專利名稱：化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測hla-g超敏感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)臨床免疫分析領(lǐng)域。利用化學(xué)發(fā)光免疫分析通過檢測
HLA—G建立早期、敏感、廣譜診斷惡性腫癯的方法。此外本發(fā)明也可用于生理、病理、藥理、免疫、生殖、腫瘤、器官移植等多方面研究。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種常見病和多發(fā)病，發(fā)病率居第二位。據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年報告稱全球腫癯患者每年死亡人數(shù)高達660萬，到2020年全球的腫瘤患者將達到1500萬。各種惡性腫癯嚴重地威脅著人類的身體健康。在腫癯發(fā)病的早期往往沒有自覺癥狀， 一旦發(fā)覺自覺癥狀時已到無法治療的中晚期。在腫癯發(fā)病機理和治療問題尚未徹底解決的今天要降低腫瘤患者死亡率必須開展基層腫瘤普査工作，做到早發(fā)現(xiàn)早治療。
盡管研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤相關(guān)抗原，例如AFP (甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA15—3、 CA19—9、 CA50、 CA125、 PSA等等。由于免疫分析具有高度的特異性、專一性，所以利用某種腫瘤相關(guān)抗原只能檢測其對應(yīng)的一類腫瘤。如果要檢查體內(nèi)是否存在常見的某些腫瘤必須作多項檢查。
1987年Geraghty等(l)發(fā)現(xiàn)并克隆了 HLA—G。 HLA—G是人類白細胞抗原(HLA) I組中非經(jīng)典的組織相容性抗原。在正常組織中不存在。HLA—G最初發(fā)現(xiàn)于胎盤絨毛細胞滋養(yǎng)層。初期有關(guān)HLA—G的研究集中于胎兒同母親之間的免疫耐受(2)。由于胎盤分泌HLA—G使母體產(chǎn)生免疫耐受，從而使胎兒避免了母體的排斥作用。近20年，HLA—G已成為重要的免疫分子，在免疫、生殖、腫瘤、器官移植等方面作為一種免疫抑制劑發(fā)揮著重要作用(3)。由于惡性腫瘤細胞能夠表達和分泌HLA—G,惡性腫瘤才得以逃避人體免疫監(jiān)視，使其快速生長和擴散。免疫組化檢測結(jié)果證實在喉癌、食道癌、胃痛、結(jié)腸癌、，
癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌等多種惡性腫瘤組織中都能表達HLA—G。大量的實驗證明，HLA-G是一個具有高度腫瘤特異性的腫瘤標志物，在惡性腫癯的表達具有普遍性。在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中其水平在血液、其它體液及腫瘤組織中增高。因此檢測HLA-G能廣泛地應(yīng)用于各種常見惡性腫瘤的診斷。通過檢測HLA-G便可探明受檢者體內(nèi)是否存在常見的各種惡性腫瘤。因此我們有理由稱HLA-G為"腫瘤共同抗原"。
由于HLA—G是腫瘤共同抗原，所以通過檢測HLA—G可以診斷多種惡性腫瘤。目前已有檢測HLA—G的免疫組化試劑盒和ELISA試劑盒的報道。由于ELISA檢測HLA—G的敏感度比較低，不適合用于檢測早期惡性腫瘤。為了檢測早期惡性腫瘤所產(chǎn)生的低濃度HLA—G，我們建立了超敏感的化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測HLA—G的方法。用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測HLA—G的試劑盒我們稱之為"早期廣譜腫瘤診斷試劑盒"。利用該試劑盒只作一次測試就可以診斷多種早期惡性腫瘤。
1977年Arakawe創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescentimmunoassay ,CLIA)。該方法可以使檢測敏感度可達10的負18次方摩爾水平。根據(jù)標記物的不同，化學(xué)發(fā)光免疫分析可分以下三個類型(l)以辣根過氧化物酶(HRP)為標記物的酶促化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)的發(fā)光底物為二酰基肼的衍生物，在氧化劑存在下，HRP催化二?；卵苌锇l(fā)光，波長425nm。苯酚類化合物可增強其發(fā)光強度。(2)以堿性磷酸酶為標記物的酶促化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)的發(fā)光底物為1, 2—二氧環(huán)乙烷衍生物(或稱金剛烷衍生物)。例如AMPPD、CSPD、 CDP-Star、 Lumi-phos480、 Lumiphos-530等。熒光素衍生物和表面活性劑會增強并延長其發(fā)光強度，發(fā)光波長470nm。 (3)以吖啶酯類化合物為標記物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。該系統(tǒng)不需酶催化，不需增強劑。吖啶酯類化合物在堿性H202作用下直接發(fā)光，波長430nm。吖啶酯類化合物發(fā)光系統(tǒng)發(fā)光強度高，反應(yīng)干擾因素少，背景發(fā)光低，信噪比高，具有較高的靈敏度。吖啶酯類發(fā)光系統(tǒng)是一類很有效的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。
參考文獻1. Geraghty DE， Koller BH， Orr HT. A human major histocompatibilitycomplex class I gene that encodes a protein with a shortenedcytoplasmic segment. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84: 9145-9149.
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發(fā)明內(nèi)容
HLA—G單抗的制備用人工合成的HLA—G多肽抗原片段作為免疫原免疫BALB/c小鼠制備兩種同HLA"G反應(yīng)具有不同結(jié)合位點的單抗。具體方法參見本文作者申請的專利(專利申請?zhí)枮?00610130403.3)。
親合素一生物素雙單抗夾心一步法檢測HLA-G方法該方法需要兩種同HLA-G反應(yīng)具有不同結(jié)合位點的單抗。需制備單抗(1)同生物素的復(fù)合物，單抗(2)同酶(或吖啶酯)的復(fù)合物，將鏈每親合素固化于固相載體上。當單抗(1)同生物素的復(fù)合物、單抗(2)同酶(或吖啶酯)的復(fù)合物、樣品(或標準品)一起加入反應(yīng)池后，通過一步法生成復(fù)合物固相載體一鏈霉親合素一生物素一單抗(l) —HLA~G—單抗(2)—酶(或吖啶酯)，經(jīng)過洗滌后加入底物、氧化劑、增強劑便可法光。吖啶酯標記物需加堿性H202發(fā)光啟動劑才能發(fā)光。
競爭法檢測HLA—G的方法只需用一種單抗。首先制備HLA—G(抗原片段)同鏈霉親合素的復(fù)合物，酶(或吖啶酯)同生物素的復(fù)合物，將單抗固化于固相載體上。當樣品(或標準品)同HLA—G—鏈奪親合素復(fù)合物、酶(或吖啶酯)一生物素復(fù)合物一起加入反應(yīng)池，經(jīng)過反應(yīng)、洗絳后加入酶的底物、氧化劑、增強劑便可發(fā)光。吖啶酯標記物需加堿性H202啟動劑才能發(fā)光。
若單抗(2)所結(jié)合的酶為辣根過氧化物酶，則底物需用二?；碌难苌?若單抗(2)所結(jié)合的酶為堿性磷酸酶，則底物是環(huán)1， 2 — 二氧乙垸衍生物(AMPPD);若單抗(2)所結(jié)合的是吖啶酯類化合物，則反應(yīng)不需底物，僅需要堿性H202發(fā)光啟動劑就可發(fā)光。
有效的吖錠酯類化合物有吖瞎酯DMAE—NHS、吖啶磺酰胺、吖啶酯AE、雙吖啶(DMDSBA)等，其發(fā)光啟動劑為堿性H202酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析法可采用全自動檢測儀，也可采用半自動發(fā)光儀。根據(jù)需要，固相載體可選用多孔板或磁微粒。渕定吖啶酯化學(xué)發(fā)光應(yīng)使用全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀。
吖啶酯標記單抗的方法參見本文作者申請的專利(申請?zhí)?00710056485.6實施例l)。
單克隆抗體同酶或生物素的結(jié)合按常規(guī)方法進行，已有多處報道
1、 J .Immunological Methods ,1979,31:231-236。
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3、 尹伯元、王仁芝、李振甲、許以平等編著《標記免疫學(xué)》41—50頁。
4、 Peters JH ， Bau呢arten H eds. Monoklonale Antik5rper. 1988:1349-53 。
具體實施方案實施例1
辣根過氧化物酶發(fā)光體系的配制方法發(fā)光底物二?；碌难苌?優(yōu)選魯
米諾)濃度為1.0mMol/L。復(fù)合氣化劑過硼酸鈉一H202各為1.0通ol/L。復(fù)合增強劑對羥基肉桂酸一對碘酚各為0.05mMol/L。用0.1Mol/L, p朋.60的Tris一HC1緩沖液調(diào)整pH。
實施例2
生物素一親合素雙單抗夾心一步法檢測HLA—G化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立
1、 按前述文獻制備單抗(1)同生物素的復(fù)合物，單抗(2)同辣根過氧化物酶的復(fù)合物，將鏈霧親合素結(jié)合于固相載體上。
2、 建立親合素一生物素雙單抗夾心一步法檢測HLA—G的CLIA法。將待測血清(或HLA—G的標準品)、單抗(1)同生物素的復(fù)合物、單抗(2)同辣根過氧化
物酶的復(fù)合物各50"l加入經(jīng)鏈霉親合素包被的Nanc板孔中，37*C溫育60分鐘，用PBST洗滌3次，加入底物魯米諾溶液(具體配制見實施例l)，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測425nm發(fā)光值，由微機軟件算出樣品含量。該方法的靈敏度經(jīng)測定(Bo+2SD)為0. lng/ml，檢測范圍0. 5—200 ng/ml。實施例3
正常人血請HLA—G含i測定。正常人105例(志愿無償獻血者)，經(jīng)檢測HLA—G,正常人血清HLA—G的含量為零，正常人血清中未檢測到HLA-G 。
實施例4
隨機抽查臨床確診的肝癌患者5例，直腸癌患者7例，食道癌患者ll例，肺癌患者3例。經(jīng)定量檢測這26例癌癥患者的HLA—G的含量，結(jié)果表明這26例癌癥患者全都呈現(xiàn)HLA —G陽性反應(yīng)。5例肝癌的HLA — G平均值為105. 2ng/ml ， 7例直腸癌患者的HLA—G平均值為97. 3ng/ml ， 11例食道癌的HLA一G平均值為85.1ng/ml ， 3例肺癌患者的HLA—G的平均值為63. 7ng/ml 。
權(quán)利要求
1、人類白細胞抗原G(HLA-G)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于用酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析體系和/或吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析體系檢測HLA-G。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析體系，其特征之一在于用辣根過 氧化物酶作為標記物，用二?；卵苌镒鳛槔备^氧化物酵的底物，過氧 硼酸鈉一H202作為復(fù)合氧化劑，對羥基肉桂酸一對姨酚作為復(fù)合增強劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析體系，其特征之二在于用堿性碟 酸酶作為標記物，用1, 2—二氧環(huán)乙烷衍生物(金剛烷衍生物)作為堿性麟酸酶的底物，用熒光素衍生物和表面活性劑作為發(fā)光增強劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析體系，其特征在于用吖啶酯類 化合物作為標記物，用堿性H202作為發(fā)光啟動劑。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述HLA—G化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，其特征在于用雙單抗夾 心法和/或競爭法；固相載體采用微孔板(或條)、高分子聚合物管(或球)、 磁微粒等；用生物素一親和素作為放大系統(tǒng)；測定手段采用全自動或半自動 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進行分析測定。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述單抗其特征在于用人工合成法合成HLA—G的多肽抗原片段作為免疫原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細胞雜交形成兩個雜交瘤細胞株。這兩個 雜交瘤細胞株分泌的HLA—G單克隆抗體同HLA—G反應(yīng)具有不同的位點。
全文摘要
本發(fā)明公開化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測HLA-G的超敏感方法。本發(fā)明由人工合成的HLA-G抗原片段作為免疫原免疫BALB/c小鼠獲得了雜交瘤細胞株。用該雜交瘤細胞株分泌的HLA-G單克隆抗體同化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)相結(jié)合組成廣譜腫瘤診斷試劑盒。廣譜腫瘤診斷試劑盒通過檢測HLA-G用于臨床診斷各種惡性腫瘤。廣譜腫瘤診斷試劑盒通過雙單抗夾心法或競爭法檢測HLA-G?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)采用酶促化學(xué)發(fā)光法或吖啶酯化學(xué)發(fā)光法。
文檔編號G01N33/574GK101493462SQ20081002603
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者蘇殿杰, 蘇 韓, 魏桂梅 申請人:廣州天美生物技術(shù)有限公司