專利名稱:人博卡病毒實時熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種實時熒光PCR檢測試劑盒,特別是涉及利用實時熒光PCR技術(shù)檢測人博 卡病毒的試劑盒。
背景技術(shù):
冬季小兒呼吸道感染高發(fā),其病原很復雜,除細菌、支原體、衣原體之外,很大一部分 為病毒。近20年來,新發(fā)現(xiàn)的30多種傳染病的病原中, 一半以上是病毒,特別是嬰幼兒急 性呼吸道感染的病原中,絕大部分為病毒。盡管如此,還有相當一部分嬰幼兒急性呼吸道感 染的病原尚不清楚。在我國,小兒下呼吸道感染是住院治療的首要原因,而小兒肺炎是引起 小兒死亡第5位的主要原因。美國每年約有250,000兒童因下呼吸道感染住院。在臨床上, 有約12-39%的小兒下呼吸道感染病因不明。2005年8月,瑞典斯德哥爾摩市卡羅林斯卡大學 醫(yī)院的科學家運用分子病毒篩査方法,首次在兒童呼吸道分泌物中發(fā)現(xiàn)了這種"非常普遍、 以前未知"的病原體,其基因序列與細小病毒科的牛(bovine)、犬(canine)細小病毒相近,他 們將這種病毒命名為人類博卡病毒(human bocavirus, HBoV) (Tobias Allander, Martti T. Ta咖i , Margareta Eriksson, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. PNAS. Sept. 2005, vol 102, p. 12891-128%)。 進一步的研究發(fā)現(xiàn),該病毒與兒童急性下呼吸道感染有關(guān)。 一個月后,澳大利亞學者再次從 急性呼吸道感染的兒童中,檢獲同一種病毒(Sloots TP,McErlean DJ.Speicher KE. Arden MD. Nissen, and IM. Mackay. 2006. Evidence of human coronavirus HKU1 and human bocavirus in Australian children. J. Clin. Virol. 35:99-102.)。此后,荷蘭、加拿大、美國、法國、 澳大利亞以及亞洲的中國、日本、韓國、泰國也相繼報道了這種病毒的感染情況。
HBoV在呼吸道感染的患者樣本中頻繁被檢測到。但它在呼吸道感染中所扮演的角色還 不清楚。蘇格蘭愛丁堡大學的Peter Simmonds博士在924例呼吸道感染者(主要來自嬰幼兒 患者)中進行了HBoV篩查,研究發(fā)現(xiàn)朋oV感染頻率僅次于呼吸道合胞病毒和腺病毒,列 第三位,且感染者幾乎全部是嬰幼兒。耶魯大學醫(yī)學院的Jeffrey S. Kahn博士通過將無呼 吸道感染癥狀的個體作為對照組,在兒童中進行朋oV篩査,發(fā)現(xiàn)在對照組個體中沒有或極少 發(fā)現(xiàn)HBov,因此認為HBoV是導致嬰幼兒上、下呼吸道疾病的病原體之一。盡管在這兩次研 究中所涉及的人群范圍較小,采用樣本的嬰兒都在同一年齡,樣本都是在同一家醫(yī)院的不同 時間抽取的,但它揭示了病毒和疾病之間統(tǒng)計學上的關(guān)聯(lián)。
在臨床上,朋oV不易區(qū)別于其他呼吸道病毒,正引起許多學者、專家的密切關(guān)注,其致病性、發(fā)病機制、傳播途徑、感染人群、機體的免疫反應等,尚需進行更多研究。
對HBoV感染的檢測意義體現(xiàn)在以下幾個方面(1)通過檢測有(或無)呼吸道感染癥狀 個體的HBoV感染情況,闡明呼吸道感染與HBoV聯(lián)系,了解臨床病征相關(guān)性。(2)簡單易行 的HBoV檢測方法,便于在人群中進行大規(guī)模的HBoV篩査或流行病學調(diào)査,幫助我們了解這 種新病毒朋oV在其他人群中的感染、傳播和季節(jié)分布情況。(3)為了解這種病毒的致病性和 發(fā)病機制提供了條件,對進一步研究防治措施和研制預防疫苗將起到積極作用。
目前朋oV診斷主要為血清學檢査和分子生物學方法。如通過在昆蟲細胞中表達特異性的
病毒抗原蛋白,建立人博卡病毒特異性抗體血清酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)。該技術(shù)適合于人博卡病 毒感染的血清學診斷及大規(guī)模的血清流行病學調(diào)査。但是受方法本身靈敏度限制,對于病毒 含量較低的患者可能會出現(xiàn)檢測的假陰性,自身免疫性疾病患者也可能出現(xiàn)假陽性。此外, 血清化驗檢測到的抗體只能代表現(xiàn)在或者過去有感染,而不能區(qū)別急性感染和慢性感染以及 治愈者,所以不適于作為急性感染的標志。
分子生物學方法主要是根據(jù)保守區(qū)設計引物,再通過電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行鑒定。熒 光定量PCR (FQ-PCR)用于病原學診斷,是PCR技術(shù)領(lǐng)域的一項創(chuàng)新,F(xiàn)Q-PCR直接檢測HBoV 核酸,特異性強、敏感性很高,是目前診斷HBoV感染的主要方法。與血清學檢測方法相比具 有以下的優(yōu)勢(1)具有更高的靈敏性,適用于鼻咽分泌物的檢測。(2)針對病毒特異性序 列設計引物探針,與血清學檢驗所用的抗原片段相比,具有更高的特異性,避免了常規(guī)血清 學檢測中與呼吸道病毒的交叉反應;(3)對病毒進行定量檢測,可真實反映出患者體內(nèi)病原 體拷貝數(shù)的高低和復制情況,有助于判斷疾病預后,選擇治療方案及監(jiān)測治療效果等。(4) 可擴大檢測人群范圍,進行流行病學調(diào)査和病原體篩查;(5)將PCR的敏感性與探針雜交的 特異性相結(jié)合,在很大程度上改變了傳統(tǒng)PCR的缺陷,降低了反應時間,簡化了操作步驟;
(6)閉管檢測不需PCR后處理,避免了由于樣本間的交叉污染引起的假陽性和環(huán)境污染;(7) 實時檢測技術(shù)可連續(xù)不斷地檢測PCR過程中熒光信號的變化,避免了傳統(tǒng)PCR的"平臺期效 應",并且模板的定量不通過終產(chǎn)物,而由Ct值計算出,準確性和靈敏度均有提高。
本發(fā)明選取人博卡病毒(朋oV)基因組中保守序列作為擴增靶序列區(qū)域,設計特異性引 物和熒光探針,通過實時熒光PCR對HBoV進行實時熒光PCR檢測,該方法相比其它方法有以 下幾點優(yōu)點(1)操作簡單,耗時少,成本低,不需要電泳檢測產(chǎn)物,從儀器上讀出數(shù)據(jù)對 檢測樣本定量;(2)可一次檢測大量樣本,敏感性高于血清學檢測方法,可獲得病毒載量, 從而用于了解病毒載量與臨床癥狀的關(guān)系。臨床研究結(jié)果表明檢測人博卡病毒(HBoV)為 小兒下呼吸道感染的臨床病因快速診斷、治療提供新的依據(jù),對于確認其在中國的流行分布 和進一步了解這種新病毒將起積極作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種利用實時熒光PCR技術(shù)定性或定量檢測人博卡病毒的試劑 盒,該試劑盒包括(l)DNA提取試劑、核酸擴增反應體系、純水、定量參考品、陰性質(zhì)控品、 陽性質(zhì)控品,和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的(1)針對人博卡病毒保守序列設計的能夠與靶多核苷酸結(jié) 合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探針;(2)將寡核苷酸探針標記上熒光發(fā)生基團,使所說的熒 光發(fā)生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合,(3)選擇適宜于PCR擴增的反應體系和熒光檢 測體系;(4)確定熒光發(fā)生基團所產(chǎn)生的熒光量,分析循環(huán)擴增后產(chǎn)生的熒光量以確定耙多 核苷酸的存在及定量。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,其中所述的核酸擴增反應體系包括耐熱DNA聚合酶、 2'-脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向寡核苷酸引物、能夠 與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向寡核苷酸引物、能夠與耙多聚核苷酸結(jié)合并且兩 末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,其中所述的與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物,其特 征在于擴增反應所使用的正向和反向寡核苷酸引物的序列分別是5' - GAG GGG AGA GGA AGA GAC ACT G - 3' (SEQ ID NO: l)和5, - GCA AGA CGA TAG GTG GCT GAT - 3, (SEQ ID NO: 2)。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,其中所述的寡核苷酸探針的序列是5' X-TCATCACAG GAG CAG GAG CCG CA - Y 3' ; (SEQ ID NO: 3)。其中X/Y表示熒光標記檢測體系,包括 能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探 針。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,進一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴增后 所產(chǎn)生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閎循環(huán)次數(shù);(2)將已確定的樣品中耙多核 苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標準溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較,以計算出樣品中靶 多核苷酸的量。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,所述的試劑盒,其特征在于定量參考品包含下列序列 或80%同源的核苷酸序列ATCGGGGAAAAAAGACAATAGAACAAATCCATACACTGTATTCAGTCAACACAGAGCTTCCA。
根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒,對人博卡病毒進行檢測,該方法包括下列步驟
(1) 用DNA提取試劑進行陰、陽性質(zhì)控品和待測樣本(痰液、鼻咽抽提液或咽拭子抽 提液)的DNA提取。DNA提取試劑除本發(fā)明提及的方法外,還可以使用其他成熟的DNA提取方 法和試劑盒。
(2) 將提取的DNA和定量參考品加入到含有核酸擴增反應體系的反應管中,進行PCR擴 增,使用熒光定量PCR檢測儀進行檢測。
(3) 利用定量參考品制備的標準曲線通過軟件分析確定待測樣品對應的濃度。 根據(jù)本發(fā)明提供的用于人博卡病毒檢測的熒光定量PCR試劑盒,其中有一條兩端標記有熒
光基團和淬滅基團的特異性熒光探針,它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列 配對。熒光基團連接在探針的5'末端,而淬滅基團則在3'末端。當完整的探針與目標 序列配對時,熒光基團發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團接近而被淬滅。但在進行延伸反應 時,聚合酶的5'外切酶活性將探針進行酶切,使得熒光基團與淬滅基團分離。隨養(yǎng)擴增循 環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。 對人博卡病毒的定量可以與定量參考品的循環(huán)域值(CT, Threshold cycle)比較得出,利用 定量參考品制備的標準曲線,直接得到待測樣本的起始拷貝數(shù)。
本發(fā)明所述的試劑盒,針對人博卡病毒培養(yǎng)困難,病毒核酸難以通過傳統(tǒng)的方法進行定 量,使用體外克隆的全長博卡病毒質(zhì)粒制備標準曲線,用于待測樣本的核酸絕對定量;此外, 針對人博卡病毒檢測中的特殊性,對核酸擴增反應體系中引物探針濃度、Mg"濃度以及反應的 退火溫度等均進行了優(yōu)化,結(jié)合熒光定量PCR技術(shù),用于人博卡病毒的定量檢測,通過優(yōu)化方 案,反復實驗,建立了定量檢測人博卡病毒的方法,并研制出用于人博卡病毒核酸定量檢測 的試劑盒,該試劑盒的檢測的靈敏度至少可達到1000拷貝/ml病毒粒子。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有下列優(yōu)點
(1) 特異性更強,靈敏度更高。
(2) 全封閉反應,提取病毒DNA后,直接用于PCR檢測,避免了污染發(fā)生;
(3) 檢測速度快,整個過程僅需3 4小時;
(4) 操作簡單,可控性強,可進行大批量樣品檢測,有利于產(chǎn)業(yè)化。
圖l顯示檢測人博卡病毒時不同濃度樣本的擴增曲線,三個標本的Ct值分別是9.91、 18.18、 21.33,擴增曲線為S形,均能夠判定為陽性。圖2顯示五個陰性標本的擴增曲線,均不具S形特征,能夠判定為陰性。
圖3顯示兩個陰性標本的擴增曲線,與熒光檢測閾值線沒有交點,能夠判定為陰性。
圖4顯示定量檢測時的擴增曲線,針對模板數(shù)為103 108拷貝/ml進行PCR分析,結(jié)果表明
試劑盒具有很高的靈敏度,可達1000拷貝/ml。
圖5顯示定量檢測時Std curve窗口下的標準曲線,繪制得到的標準曲線相關(guān)系數(shù)達到
0.9975。
圖6顯示陽性標本靈敏度實驗的檢測曲線,結(jié)果表明試劑盒具有很高的靈敏度,可達IOOO 拷貝/ml。
圖7顯示陽性標本重復性實驗的檢測曲線,結(jié)果表明試劑盒具有良好的重復性。
具體實施例方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
實施例h人博卡病毒實時熒光PCR檢測試劑盒及其使用
(1) 制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(500yl /管)l管、PCR反應管IO 管、純水(2000ul/管)l管、強陽性質(zhì)控品(50ul /管)l管、臨界陽性質(zhì)控品(50u1/ 管)l管、陰性質(zhì)控品(50ul/管)l管。
其中DNA提取液由異硫氰酸胍、氫氧化鈉、SDS等物質(zhì)組成。PCR反應管內(nèi)為核酸擴增反應 體系,由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs等組成。本發(fā)明的試劑盒中使用帶有目的基因 片段的重組質(zhì)粒作為強陽性質(zhì)控品,其濃度為lX105拷貝/ml,使用帶有目的基因片段的重組 質(zhì)粒作為臨界陽性質(zhì)控品,其濃度為lX102拷貝/ml,并使用生理鹽水作為陰性質(zhì)控品。
(2) 標本采集、運送和保存負壓下吸取痰液,置于低溫冰箱(一7(TC或一2(TC)冷凍 保存。如集中檢驗,標本需在(TC以下環(huán)境中運送并于24小時內(nèi)送達實驗室。
(3) 檢測步驟和結(jié)果分析
痰液吸取50ul待檢樣本至1. 5ml離心管中,直接加入50 u 1 DNA提取液充分混勻。 10(TC加熱處理10分鐘(誤差不超過l分鐘)后,12,000rpm離心5分鐘,取上清液2yl 用于PCR反應。
將強陽性質(zhì)控品6000rpm離心15秒,加入稀釋液450 ul,充分混勻后標示為105。然后另 取3支新的0.5ml離心管,對標準品依次進行10倍梯度稀釋(分別標示為104、 103、 102), -20 'C保存?zhèn)溆谩?br>
然后分別取待檢樣品(每份2ul)、同樣體積的定量質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品,加樣于PCR反應 管中進行PCR擴增。PCR循環(huán)條件是93。C預變性3分鐘,93°C 30秒,55°C 45秒,進行40次循環(huán),在反應的延伸階段檢測熒光信號。
反應結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。調(diào)節(jié)分析參數(shù),使標準曲線(Std curve )窗口下的標 準曲線圖達到最佳(即相關(guān)系數(shù)的絕對值〉0.95)(參見附圖5)。陽性標本的熒光擴增曲線呈S 形,且與設定的閾值線有一交點(參見附圖l),而陰性標本的熒光曲線為不規(guī)則的折線,不 是S形曲線(參見附圖2和附圖3)。最后由儀器自動分析裝置計算出未知標本的測定數(shù)值(Qty), 即標本中博卡病毒的DNA含量(參見附圖4和附圖5)。
實施例2:靈敏度測試
具體步驟同實施例l,不同的是所用標本為確定陽性的標本并測定濃度。提取核酸后用本 發(fā)明的試劑盒進行PCR擴增,每一份標本設置多個復管。在擴增的同時由儀器自動監(jiān)測并收集 熒光信號的變化。結(jié)果表明試劑盒具有很高的靈敏度,可達1000拷貝/ml。(參見附圖6)。
實施例3:重復性測試
具體步驟同實施例l,不同的是所用標本為確定陽性、不同濃度的標本提取核酸后用本發(fā) 明的試劑盒進行PCR擴增,每一份標本設置多個復管。在擴增的同時由儀器自動監(jiān)測并收集熒 光信號的變化。反應結(jié)束后分析,應用本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果,此結(jié)果表明i式劑盒具有良 好的重復性。(參見附圖7)。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一歩詳細說明,不能認定本發(fā)明 的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本 發(fā)明構(gòu)思的前提下,如做出若干簡單推演或替換,都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。序列表
〈110>中山大學達安基因股份有限公司
〈120〉人博卡病毒實時熒光PCR檢測試劑盒
<140>
<141〉
<160>4
〈210> 1 <211〉 22 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計,以用作PC財廣增的引物。 <400〉 1
g3gggg3g恥g肪g3gacac t g
<210〉 2
<211> 21 〈212〉畫 <213>人工序列 <220〉
<223〉根據(jù)特定核苷酸序列設計,以用作PCR擴增的引物。
<400〉 2
gcaagacgataggtggctgat
<210> 3 <211> 23 <212>腿 <213>人工序列<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計,以用作檢測熒光信號的探針。 〈400> 3
tcatcacaggagcaggEigccgcEL
權(quán)利要求
1、一種利用實時熒光PCR技術(shù)定性或定量檢測人博卡病毒的試劑盒,該試劑盒包括(1)DNA提取試劑、核酸擴增反應體系、純水、定量參考品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品,和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒,其中核酸擴增反應體系包括耐熱DNA聚合酶、2’-脫氧核苷三磷酸、正向寡核苷酸引物、反向寡核苷酸引物、寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液,其特征在于擴增反應所使用的正向和反向寡核苷酸引物的序列分別為5’-GAGGGGAGAGGAAGAGACACTG-3’和5’-GCAAGACGATAGGTGGCTGAT-3’。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒,其特征還在于寡核苷酸探針的序列為5' X-TCATCACAGGAGCAGGAG CCGCA - Y 3',其中X/Y表示熒光標記檢測體系,包括能夠與靴多核 苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒,其特征還在于可應用于人博卡病毒快速定性或定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實時熒光PCR檢測試劑盒,特別是涉及利用實時熒光PCR技術(shù)檢測人博卡病毒的試劑盒。本試劑盒操作簡單,耗時短,靈敏度高,特異性強,可對多種類型標本中人博卡病毒進行定性或定量檢測,用于早期診斷、流行病學研究等多個領(lǐng)域。
文檔編號G01N21/64GK101550452SQ20081002710
公開日2009年10月7日 申請日期2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日
發(fā)明者喬穎颯, 瑰 何, 何蘊韶, 朱振宇, 明 李, 王方金 申請人:中山大學達安基因股份有限公司