC150mM，余量為二次蒸餾水，該提取緩沖液的最終pH為6.0)，于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，勻漿液中按照1:2的體積比加入上述提取緩沖液混合，4°C，4000g，離心10分鐘，去除菌體碎片，留取上清，在上清中加入固體硫酸銨，使之形成40%的硫酸銨飽和度，置《C中過夜。4°C，10000g，20分鐘離心，棄沉淀；在上清中，緩慢加入固體硫酸銨，使其形成75%硫酸銨飽和度，置4。C中過夜。4°C，10000g,20分鐘離心，棄上清，保存沉淀。用pH6.0,0.02mol/LPBS將75。/。硫酸銨沉淀物稀釋成40%硫酸銨沉淀液，8000g離心10分鐘后留取上清液，沉淀加入固體硫酸銨使之成70%硫酸銨飽和度，置4。C中過夜，8000g離心后留取沉淀物，取適量上述沉淀物，以1:4(重量體積)溶于pH6.5，0.02MPBS中，4°C，充分混勻，成為下一步純化的上樣樣品。(2)用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)(為瑞典Pharmacia公司產(chǎn)品，苯基瓊脂糖疏水層析介質(zhì)6FastFlow型號)進(jìn)行進(jìn)一步純化用平衡緩沖液(pH5.5，0.02MPBS，含30%飽和度硫酸銨)以2ml/min的流速洗PhenylSepharose6FastFlow(highsub)柱，至洗脫液檢測基線穩(wěn)定。取步驟(1)所得上樣樣品適量，以0.5ml/min的流速上樣。當(dāng)樣品接近完全進(jìn)入柱床時，以2ml/min的流速用平衡緩沖液(pH5.5，0.02MPBS，含30%飽和度硫酸銨)，進(jìn)行洗脫，基線回復(fù)平穩(wěn)時，依次換用含10%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH6.3，0.02MPBS)以及含0%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH7.0，0.02MPBS)，分別洗脫至基線回復(fù)平穩(wěn)。收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后得黃曲霉毒素氧化酶。(3)酶活測定按表2所示加好各種試劑后，3(TC水浴反應(yīng)30分鐘，其中滅活對照組的操作是酶液在140。C沸水浴中滅活10分鐘后，再加入與反應(yīng)組相同的反應(yīng)體系中。表2質(zhì)控組空白組滅活對照組酶液組6.5pH，0.1mol/LPBS100909090酶液(W)'1010100.01mg/mlAFB,222上述各組均作3個平行管，反應(yīng)完成后，各管加入lml預(yù)冷色譜甲醇，12000rpm/分鐘，離心10分鐘，取上清在435nm的波長下進(jìn)行熒光掃描。酶活力單位的定義每分鐘使底物AFB,的熒光值(435nm)下降一個單位值所需要的酶量定義為一個酶活單位。C、以正硅酸乙酯為前驅(qū)體，使用0.2M的鹽酸催化前驅(qū)體水解，并在該7拙軍體系中加入防裂劑，使防裂劑體積分?jǐn)?shù)為5%,混勻后，超聲1小時，室溫靜置12小時,備用oD、多壁碳納米管修飾酶電極的制備將鉑電極在由4體積98%H2S04與1體積30%H202組成的溶液中浸泡30min，依次用丙酮、無水乙醇、二次蒸餾水超聲波清洗5min，然后用粒徑0.05pmAl2O3磨墊拋光。最后用二次蒸餾7K超聲波清洗5min。接著將電極浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作電位范圍一500mV_+1500mV，用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描直至電極信號穩(wěn)定為止，將步驟A所得的羧基化多壁碳納米管溶液適量滴加在電極表面，烘干成膜；再將步驟B中制備的酶液與步驟C制備的A溶液以1:11(體積體積)的比例混勻，用6.5%的氨水調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.2,然后滴加于電極表面，-4t:放置24小時以上；直至溶膠凝膠縮聚陳化成透明薄膜，即得黃曲霉毒素氧化酶修飾的生物傳感器電極。所述的步驟C中，每TEOS液中加入5|il的防裂劑Triton-lOO，混勻，超聲，靜置，然后滴加于電極表面?；谔技{米管的在酶生物傳感器上的潛在應(yīng)用，本發(fā)明以硝化氧化方式活化處理多壁碳納米管，以MWNT-COOH作為酶反應(yīng)電子介體，以TEOS為前驅(qū)體的溶膠凝膠固態(tài)薄膜將黃曲霉毒氧化酶包埋固定起來，從而制備成固相酶生物傳感器電極。本發(fā)明所述的生物傳感器電極，主要是利用所含的黃曲霉毒素氧化酶來檢測黃曲霉毒素Bi，其原理是AFBt在黃曲霉毒素氧化酶催化下發(fā)生氧化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中產(chǎn)生可以被檢壩啲電信號。因此，本發(fā)明所述的生物傳感器電極，對于黃曲霉毒素Bi的檢測是高特異性的，而且其檢測的靈敏度非常高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.利用本發(fā)明的生物傳感器電極，僅需要對樣品進(jìn)行簡單的預(yù)處理，可用于在線檢測，響應(yīng)時間較決，靈敏度高單個樣品或批量檢測均可以方便地使用；2.本發(fā)明生物傳感器電極能在pH4~7，2(TC55'C的檢測體系中檢測AFBp靈敏度更高，檢測范圍擴(kuò)大到1.5ppm0.125ppb;3.本發(fā)明的生物傳感器電極使用起來省時、省力，檢測速度快且操作簡單方便，無須培訓(xùn)即可推廣應(yīng)用。圖1為黃曲霉毒素氧化酶通過溶膠凝膠法固化在MWNT鉑電極上的示意圖；圖2為不同濃度AFBi的循環(huán)伏安圖(Scanrate:100mv/s);圖3為不同濃度AFBt的微分脈沖圖；圖4為不同濃度AFB!與峰電流的關(guān)系圖；其中，A為不同濃度的AFB!溶液，B為空白PBS。具體實(shí)施方式實(shí)施例1用于檢測黃曲霉毒素B,的生物傳感器電極本發(fā)明所述的用于檢測黃曲霉毒素B,的生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體，溶膠;疑膠薄膜和黃曲霉毒素氧化酶，電子介體固定在基底層上，溶膠凝膠將黃曲霉毒素氧化酶包埋于電子介體修飾基底上成膜，形成用于檢測黃曲霉毒素Bt的酶修飾電極。本實(shí)施例中，所采用的電子介體是由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成，具體是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管，其通過溶膠凝膠法包埋固定黃曲霉毒素氧化酶。實(shí)施例2用于檢測黃曲霉毒素Bi的生物傳感器電極的制備(一)、材料的準(zhǔn)備(1)工作電極選用鉑電極，購自天津蘭力科技公司。(2)多壁碳納米管(MWNT):購自深圳納米港。(3)TEOS(tetraethylorthosilicate，正硅酸乙酯)購自Sigma公司。(二)、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管(MWNT)用王水回流810小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀。將沉淀置于烘箱中烘干，即得羧基化多壁碳納米管。稱取上述lmg羧基化的MWNT溶于10ml含0.05°/".15%表面活性劑的純水中，攪拌均勻后，配成0.1mg/ml的溶液。(三)、黃曲霉毒素氧化酶的制備^7^7/^^/^/^^^"真菌培養(yǎng)4周后收集菌體，取適量菌體按1:2(重量體積)的比例加入提取緩沖液(每1000ml含pH6.0，PBS0.05M，EDTA0.5mM，DTTO.lmM，NaC150mM，余為二次蒸餾水，pH6.0)，于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，離心，去除菌體碎片，留取上清，再加入固體硫酸銨,使之形成40%的硫酸銨飽和度，靜置，離心，棄沉淀；在上清中，緩慢加入固體硫酸銨，使其形成75%硫酸銨飽和度，靜置，離心，棄上清，保存沉淀。將上述沉淀以l:4(重量體積)溶于pH6.5，0.02MPBS中，混勻，成為下一色譜分離的上樣樣品。用PhenylSepharose6FastFlow(highsub)進(jìn)行進(jìn)一部的純化。取上述適量上樣樣品，以0.5ml/min的流速上樣。以平衡緩沖液(pH5.5，，0.02MPBS，含30%飽和度硫酸銨)進(jìn)行洗脫，然后再依次換用含10%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH:6.3，0.02MPBS),以及含0%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液(pH7.0，0.02MPBS)，分別洗脫，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后得黃曲霉毒素氧化酶。(四)、TEOS的溶膨疑膠溶液的制備在2ml潔凈的EP管中，依次加入405^1純水，10pl0.2MHCl，混勻后，加入60jxlTEOS，25(ilTriton-100。振蕩均勻，室溫靜置23小時，備用。(五)、多壁碳納米管修飾酶電極的制備以鉑電極為基底層，將鉑電極在Piranha(由4體積98%H2S04與1體積30%H202組成)溶液中浸泡30min，依次用丙酮、無水乙醇、二次蒸餾水超聲波清洗5min，然后用粒徑0.05pmAl2O3磨墊拋光，最后二次蒸餾水超聲波清洗5min，干燥鉬表面。接著將電極浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作電位范圍一500mV—+1500mV，用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描直至電極信息穩(wěn)定為止，將步驟(二)所得的0.1mg/mL的MWNT溶液滴加lOpl在電極表面，4080。C烘干成膜；將5^1上述步驟(三)所得的酶液與55pl上述步驟(四)所得溶膠凝膠溶液混勻后，用6.5%的氨水調(diào)pH值至7.2后，取該混合液1(^1滴加于上述MWNT(多壁碳納米管)修飾的電極表面。放入4。C冰箱內(nèi)保存,放置24h以上，直至溶膠凝膠縮聚陳化成透明薄膜，即得用于檢測黃曲霉毒素B1的生物傳感器電極，如圖1所示。本實(shí)施例中，選用黃曲霉毒素B1作為底物。本實(shí)施例為優(yōu)選方案，在TEOS的溶膠凝膠溶液中加入5%的Triton-lOO做為防裂劑，此步驟中即使不加入防裂劑也可制備出有功能的酶修飾電極。實(shí)施例3用于檢測黃曲霉毒素B1的生物傳感器電極的實(shí)驗(yàn)分析將本發(fā)明所述的黃曲霉毒素氧化酶修飾的鉑電極作為工作電極，與通用的對電極和任選的參比電極一起組成一個電極系統(tǒng)。本實(shí)施例中，選用Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲電極為對電極組成三電極系統(tǒng)，磷酸鹽緩沖液為電解液。(一)樣品的處理固態(tài)樣品腦g樣品以粉碎機(jī)粉碎，用甲醇:水45:55的體積比充分溶解震蕩，以等體積的氯仿提取3次，通過含有無水硫酸鈉的漏斗，65'C下吹氮?dú)鈸]干。液態(tài)樣品100ml樣品以0.5:1(體積:體積)的氯仿提取3次，通過含有無水硫酸鈉的漏斗，65'C下吹氮?dú)鈸]干。(二)MWNT修飾黃曲霉毒素氧化酶電極對黃曲霉毒素B,的電化學(xué)響應(yīng)電位范圍一400mV+1250mV，在10ml的含0.1MNa2S04的0.01M磷酸緩沖液(pH7.0)中，用BAS-IOOElectrochemicalanalyzer進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)研究和示差脈沖伏安(DPV)研究，計時電流法，掃描速率100mV/s。分別檢測MWNT修飾溶膠凝膠法固化ADTZ修飾電極對黃曲霉毒素B,的響應(yīng)情況。一、循環(huán)伏安法檢測采用BAS—100電化學(xué)分析儀三電極系統(tǒng)(參比電極Ag/AgCl電極，對電極:Pt絲電極，工作電極修飾AU電極)，選擇循環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下工作電位范圍一400mv+1250mv掃描速率100mv/s;靈敏度lO^lA/V;靜息時間2s設(shè)置好參數(shù)后，分別用不同的修飾工作電極對10ml0.2M，pH6.60PBS(含lg/1kcl)的底液以及相同底液體系中加入不同濃度的AFB!的乙醇溶液或上述樣品進(jìn)行循環(huán)伏安掃描檢測。測試效果以100mv/s的掃描速率，在一400mv+1250mv工作電位范圍內(nèi)用循環(huán)伏安法對不同濃度的AFB,溶液進(jìn)行測定，如圖2和圖3所示，峰電流隨AFB,濃度的增加而增加。二、微分脈沖伏安纟去檢測選擇微分脈沖伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下脈沖振幅50mv;采集數(shù)據(jù)電位區(qū)間一400mv4l250mv;采樣寬度20ms;掃描速度100mV/S;靜息時間10s測試效果:以溶膠凝膠法固定化黃曲霉毒素氧化酶修飾電極對不同濃度的AFB,溶液進(jìn)行微分脈沖伏安掃描，所測結(jié)果如圖3所示，表明該電極對AFBi敏感，不同的濃度下產(chǎn)生不同大小的脈沖信號(信號大小與濃度有正比例關(guān)系)。即黃曲霉毒素B!的含量可以通過脈沖信號表示出來。如圖3所示，以溶膠凝膠法固定化的黃曲霉毒素氧化酶修飾電極在+30mv位置用微分脈沖伏安法對AFB!進(jìn)行定量分析，得到在5.00xlO—55.00xlO"VL濃度范圍內(nèi)，峰電流隨著AFBi濃度的增加而上升，AFBi的線性檢測范圍為5.00x10-55.00x1(TVl，線性方程為Ip=7.609+6.613c，R2=0.96941，P<0.05。圖4表明本發(fā)明的生物傳感器電極對AF響應(yīng)靈敏，產(chǎn)生的峰電流大小與AFB1的含量成正比例關(guān)系，即可以通過峰電流表示樣品中黃曲霉毒素的含量。如圖4所示，在AFB!濃度范圍5ug/L25ug/L,電極檢觀啲信號(電流強(qiáng)度)變化更為靈敏。電極的分析特性，對AFBi的檢測線性范圍有兩個幾性范圍1:5pg/L25jiig/L,其線性回歸方程為Ip=24.03879+7.14296*C，相關(guān)系數(shù)R2=0.9792PO.0001。線線性范圍2:30ng/L70pg/L,其線性回歸方程為Ip=185.35+1.44143*C,相關(guān)系數(shù)R2=0.9865PO.0001。權(quán)利要求1、一種用于檢測黃曲霉毒素B1的生物傳感器電極，包括基底層及在基底層上形成的反應(yīng)層，其特征在于所述的反應(yīng)層由電子介體、溶膠凝膠和黃曲霉毒素氧化酶組成，電子介體固定在基底層上，溶膠凝膠將黃曲霉毒素氧化酶包埋于電子介體修飾的基底層上成膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器電極，其特征在于所述的電子介體由在酸氧化環(huán)境下活化的多壁碳納米管構(gòu)成；所述的溶膠凝膠的前驅(qū)體為正硅酸乙酯，在溶膠凝膠中正硅酸乙酯的質(zhì)量百分比為10%15%。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物傳感器電極，其特征在于所述的多壁碳納米管是以硝化氧化方式活化處理所得的羧基化多壁碳納米管。4.權(quán)利要求1^3之一所述生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下(1)、將多壁碳納米管進(jìn)行羧基化的活化處理后，加入到含有0.05°/^0.15%質(zhì)量表面活性劑的純水中混勻，即得羧基化多壁碳納米管溶液；(2)、制備黃曲霉毒素氧化酶；(3)、在酸性環(huán)境下,正硅酸乙酯作為前驅(qū)體,被催化水解成為的羥基化的產(chǎn)物和相應(yīng)的醇，即得到A溶液；(4)、以羧基化多壁碳納米管溶液對工作電極進(jìn)行修飾成膜，黃曲霉毒素氧化酶的酶液與上述A溶液混合，用還原劑調(diào)混合液pH至7.2，混勻后，滴加于電極表面，溶膠凝膠縮聚陳化成膜后，得用于檢測黃曲霉毒素Bi的生物傳感器電極。5.權(quán)利要求1^3之一所述生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流812小時，離心，棄上清，干燥后為羧基化多壁碳納米管；將羧基化多壁碳納米管溶于含有0.05°/』.15%質(zhì)量表面活性劑的純水中，超聲波攪拌均勻后，配成0.011.0mg/ml的羧基化多壁碳納米管溶液；(2)、黃曲霉毒素氧化酶的制備收集Armillariellatabescen真菌菌體，加入提取緩沖液，破碎，離心，取上清，用硫酸銨沉淀法獲取沉淀物，以PBS混勻后上樣于PhenylSepharose6FastFlow，進(jìn)一步純化，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后即得黃曲霉毒素氧化酶；(3)、以正硅酸乙酯為前驅(qū)體,在酸性條件下讓其催化水解，并在該水解體系中加入防裂劑，使防裂劑體積分?jǐn)?shù)為2.5%7.5%，混勻，即得到A溶液；(4)、電極的制備以鉑電極為基底層，打磨至拋光，并依次在丙酮，強(qiáng)堿溶液，強(qiáng)酸溶液以及蒸餾水中超聲波清洗，將步驟(1)所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，烘干成膜；再將步驟(2)制備的酶液與步驟(3)制備的A溶液，以l:ll體積比混勻，并用堿性溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.2，然后滴加于電極表面，-4"放置24小時以上，陳化；直至溶膠凝膠薄膜縮聚陳化完全，得用于檢測黃曲霉毒素Bt的生物傳感器電極。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物傳感器電極的制備方法，其特征在于，所述的防裂劑為Triton-100或聚乙二烯。7、權(quán)利要求1^3之一所述生物傳感器電極的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、羧基化多壁碳納米管溶液的制備將多壁碳納米管用王水回流812小時，10000g離心15分鐘，棄上清，用雙蒸水清洗沉淀，10000g離心15分鐘，洗滌沉淀，重復(fù)此步驟兩次；將沉淀置于烘箱中烘干，為羧基化多壁碳納米管；稱取上述lmg羧基化多壁碳納米管溶于10ml的加入表面活性齊啲雙蒸水中，混勻，配成0.1mg/ml的溶液；(2)、黃曲霉毒素氧化酶的制備收集^7^7/0^//"^&^^2培養(yǎng)4周后的真菌菌體，按重量、體積比為12:1的比例加入提取緩沖液中，于高速組織搗碎機(jī)中搗碎，勻漿液中按照1:2的體積比，加入上述提取緩沖液混合，4°C，4000g，離心10分鐘，取上清，依次用硫酸銨濃度為40%和75%的硫酸銨沉淀法獲取沉淀物，將所得沉淀以l:4體積比溶于pH6.5，0.02MPBS中，4°C，充分混勻后上樣于PhenylSepharose6FastFlow，進(jìn)行純化，依次用含10%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液和含0%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液分別洗脫，收集色譜過程中的酶活性峰組分，濃縮后即得黃曲霉毒素氧化酶；(3)、以正硅酸乙酯為前驅(qū)體,使用0.2M的鹽酸催化前驅(qū)體水解，并在該水解體系中加入防裂劑，使防裂劑體積分?jǐn)?shù)為5%，混勻后，室溫靜置12小時，備用；(4)、電極的制備將鉑電極在由4體積98%H2S04與1體積30%11202組成的溶液中浸泡30min，依次用丙酮、無水乙醇、二次蒸餾水超聲波清洗5min，然后用粒徑0.05pmAl2O3磨墊拋光，最后用二次蒸餾水超聲波清洗5min，接著將電極浸泡于0.5mol/LH2SO4，工作電位范圍一500mV—+1500mV，用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描直至電極信號穩(wěn)定為止，將步驟(1)所得的羧基化多壁碳納米管溶液滴加在電極表面，烘干成膜；再將步驟(2)制備的酶液與步驟(3)制備的A溶液以1:11體積比混勻，用6.5n/。質(zhì)量氮水調(diào)節(jié)混合液的pH值至7.2，然后滴加于電極表面，-4。C放置24小時以上；直至溶膠凝膠縮聚陳化成透明薄膜，得用于檢測黃曲霉毒素Bi的生物傳感器電極。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物傳感器電極的制備方法，其特征在于，步驟(l)中所述的提取緩沖液為每1000ml溶液中含有0.05MpH6.0的PBS，0.5mM的EDTA，O.lmM的DTT，50mM的NaCl，余量為二次蒸水，且該提取緩沖液的pH為6.0。9、根據(jù)權(quán)禾腰求7所述的生物傳繊電極的審恪方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的含10%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液為0.02M的PBS,其pH為6.3;所述的含0%飽和度硫酸銨洗脫緩沖液為0.02M的PBS，其pH為。10、權(quán)利要求1-3中任意一項的生物傳感器電極在制備檢測黃曲霉毒素B,的生物傳感器中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種用于檢測黃曲霉毒素B₁的生物傳感器電極及其制備方法，所述生物傳感器電極，包括基底層與在基底層上形成的反應(yīng)層，所述的反應(yīng)層包含電子介體、溶膠凝膠薄膜和黃曲霉毒素氧化酶，電子介體固定在基底層上，溶膠凝膠將黃曲霉毒素氧化酶包埋于電子介體修飾的基底上成膜，即得黃曲霉毒素氧化酶修飾電極。本發(fā)明的生物傳感器電極響應(yīng)快、信號靈敏度可達(dá)到1.5ppm～0.125ppb、特異性高、使用方便、可定量檢測，使用壽命長，穩(wěn)定性好。文檔編號G01N27/327GK101216450SQ20081002582公開日2008年7月9日申請日期2008年1月16日優(yōu)先權(quán)日2008年1月16日發(fā)明者劉大嶺,姚冬生,李世川,謝春芳申請人:暨南大學(xué)